KR102405368B1 - 나노입자 강화된 젤라틴-하이드로겔 및 이의 제조방법 - Google Patents

나노입자 강화된 젤라틴-하이드로겔 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

(a) 수용액 상에서 나노입자 전구체 및 젤라틴 캡핑제 또는 안정화제를 혼합하는 단계, 및 상기 수용액에 메타크릴 무수화물 또는 아크릴레이트 무수화물을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 나노입자 전구체는 0.1 mM 내지 1M 의 금속이온을 포함하고, 인-시츄(in-situ) 반응에 의해 나노입자의 형성을 유도하고, 균일하게 혼합하는 것을 특징으로 하는, 나노입자 강화 하이드로겔 제조방법이 제공된다.

Description

나노입자 강화된 젤라틴-하이드로겔 및 이의 제조방법{Gelatin-hydrogel reinforced with nanoparticles and method for manufacturing the same}
본 발명은 나노입자를 균일하게 분산시켜 강화된 하이드로겔을 제조하는 기술에 관한 것이다.
하이드로겔(Hydrogel)은 화학적 결합이나 정전기적 인력에 의해 상호작용하는 분자들이 친수성 가교결합된 중합체를 형성하고, 건조중량의 수백배에 해당하는 수분을 흡수하는 물질이다. 이와 같은 하이드로겔은 우수한 생체적합성 및 친수성 특성을 나타내기 때문에 제약, 조직재생공학, 의료기기 및 의학 분야에서 다양한 응용이 가능한 것으로 알려져 있다.
또한, 하이드로겔은 손상된 인체 조직의 치유를 목적으로 하는 조직공학 기질의 제조에 유용한 후보물질로 알려져 있다. 하이드로겔에 의해 형성되는 3차원 구조는 지지체(scaffold)라고도 불리며, 이와 같은 지지체를 다양한 조직공학 재료로 사용하고 있다.
이와 같은 하이드로겔의 소재로 이용할 수 있는 물질 중, 히알루론산을 적용하는 연구가 다수 진행 중에 있다. 히알루론산(Hyaluronic acid)은 살아 있는 유기체 내에서 자연 상태로 존재하는 성분으로, 인체 내 다양한 부위에 분포되어 있다. 히알루론산은 면역에 관한 문제를 발생시키지 않고, 특정세포와의 상호작용이 우수하여 조직공학과 약물전달시스템 등에 이용될 수 있는 우수한 생체적합성을 지니고 있어 하이드로겔의 성분으로 우수한 효능을 나타낼 수 있다.
이와 같은 히알루론산의 다양한 장점에도 불구하고, 이를 단독으로 사용하는 경우 점탄성 특성이나 기계적 물성이 충분하지 못하여 지지체 골격의 강도가 낮고, 과도한 친수성과 세포부착 리간드 특성으로 인해 세포부착성, 세포 분화능 등이 불량한 단점이 있다. 이에 따라, 히알루론산을 화학적으로 개질하여 적용하고자 하는 연구가 다수 진행 중에 있다.
조직공학적 용도로 이용하기 위해 생체적합성 고분자인 젤라틴을 이용하여 하이드로겔을 제조하고자 하는 수요는 지속적으로 늘어나는 추세이나, 젤라틴의 약한 물성으로 인해 용도의 제약이 있다.
젤라틴의 물성을 강화시키기 위해, 젤라틴에 메타크릴로일 작용기를 부착한 젤라틴-메타크리올(gelatin-methacrylate, GelMA)을 젤라틴 대신 사용하여 약물전달체, 주사용 하이드로겔 등 생의학 응용분야에 사용하고 있다. 젤라틴-메타아크리올(gelatin-methacrylate, GelMA)은 3D 프린팅에 적합한 광 가교결합 하이드로겔로 전환되는 고분자로 생물학적 특성이 우수하나, 기계적 물성 및 3D 프린팅시 안정성이 낮은 문제점이 여전히 존재한다.
젤라틴의 물성을 보완하기 위한 다른 방안으로, 나노입자를 보강하여 구조적, 기계적 및 프린팅 특성을 개선하기 위한 노력이 있었으나, 균일하게 분산하기 어렵거나, 혹은 균일하게 분산하기 위해 복잡한 공정이 요구되는 등 공정의 복잡성 및 경제성 측면에서 더 바람직한 해결수단이 요구된다.
한국등록특허 제2100506호 (2020.04.07) 한국등록특허 제1299490호 (2013.08.19)
본 발명의 목적은 (a) 수용액 상에서 나노입자 전구체 및 젤라틴 캡핑제 또는 안정화제를 혼합하는 단계, 및 상기 수용액에 메타크릴 무수화물 또는 아크릴레이트 무수화물을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 나노입자 전구체는 0.1 mM 내지 1M 의 금속이온을 포함하고, 인-시츄(in-situ) 반응에 의해 나노입자의 형성을 유도하고, 균일하게 혼합하는 것을 특징으로 하는, 나노입자 강화 하이드로겔 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 나노입자 전구체 및 캡핑(capping)제를 포함하고, 상기 캡핑제는 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 젤라틴 아크릴레이트, 중 어느 하나고, 상기 캡핑제 내부에 세포 및 가교결합제를 포함하고, 상기 나노입자가 균일하게 분산된, 나노입자 강화 하이드로겔을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 수용액 상에서 나노입자 전구체 및 젤라틴 캡핑제 또는 안정화제를 혼합하는 단계, 및 상기 수용액에 메타크릴 무수화물 또는 아크릴레이트 무수화물을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 나노입자 전구체는 0.1 mM 내지 1M 의 금속이온을 포함하고, 인-시츄(in-situ) 반응에 의해 나노입자의 형성을 유도하고, 균일하게 혼합하는 것을 특징으로 하는, 나노입자 강화 하이드로겔 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 (b)단계에 의한 메타크릴화 또는 아크릴화로 인해 상기 젤라틴이 가교결합할 수 있는 작용기를 가진 젤라틴 유도체를 제조하고, 젤라틴 내부에 나노입자가 가교결합되어 균일하게 분산되고, 분산된 나노입자는 젤라틴 중량 기준 0.001 내지 100%(w/w) 일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 가교결합은, 광 가교 결합일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 나노입자 전구체 및 캡핑(capping)제를 포함하고, 상기 캡핑제는 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 젤라틴 아크릴레이트, 중 어느 하나고, 상기 캡핑제 내부에 세포 및 가교결합제를 포함하고, 상기 나노입자가 균일하게 분산된 나노입자 강화 하이드로겔이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 나노입자 크기는 1 nm to 10 μm일 수 있다.
본 발명의 제조방법을 이용하면, 젤라틴-메타크릴올 내부에 나노입자를 골고루 분산시켜 강화된 하이드로겔을 제조할 수 있다. 특히, 하나의 반응조에서 수용액에 젤라틴, 나노입자 전구체를 넣고 분산시킨 뒤, 메타크릴화를 통해 광 가교결합시킴으로써 단순한 공정만으로도 기계적 물성이 향상된 하이드로겔을 수득할 수 있다.
도 1은 젤라틴 코팅된 건조 나노입자를 수득하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 일 실시예 따른 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴올 파우더 제조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 바이오잉크 프린팅 및 주사형 젤로 적용할 수 있는 하이드로젤 샘플 제조과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 젤라틴 농도에 따른 나노입자 크기 분포를 확인한 것이다.
도 5는 실시예 1 내지 3으로 제조된 샘플 1 내지 3의 SEM, TEM 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 일 실시예로 제조된 나노입자 강화된 하이드로젤 샘플의 디지털 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴 샘플에서 인산칼슘이 무결정임을 확인하는 XRD 테스트 결과 그래프이다.
도 8은 일 실시예로 합성된 나노입자 강화된 젤라틴-메타아클릴올의 구조를 FTIR 확인한 것이다.
도 9는 실시예 2로 제조된 나노입자의 FTIR 결과이다. 확인한 것이다.
도 10은 나노입자 강화된 가교결합 젤라틴-메타아크릴올 하이드로젤의 유변학적 특성을 확인한 것이다.
도 11은 실시예 3으로 제조된 샘플의 기계적 물성을 확인한 것이다.
도 12는 실시예 2로 제조된 샘플 2의 세포독성을 평가한 것이다.
도 13은 실시예 3으로 제조된 샘플 3의 MTT를 분석한 것이다.
도 14는 실시예 3으로 제조된 샘플 3의 세포 생존능을 확인한 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 수용액 상에서 나노입자 전구체 및 젤라틴 캡핑제 또는 안정화제를 혼합하는 단계, 및 상기 수용액에 메타크릴 무수화물 또는 아크릴레이트 무수화물을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 나노입자 전구체는 0.1 mM 내지 1M 의 금속이온을 포함하고, 인-시츄(in-situ) 반응에 의해 나노입자의 형성을 유도하고, 균일하게 혼합하는 것을 특징으로 하는, 나노입자 강화 하이드로겔 제조방법이 제공된다.
본 발명의 하이드로겔은 생체조직의 손상된 부분을 접착시키거나, 유실된 조직 중 일부를 대체하는 용도로 사용되는 것일 수 있다. 여기서 “생체조직”은 예를 들어 피부, 뼈, 신경, 액손, 연골, 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 비장, 소장, 간, 정소, 난소, 경부, 직장, 위, 림프절, 골수, 및 신장 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 하이드로겔은 의료기기 또는 의료재료의 일부에 코팅되거나 부착될 수 있다. 혹은, 세포, 생체활성물질, 치료용 약물 또는 약물전달체의 일부를 부착 또는 포함하는 것일 수도 있다. 여기서 세포는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 조골세포(osteoblast), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B세포(B cell), 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함하는 면역세포(immunocyte), 배아세포(embryonic cell) 또는 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 약물은 화학물질, 소분자, 펩타이드, 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 항암제, 항염증제, 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 약물전달체는 세포 부착성 매트릭스 또는 스캐폴드(scaffold)일 수 있고, 인공 세포외 기질로 사용될 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 조직공학 기술에 이용되는 것일 수 있다. 조직공학(Tissue engineering) 기술은 환자의 조직으로부터 분리된 세포 또는 인공 배양된 세포를 지지체에 배양하여 다시 생체 내부로 이식하거나 외부에 적용하는 것을 의미할 수 있다. 예를들면, 하이드로겔을 조직공학 기술에 이용함으로써, 인공 피부, 인공혈관, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공근육, 인공장기 등을 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 하이드로겔은 바이오 잉크(bioinks)일 수 있다. 여기서, 용어 "바이오 잉크(bioinks)"는 3D프린팅 또는 바이오 프린팅에 사용되는 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물을 포함하는 의미일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이오 잉크 조성물은 3D프린팅 또는 바이오 프린팅을 위한 것일 수 있다. 본 발명의 하이드로겔은 3D 프린팅되어 복수의 적층구조를 갖는 3D 프린팅 하이드로겔일 수 있다. 3D 프린팅 가능한 하이드로겔의 경우, 주사가능한 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
젤라틴은 동물의 뼈나 연골 등 결합조직에 포함되는 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 얻어지는 단백질로, 생체적합성이 높고 무독성의 생분해성 특징을 가지고 있어 생체 적합성 고분자로 이용된다. 젤라틴은, 낮은 온도와 농도에서도 점성을 가지며, 용액 상태로 냉각되면, 선명하고 탄성력이 있는 열가역적 겔을 형성하지만 수용액 상에서 쉽게 녹아버리기 때문에, 하이드로겔의 안정성 및 물성을 향상시키기 위해 종래에는 주로 화학적 가교제를 함께 사용해왔다.
본 명세서에서의 젤라틴은 순수한 젤라틴 외에도 젤라틴 유도체를 포함할 수 있으며, 포유류, 어류 등 다양한 동물 유래의 것일 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서의 젤라틴은 캡핑제 또는 안정화제로 사용되며, 이 때, 젤라틴은 0.5Mm 내지 10mM일 수 있다.
상기 나노입자 전구체는 0.1 mM 내지 1M 의 금속이온을 포함할 수 있으며, 이 때 금속이온은 칼슘, 은, 금 등일 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 (a)단계는 나노입자가 합성되는 과정을 포함하는 것일 수 있다. 여기서, 나노입자는 공침되거나 또는 졸-겔(sol-gel) 방법으로 합성된 세라믹 나노입자일 수 있다. 합성된 나노입자는 삼인산칼슘, HPO4, 인산칼슘 등의 인산칼슘 나노입자일 수 있으나, 수용액에 첨가되는 물질에 따라 달라질 수 있다. 합성된 나노입자의 크기는 1nm 내지 10μm 일 수 있으나, 종류 및 크기가 특별히 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법은 도 1 또는 도 2 의 반응을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 도 1은 젤라틴 코팅된 건조 나노입자를 수득하는 과정을 개략적으로 나타낸 것으로, 젤라틴 용액과 염화칼슘을 혼합하여 pH9의 염기성 조건에서 교반하고, 균일하게 분산을 유도한 다음 Na2HPO4를 첨가하여 젤라틴 용액 내에서 인산칼슘나노입자를 형성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 도1의 과정으로 제조한 나노입자 코팅된 젤라틴 용액을 동결건조하여 파우더로 전환한 후, pH7.6, 50℃의 중성조건에서 6시간동안 교반하여 나노입자 분산된 젤라틴 용액을 형성한 다음, 무수메타아크릴산을 첨가하여 나노입자 분산된 젤라틴-메타아크릴레이트(NP-GelMA) 용액을 제조한 과정을 나타낸 개략적으로 나타낸 것이다. 제조된 용액을 세척 및 동결건조하여 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴올 파우더를 형성할 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 하이드로젤을 바이오잉크 프린팅용 또는 주사형 젤로 적용이 적합한 물성으로 제조하기 위해서는 도 3의 반응을 포함하는 제조방법이 바람직할 수 있다. 도 3은 전술한 도 1의 반응으로 제조된 인산칼슘 나노입자를 세척 및 건조하여 제조된 나노입자에 젤라틴-메타아크릴올과 세포 및 가교결합제인 이가큐어(Igacure)를 PBS 완충 용액에 첨가하고 균일하게 혼합한 뒤, UV 조사를 통해서 나노입자 강화된 세포함유 젤라틴-메타아크릴레이트 하이드로젤을 제조한 과정을 나타낸 것이다. 최종적으로 가교결합제를 세척, 제거함으로써 바이오잉크 프린팅 및 주사형 젤로 적용이 적합한 하이드로젤을 수득할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 (b)단계에 의한 메타크릴화 또는 아크릴화로 인해 상기 젤라틴이 가교결합할 수 있는 작용기를 가진 젤라틴 유도체를 제조하고, 젤라틴 내부에 나노입자가 가교결합되어 균일하게 분산되고, 분산된 나노입자는 젤라틴 중량 기준 0.001 내지 100%(w/w) 일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 가교결합은, 광 가교 결합일 수 있다 메타크릴 무수화물 또는 아크릴레이트 무수화물의 첨가로, 추가된 메타크릴올 그룹들이 나노입자가 분산된 젤라틴에 부착되어 광 가교결합에 이용된다. 이 때, 광 가교결합은, 이가큐어(Irgacure)일 수 있고, 구체적으로는 이가큐어 2955(Irgacure 2955)임이 바람직하나, 통상적으로 당업자가 사용하는 광 가교결합제면 될 뿐, 특별히 제한되는 것은 아니다.
일 측에 따르면, 상기 (a) 단계는, 콜라겐, 실크 피브로인, 케라틴, 및 임의의 단백질 또는 아민 작용 화 된 다당류 및 합성 중합체와 같은 다른 중합체를 안정화제로 더 포함하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로는, 반응액에서 세포 또는 생물활성 분자와의 인-시츄(in-situ) 자가 가교결합된 겔화반응을 위해 티올-함유 중합체를 첨가하는 것일 수 있다. 이 때, 티올-함유 중합체는 젤라틴-SH(gelatin-SH), 콜라겐-SH(collagen-SH), 폴리에틸렌옥사이드-SH(PEO-SH), 히알루론산-SH(hyaluronic acid-SH) 등의 마이클 반응성 자가 가교결합 중합체일 수 있다. 마이클 반응(Michael reaction)은 전자 흡인기를 함유하는 α, β- 불포화 카보 닐 화합물에 카바니온 또는 다른 친핵체의 친핵성 첨가 반응을 의미하고, C-C 결합 형성에 유용하다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 나노입자 전구체 및 캡핑(capping)제를 포함하고, 상기 캡핑제는 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 젤라틴 아크릴레이트, 중 어느 하나고, 상기 캡핑제 내부에 세포 및 가교결합제를 포함하고, 상기 나노입자가 균일하게 분산된 나노입자 강화 하이드로겔이 제공된다. 이 때, 젤라틴은 0.5 mM 내지 10 mM 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로, 나노입자 강화 하이드로겔은 전술한 방법으로 제조된 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 나노입자 크기는 1 nm to 10μm일 수 있다. 상기 나노입자가 분산된 하이드로겔은 내부에 세포, 약물 또는 활성물질이 더 포함할 수도 있다. 여기서, 세포는 구체적으로 세포 치료제일 수 있고, 구체적으로는 줄기세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, 활성물질은 펩타이드 계열의 물질, 단백질 의약품, 항균제, 항암제, 항염증제 또는 통상의 치료제 중 적어도 하나일 수 있으나, 생체 내 활성 또는 특정 물질의 억제를 위한 물질로 통용되는 것이면 제한되지 않는다.
본 발명의 하이드로겔은 약물 전달 용도로 이용하는 경우, 약제학적으로 적합한 담체를 더 포함할 수 있다.
<실시예>
실시예 1. 젤라틴 코팅(캡핑) 나노입자 제조
100ml 증류수에 10mM CaCl2 0.11g 녹여 분리함으로써 나노 입자를 합성 하였다. 젤라틴 0.3 내지 1.2 g을 첨가하고 완전히 용해 될 때까지 교반 하였다 (0.5 내지 2 mM). NaOH 용액을 사용하여 pH 9로 조정 하였다. 0.0852g 디소듐포스페이트(Na2HPO4)를 10ml 증류수 (60mM)에 별도로 첨가 하였다. pH 9를 조정하고 2 시간 동안 계속 교반 하였다. 젤라틴 안정화된 Ca3(PO4)2 나노 입자 분산액이 형성되었다. 코팅(캡핑)되지 않은 젤라틴을 제거하여 원심 분리하고 증류수로 2 회 세척 하였다. 마지막으로, 동결 건조하여 분말 형태의 젤라틴으로 코팅(캡핑)된 건조 나노 입자를 수득 하였다.(도 1)
실시예 2. 젤라틴-메타크릴올(GelMA) 합성
1g의 젤라틴(소 피부 유래, ~75 bloom, G6650, Sigma Aldrich, USA)과 메타 크릴 산 무수물 및 50ml PBS를 오일 욕에서 100ml 양면 둥근 바닥 플라스크에 첨가함으로써 순수한 젤라틴-메타크릴올(GelMA)를 합성 하였다.
이후, 실시예 1로 합성된 나노입자를 젤라틴 첨가된 용액에 넣고, 충분히 용해되도록 50 ℃에서 400 rpm으로 6 시간 동안 교반 한 뒤, 60 ℃로 온도를 올려 30분간 교반하였다. 이후, 소량의 5M NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.6으로 조정하고, 4ml 메타크릴 무수화물(Molecular Weight: 154.16, 276685, Sigma Aldrich, USA)을 한방울씩 천천히 첨가하면서 3시간 동안 교반하였다. 50 ml의 PBS를 반응 플라스크에 첨가하고 5 분 동안 교반한 뒤, 실온에서 냉각시켰다. 수득된 화합물을 막 튜빙(분자량이 6 내지 8KD 인 분자 다공성 막 튜빙; 표준 RC 튜빙, 부품 번호 132665, Spectrum Laboratories, Inc, USA)에서 4일 동안 5L 증류수로 투석한 후, 순수한 NP-GelMA를 얻기위해 4일간 동결 건조시켜 샘플 2를 수득하였다.(도 2)
실시예 3. 바이오잉크 프린팅용 및 주사용 NP-GelMA 하이드로겔
먼저, 10mM CaCl2 (0.11g)를 50ml 증류수에 용해시킨다. 여기에 1.0g 젤라틴을 첨가하고 오일 조에서 50 ℃에서 400rpm으로 6 시간 동안 교반하여 완전히 용해시켰다. NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정 하였다. 0.0852g의 Na2HPO4를 10ml 증류수 (60mM)에 별도로 녹인 후, 2 시간 동안 교반하면서 첨가하였다. 온도를 60 ℃로 증가시키고 30 분 동안 계속 교반한다. 메타크릴산 무수화물 4ml를 천천히 적가하고 3시간 동안 계속 교반 하였다. 반응 플라스크에 40ml 인산 완충식염수(PBS)를 5분간 교반하면서 첨가하였다. 막 튜빙(분자량 6 ~ 8KD인 분자 다공성 막 튜빙; 표준 RC Tubig, 부품 번호 132665, Spectrum Laboratories, Inc, USA)을 사용하여 4일간 5L 증류수에서 냉각시킨 뒤 투석한다. 투석 후, 추가로 건조시켜 나노입자 강화된 NP-GelMA(샘플 3)를 수득하였다. 제조한 인산칼슘 나노입자를 세척 및 건조하여 제조된 나노입자에 젤라틴-메타아크릴올과 세포 및 이가큐어 가교결합제를 PBS 버퍼용액에 첨가한 다음에, 균일하게 혼합하였다. 이후에 UV 조사를 통해서 나노 강화된 세포함유 젤라틴-메타아크릴레이트 하이드로젤을 제조한 다음에, 가교결합제를 세척에 의해 제거하여 바이오잉크 프린팅 및 주사형 젤로 적용할 수 있는 샘플을 제조하였다 (도 3)
실시예 4. 본 발명 NP-GelMA 의 물성 확인
실시예 1 내지 3에서 제조한 인산칼슘 나노입자의 무결정성 확인, SEM과 TEM을 이용한 나노입자 형성 및 분산, 이카큐어 가교결합제를 사용한 막대형 젤 제조모습, 나노입자가 포함된 젤라틴 고분자 화학구조, 점탄성 이력현상, 기계적 물성 등을 테스트 하여 나노입자와 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴올 및 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴올 젤 형성을 확인하였다 (도 5-11의 분석방법 및 결과 참조).
도 5는 실시예 1 내지 3으로 제조된 샘플의 SEM, TEM 사진을 나타낸 것이다.
도 5의 (a) 2mM 젤라틴 안정화된 합성 나노입자; (b) 순수 GelMA, (c) 나노입자 강화된GelMA, (d) 나노입자의 TEM 사진(SAED pattern as insert), (e) Ca, P and O 가 주요 구성성분임을 나타내는 EDX 결과, (f) 젤, 나노입자강화된 젤라틴-MA 에 분산된 나노입자를 보여주는 나노입자강화 젤라틴-MA 의 TEM 이다.
도 6은 실시예 3으로 제조된 인산칼슘 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴(30%)올에 이가큐어 2955 가교결합제(5%) 첨가한 이후에, UV 조사에 의하여 수득한 나노입자 강화된 젤라틴 젤 샘플 3의 디지털 사진이다.
도 7은 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴 샘플에서 인산칼슘이 무결정(약 26도)임을 확인하는 XRD 테스트 결과이다.
도 8은 일 실시예로 합성된 나노입자 강화된 젤라틴-메타아클릴올의 구조를 FTIR 확인한 것이다. 가교결합된GelMA, 가교결합된 NanoGelMA, NanoGelMA 샘플을 사용하였다.
도 9는 실시예 2 로 제조된 나노입자의 FTIR 결과를 확인한 것이다. 인산이온 (PO4)3- 은564, 603, 963, 1035, and 1094 cm-1 피크위치를 가지고, 탄산이온 (CO3)2- 은 1567 and 2300-2500 cm-1, 3000 and 3800 cm-1 의 넓은 범위의 피크는 물의 O-H 그룹이다.
도 10은 나노입자 강화된 가교결합 젤라틴-메타아크릴올 하이드로젤의 유변학적 특성을 확인한 것이다. 도 10을 살펴보면, (a) 5 분 UV 노출 후 나노 GelMA 유동학 (점도 대 전단 속도), (b) 원통형 가교된 나노 GelMA (10mm 높이 및 9mm 직경)에 대한 주기적 압축 시험, (c-f) 3D 프린팅 관련된 기계적 텍스처 특성을 평가한 것이다. 실시예 2로 합성된 NanoGelMA, GelMA0, GelMA1, GelMA2, GelMA3 샘플을 평가에 사용했으며, GelMA0, 1, 2, 3 은 각각 나노입자의 함량이 0, 1, 2, 3 %(w/w)인 것을 의미한다.
도 11은 실시예 3으로 제조된 샘플의 기계적 물성을 확인한 것이다. (a) 원통형 가교 나노 GelMA (10mm 높이 및 9mm 직경)에 대한 주기적 압축 시험, (b-e) 3D 프린팅과 관련된 기계적 텍스처 특성을 평가한 것이다. 실시예 3으로 합성된 샘플인 NanoGelMA을 사용했으며, 샘플 제조에 있어서 20 % (w/w) 농도의 나노입자를 사용하였다.
실시예 5. 본 발명 NP-GelMA의 in vitro 세포독성 평가
세포가 포함된 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴올 및 나노입자 강화된 젤라틴-메타아크릴올 하이드로젤의 in vitro 세포생존성 및 세포증식성을 chleo 7일 동안 관찰한 결과에 따르면 나노입자가 균일하게 분포되어 있고 세포적합성이 우수한 것을 확인하였다.(도 12-14)
도 12는 실시예 2로 제조된 샘플의 세포독성을 평가한 것으로, (a) 0 일, (b) 3 일 및 (c) 7 일의 GelMA0, (d) 0 일, (e) 3 일 및 (f) 7 일에서의 GelMA3 의 세포 생존성을 평가한 것이다.
도 13은 실시예 3으로 제조된 샘플 3의 MTT를 분석한 것이다. 도 13에서 NP는 나노 입자, GelMA + NP 는 NP 혼합 GelMA 샘플을 나타낸다. 실시예 3을 사용하여 합성된 nanoGelMA와 비교하기 위해 NP 혼합 GelMA도 20 % (w / w)로 선택하였다.
도 14는 실시예 3으로 제조된 샘플 3의 세포 생존능을 확인한 것이다. (a) 3 일차, (d) 7 일차, NP 혼합 겔 마스크 (b) 3 일차, (e) 7 일차, 나노 GelMA (d) 3 일차, (e) 7 일차. 방법 3을 사용하여 합성된 nanoGelMA와 비교하기 위하여 나노입자 혼합된 GelMA는 20 % (w / w) 조건의 용액을 사용하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (5)

  1. (a) 수용액 상에서 나노입자 전구체 및 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 젤라틴 아크릴레이트 중 어느 하나의 캡핑제를 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 수용액에 메타크릴 무수화물 또는 아크릴레이트 무수화물을 첨가하는 단계;를 포함하고,
    상기 나노입자 전구체는 0.1 mM 내지 1M 의 금속이온을 포함하고,
    인-시츄(in-situ) 반응에 의해 나노입자의 형성을 유도하고, 균일하게 혼합되며,
    상기 (b)단계에 의한 메타크릴화 또는 아크릴화로 인해 상기 젤라틴이 가교 결합할 수 있는 작용기를 가진 젤라틴 유도체를 제조하고, 젤라틴 내부에 나노입자가 가교결합되어 균일하게 분산되고, 분산된 나노입자는 젤라틴 중량 기준 0.001 내지 100%(w/w)이며, 하이드로겔 내부의 젤라틴 농도는 0.5 mM 내지 10 Mm인, 나노입자 강화 하이드로겔 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교결합은, 광 가교 결합이고,
    메타크릴올 그룹들이 나노입자가 분산된 캡핑제에 부착되는 것인, 나노입자 강화 하이드로겔 제조방법.
  4. 나노입자 전구체 및 캡핑(capping)제를 포함하고,
    상기 캡핑제는 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 젤라틴 아크릴레이트, 중 어느 하나고,
    상기 캡핑제 내부에 세포 및 광 가교결합제를 포함하고,
    상기 나노입자가 균일하게 분산되며,
    분산된 나노입자는 젤라틴 중량 기준 0.001 내지 100%(w/w)이며, 하이드로겔 내부의 젤라틴 농도는 0.5 mM 내지 10 mM 인, 나노입자 강화 하이드로겔.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 나노입자 크기는 1 nm to 10 μm인, 나노입자 강화 하이드로겔.
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