CN107007881B - 可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶及其制备方法和应用。本发明使用带表面电荷的高分子微凝胶颗粒，通过颗粒间的静电相互作用自组装得到胶体凝胶。由于微凝胶之间的静电作用是物理交联且具有可逆性，本发明的胶体凝胶具有良好的可注射性和自愈合能力，在注射和固化过程无需引入化学交联反应，不同于化学高分子，也没有引入小分子交联剂，生物相容性好，可降解吸收，无毒副作用，安全性好，使其在生物医学领域的广泛应用成为可能。

Description

可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种可用于药物加载和释放的、可注射型自愈合凝胶生物材料及其制备方法和应用。具体而言，本发明涉及一种基于明胶颗粒的、生物相容性的、可降解胶体凝胶材料，可直接施用于外科手术(含微创手术)以及外伤等原因造成的人及其他哺乳动物的组织器官创面或缺损的修复填充及再生重建。
背景技术
自愈合材料为一类新型功能材料，这类材料在受到外力破坏后能自动修复愈合，可完全或部分恢复破坏前的结构和力学强度，已成为非常重要的一类新型、智能化、工程材料。其中，具有自愈合能力的水凝胶材料因其自修复能力、具有生物相容性、和人体组织类似的高含水率等特点，在生物医药工程领域具有重要的应用价值。近来，科学家们借助可逆的高分子链间相互作用，即高分子间的键合可被打破和重建这一特性，开发出多种具有自愈合效应的新型水凝胶材料。然而这些自愈合材料因普遍采用高分子链间的分子间相互作用，包括氢键、金属离子配体的配位作用、静电作用或疏水性作用等，易产生微观相分离，且这类水凝胶高分子网络无法实现对药物分子的可控加载和释放。同时传统的自修复高分子水凝胶材料存在诸多难以克服的瓶颈，包括力学强度较弱，无法对药物释放进行准确控制，同时难以兼顾生物相容性和生物降解性。这些都限制了其在生物医药领域，尤其是作为可植入生物材料的应用。
发明内容
鉴于上述所述的自愈合材料在现有技术中存在的问题，本发明提供一种可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶生物材料及其制备方法。该凝胶生物材料具有自愈合功能，并可加载水溶性小分子化学药物、蛋白药物或活细胞，实现药物或生物因子的可控释放，可诱导组织再生，适用于皮肤组织、牙周组织、软骨组织等病缺损组织的修复，也可作为3D生物打印墨水。
本发明的技术方案如下：
一种可注射型自愈合胶体凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)以明胶为原料，使其在去离子水中加热溶解，配置浓度为0.1～20w/v％的明胶水溶液，调pH值为1-6或8-14，向溶液中加入>2倍体积的极性有机溶剂，生成明胶微凝胶颗粒分散液，加入交联剂交联反应1～12h，离心、清洗得到明胶微凝胶颗粒；
其中，所述明胶微凝胶颗粒的zeta电势为-30～+30mV，所述明胶微凝胶颗粒的直径为20nm～5μm；
(2)将步骤(1)制备得到的表面zeta电势>+10mV的明胶微凝胶颗粒，分散在pH<5的酸性水溶液或pH>9的碱性水溶液中，得明胶微凝胶颗粒的分散液，再与带负电荷的有机高分子颗粒分散液按照颗粒数比1:1000～1000:1共混，用pH调节剂调pH至7.0，冷冻干燥，得到明胶微凝胶颗粒冻干粉末I；
(3)将步骤(1)制备得到的表面zeta电势<-10mV的明胶微凝胶颗粒，分散在pH<5的酸性水溶液或pH>9的碱性水溶液中，得明胶微凝胶颗粒的分散液，再与带正电荷的有机高分子颗粒分散液按照颗粒数比1:1000～1000:1，混合，用pH调节剂调pH至7.0，冷冻干燥，得到明胶微凝胶颗粒冻干粉末II；
(4)将步骤(1)制备得到的表面zeta电势为-10～+10mV的明胶微凝胶颗粒分散在中性水溶液中，再与另一种表面zeta电势在-10～+10mV的有机高分子颗粒分散液按照颗粒数比1:1000～1000:1共混，冷冻干燥，得明胶微凝胶颗粒冻干粉末Ⅲ；
(5)明胶微凝胶颗粒冻干粉末I、明胶微凝胶颗粒冻干粉末II或明胶微凝胶颗粒冻干粉末Ⅲ分别与水性溶液共混，搅拌混合，得可注射型自愈合胶体凝胶；
其中，所述的带正电荷的有机高分子颗粒的表面电荷为+5～+60mV，带负电荷的有机高分子颗粒的表面电荷为-5～-60mV；所述有机高分子颗粒的直径为20nm～500μm，优选20nm～50μm。
本发明上述可注射型自愈合胶体凝胶的制备方法中，将步骤(1)制备得到的明胶微凝胶颗粒，冷冻干燥得到的明胶微凝胶颗粒冻干粉末与水性溶液共混，也可以得到本发明所述的可注射型自愈合胶体凝胶，但其性能差于本发明中其他方法制备得到的可注射型自愈合胶体凝胶。
本发明上述可注射型自愈合胶体凝胶的制备方法中，在步骤(1)中，根据调整明胶水溶液的浓度、极性有机溶剂的加入量、交联反应时间等，可以制备得到带有不同zeta电势和直径大小的明胶微凝胶颗粒。本发明上述技术方案中，明胶水溶液浓度优选为0.1～20w/v％，更优选为2.5～10w/v％；极性有机溶剂的加入量优选为明胶水溶液的>2倍，更优选为3～6倍。明胶微凝胶颗粒的尺寸优选为20nm～5μm，更优选为100nm～2000nm。
本发明上述可注射型自愈合胶体凝胶的制备方法中，步骤(2)、(3)和(4)中，明胶微凝胶颗粒的分散液和各有机高分子颗粒分散液中的颗粒数的比例影响所制备胶体凝胶的弹性模量和自修复效率，本发明中两种分散液中颗粒数的比例优选为1:10～10:1，更优选为1:5～5:1，共混的两种颗粒直径比为1:5～5:1时，可得到具有更高弹性模量和自修复效率的可注射型自愈合凝胶，若直径的差异过大，则所得到的胶体凝胶弹性模量下降，自修复效率降低。
进一步地，在上述技术方案中，所述的带正电荷的有机高分子颗粒分散液以壳聚糖、A型明胶、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯亚胺中的一种或几种作为原料制备得到，所述的带负电荷的有机高分子颗粒分散液以透明质酸、海藻酸、A型明胶、B型明胶或聚丙烯酸中的一种或几种作为原料制备得到，所述的表面zeta电势在-10～+10mV的有机高分子颗粒分散液以胶原蛋白、白蛋白、明胶中的一种或几种作为原料制备得到。所述带正电荷的高分子颗粒分散液、带负电荷的高分子颗粒分散液或表面zeta电势在-10～+10mV的高分子颗粒分散液，本领域技术人员可以根据高分子颗粒的常规制备技术来制备得到，在本申请中不再详细陈述。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合；所述的交联剂为戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亚胺、二卤代烷、异氰酸酯、二异氰酸酯、谷氨酰胺转胺酶、京尼平中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的交联反应的反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比>0.1；优选0.5～5。交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比影响所形成的明胶微凝胶颗粒的交联度，交联度过高明胶微流强度更高、表面电荷更倾向于带负电，交联度过低明胶微球强度低、表面电荷取决于明胶原料的等电点，本发明优选的技术方案中交联度较低时较为好，优选的，本发明中所述交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比要控制在0.5～5。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(2)和步骤(3)中所述的酸性水溶液和碱性水溶液中所含有的离子浓度均小于200mM。所述的酸性水溶液和碱性水溶液中所含有的离子的种类不特别限定，可以采用本领域常规的用于调节酸性或碱性的试剂，如盐酸、硫酸、醋酸、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水、碳酸钠等。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(2)和步骤(3)中所述的pH调节剂包括酸性物质和碱性物质，所述酸性物质为葡萄糖酸内酯、HCl、HNO3、H2SO4中的一种或几种，所述碱性物质为尿素和脲酶的组合、或者氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(5)中制备得到的可注射型自愈合胶体凝胶中胶体颗粒占胶体凝胶总体积的百分比为2.5vol％～150vol％，优选50vol％～100vol％；胶体颗粒占凝胶总质量的百分比为2.5wt％-50wt％，优选10wt％～25wt％；相应的胶体凝胶储存(弹性)模量为1Pa～100kPa，优选1kPa～100kPa。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(5)中所述的水性溶液是任意离子浓度<1000mM、pH值为5～9的水溶液、亲水性高分子的水溶液、非水溶性的纳米颗粒分散液中的一种或几种的组合，优选离子浓度<150mM，pH值为7。
本发明还提供一种可注射型自愈合凝胶载体，该凝胶载体是将本发明所述的方法制备得到的明胶微凝胶颗粒冻干粉末I、明胶微凝胶颗粒冻干粉末II、明胶微凝胶颗粒冻干粉末Ⅲ或可注射型自愈合胶体凝胶与含有生物活性物质或活细胞的水性溶液按照一定比例共混而制备得到，所述的水性溶液的离子浓度优选100～200mM，pH值优选6.5～7.8。其中，所述的生物活性物质为天然药物成分、合成的化合物或蛋白类药物分子，所述的活细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种。含有活细胞的水性溶液中细胞的浓度优选为1～109个/mL，所述的蛋白类药物分子为骨形态发生蛋白、凝血VIII因子、成血管生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、血小板来源增殖因子、生长激素释放抑制因子、转化生长因子TGFα和TGFβ、神经生长因子、白细胞介素类生长因子、红细胞生长素、集落刺激因子中的一种或几种；成骨诱导因子，生长因子、蛋白药物的浓度在10ng/ml-1mg/ml范围。加载有生物活性物质的凝胶载体中，生物活性物质在高分子微凝胶胶体料在注射和固化过程无需引入化学交联反应，不同于化学高分子，也没有引入小分子交联剂，生物相容性好，可降解吸收，无毒副作用，安全性好，使其在生物医学领域的广泛应用成为可能。
2.与传统自愈合材料的区别
传统自愈合材料主要分为两类。一类是将包埋有交联剂或交联反应引发剂的微胶囊分散在水凝胶的连续相网络中，当材料发生破坏，微胶囊在剪切力作用下破裂而释放出交联剂而诱发进一步的交联或固化反应实现材料的自愈合；另一类是利用高分子间的物理相互作用构建的水凝胶材料，基于分子链间可逆的物理交联形成稳定的凝胶网络，当材料受力被破坏后分子链间相互作用断裂，但由于键合的可逆性，分子链间相互作用可以快速重建，实现材料的自愈合(CN201610538145.6)。
本发明的自愈合水凝胶是以微纳米尺寸的微凝胶胶体颗粒为基本单元，通过利用胶体颗粒表面形成可逆的静电作用和氢键作用，实现结构稳定的凝胶网络的制备，这样以胶体颗粒为基本单元构建的水凝胶体系成为胶体凝胶。这种胶体凝胶的自修复性能来源于微凝胶胶体颗粒间的可逆相互作用。当凝胶被剪切力破坏时，胶体颗粒间物理键合断裂，但随着外力取消后，胶体颗粒重新分布排列，胶体间键合重新形成，使水凝胶重新恢复其结构和力学强度，实现材料的自愈合。与传统自愈合水凝胶依托分子链间的可逆键合不同，自愈合胶体凝胶是依托凝胶颗粒间的可逆相互作用实现自修复。
3.在蛋白释放方面的优势
生物活性药物，例如蛋白类大分子药物的可控释放一直是生物医药领域的难题。尤其是在组织工程应用方面，生物活性分子，例如生长因子、激素等蛋白药物有着诱导细胞增殖、分化和进一步组织修复再生的功效。然而，这些生长因子类蛋白药物在体内易失活，并且生长因子诱导细胞和组织修复再生的作用是与药量和给药时间紧密相关的。生长因子的可控释放有利于组织修复再生，反之则会出现不可控的副作用，包括组织增生肥大、异位成骨、甚至发生肿瘤的风险。传统的组织工程技术通常利用预加工好的支架材料，通过蛋白药物在支架的表面物理吸附实现药物的加载，这种方式往往导致支架植入体内后，蛋白药物的暴释，不能实现长期的持续的释放。并且，由于蛋白药物的快速不可控释放，容易造成不可预期的负面效果。冻干溶胀过程中，在高渗透压纳米级的高分子网络中，缓慢释放，实现在植入部位中药物缓释，通过药物持续的作用，提高治疗效果。要加载活细胞时，将悬浮有活细胞的水性溶液按照适当的比例直接与本发明的可注射型自愈合凝胶生物材料的冻干粉混合，得到加载活细胞的凝胶载体，活细胞分布在胶体凝胶内部，胶体凝胶为细胞提供力学支撑和生长繁殖的空间。加载生物活性物质或活细胞的胶体凝胶可作为用于皮肤组织、骨软骨组织、牙周组织等组织缺损修复填充和治疗的可注射型组织工程支架材料、可植入填充材料来应用，也可以作为3D生物打印墨水来应用。
本发明还提供可用于多种不同药物有序释放的可注射型自愈合药物载体，具体为：将不同交联度的明胶微凝胶颗粒与不同蛋白药物分子共混，经冷冻干燥得到载有不同蛋白分子的微凝胶冻干粉末；再与水性溶液共混，并搅拌混合均匀，得到加载多种蛋白药物分子且可有序释放不同药物分子的、可注射型自愈合药物载体。
本发明的有益效果：
1.和传统可注射材料的区别和优势：
传统的可注射型水凝胶材料多数是基于高分子水凝胶的前驱体，在注射器中未发生聚合/交联反应，是具有良好流动性的液体，因此具有良好的可注射性，当水凝胶预聚体通过针管注射后，通过快速的化学交联/聚合反应实现预聚体水溶液的固化。例如专利CN105176080A报道了一种基于聚乙二醇水凝胶的可注射材料，是通过双键和胺基的迈克尔加成反应实现聚合物单体水溶液在注射后固化并形成水凝胶(CN201510452759.8)。这类由化学反应诱导水凝胶固化的反应在生物医学应用过程中由于难以避免引入化学交联剂或催化剂，因此容易造成细胞毒性问题，限制了其作为生物医用材料的应用。
而本发明的可注射凝胶使用带表面电荷的高分子微凝胶颗粒，通过颗粒间的静电相互作用自组装得到胶体凝胶材料。由于微凝胶之间的静电作用是物理交联且具有可逆性，因此当这种胶体凝胶受到破坏性的剪切力破坏时，微凝胶颗粒间的静电相互作用被外力破坏，胶体凝胶从具有刚性的固体材料向具有流动性的流体材料转变，这一过程被称为剪切变稀行为。当外力取消时，胶体间的相互作用快速恢复，胶体颗粒通过重新形成物理交联组装成胶体凝胶。因此本发明的胶体凝胶具有可注射性和自愈合性能。更重要的是，本发明的凝胶材
本发明的胶体凝胶材料对比与传统载体材料具有更多优势。1)凝胶由具有微纳米尺寸的微凝胶颗粒为基本单元，相比传统多孔支架材料具有更高比表面积，因此可表面吸附的蛋白量更高；2)生长因子的加载是将微凝胶颗粒的冻干粉直接与生长因子水溶液共混，在颗粒溶胀过程中蛋白分子在渗透压作用下进入微凝胶颗粒网络内部，因此蛋白的释放主要是由微凝胶的降解速率控制的；3)生长因子的释放速率主要由明胶微凝胶的降解速率调控，因此通过控制微凝胶的交联度可以实现对加载的生长因子的释放速率进行调控，进一步将不同的生长因子加载入不同交联度的胶体颗粒，可以实现多种生长因子的有序可控释放。
附图说明
图1为实施例1所述方法制备的A型明胶微凝胶颗粒的扫描电镜照片。
图2为实施例1所述方法制备的A型明胶微凝胶颗粒的激光粒度仪测试结果。
图3为实施例2所述方法制备的由带相反电荷的A型和B型明胶胶体颗粒组成的复合胶体凝胶的微观结构的扫描电镜照片。
图4为实施例2所述方法制备的由带相反电荷的A型和B型明胶胶体颗粒组成的复合胶体凝胶的自修复行为的流变学测试结果。
图5为实施例5中所述方法制备的可注射胶体凝胶实现生物活性蛋白药物的有序释放。
图6为实施例6所述方法制备的载骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的自愈合胶体凝胶作为可注射型凝胶用于骨缺损的填充修复；其中，右图①-④是动物实验手术过程制造的大鼠膝关节骨缺损，及使用本发明所述凝胶进行填充修复的过程。
图7为实施例6所述方法制备的载骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的自愈合胶体凝胶作为骨填充物用于大鼠膝关节骨缺损的修复填充，植入后4周骨再生的组织切片图。虚线区域为骨缺损的位置。A：空白对照组，即制造圆柱状缺损后不做任何处理；B：胶体凝胶组，即制造缺损后使用实施例5所述胶体凝胶进行填充；C：载BMP-2胶体凝胶组，即制造缺损后使用载生长因子BMP-2的胶体凝胶进行填充修复。
图8为实施例7所述的以明胶基胶体凝胶为3D打印墨水打印出的三维机构支架的照片；其中，A：打印出的三维机构支架整体图，B和C为三维支架的显微放大照片。
图9为实施例7所述的包埋有细胞的明胶基胶体凝胶的激光共聚焦显微图片；其中，A：细胞分布在胶体凝胶中，B：细胞在微凝胶中的三维分布图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
下面实施例中将胶体颗粒冷冻干燥后得各胶体颗粒的冻干粉末，其中所述冷冻干燥条件为：将胶体颗粒在-60℃、<300Pa下冷冻干燥2-3天。
实施例1
以A型明胶为原料，使其在去离子水中加热40℃溶解，配置浓度为5w/v％的明胶水溶液，调节明胶水溶液pH值为3，随后向溶液中加入3倍溶液体积的丙酮，生成明胶微凝胶颗粒的分散液；分别向分散液中加入不同量的25wt％戊二醛水溶液，使明胶微凝胶颗粒交联，加入戊二醛的量分别为每克明胶对应25wt％戊二醛66μL、132μL、264μL、538μL，交联反应时间12hr，随后加入甘氨酸中和未反应的醛基，离心清洗得到A型明胶微凝胶颗粒的分散液。
使用激光粒度仪对在使用不同交联剂用量制备的A型明胶颗粒进行颗粒尺寸分析，结果如表1所示。
表1.A型明胶颗粒尺寸和颗粒表面zeta电势随着戊二醛加入量的变化
Figure BDA0001293618900000081
图1为在上述方法中戊二醛加入量为264μL时的A型明胶微凝胶颗粒的扫描电镜照片，可见颗粒尺寸分别较均匀，70％以上的颗粒尺寸在200-400nm范围内，比使用激光粒度仪测试的颗粒尺寸小，这是因为冷冻干燥后明胶颗粒发生干燥收缩引起的。
图2为在上述方法中戊二醛加入量为264μL时的A型明胶微凝胶颗粒的激光粒度仪测试结果，可见这一制备参数得到的明胶胶体颗粒的平均粒径为376.9±6.5nm，且粒径分布窄。
实施例2
分别以A型明胶和B型明胶为原料，使其在去离子水中，在加热40℃下溶解，配置得到浓度为5w/v％的A型明胶水溶液和浓度为5w/v％的B型明胶水溶液，调节两种明胶水溶液pH值均为3，随后向溶液中各加入3倍体积的丙酮，生成A型明胶和B型明胶微凝胶颗粒悬浮液；分别向悬浮液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明胶微凝胶颗粒交联，加入戊二醛的量为每g明胶对应25wt％戊二醛66μL，交联反应时间12hr，随后加入甘氨酸中和未反应的醛基，离心清洗分别得到A型明胶颗粒分散液和B型明胶颗粒分散液。利用激光粒度仪测得制备微凝胶颗粒尺寸和zeta电势数据如表2所示。经冷冻干燥分别得到A型明胶颗粒的冻干粉末(标记为GelA)和B型明胶颗粒的冻干粉末(标记为GelB)。
表2.不同类型明胶颗粒的性能参数
Figure BDA0001293618900000091
将GelA和GelB分别分散在20mM的NaOH碱性水溶液中，分别得到分散有带正电荷的A型明胶微凝胶颗粒分散液和带负电荷的B型明胶微凝胶颗粒的分散液，按照A型明胶颗粒和B型明胶颗粒的颗粒数量比为1:1将所述两种明胶的分散液充分混合、搅拌，得分散有两种不同微凝胶颗粒的分散液；向分散液中加入100mM的盐酸调节pH值至7.0，搅拌混合，冷冻干燥，得到含有两种不同胶体颗粒的冻干粉末，标记为GelA+B。通过扫描电镜观察到胶体凝胶的微观网络结构如图3所示，胶体凝胶具有多孔网络结构，且凝胶网络由明胶微球组装堆积而成。
分别将GelA、GelB、和GelA+B胶体颗粒冻干粉末与不同体积的1mM的NaCl盐溶液共混，并快速搅拌混合均匀得到三种不同可注射型自愈合胶体凝胶，得到含不同微凝胶胶体颗粒体积分数的胶体凝胶。进一步通过流变仪对所得凝胶材料的弹性模量(表3)和剪切破坏后自愈合效率(表4)进行评价。
胶体凝胶的自修复行为是通过流变仪进行表征，具体测试方法如下。对胶体凝胶进行连续的流变测试：首先进行震荡时间扫描，对样品施加频率为1Hz和应变为0.5％的外力，测试样品的弹性模量(G’)和粘性模量(G”)，此时凝胶在低剪切力情况下表现出固体的刚性行为，因此弹性模量G’大于粘性模量G”且保持稳定。这一阶段的G’值即为样品的初始弹性模量。随后逐渐增加施加的应变从0.1％至1000％，此过程中通过施加外力将样品破坏，弹性模量G’逐渐降低，最终低于G”，即胶体体系从刚性固体向粘性流体发生转变，结构被破坏。随后立即取消外力作用，考察样品弹性模量的恢复情况。将外力释放后，样品恢复的弹性模量与其初始弹性模量的百分比(％)定量考察凝胶的自修复效率。
表3和表4显示，两种带相反电荷的胶体颗粒共混的胶体凝胶GelA+B的弹性模量最高，剪切破坏后5分钟内自愈合效率最高，弹性模量恢复率超过80％。并且这样自修复行为可以反复发生：在对样品施加多个循环的剪切破坏过程中，每次取消外力后，凝胶的弹性模量都会快速恢复，并恢复到初始弹性模量的80％以上(如图4所示)。
表3.实施例2中制备的不同胶体凝胶含有不同体积分数的微凝胶颗粒所得到凝胶材料的弹性模量G'
Figure BDA0001293618900000101
表4.实施例2中制备的不同胶体凝胶不同体积分数的微凝胶颗粒所得的凝胶材料的自修复效率
Figure BDA0001293618900000102
*注：自修复效率是采用1000％的应变持续你剪切凝胶材料60s后，检测应力释放后5min内的弹性模量恢复的百分比(％)。
实施例3
以A型明胶为原料，在加热40℃下溶解，配置得到浓度为5w/v％的A型明胶水溶液，调节pH值为11，随后向溶液中各加入3.5倍体积的乙醇，生成A型明胶微凝胶颗粒悬浮液；向悬浮液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明胶微凝胶颗粒交联，加入戊二醛的量为每g明胶对应25wt％戊二醛66μL，交联反应时间12hr，得到A型明胶微凝胶颗粒，颗粒尺寸和表面zeta点位参数如表5所示。
通过乳液法制备海藻酸微凝胶颗粒，具体制备方法如下：将1wt％的海藻酸钠的水溶液加入氯化钙水溶液中并持续高速搅拌(搅拌速度>5000rpm)，即得到海藻酸钙颗粒，颗粒尺寸和表面zeta点位参数如表5所示。将A型明胶和海藻酸钙微凝胶颗粒分别分散在10mM的醋酸酸性水溶液中，分别得到带正电荷的A型明胶微凝胶颗粒的分散液Ⅰ、带负电荷的海藻酸微凝胶颗粒的分散液Ⅱ，将分散液Ⅰ和分散液Ⅱ充分混合、搅拌，得分散液III，其中A型明胶和海藻酸微凝胶颗粒混合的颗粒数量比为2:1；向分散液III中加入100mM的氢氧化钠调节pH值至7.0，搅拌混合，冷冻干燥，得到混有两相不同胶体颗粒的冻干粉末。将上述微凝胶颗粒冻干粉末与一定体积的1mM的NaCl盐溶液共混，并快速搅拌混合均匀得到自愈合胶体凝胶，其中微凝胶胶体颗粒体积分数占胶体凝胶体积的50vol％或100vol％。使用流变仪对胶体凝胶的力学参数进行评价，结果如表6所示，带相反电荷的海藻酸钙和A型明胶胶体颗粒共混得到的胶体凝胶的弹性模量随着胶体颗粒体积分数的增加而增加，体积分数100vol％时，储存(弹性)模量G’超过12kPa。剪切破坏后5分钟内自愈合效率同样随着胶体颗粒体积分数的增加而增加，体积分数100vol％时，弹性模量G’自愈合效率超过80％。
将上述胶体凝胶利用成标准抗拉(GB/T 1040-1992)和抗压(GB/T 1041-1992)测试的标准样条，对凝胶剪切破坏自修复前后进行抗拉和抗压测试，结果如表7所示。
表5.实施例3中制备的A型明胶和海藻酸钙微凝胶的性能参数
Figure BDA0001293618900000111
表6.实施例3中制备的自愈合胶体凝胶在不同胶体体积分数情况下的力学强度(流变测试弹性模量G')和自愈合效率。
Figure BDA0001293618900000121
*注：自修复效率是采用1000％的应变持续你剪切凝胶材料60s后，检测应力释放后5min内的弹性模量恢复的百分比(％)。
表7.对实施例3中制备的自愈合胶体凝胶的剪切破坏前后凝胶自愈合行为的力学性能
Figure BDA0001293618900000122
表7中的自愈合前是指对凝胶剪切破坏之前；自愈合后是指对凝胶剪切破坏后愈合。
实施例4
以A型明胶为原料，在加热40℃下溶解，配置得到浓度为10w/v％的A型明胶水溶液，调节pH值为11，随后向溶液中各加入2倍体积的乙醇，生成A型明胶微凝胶颗粒悬浮液；向悬浮液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明胶微凝胶颗粒交联，加入戊二醛的量为每g明胶对应25wt％戊二醛264μL，交联反应时间12hr，反复离心并在去离子水中重悬，得到A型明胶微凝胶颗粒，颗粒尺寸和表面zeta点位参数如表8所示。
将聚乙二醇(PEG，分子量2kDa)溶于去离子水配置浓度为5w/v％PEG水溶液。将上述方法制备的A型明胶微凝胶颗粒分散得到的PEG水溶液中，进一步将PEG水溶液与A型明胶微凝胶分散液充分共混，搅拌，得分散液III，其中A型明胶微凝胶颗粒与PEG的质量比为1:2。随后将分散液III的pH值调节至7.0，然后冷冻干燥，得到A型明胶胶体颗粒和PEG的复合冻干粉末。将上述冻干粉末与一定体积的10mM的NaCl盐溶液共混，并快速搅拌混合均匀得到自愈合胶体凝胶，其中明胶微凝胶颗粒体积分数占自愈合凝胶体积分数为100vol％。使用流变仪对胶体凝胶的力学参数进行评价，结果如表9所示，当胶体凝胶中A型明胶胶体颗粒体积分数为100vol％时，储存(弹性)模量G’约19kPa。剪切破坏后5分钟内自愈合效率在胶体颗粒体积分数为100vol％时，弹性模量G’自愈合效率约为83％。
表8.实施例4中制备的A型明胶微凝胶颗粒的性能参数
Figure BDA0001293618900000131
表9.实施例4中制备的A型明胶微凝胶颗粒和PEG共混制备的自愈合凝胶的力学强度(流变测试弹性模量G')和自愈合效率。
Figure BDA0001293618900000132
*注：自修复效率是采用1000％的应变持续你剪切凝胶材料60s后，检测应力释放后5min内的弹性模量恢复的百分比(％)。
实施例5
以A型明胶为原料，通过实施例2所述反溶剂法制备A型明胶微凝胶颗粒，戊二醛交联浓度为每g明胶使用25wt％戊二醛的量为66μL，制备得到带正电荷的A型明胶微凝胶颗粒；以B型明胶为原料，通过实施例2所述的反溶剂法制备B型明胶微凝胶颗粒，其中戊二醛交联浓度为每g明胶使用25wt％戊二醛的量为264μL，制备得到带负电荷的B型明胶微凝胶颗粒，制备参数和所得微凝胶颗粒尺寸和zeta点位数据如表10。
表10.实施例5中制备的不同类型明胶微凝胶颗粒的性能参数
Figure BDA0001293618900000133
将A型明胶颗粒分散在含100ng/ml浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)的水溶液中，将B型明胶颗粒分散在含100ng/ml浓度的股形态发生蛋白-2(BMP-2)的水溶液中，分别得到载有bFGF的A型明胶颗粒和载有BMP-2的B型明胶微凝胶颗粒的分散液。将上述两种明胶颗粒分散液按照颗粒数比1:1充分混合，并冷冻干燥，得到载有不同生长因子的两种明胶颗粒冻干粉末。将上述微凝胶颗粒冻干粉末与一定体积的1mM的NaCl盐溶液共混，并快速搅拌混合均匀，得到载有不同生长因子的、可注射型自愈合胶体凝胶，其中微凝胶胶体颗粒体积分数占胶体凝胶体积的100vol％。两种不同的生长因子从胶体凝胶载体材料中体外释放动力学的释放曲线如图5所示，载有bFGF的A型明胶由于交联度低降解速率较快，因此bFGF释放速率较快，载有BMP-2的B型明胶由于交联度高降解速率慢，因此BMP-2释放速率较为缓慢；结果表明本发明所述的胶体凝胶可实现不同生长因子药物的有序释放。
实施例6动物实验
分别以A型明胶或B型明胶为原料，使其在去离子水中加热40℃溶解，配置浓度为5w/v％的A型明胶水溶液和B型明胶水溶液，调节明胶水溶液pH值为11，随后向溶液中加入4倍体积的丙酮，生成明胶微凝胶颗粒的分散液；分别向分散液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明胶微凝胶颗粒交联，加入戊二醛的量为每g明胶对应25wt％戊二醛132μL，交联反应时间12hr，随后加入赖氨酸中和未反应的醛基，离心清洗分别得到A型明胶和B型明胶微凝胶颗粒的分散液。将A型明胶和B型明胶微凝胶颗粒分别分散在20mM的盐酸水溶液中，分别得到分散有带正电荷的A型明胶微凝胶颗粒分散液和带负电荷的B型明胶微凝胶颗粒分散液，将两者充分混合、搅拌，得分散有两种不同微凝胶颗粒的分散液，其中A型明胶和B型明胶混合的颗粒数量比为1:1；向分散液中加入80mM的碳酸氢钠调节pH值至7.0，搅拌混合，冷冻干燥，得到含有两种不同胶体颗粒的冻干粉末。将上述胶体颗粒冻干粉末与一定体积的磷酸缓冲溶液PBS共混，并快速搅拌混合均匀得到可注射型自愈合胶体凝胶，凝胶中胶体颗粒占凝胶总体积的百分比为75vol％。
以大鼠膝关节5mm直径骨缺损为动物实验模型，通过手术将制备得到的所述可注射型自愈合胶体凝胶作为填充物，直接用于骨缺损的填充修复。动物实验过程如图6所示，通过动物实验证明本专利所述可注射型胶体凝胶可作为组织器官修复填充材料用于组织器官的修复再生。动物实验结果如图7所示。空白对照组是制造直径为5mm的圆柱状缺损后不做任何处理，4周后的缺损部位组织切片图，结果显示：由于制造的缺损是非极限缺损，动物自身的骨修复能力可以实现一定程度的骨修复，组织切片图显示骨组织有一定程度的修复。胶体凝胶组，即为制造缺损后，使用胶体凝胶进行填充修复，由于凝胶存在是骨组织自身的修复受到限制，因此缺损中心部位可见大量的纤维组织长入，4周后仍未实现骨缺损的修复重建。载BMP-2胶体凝胶组，即制造缺损后使用载生长因子BMP-2的胶体凝胶进行填充修复，由于胶体凝胶可实现生长因子的局部缓释，有骨诱导的作用，因此组织切片结果显示4周后骨缺损部位完全实现了骨修复。
实施例7作为3D打印生物墨水的应用
以A型明胶为原料，使其在去离子水中加热40℃溶解，配置浓度为5w/v％的明胶水溶液，调节明胶水溶液pH值为10，随后向溶液中加入3.5倍体积的异丙醇，生成明胶微凝胶颗粒的分散液；向分散液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明胶微凝胶颗粒交联，加入戊二醛的量为每g明胶对应25wt％戊二醛132μL，交联反应时间12hr，随后加入甘氨酸中和未反应的醛基，离心清洗，得到表面zeta电势为正的A型明胶微凝胶颗粒。同样方法，以B型明胶为原料制备得到表面zeta电势为负的B型明胶微凝胶颗粒。将A型明胶和B型明胶微凝胶颗粒分别分散在20mM的NaOH水溶液中，分别得到分散有带正电荷的A型明胶微凝胶颗粒和带负电荷的B型明胶微凝胶颗粒的分散液，将两者充分混合、搅拌，得分散有两种不同微凝胶颗粒的分散液，其中A型明胶和B型明胶混合的颗粒数量比为1:1；向分散液中加入100mM的盐酸调节pH值至7.0，搅拌混合，冷冻干燥，得到含有两种不同明胶胶体颗粒的冻干粉末。将上述混合物冻干粉末与磷酸缓冲液PBS共混，并快速搅拌混合均匀得到可注射型自愈合胶体凝胶。其中胶体凝胶中明胶胶体颗粒占凝胶总体积的百分比为100w/v％。
以上述方法制备的胶体凝胶作为细胞三维包埋和培养的支架材料，制备载细胞3D打印“生物墨水”。具体实施步骤如下：
(I)细胞培养：以NIH3T3(
Figure BDA0001293618900000151
CRL-1658TM)成纤维细胞培养为例，在增殖培养基(DMEM，含有10％的胎牛血清(FBS，Gibco)中，在37℃，95％相对湿度和5％CO2。细胞培养基每三天后更换。使用前，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，使用胰蛋白酶/EDTA溶液中分离(0.25％的胰蛋白酶/0.02％EDTA)5分钟，并悬浮于培养基中以备使用。
(II)载细胞胶体凝胶的制备：将分散有细胞的细胞悬液与上述胶体凝胶混合均匀，从而得到胶体颗粒体积分数为75％的载有活体细胞的复合胶体凝胶，凝胶中细胞浓度为5×105个/cm3。将上述制备的载细胞明胶基可注射凝胶使用挤注式生物3D打印机(沈阳尚贤OrganP 1800
Figure BDA0001293618900000161
)进行三维结构的打印，结果如图8所示。结果表明，本发明所述的自愈合胶体凝胶可作为3D生物打印的“墨水”材料，制备打印精度为500μm的三维机构支架。
通过使用死活荧光染色(LIVE/DEAD荧光染色)对凝胶材料的细胞毒性进行考察。为此，染色前用无菌PBS清洗30分钟，在室温下加入2mM钙黄绿素(绿色荧光标记活细胞)和4mM乙锭同型二聚体(红色荧光标记死细胞)，并使用共聚焦激光扫描显微镜检查。结果如图9所示，NIH/3T3成纤维细胞在明胶基胶体凝胶内部均匀分散，且荧光染色显示包埋细胞的存活率>90％，证实使用本发明所述胶体凝胶作为细胞外基质进行生物3D打印能保持细胞的生物活性和正常功能。

Claims (9)

1.一种由高分子微凝胶颗粒组成的、用于药物缓释的、可注射型自愈合胶体凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)以明胶为原料，使其在去离子水中加热溶解，配置浓度为2.5～10w/v％的明胶水溶液，调pH值为1-6或8-14，向溶液中加入>2倍体积的极性有机溶剂，生成明胶微凝胶颗粒分散液，加入交联剂交联反应1～12h，离心、清洗得到明胶微凝胶颗粒；
其中，所述明胶微凝胶颗粒的zeta电势为-30～+30mV，所述明胶微凝胶颗粒的直径为100nm～2000nm；
(2)将步骤(1)制备得到的表面zeta电势>+10mV的明胶微凝胶颗粒，分散在pH<5的酸性水溶液或pH>9的碱性水溶液中，得明胶微凝胶颗粒的分散液，再与带负电荷的有机高分子颗粒分散液按照颗粒数比1:5～5:1共混，共混的两种颗粒直径比为1:5～5:1，用pH调节剂调pH至7.0，冷冻干燥，得到明胶微凝胶颗粒冻干粉末I；
(3)将步骤(1)制备得到的表面zeta电势<-10mV的明胶微凝胶颗粒，分散在pH<5的酸性水溶液或pH>9的碱性水溶液中，得明胶微凝胶颗粒的分散液，再与带正电荷的有机高分子颗粒分散液按照颗粒数比1:5～5:1，混合，共混的两种颗粒直径比为1:5～5:1，用pH调节剂调pH至7.0，冷冻干燥，得到明胶微凝胶颗粒冻干粉末II；
(4)明胶微凝胶颗粒冻干粉末I或明胶微凝胶颗粒冻干粉末II分别与水性溶液共混，搅拌混合，得可注射型自愈合胶体凝胶；
其中，所述的带正电荷的有机高分子颗粒的表面电荷为+5～+60mV，带负电荷的有机高分子颗粒的表面电荷为-5～-60mV，所述有机高分子颗粒的直径为20nm～500μm；
所述的带正电荷的有机高分子颗粒分散液以壳聚糖、A型明胶、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯亚胺中的一种或几种作为原料制备得到，所述的带负电荷的有机高分子颗粒分散液以透明质酸、海藻酸、A型明胶、B型明胶或聚丙烯酸中的一种或几种作为原料制备得到；
在步骤(4)中制备得到的可注射型自愈合胶体凝胶中胶体颗粒占胶体凝胶总体积的百分比为100vol％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合；所述的交联剂为戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亚胺、二卤代烷、异氰酸酯、二异氰酸酯、谷氨酰胺转胺酶、京尼平中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的交联反应的反应体系中交联剂与明胶中氨基基团的摩尔比>0.1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(3)中所述的酸性水溶液和碱性水溶液中所含有的离子浓度均小于200mM。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(3)中所述的pH调节剂包括酸性物质和碱性物质，所述酸性物质为葡萄糖酸内酯、HCl、HNO3、H2SO4中的一种或几种，所述碱性物质为尿素和脲酶的组合、或者氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中所述的水性溶液是任意离子浓度<1000mM且pH值为5～9的水溶液、亲水性高分子的水溶液、非水溶性的纳米颗粒分散液中的一种或几种的组合。
7.一种可加载生物活性物质或活体细胞的、可注射型自愈合凝胶载体，其特征在于，将权利要求1中制备得到的明胶微凝胶颗粒冻干粉末I、明胶微凝胶颗粒冻干粉末Ⅱ或可注射型自愈合胶体凝胶与含有生物活性物质或活细胞的水性溶液共混而制备得到。
8.权利要求7所述的可加载生物活性物质或活体细胞的、可注射型自愈合凝胶载体作为可注射型组织工程支架材料或3D生物打印墨水的应用。
9.根据权利要求7所述的可加载生物活性物质或活体细胞的、可注射型自愈合凝胶载体，其特征在于，所述的水性溶液的离子浓度是100～200mM，pH值为6.5～7.8。
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