CN108367100B - 水凝胶的光活化制备 - Google Patents
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Abstract
一种制备水凝胶的方法，包括将聚合物溶液与光引发剂混合，其中所述聚合物包含各自具有非芳族不饱和官能团的多个亚单元，以及用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及通过使用可见光光引发使聚合物分子交联来制备水凝胶。特别地，本发明涉及通过将聚合物与光引发剂混合并用可见光照射混合物来制备水凝胶的方法。以这种方式生产的水凝胶具有多种用途，包括组织工程用途。
背景技术
关节软骨被发现存在于关节的表面，并起到促进载荷传递的作用。然而，诸如关节炎之类的慢性疾病导致软骨变性和侵蚀，导致运动不稳定并显著影响生活质量。最近的统计数据显示，美国有5250万成人患有关节炎，到2030年这一数字预计将增加到6700万。由于软骨是一种无血管组织，因此其内在愈合和修复能力有限。虽然自体软骨细胞植入和微骨折等疗法已在临床实施，但这些治疗只能缓解症状直至需要手术关节置换。因此，正在寻求修复或替换受损软骨的新策略。
近年来，将细胞、信号因子和支架组合的组织工程方法已经成为关节炎的有前景的治疗方法。这些支架大多为水凝胶，它们是高度水合的聚合物网络，并且之前已经显示与天然细胞外基质具有结构相似性。它们的高含水量使得营养物质和氧气良好地渗透和扩散到包封的细胞，而且使废物从细胞释放到环境中。这些水凝胶可由合成聚合物，如聚乙烯醇(PVA)、聚(乙二醇)(PEG)制成或由生物聚合物，如藻酸盐、透明质酸、胶原蛋白和明胶制成。在所有这些水凝胶中，明胶已经成为软骨修复的潜在材料。它是水溶性的，具有低免疫原性，但最重要的是，由于是胶原蛋白水解的产物，其还保留胶原蛋白中的许多天然分子表位，这对于细胞信号传导和维持软骨细胞表型很重要。
特别地，通过光聚合制备的明胶水凝胶特别有吸引力，因为聚合过程的空间和时间控制是可能的，并且该过程可以在室温或生理温度下进行，具有快速固化速率和最小的热量产生。该光聚合过程通常需要将明胶用官能部分如甲基丙烯酰基接枝。取决于甲基丙烯酰化程度和大分子单体浓度，可以调节明胶-甲基丙烯酰基(Gel-MA)水凝胶的物理性质(交联密度、溶胀和硬度)，这使得该材料成为各种组织工程应用的通用平台。迄今为止，用于交联Gel-MA的最常用的光引发剂是1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮，其也被称为Irgacure2959(I2959)。当暴露于紫外光(UV)时，I2959分子吸收光的光子并解离成自由基，然后自由基通过甲基丙烯酰基团传播，形成共价动力学链以将聚合物链保持在一起。
然而，使用该系统的一个主要缺点是I2959需要紫外光进行光激发，这可能会破坏细胞DNA。先前的研究已经表明，UVA(320-400nm)和UVB(290-320nm)照射均诱导哺乳动物细胞中的染色体以及基因组不稳定性。紫外光也会产生活性氧(ROS)，其可以导致DNA的氧化损伤。因此，使用对细胞光毒性较小的可见光(400-700nm)的光聚合系统更适合于组织工程应用。
已经研究了许多可见光引发系统，如樟脑醌、荧光素、核黄素和玫瑰红等，以制造载有细胞的水凝胶。然而，这些引发剂具有差的水溶性和有限的光反应性或细胞毒性。最近合成的光引发剂，苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)在405nm吸收，具有良好的光反应性和细胞相容性。但是，LAP需要复杂的合成路线，目前还未市售。相比之下，另一种由市售引发剂，基于钌(Ru)的过渡金属络合物和过硫酸钠(SPS)组成的新型可见光引发体系已显示出组织工程应用的潜力。这种Ru/SPS体系已被用于采用酚部分交联聚合物，其中所得水凝胶已被用作组织密封剂或基质以包封成纤维细胞和神经细胞。当用可见光照射时，Ru2+通过向SPS提供电子而光激发成Ru3+。光激发的Ru3+然后与聚合物上的酚基反应形成共价交联。接受电子后，SPS解离成硫酸根阴离子和硫酸根。这些硫酸根可以通过甲基丙烯酰基团增长，引起共价交联。然而，通过酚基交联的显著缺点是交联效率低。因此，产生足够交联所需的光能量可能非常高。此外，使用这种光引发/交联体系形成的水凝胶趋于具有有限的机械特性。由于物理化学性质差，它们通常不可以被调节用于不同的应用。
与许多水凝胶(包括Gel-MA水凝胶)的制备相关的一个问题是氧抑制的影响。在一些光聚合体系的情况下，例如使用紫外光(320-365nm)和光引发剂I2959时，任何存在的氧气都能够猝灭交联所需的自由基。这导致交联形成不完全或不充分，并因此导致构建体不能保持其形状。这对于使用水凝胶作为在计算机辅助生物制造技术中的生物墨水(bio-ink)来构建生物材料的三维结构或支架尤为重要。显示低水平氧抑制的水凝胶形成的水凝胶制备系统是有利的。
因此，本发明的一个目的是通过提供一种水凝胶或者至少提供已知水凝胶形成系统的有用替代物来克服或改善上述一个或多个缺点或问题，所述水凝胶可以通过使用可见光照射聚合物来制备。
发明内容
在本发明的第一方面中，提供了一种制备水凝胶的方法，包括以下步骤：
(i)将聚合物溶液与光引发剂混合，其中所述聚合物包含各自具有非芳族不饱和官能团的多个亚单元；以及
(ii)用可见光照射所述混合物以产生水凝胶。
在本发明的第二方面中，提供了根据本发明第一方面制备的水凝胶用于制造或修复人类或非人类动物中的组织(例如软骨)的用途。
在本发明的第三方面中，提供了根据本发明第一方面制备的水凝胶作为生物墨水或生物树脂的用途。
附图说明
图1显示使用在2D表面上培养的HAC评价光毒性(紫外光vs可见光(Vis))和自由基毒性(UV+I2959vs可见光+Ru/SPS)。
图2显示在第1天，第7天，第14天和第21天，在使用UV+I2959或Vis+Ru/SPS制造的Gel-MA水凝胶中包封的HAC的细胞存活率。*表示在各个时间点与UV+I2959相比的统计显著性(p<0.05)。
图3显示在第1天，第7天，第14天和第21天，在使用UV+I2959或Vis+Ru/SPS制造的Gel-MA水凝胶中包封的细胞的代谢活性。*表示与各个时间点与UV+I2959相比的统计显著性(p<0.05)。
图4显示在使用UV+I2959或Vis+Ru/SPS的Gel-MA水凝胶中包封的HAC的软骨形成分化：A)每个凝胶的DNA；B)每个凝胶保留的GAG；C)GAG/DNA和D)21天后载有细胞的Gel-MA水凝胶的组织学，番红-O染色指示GAG产生(红色)(比例尺＝100μm)。
图5显示Gel-MA和Gel-MA+胶原蛋白1大分子单体溶液的粘度vs剪切速率，温度在20℃保持恒定。
图6显示Gel-MA+胶原蛋白1水凝胶在不同引发剂浓度下的厚度变形。
图7显示Gel-MA+胶原蛋白1水凝胶在不同光强度下的厚度变形。
图8显示在不同引发剂浓度下在Gel-MA+胶原蛋白1凝胶中的MCF-7的细胞存活率。
图9显示在不同光强下在Gel-MA+胶原蛋白1凝胶中的MCF-7的细胞存活率。
图10显示在各种光强度下溶胀之前(t＝0)和溶胀后(t＝1)的3D打印的Gel-MA+胶原蛋白1水凝胶构建体(比例尺＝500μm)。
图11显示3D打印的载有细胞的Gel-MA+胶原蛋白1水凝胶构建体(比例尺＝500μm)。
图12显示使用光投射立体光刻制造的多孔层状PVA-MA水凝胶构建体(比例尺＝500μm)。
图13显示使用光投射立体光刻制造的多孔PVA-MA螺旋二十四面体水凝胶构建体(比例尺＝500μm)。
图14显示使用光投射立体光刻制造的不同的复合多孔PVA-MA水凝胶结构(比例尺＝500μm)。
图15显示使用DLP生物打印的水凝胶构建体：立方体(A-C)，金字塔(D-F)，锥体(G-I)，花状(J-K)，多孔晶格(L-N)，多孔螺旋二十四面体(O-Q)，织造垫(R-T)和链甲(chainmail)(U-W)。
图16显示使用光投射立体光刻打印的PVA-MA或PVA-MA+Gel-MA载有细胞的水凝胶构建体(比例尺＝100μm)。
图16显示使用微流体方法制造的Gel-MA载有细胞的水凝胶珠。
图17显示打印的水凝胶构建体中的细胞包封。14天后在成骨分化培养基中培养的打印的MSC的存活死亡图像：PVA-MA(A)，PVA-MA/Gel-MA(B)。7天后包封在PVA-MA(C)和PVA-MA/Gel-MA(D)中的MSC的碱性磷酸酶染色(红色)。7天后包封在PVA-MA(E)和PVA-MA/Gel-MA(F)中的MSC的茜素红染色(红色)。在软骨分化培养基中培养21天后，包封在PVA-MA(G)和PVA-MA/Gel-MA(H)中的CPC的阿尔新蓝(Alcian blue)染色(蓝色)。尽管打印时间长，但在打印的大型构建体中的细胞分布显示出均匀的细胞包封并且没有沉积(立方体50×50×50mm，打印时间＝1.5小时)：构建体的横截面图像，显示立方体的全部高度(J)。将细胞固定，并用乙锭同型二聚体染色，并将切片分成7个不同的区域(各为7.1mm高度)；相对于整个横截面中的总细胞量，每个区域中存在的细胞的百分比(K)。比例尺是200μm。
图18显示使用各种DTT浓度20wt％的Gel-AGE凝胶的质量损失和溶胀。
图19显示使用1/10Ru/SPS(mM/mM)和3分钟30mW/cm2可见光交联的20wt％的Gel-AGE凝胶的压缩模量。
图20显示使用DTT、PEGSH-4臂或PEGSH-8臂交联的20wt％的Gel-AGE凝胶的质量损失和溶胀比。硫醇的最终浓度保持在30mM。使用的光引发剂浓度为1/10Ru/SPS(mM/mM)和3分钟30mW/cm2的可见光。
图21显示在使用各种浓度的DTT培养7天后，包封在Gel-AGE水凝胶中的HAC的存活/死亡图像：A)30mM；B)60mM；C)120mM；D)240mM。比例尺＝100μm。
图22显示使用各种浓度的DTT包封在Gel-AGE水凝胶中的HAC的A)细胞存活率和B)代谢活性。
图23显示使用微流体方法制造的Gel-MA载有细胞的水凝胶珠。
图24显示在第0天，第7天和第12天测量的SKOV3、成纤维细胞和共培养微球的DNA含量的n倍变化(n＝3)。
图25显示暴露于药物4天后测量的SKOV3、成纤维细胞和共培养微球的阿霉素剂量依赖性DNA含量，以百分比对照表示。
图26显示肝素-MA在使用可见光系统制造的Gel-MA水凝胶圆盘或珠中的保留。
图27显示包封在纯的5wt％的Gel-MA水凝胶(A)或掺有0.5mg/ml MgCO3(B)或1.5mg/ml MgCO3(C)的5wt％的Gel-MA水凝胶中的MSC的存活/死亡图像。包封在具有和不具有MgCO3纳米颗粒的Gel-MA水凝胶中的MSC的细胞存活率(D)。
图28显示包封在具有或不具有MgCO3纳米颗粒的Gel-MA水凝胶中的MSC的组织学切片，用茜素红染色：A)对照-无纳米颗粒；B)0.5mg/ml MgCO3；C)1.5mg/ml MgCO3。红色表示矿化作为骨形成的量度。
图29显示了使用各种NOR:SH比率制造的Gel-NOR水凝胶的溶胶分数和质量溶胀比。照射条件保持在1/10(mM/mM)，30mW/cm2和3分钟。
图30显示了使用1:2NOR:SH比率和DTT制造的Gel-NOR水凝胶(2.5wt％，5wt％和10wt％)的溶胶分数和质量溶胀比。照射条件保持在1/10(mM/mM)，30mW/cm2和3分钟。
图31显示使用1:2NOR:SH比率制造的2.5wt％Gel-NOR水凝胶的溶胶分数和质量溶胀比。使用不同的硫醇化分子(DTT、PEG4SH和PEG8SH)作为交联剂。照射条件保持在1/10(mM/mM)，30mW/cm2和3分钟。
图32显示在用1:2NOR:SH(DTT)，1/10mM Ru/SPS，30mW/cm2交联3分钟的5wt％Gel-NOR水凝胶中的血管生成。样品培养14天。
具体实施方式
本发明大体涉及水凝胶的制备方法，其使用可见光而不是紫外光以引发聚合物链交联以形成水凝胶。因为紫外光对生物细胞有害，所以使用可见光制备水凝胶有利于应用，对于避免细胞损伤有益，甚至是至关重要的。这种应用包括动物(特别是人)组织工程程序(tissue engineering procedure)。聚合物链的交联是通过聚合物的不饱和官能团。重要的是，不饱和官能团是非芳族的。本发明人已经发现可以避免与具有芳族官能团(如酚基)的聚合物的交联相关的问题。发明人确定了非芳香族官能团，如甲基丙烯酰基，通过光引发以更高的效率交联并导致形成具有更理想的物理化学性质的水凝胶。这也使制造工艺条件得到更好的控制，从而提供专门用于特定用途或应用的水凝胶和生物墨水。
术语“凝胶”是指当处于稳态时不显示流动的大体上稀释的交联体系。
术语“水凝胶”是指包含亲水性聚合物链网络的凝胶。水凝胶是高度吸水的(它们可以含有90％以上的水)天然或合成的聚合物网络。
术语“聚合物”是指包含许多重复亚单元的合成或天然大分子。
术语“聚合物链”是指包含以链形式连接在一起的多个亚单元的聚合物的长度。
术语“明胶”是指通过胶原蛋白的部分水解产生的肽和蛋白质的任何混合物。胶原蛋白是动物(如牛、鸡、猪、马和鱼)的皮肤、骨骼和结缔组织的细胞外空间中的主要结构蛋白。
术语“肝素”是指糖胺聚糖家族的碳水化合物并且由可变的硫酸化的重复二糖单元组成。最常见的二糖单元由2-O-硫酸化的艾杜糖醛酸和6-O-硫酸化的，N-硫酸化的葡萄糖胺组成。
术语“光引发剂”是指当暴露于光时产生自由基的化合物或两种或更多种化合物的组合。
术语“官能团”是指分子内的一组原子或键，其负责该分子的化学反应。
术语“不饱和官能团”是指具有至少一个双键或三键的官能团。
术语“芳族”是指涉及或表示含有原子的平面不饱和环的有机化合物或官能团，所述平面不饱和环通过形成环原子之间的离域π电子的相互作用而变得稳定，如，苯及其衍生物。
术语“非芳族不饱和官能团”是指具有至少一个双键或三键并且不是芳族官能团的官能团。
术语“生物墨水”是指可以3D打印、3D绘图或制造成特定形状或构造，并且是细胞相容性的水凝胶。水凝胶可以或不可以掺入活细胞和/或生长因子。
术语“生物树脂”是指可以使用基于激光或光投射的光立体光刻或类似的光刻技术3D打印或制造成特定形状或构建体，并且是细胞相容性的水凝胶。水凝胶可以或不可以掺入活细胞和/或生长因子。
本发明的方法涉及水凝胶的制备，其包括以下步骤：
(i)将聚合物溶液与光引发剂混合，其中所述聚合物包含各自具有非芳族不饱和官能团的多个亚单元；以及
(ii)用可见光照射所述混合物以产生水凝胶。
在本发明的一些实施方案中，不饱和官能团包括双键。在其他实施方案中，不饱和官能团是三键。实例包括甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、降冰片烯、丙炔酸酯和烯丙基。
在本发明的一些实施方案中，所述水凝胶通过链增长聚合过程通过不饱和官能团的交联而形成。在其他实施方案中，所述水凝胶通过逐步增长聚合过程通过不饱和官能团的交联形成。所述逐步增长聚合过程优选包括一个聚合物链的一个或多个不饱和官能团与另一个聚合物链的硫醇化官能团之间的反应。
所述光引发剂可以是在用可见光照射时产生自由基物质以使聚合物链交联的任何合适的化合物或化合物的混合物。一种类型的光引发剂是钌(II)化合物和过硫酸钠、过硫酸铵或过硫酸钾的组合。钌(II)化合物的一个例子是三(2,2-联吡啶基)-二氯钌(II)六水合物。
在本发明的一些实施方案中，所述聚合物是合成聚合物。实例包括聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(pHEMA)、聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)(PTMC)、聚富马酸酯、聚(乳酸)(PLA)、聚己内酯(PCL)和聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)。
在其他实施方案中，所述聚合物是天然聚合物。实例包括藻酸盐、透明质酸、肝素、丝素蛋白、丝胶蛋白、甲基纤维素、结冷胶、硫酸软骨素、壳聚糖、纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和转化生长因子(TGF)。
在本发明的方法中使用的可见光可以具有适合于使聚合物交联的任何范围内的波长。优选的范围是400-450nm。
在本发明的某些实施方案中，所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚乙烯醇-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
用于制备明胶-甲基丙烯酰基水凝胶的一种方法包括以下步骤：
(i)将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii)将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii)用可见光照射混合物以产生水凝胶。
所使用的光的强度可以在10-100mW/cm2的范围内，例如10，20，30，40或50mW/cm2，优选30mW/cm2，或者在这个范围内的任何其他强度。
钌(II)化合物与过硫酸钠的比例可以是任何合适的比例(例如1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:11，1:12，1:13，1:14或1:15)，但优选为1:10。
光照时间可以是使聚合物交联的任何合适的时间。在本发明的一些实施方案中，照射时间为2-15分钟(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15分钟)。
在本发明的一些实施方案中，所述水凝胶包含包封的生物细胞和/或细胞球体。
在本发明的一些实施方案中，所述水凝胶包含一种或多种包封的生长因子，例如，VEGF、BMP2、EGF、BDNF或TGF-β。
在本发明的一些实施方案中，所述水凝胶包含纳米颗粒，例如包含镁或锶化合物的纳米颗粒。
在本发明的一些实施方案中，与使用紫外光照射聚合物和光引发剂相比，在照射步骤中减轻氧对水凝胶形成的抑制。
根据本发明制备的水凝胶可用于各种应用，包括但不限于人或非人动物中的组织(例如软骨)的制造或修复，以及用作生物墨水或生物树脂用于生物构建体的三维生物制造或三维生物打印。所述生物构建体可以是能够使用生物制造或生物打印技术制造的任何动物组织或器官，或其部分，例如，含有细胞的支架，其可以是多孔的或无孔的。
下面参照明胶-甲基丙烯酰基(Gel-MA)水凝胶详细描述本发明，但应理解，各种类似的水凝胶将以相同或类似的方式起作用。
实施例1描述了如何制备Gel-MA水凝胶。实施例2至8将可见光系统与紫外光聚合系统进行比较。首先使用由在组织培养塑料(TCP)上培养的人关节软骨细胞(HAC)构成的2D模型，将可见光系统的光毒性和自由基毒性与常规UV+I2959系统的光毒性和自由基毒性进行比较。如图1所示，对于TCP对照，从第1天(50个HAC/mm2)到第7天(400个HAC/mm2)观察到显著的细胞增殖。然而，将这些细胞暴露于的紫外光15分钟细胞生长受到显著干扰，其中在第7天后仅获得80个HAC/mm2。另一方面，用可见光照射细胞15分钟不影响细胞生长，其中第7天附着细胞的总数与TCP对照没有显著差异。这个结果表明紫外光对细胞更具有光毒性，这与之前的研究一致。在引入引发剂的两个系统后，观察到细胞增殖显著减少。由于在引发剂存在下用光照射细胞时会产生自由基，因此观察显示这些自由基对细胞具有细胞毒性，并且可能减少细胞增殖。然而，还观察到7天后Vis+Ru/SPS样品与UV+I2959样品(20HAC/mm2)相比具有显著更高数目的附着细胞(60HAC/mm2)，突出了可见光系统更好的细胞耐受性。
在处理后温育7天后，根据实施例5对样品进行存活-死亡染色。附着于表面的细胞的形态清楚地表明，对于TCP对照，细胞被拉长并保持纺锤体形状，这通常见于扩张中的软骨细胞。尽管用紫外光照射细胞显著减少了附着细胞的数目，但细长和纺锤形形态仍然存在。然而，当紫外光与引发剂I2959组合时，可以观察到形态变化，其中细胞变圆，表明细胞骨架受损。相比之下，TCP对照和用可见光照射的细胞之间没有观察到明显的差异。尽管在Vis+Ru/SPS样品中观察到细胞数目的显著减少，但细胞仍保持伸长和纺锤形。
由于目标是利用Gel-MA凝胶进行3D细胞递送，所以根据实施例4将HAC包封到Gel-MA水凝胶中。3周内进行存活-死亡分析以评价细胞的存活率。结果如图2所示。聚合后1天之后，可以看出Vis+Ru/SPS系统(90％)比UV+I2959系统(80％)具有显著更高的细胞存活率。使用UV+I2959系统包封的细胞显示存活率降低，其中在21天后仅70％保持存活。另一方面，Vis+Ru/SPS样品在整个21天内表现出超过80％的恒定存活率。这突出了可见光系统与UV交联系统相比较低的细胞毒性效应。
根据实施例4制备的样品的存活-死亡分析的图像显示，与Vis+Ru/SPS系统相比，使用UV+I2959系统制造的载有细胞的凝胶对于所有检查时间点具有更多的死亡细胞。这证实了在细胞存活率研究中获得的结果。在3D环境中，软骨细胞应呈现圆形形态作为其天然表型的指标。21天后，包封的细胞不仅分布均匀，而且保持圆形。
此外，根据实施例6检查样品的代谢活性，以评价包封细胞的功能。清楚地看到，与UV+I2959相比，Vis+Ru/SPS样品在第7天，第14天和第21天具有显著更高的代谢活性。结果显示在图3中。如包封后更高的代谢活性所表明的，该实施例显示使用可见光系统包封的细胞不仅具有更好的存活率，而且更具功能性。
根据实施例7考察包封后细胞的软骨形成分化以评价它们作为软骨工程凝胶的潜力。发现在培养21天后，就凝胶中DNA总量而言，UV+I2959和Vis+Ru/SPS样品之间没有显著差异(图4A)。然而，就组织形成而言，在第7天和第14天的时间点Vis+Ru/SPS样品中构建体中累积的GAG的总量显著更高(图4B)。在第21天时，尽管Vis+Ru/SPS样品(0.15μg/mg)中的GAG/凝胶略高于UV+I2959(0.1μg/mg)，但这两种样品之间没有显著差异。尽管如此，这种现象表明可见光系统支持更快的组织形成速率。根据实施例8制备的组织学图像显示分泌的GAG沉积在细胞周围区域中，其中可见光样品似乎具有较大的GAG沉积区域(图4D)。另一方面，在所有时间点都没有观察到由GAG/DNA给出的细胞分化能力的显著差异(图4C)。
基于在组织工程支架中结合细胞的组织工程和再生医学(TERM)策略作为替代或修复受损和死亡组织的潜在解决方案已被广泛研究。这些策略已被用于设计各种组织，如骨骼、皮肤或软骨。然而，TERM中的一个挑战是个性化需求，其中不同患者需要取决于靶组织缺陷的大小和形状的专用个性化工程组织。将新兴的生物制造技术与TERM相结合，从患者收集的三维数据逐层制造材料以设计患者特异的组织构建体是一个不断发展的领域。
利用计算机辅助能够精确控制细胞和生物材料的沉积的生物制造技术在制造复杂和有组织的设计构建体方面显示出巨大的前景。有几种不同类型的生物制造技术，例如激光辅助打印、喷墨打印、微阀打印和挤出打印。后两者通常在构建大型构建体方面更有前景且用于组织工程更具临床相关性。然而，这些技术需要专门的生物材料平台(生物墨水)，其通常具有特定的流变学特性，允许打印具有良好形状保真度的构建体，并且与细胞相容以支持细胞的存活和功能。由于水凝胶与天然细胞外基质的结构相似，其已经显示出作为生物墨水的前景。许多由聚(乙二醇)、聚(N-羟丙基-甲基丙烯酰胺乳酸盐)、藻酸盐、透明质酸、胶原蛋白或明胶制成的水凝胶已被用作生物墨水。
在所有不同的材料中，明胶水凝胶已显示出作为用于生物制造各种组织类型(如肝、皮肤、癌症模型和软骨)的生物墨水的潜力。明胶不仅是水溶性的，而且含有已知支持细胞粘附和增殖的各种肽序列，因此非常有利于组织工程方法。然而，明胶具有热响应流变性能，对于成功地挤出纤维以用于构建复杂和有组织的结构具有窄但确定的打印窗口。因此，需要改变明胶的流变行为以更好地控制其在生物制造应用中的可挤出性。本发明人已经发现可以将胶原蛋白1引入Gel-MA中以产生具有改善的流变行为的水凝胶。重要的是，发明人还发现生物制造的Gel-MA/胶原蛋白构建体的氧抑制效应最小。
实施例9描述了Gel-MA/胶原蛋白水凝胶的制备。流变学测量(实施例10)通过将温度保持在20℃同时剪切速率从1/s逐渐增加至1200/s来进行。与纯Gel-MA溶液相比，Gel-MA+胶原蛋白1大分子单体溶液具有显著更低的粘度。作为剪切速率函数的剪切应力曲线显示胶原蛋白1添加到Gel-MA将剪切应力的大小显著降低了至少一半。这表明Gel-MA+胶原蛋白1大分子单体溶液具有作为生物墨水的潜力，这是因为在打印过程中对细胞施加较低的剪切应力。
实施例11涉及Gel-MA/胶原蛋白水凝胶的氧抑制能力的研究。通过将Gel-MA+胶原蛋白1大分子单体溶液浇铸到圆盘模具中来制造水凝胶圆盘。然后在光引发剂和光源(3mW/cm2)存在下对构建体进行照射，其中构建体的表面暴露于氧气。通过测量平衡溶胀后凝胶构建体的厚度变形来评价氧抑制水平。据观察，对于紫外光和可见光系统，低的光引发剂浓度导致显著的厚度变形。本研究中使用的对照是在没有暴露于氧气的情况下制造的水凝胶圆盘。对照仅显示<10％的厚度变形。增加光引发剂浓度的确降低了两种体系中厚度变形，其中使用0.5wt％I2959和2/20Ru/SPS(mM)制备的样品显示出与对照相当的厚度变形。结果如图6所示。
使氧抑制最小化的另一种方法是通过增加光强度来增加总暴露剂量。所使用的光引发剂的浓度保持在最小值(对于紫外光和可见光系统分别为0.05wt％I2959和0.2/2Ru/SPS(mM))。发现紫外光和可见光系统的光强度从3mW/cm2增加到100mW/cm2成功地减少了氧抑制(图7)。即使在低强度下(3mW/cm2)，可见光系统也显示厚度减少(约30％)远低于UV系统(约55％)。
为了使用生物墨水制备载有细胞的构建体，重要的是要知道细胞是否可以在光聚合条件下存活。已知高浓度的光引发剂和光强度由于在聚合过程中产生有害的自由基和活性氧物质而通常是有毒的。将人乳腺癌(MCF-7)细胞包封到这些凝胶中，并在1天后评价它们的存活率(实施例12)。结果表明，当光强度在3mW/cm2保持恒定时，增加I2959浓度显著降低细胞存活率，其中0.5wt％I2959导致50％的细胞存活率。然而，令人惊讶的是，Ru/SPS浓度的增加没有显示出对细胞存活率的显著有害影响(图8)。
此外，实施例12显示，当I2959浓度在0.05wt％保持恒定时，细胞存活率随UV强度的增加而降低。这与文献报道的一致，即紫外光可以破坏细胞的DNA和染色体稳定性，在此过程中杀死它们。相反，如图9所示，即使在高光强度(100mW/cm2)下，可见光系统也显示出高的细胞存活率(约90％)。这进一步突出了可见光系统用于生物制造载有细胞的构建体的潜力。
实施例13描述了涉及3D生物制造的构建体的氧抑制实验。本发明人发现，在低紫外光(3mW/cm2)下，水凝胶构建体在平衡溶胀1天后完全降解，表明发生高水平的氧抑制并且凝胶不交联。将紫外光强度增加至30mW/cm2和50mW/cm2，1天后成功产生了具有良好结构完整性的构建体。相比之下，用3mW/cm2可见光照射的水凝胶构建体在1天后结构仍然完整。在更高的光强度下，还观察到可见光系统具有较低的纤维直径减小水平，进一步表明可见光系统具有较低水平的氧抑制，因此是用于3D生物制造的更合适的光聚合系统。实施例14显示使用这种可见光系统可以制造载有细胞的3D打印构建体。与使用紫外光系统相比，包封的细胞显示出高的存活率。
因此，发明人首次示出可以使用可见光引发的自由基聚合体系来制备Gel-MA水凝胶。照射条件被优化并确定为30mW/cm2的可见光强度，0.2/2Ru/SPS(mM)的引发剂浓度和至少3分钟的暴露时间。应该注意的是，Gel-MA所需的Ru/SPS浓度比已知的通过其酚部分交联其他聚合物的引发剂组合低10倍。不受理论束缚，Gel-MA和酚化聚合物之间的差异可能是由于不同官能团的反应性以及负责交联的不同引发剂组分的差异。在光聚合过程中，通过向SPS提供电子Ru2+被光激发成Ru3+。对于酚化聚合物体系，Ru3+负责交联成形。然而，在本发明的方法中，硫酸根(SPS解离的产物)负责与Gel-MA上的甲基丙烯酸酯基团反应以形成共价交联。本发明人还示出获得的最小溶胶分数(10-15％)和q(9-10)与使用UV+I2959系统制造的Gel-MA凝胶获得的值相当。这表明本发明的可见光系统能够制造具有类似于UV系统的良好物理机械性能的Gel-MA水凝胶。
在2D表面上使用HAC培养物来评价UV和可见光系统的光毒性。发现用UV照射细胞显著降低细胞增殖。这一结果与之前的研究结果一致，紫外光已被证明会导致细胞基因组不稳定。此外，紫外光能够与环境中的氧气反应，形成活性氧(ROS)，如超氧自由基(O2˙˙)、羟基自由基(OH˙)、单线态氧(1O2)和臭氧(O3)等可以氧化细胞的脂质双分子层。这种脂质过氧化可以会破坏细胞膜的完整性和通透性，从而导致组织降解酶的上调和毒性产物的产生。相反，可见光已被证明具有可忽略的光毒性，因此更具临床相关性。就自由基毒性而言，发现即使Vis+Ru/SPS系统也导致细胞增殖的显著减少。然而，UV+I2959系统对细胞具有更大的细胞毒性作用，甚至细胞形态受到影响。
对于两种系统，包封的细胞在1天后显示出良好的细胞存活率(约80％)。本发明人已经示出Vis+Ru/SPS系统在1天后产生具有90％存活率的载有细胞的水凝胶构建体，这显著高于先前的研究。应该注意的是，可见光交联凝胶中的细胞具有比UV凝胶显著更高的代谢活性。然而，软骨分化研究表明，尽管可见光系统中GAG积累速率更快，但细胞的再分化能力(GAG/DNA)没有显著差异。这可能是由于指示细胞再分化能力的驱动因素是提供的3D工程基质。由于UV和可见光系统都会产生具有相当的物理机械性能的Gel-MA凝胶，因此可以预期在这些凝胶中细胞功能和行为相似。
本发明的潜在益处在于，与使用紫外光制备水凝胶相比，使用可见光制备水凝胶的系统在体内可注射水凝胶应用的临床相关性和实用性及微创手术方面是显著有利的。本发明的这种可见光+Ru/SPS系统用于制备明胶或Gel-MA凝胶的潜力不仅用于软骨工程，还用于其他组织工程应用，包括组织胶或密封剂，以及涉及生物墨水的使用和这种生物墨水的3D生物制造或生物打印的那些应用。
使用光投射立体光刻或类似的3D打印或光刻技术利用可见光或激光使包封或不包封细胞的生物树脂固化或聚合，将可见光+Ru/SPS系统与生物树脂结合来制造复杂的水凝胶构建体。图11显示可以使用常规立体光刻机器打印多孔和层状PVA-MA水凝胶构建体。也可以制造复杂的设计，如多孔螺旋二十四面体结构，最终产品与设计的构建体相同(图12)。如图13-15所示，使用立体光刻的另一个主要优势是高分辨率，其中可以设计具有详细拓扑结构的织造垫结构。
PVA-MA是一种细胞相容性，水溶性大分子单体，没有批次间变化，其中所得水凝胶提供可调节的物理机械性能。图15A显示试图通过将每一层暴露于的1mW/cm2光10秒(照射剂量为10mJ/cm2)由10wt％PVA-MA和0.2/2mM Ru/SPS的“生物树脂”打印简单的立方体设计，步长(step size)为50μm。观察到使用市售的数字光处理(DLP)设备可以由该树脂组合物成功制造水凝胶构建体(图15B)。从所测试的低照射剂量形成水凝胶的能力还突出了Ru/SPS光引发剂相比于其他光引发体系如I2959的高反应性。将低浓度的染料/光吸收剂(例如1wt％的丽春红4R)作为第三组分添加到“生物树脂”中，成功地使光散射最小化并产生如设计尺寸的构建体(图15C)。
具有金字塔形状(图15D-15F)和锥形(图15G-15I)的固体水凝胶构建体也成功地使用这种树脂组合物打印，其中50μm的体素(voxel)/步长(step size)清晰可见。花状结构(图15J和15K)证明了在一个印刷品中制造通道范围从50μm到500μm的水凝胶的可能性。还制造了多孔构建体，例如图15L所示的格子结构，其打印有自支撑和互连孔。在这种结构中，产生的支柱直径为100μm，支柱之间的距离为500μm(图15M和15N)。当复杂的设计是由生物制造的时候，进一步突出DLP的分辨率，例如特征为孔径(500μm)的高度弯曲的表面和高孔隙率(图15P和15Q)的螺旋二十四面体(图15O)。开发载有细胞的水凝胶构建体时，观察到的孔隙率和互联网络对于营养物扩散以及新组织的整合和形成是必不可少的。此外，使用这种DLP技术也可以打印无法通过任何其他添加制造技术(additive manufacturingtechnique)获得的复杂设计。实例包括织造垫(图15R-15T)和链甲(ring mail)(图15U-15W)，它们由复杂交织的支柱组成。特别是在织造垫结构(图15S)中，在支柱上沿z方向可见30μm的阶梯(step)，对应于每个打印层的高度，并且进一步表现出使用DLP可以实现的高分辨率。该观察表明使用开发的“生物树脂”和DLP来设计具有高度定义的表面拓扑的水凝胶构建体的可能性。
还显示可以使用这种方法制备载有细胞的构建体，其中普通的PVA-MA生物树脂产生约87％的细胞存活率。PVA-MA是一种合成聚合物并缺乏细胞信号传导和功能的生物识别位点。因此，已知支持细胞粘附、生长和增殖的Gel-MA与PVA-MA共聚以赋予生成的生物合成水凝胶生物功能性。显示细胞存活率进一步改善(实施例17)，其中将1wt％Gel-MA掺入PVA-MA生物树脂中成功地将细胞存活率提高至约92％(图16)。
进行溶胶-凝胶分析以评价使用DLP打印的PVA-MA和PVA-MA/Gel-MA水凝胶圆盘的物理机械性能。发现在溶胶分数(约25％)、质量溶胀比(q约9)、网目尺寸(约
)和交联密度(约1.3mol/L)方面有Gel-MA或没有Gel-MA的样品之间无显著差异。此外，评价PVA-MA/Gel-MA水凝胶的压缩模量为63.2±9kPa，明显高于纯的PVA-MA凝胶(45.9±6kPa，p<0.001)。
进行细胞包封研究，其中将骨髓衍生的间充质基质细胞(MSC)掺入生物树脂和打印的载有细胞的水凝胶构建体中。观察到具有或不具有Gel-MA的生物树脂制剂对MSC没有细胞毒性，其中打印后1天包封在构建体中的细胞的存活率大于85％(图17A和17B)。然而，发现Gel-MA的存在对于支持包封细胞的长期存活是至关重要的。在纯的PVA-MA凝胶中，MSC的存活率显示从87±3％(第1天)降低到71±7％(第14天)，而包封在PVA-MA/Gel-MA样品中的细胞的存活率在培养14天后保持在92±3％。尽管如此，两种样品都能够支持包封的MSC的成骨分化，如分别在成骨分化培养基中培养7天和21天后由碱性磷酸酶(图17C和17D)和茜素红(图17E和17F)的阳性染色所反映的。
为了测试生物树脂用于其他组织工程应用的潜力，使用DLP将马软骨原代细胞(CPC)也包封在这些凝胶中，并在软骨形成培养基中进一步培养。如培养21天后硫酸化糖胺聚糖的阳性染色所示，CPC能够在水凝胶内产生细胞外基质。这些结果突出了使用开发的生物树脂制造的载有细胞的水凝胶构建体以用于骨和软骨工程的潜力。此外，考察了在打印的水凝胶构建体内的细胞分布。发现细胞均匀分布在整个打印的水凝胶构建体中。图17J显示了50mm厚的水凝胶构建体的横截面，其中每个区域(I-VII)中从顶部到底部存在的细胞百分比保持恒定。
申请人已经证明，由PVA-MA、Gel-MA和Ru/SPS组成的生物树脂与DLP技术兼容用来制造具有比现有3D打印技术更高分辨率的构建体。水凝胶也能够支持细胞的长期存活以及促进细胞分化。这种新型生物树脂系统使得可以用相对较软的水凝胶制造复杂的几何形状，而这些用其他技术无法获得。这种方法对于再生医学、体外组织和疾病模型、芯片上的器官装置和微流体学的新型和先进材料平台的产生也具有潜在的影响。
研究了烯丙基化明胶(Gel-AGE)水凝胶作为Gel-MA水凝胶的替代物。Gel-AGE凝胶可以使用可见光+Ru/SPS系统，使用线性硫醇化分子—二硫苏糖醇(DTT)作为交联剂来制备。所得水凝胶的物理化学性质可以根据添加的DTT的浓度来调整。凝胶具有<20％的质量损失，表明良好的交联效率(图18A)。增加DTT浓度导致质量损失减少，表明较高浓度的交联剂导致较高的交联密度，由此具有较好的交联效率。质量溶胀比值也反映相同的现象，其中DTT浓度增加导致较低的溶胀(图18B)。DTT浓度越高，交联密度也越高，形成更紧密的网络，因此限制了吸入水凝胶中的水量。这些结果显示了Gel-AGE平台的可调节性，其中可以通过改变交联剂浓度来调整凝胶的物理化学性质以匹配期望的目标组织。质量损失和溶胀值从第1天到第7天也有变化。
通过改变DTT的浓度，所得到的水凝胶也具有不同的机械性能。图19显示Gel-AGE凝胶的压缩模量随着DTT浓度的增加而增加。该结果与从质量损失和溶胀研究获得的结果一致，其中产生的凝胶的DTT浓度越高或溶胶分数越低，则质量溶胀比越高，这表明形成了较高的交联网络。这种高交联密度代表了观察到的高压缩模量。
也可根据硫醇化分子的化学结构调整Gel-AGE凝胶的物理机械性能(图20)。使用三种不同硫醇化分子(DTT、PEGSH-4臂和PEGSH-8臂)对Gel-AGE凝胶的质量损失和溶胀性质的作用进行了比较。正如预期的那样，线性硫醇化分子(DTT，MW＝154.23Da)形成的凝胶与硫醇化PEG(MW10kDa的4臂和8臂)相比具有更高的溶胶分数和质量溶胀比。使用较大的硫醇化分子提高了接枝到明胶上的AGE基团的可及性，使AGE和硫醇基团之间更容易逐步增长聚合。
将HAC包封入Gel-AGE水凝胶中并评价存活率以及代谢活性。存活/死亡图像显示培养7天后所有样品中HAC的存活率都很高(图21)。增加DTT浓度导致存活率下降(图22)。这一结果并不出人意料，因为已知DTT是一种有效的还原剂，并能够减少细胞膜脂质双分子层，导致细胞死亡。显示从培养的1天至7天细胞的总代谢活性增加，表明细胞能够在Gel-AGE凝胶中增殖(图21B)。再次，增加DTT浓度导致代谢活性降低，这与细胞存活率研究一致。通过将细胞包封研究与质量损失和溶胀研究相关联，发现120mM的DTT是制造凝胶及最低质量损失同时仍保留最大的细胞存活率的最佳条件。
也可运用微流体方法使用可见光+Ru/SPS系统制造水凝胶珠或连续水凝胶纤维。细胞也可被包封在水凝胶珠或纤维中并含有单个或多个细胞类型(即共培养)。实施例23显示人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)可以被成功地包封到Gel-MA水凝胶珠中并显示出高存活率(图23)。本领域技术人员将理解，其他类型的细胞(例如软骨细胞和间充质干细胞)或细胞的共培养物也可以以类似的方式包封在水凝胶珠中。这些珠或纤维也可以组装成其他3D打印构建体，以形成用于3D癌症药物筛选或组织工程应用的宏观组织。预计微流体方法可在组织工程应用中用于制造包封有细胞及治疗剂(例如蛋白质、生长因子或药物)的单层或多层水凝胶珠以控制治疗剂的释放速率。
也可将其他生物分子掺入到Gel-MA水凝胶中作为指导特定细胞信号传导的措施以用于某些应用。作为天然存在于天然软骨细胞外基质中的硫酸肝素的类似物，已掺入肝素以进一步增强Gel-MA水凝胶的软骨形成能力。实施例29显示Hep-MA共价结合到制作成浇铸的盘或珠(使用微流体)的Gel-MA水凝胶中。使用这两种技术制造的Gel-MA/Hep-MA凝胶中Hep-MA的保留较高。
也可将纳米粒子掺入到Gel-MA水凝胶中，用于机械强化或用于增加生物功能性。例如，已知镁离子刺激骨骼生长。因此，可将基于镁的纳米粒-碳酸镁(MgCO3)掺入到Gel-MA水凝胶中，并且研究了这些混合凝胶刺激人类MSC的成骨分化的能力。结果表明，加入MgCO3纳米颗粒未对细胞造成任何不利影响(图27存活/死亡-高存活率)，其中，包封的MSC能够在水凝胶基质内矿物化(mineralise)(图28茜素红染色)。
本发明人测试了使用可见光系统的另一种类型的不饱和酯基团(降冰片烯-二环[2.2.1]庚-2-烯)，并表明，再次形成的凝胶具有可调节的物理化学性质，在用于3D生物打印和组织工程应用中，特别是骨预血管化(prevascularisation)应用中，具有很好的潜力。实施例32的结果是可见光引发剂与巯基-降冰片烯逐步增长聚合相容。还观察到质量溶胀比随着溶胶分数值的降低而降低。实施例33显示明胶-降冰片烯水凝胶可用于软组织工程，例如骨支架的预血管化。
在本说明书中对现有技术文献的任何提及都不被认为是承认这种现有技术已公知或者形成本领域中的一般常识的一部分。
如在本说明书中所使用的，词语“包括”、“包含”以及类似词语不应被解释为排他性或穷举性含义。换句话说，它们旨在表示“包括但不限于”。
参考以下实施例进一步描述本发明。可以理解的是，所要求保护的本发明并不意图以任何方式受这些实施例的限制。
实施例
材料和方法
明胶(猪皮，A型，300g勃鲁姆强度)、聚乙烯醇(13-23kDa、98％水解)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、甲基丙烯酸酐、纤维素透析膜(10kDa分子量截留值)、II型胶原蛋白酶、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、三(2,2-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物(Ru)、过硫酸钠(SPS)、钙黄绿素-AM、碘化丙啶(PI)、蛋白酶K、二甲基亚甲蓝(DMMB)、番红-O、硫酸软骨素A(CS-A)和L-脯氨酸购自Sigma-Aldrich。杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)高葡萄糖、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸(HEPES)、胎牛血清(FCS)、0.25％胰蛋白酶/EDTA和青霉素-链霉素(PS)购自Invitrogen。医用级硅胶片从BioPlexus获得。细胞过滤器(100μm)购自BD Biosciences。阿尔玛蓝
试剂购自LifeTechnologies。
细胞增殖分析试剂盒购自ThermoScientific。吉尔的苏木精溶液(Gill’s hematoxylin solution)从Merck Millipore获得。最佳切割温度复合物(OCT)获自VWR International。
实施例1：明胶-甲基丙烯酰基(Gel-MA)水凝胶的合成
明胶以10wt％的浓度溶解在PBS中。在明胶溶液中加入0.6g甲基丙烯酸酐/g明胶，在50℃恒速搅拌下反应1h，然后用去离子水透析除去未反应的甲基丙烯酸酐。纯化的明胶-甲基丙烯酰基溶液通过0.22μm无菌过滤器过滤，然后在无菌条件下冻干。使用1H-质子核磁共振(Bruker Avance 400MHz)将甲基丙烯酸化程度定量为60％。
在37℃下将无菌干燥的Gel-MA溶解于PBS中并在室温放置过夜。在交联之前，将Ru和SPS加入到Gel-MA溶液中，舀入在载玻片上的硅模具(直径5mm×厚度1mm)并夹住盖玻片。然后用可见光(
S1500，Excelitas Technologies)照射样品。用仅允许波长400-450nm的光通过的滤光器(Rosco IR/UV滤光器)照射光。研究各种引发剂浓度(0.1/1，0.2/2和0.3/3的Ru/SPS(mM))，光强度(10，20和30mW/cm2)和曝光时间(0.5，1，3，5，10和15分钟)以优化照射条件。发现最佳条件为：30mW/cm2的可见光强度，0.2/2Ru/SPS(mM)的引发剂浓度以及至少3分钟的暴露时间。
实施例2：软骨切除，软骨细胞分离和扩增
经同意28岁女性患者的道德批准后，收集关节软骨活检组织。将软骨切成1-2mm的立方体，并于37℃在基础软骨细胞培养基(补充有10％FCS、10mM HEPES、0.2mM L-抗坏血酸-2-磷酸、0.4mM L-脯氨酸和1％PS的DMEM高葡萄糖培养基)中用0.15％w/v胶原蛋白酶II型消化过夜。将得到的悬浮液通过100μm细胞过滤器(BD Biosciences)过滤以去除未消化的组织并以700g离心4分钟。将分离的软骨细胞(HAC)在37℃下，在潮湿的5％CO2/95％空气培养箱中在碱性软骨细胞培养基中培养并扩增。
实施例3：光毒性和自由基毒性评价
使用来自实施例2的扩增的HAC来评价实施例1的可见光引发的自由基聚合体系的毒性。将培养瓶中的HAC用胰蛋白酶消化，悬浮于碱性软骨细胞培养基中，并以50HAC/mm2的浓度接种于48孔板中。首先使细胞附着于表面4小时，然后分别暴露于的30mW/cm2的UV或可见光(15分钟)，其中有或没有0.05wt％的I2959或0.2/2Ru/SPS(mM)。然后将样品在37℃的潮湿5％CO2/95％空气培养箱中温育，3天后补充新鲜培养基。第1天和第7天后，使用存活/死亡分析使细胞显现并定量。使用ImageJ(版本1.46，美国国立卫生研究院)计数细胞。结果如图1所示。
实施例4：Gel-MA水凝胶中的HAC包封
将来自实施例2的扩增的HAC用胰蛋白酶消化并悬浮于基础软骨细胞培养基中。将细胞悬浮液加入含有引发剂的大分子单体溶液中，得到2.5×106HAC/ml的终浓度。然后根据实施例1制造载有细胞的凝胶。照射条件为15分钟的光(对于UV和可见光均为30mW/cm2)，其中对于所述光源引发剂浓度分别保持在0.05wt％的I2959或0.2/2Ru/SPS(mM)。在培养第1天，第7天，第14天和第21天后对样品进行存活/死亡、阿尔玛蓝(AlamarBlue)、糖胺聚糖(GAG)和DNA分析。结果如图2所示。
实施例5：存活/死亡分析
首先用PBS洗涤来自实施例4的Gel-MA水凝胶样品，然后用1μg/ml的钙黄绿素-AM和PI染色10分钟。如果细胞存活，则会染成绿色，如果死亡则会染成红色。染色后，将凝胶用PBS洗涤三次，然后使用荧光显微镜(Zeiss axioimager Z1)成像。使用ImageJ软件对细胞进行定量，并使用以下公式计算细胞存活率：
存活/死亡分析结果如图2所示。
实施例6：阿尔玛蓝分析
根据制造商的方案进行阿尔玛蓝分析。将来自实施例4的Gel-MA水凝胶样品在含有10％(v/v)
试剂的碱性软骨细胞培养基中温育24小时。对于保持代谢活性的细胞，阿尔玛蓝试剂从蓝色还原成红色/粉色。在使用600nm作为参比波长(FluostarGalaxy BMG Labtechnology)测量570nm处的吸光度之后，使用制造商提供的公式计算阿尔玛蓝试剂的还原。结果如图3所示。
实施例7：糖胺聚糖(GAG)和DNA分析
将载有细胞的Gel-MA样品在56℃下在200μL的1mg/ml蛋白酶K溶液中消化过夜。为了定量保留在凝胶中的GAG的量，使消化的样品与DMMB反应。然后在492nm测量样品的吸光度(Fluostar Galaxy BMG Labtechnology)。从使用已知浓度的CS-A构建的标准曲线计算GAG浓度。使用CyQUANT试剂盒测量凝胶中DNA的量。首先裂解消化的样品中的细胞，并使用提供的添加有RNase A(1.35KU/ml)的裂解缓冲液在室温下使RNA降解1小时。然后将GR-染料溶液加入到样品中，在室温下温育15分钟，然后测量荧光(Fluostar Galaxy BMGLabtechnology)。使用试剂盒中提供的DNA构建标准曲线。结果如图4A、4B和4C中所示。
实施例8：组织学检查
载有细胞的构建体在10％福尔马林中固定1小时，然后包埋在OCT中。将样品进行冷冻切片(每片10um)，然后细胞用苏木精染色，糖胺聚糖用番红-O染色。结果如图4D所示。
实施例9：Gel-MA/胶原蛋白水凝胶的制备
将无菌干燥的Gel-MA以20wt％的浓度溶解于无菌PBS中。将胶原蛋白溶液(1.7wt％)以1:1的比例加入到Gel-MA溶液中。大分子单体溶液的最终浓度为10wt％的Gel-MA和0.85wt％的胶原蛋白。如实施例1所述，由该溶液制备水凝胶。
实施例10：Gel-MA/胶原蛋白大分子单体溶液的剪切应力
使用40mm平行板装置(TA instruments)测量生物墨水(10wt％Gel-MA+0.85wt％胶原蛋白)的流变性质。测量在20℃下进行，剪切速率从1/s增加到1200/s。结果如图5所示。
实施例11：Gel-MA/胶原蛋白水凝胶的厚度变形
通过将10wt％Gel-MA+0.85wt％胶原蛋白1大分子单体溶液浇铸到圆盘模具中来制备水凝胶圆盘。然后将构建体在光引发剂和光源存在下照射15分钟，其中构建体的表面暴露于氧气。在第一个实验中，光强度保持在3mW/cm2，而对于I2959和Ru/SPS，光引发剂浓度分别从0.05wt％变为0.5wt％和从0.2/2mM变为2/20mM。在第二个实验中，光强度从3mW/cm2到100mW/cm2变化，同时分别使I2959和Ru/SPS的光引发剂浓度保持恒定在0.05wt％和0.2/2mM。氧抑制水平表征为平衡溶胀之前(t0)和平衡溶胀之后(ts)厚度的变形。厚度变形由以下公式给出：厚度变形＝[(t0-ts)/t0]×100。结果如图6和7所示。
实施例12：Gel-MA/胶原蛋白水凝胶中MCF-7的细胞存活率
将乳腺腺癌细胞(MCF-7)以250万个细胞/ml的浓度混入10wt％Gel-MA+0.85wt％胶原蛋白1大分子单体溶液中，然后在各种光引发剂浓度和光强度下进行光包封。1天后进行存活/死亡分析以评价包封的MCF-7细胞的存活率。结果如图8所示。
实施例13：3D生物制造的构建体中的氧抑制
使用BioScaffolder分配系统(SYS+ENG，Salzgitter-Bad，德国)打印构建体。水凝胶分配头保持在20℃。使用的生物墨水是具有0.05wt％的I2959或0.2/2Ru/SPS(mM)的10wt％Gel-MA+0.85wt％胶原蛋白1。使用23G针头，500mm/min的XY平面速度和1.5mm的股线距离打印构建体。打印的构建体经受3mW/cm2，30mW/cm2和50mW/cm2的光强度。然后使用立体显微镜使光交联的构建体成像并示于图10中。
实施例14：3D生物制造的构建体中的细胞包封
以500万细胞/ml浓度使包含10wt％Gel-MA+0.85wt％胶原蛋白1+0.2/2Ru/SPS(mM)大分子单体溶液的生物墨水与乳腺腺癌细胞(MCF-7)混合。然后如实施例13中概述的那样对生物墨水进行3D打印并在50mW/cm2的光下照射15分钟。使用立体显微镜对构建体成像(图11A)，并使用存活/死亡分析法评价包封细胞的存活率(图11B)。
实施例15：烯丙基化明胶的合成
使用标准试验方案合成烯丙基化明胶(Gel-AGE)。在65℃将明胶溶于去离子水(10wt％)中并加入不同比例的烯丙基缩水甘油醚(4.71-29.5mmol)和2M NaOH(0.79-19.65mmol)。使反应在65℃下持续1-24小时，然后用去离子水透析(MWCO 1kDa)。将产物冻干并保存在4℃直至使用。1H-NMR(300MHz,D2O):δ＝7.33-7.25(d,arom.-CH)6.01-5.86(m,-O-CH2-CH＝CH2),5.36–5.25(t,-O-CH2-CH＝CH2),4.6-0.8(m,骨架-H)ppm.
实施例16：Gel-AGE水凝胶的制造
在PBS中制备Gel-AGE水凝胶(20wt％)，然后与DTT混合以实现1:1.5，1:3，1:6和1:12(烯丙基:SH)的官能团比例。加入光引发剂(1/10mM RU/SPS)后，将水凝胶前体溶液用30mW/cm2的可见光(装配到
S1500的Rosco IR/UV滤光器，ExcelitasTechnologies)光聚合3分钟。使用定制的模具制备圆柱形构建体(h＝2mm，
)。聚合后，将每种水凝胶称重(m初始，t0)，并将每种水凝胶组合物直接冻干三个样品以记录它们的初始干重(m干，t0)并确定实际的大分子单体重量分数，其为初始干燥体重相对初始重量的比例。
为了确定剩余样品的初始干重，使用了实际大分子单体分数和单个初始重量的乘积(factor)。
M干，t0＝m初始×实际大分子单体分数
剩下的样品在37℃下在PBS中溶胀长达1周。收集溶胀的水凝胶样品以记录湿重(m溶胀)，然后冻干以获得冻干重量(m干)并根据以下公式定义质量损失和质量溶胀比(q)：
将水凝胶的溶胶分数定义为未交联到水凝胶网络中的大分子单体的百分比，并将其定义为平衡溶胀后(t＝1d)的质量损失。
实施例17：在Gel-AGE水凝胶中进行细胞包封
软骨细胞收集自在新西兰基督城Forte健康私人医院进行ACL重建手术的人类患者的关节软骨宏观正常区域。37℃下将组织在具有0.15wt％II型胶原蛋白酶的软骨形成的扩大培养基(补充有10mM HEPES、0.1mM NEAA，1％(v/v)青霉素-链霉素、0.1mM AsAp和10wt％FBS的DMEM)中消化，在潮湿空气培养箱中(5％CO2/95％空气)过夜。通过细胞过滤器过滤溶液，并将分离的软骨细胞在高密度单层(BD Biosciences组织培养瓶)中扩增，在软骨扩大培养基中培养三代。然后将细胞以15×106个细胞/mL的浓度包封在Gel-AGE水凝胶中，并在软骨形成分化培养基(补充有10mM HEPES，0.1mM NEAA、1×ITS+1、1％(v/v)青霉素-链霉素、0.4mM L-脯氨酸、0.2mM BSA、0.2mM AsAp、0.1μM地塞米松和10ng/mL TGFb-1的杜氏DMEM)中培养1周。无细胞水凝胶充当阴性对照组。
实施例18：Gel-AGE水凝胶存活/死亡存活率分析
根据实施例5的程序分析根据实施例16制备的Gel-AGE水凝胶样品。结果如图21所示。
实施例19：Gel-AGE水凝胶阿尔玛蓝代谢活性
使用实施例6的程序评价根据实施例16制备的Gel-AGE水凝胶样品的代谢活性。结果如图22所示。
实施例20：聚乙烯醇-甲基丙烯酰基(PVA-MA)的合成
通过PVA与甲基丙烯酸酐在水中反应制备PVA-MA。在典型的实验中，通过在80℃的水中加热PVA直至PVA完全溶解来制备10wt％的PVA溶液。然后将PVA溶液冷却至室温，然后加入甲基丙烯酸酐(0.375ml/g PVA)，并使溶液反应4小时。每小时将反应溶液的pH调节至8。为停止反应，使溶液在丙酮中沉淀。然后将沉淀的聚合物重新溶于水中，然后通过10kDa分子量截留膜用水透析进一步纯化。最后，将纯化的溶液冻干以获得干燥的PVA-MA。
实施例21：使用基于光投射立体光刻的方法制造构建体
使用
4标准(EnvisionTec，Gladbeck，德国)制造构建体。所使用的生物树脂是含有或不含1wt％Gel-MA的10wt％PVA-MA+1wt％光吸收剂。引发剂浓度范围为0.2/2至0.5/5Ru/SPS(mM)。通过将每个层(50μm)暴露于10mJ/cm2的光来打印构建体。进行溶胶-凝胶分析以评价打印的构建体(
圆柱体)的物理机械性能。对于细胞包封研究，在光投射之前，分别将人间充质多能基质细胞(hMSC)和马软骨原代细胞(CPC)与树脂以5×106个细胞/ml和20×106个细胞/ml的终密度混合。然后使用立体显微镜使打印的构建体成像，并示于图12至15中。
实施例22：在使用光投射立体光刻制造的构建体中包封细胞。
将小鼠畸胎瘤细胞(ATDC5)混入10wt％PVA-MA+0.5/5Ru/SPS(mM)+1wt％光吸收剂(含或不含1wt％Gel-MA)中。使用实施例14中概述的相同条件打印水凝胶圆盘(5mm直径×0.5mm厚度)。使用存活/死亡分析评价打印后细胞的存活率并示于图16中。
实施例23：水凝胶珠的制造和细胞包封
使用由PTFE管、T形接头和熔融石英毛细管组成的微流体装置制造载有细胞的Gel-MA水凝胶珠。连续相为向日葵油，分散相为与浓度为1000万个细胞/ml人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)混合的20wt％Gel-MA生物墨水+0.2/2Ru/SPS(mM)。将油和水凝胶溶液分别以1ml/min和50μl/min的速率通过所述装置泵入。用油剪切水凝胶珠并使其经受100mW/cm2的可见光以便交联。总暴露时间保持在3分钟。然后将水凝胶珠染色以进行存活/死亡分析以评价包封后细胞的存活率。结果如图23所示。
实施例24：Gel-MA水凝胶微球的制造和癌细胞包封
用人卵巢腺癌细胞系(SKOV3)和正常人包皮成纤维细胞(HFF)进行实验。将SKOV3和HFF在包含含有5％胎牛血清(FBS；GIBCO，新西兰)、100单位/ml青霉素(GIBCO，美国)和100μg/ml链霉素(GIBCO，美国)的DMEM(高葡萄糖，GlutaMAX补充物，丙酮酸)(GIBCO，美国)的培养基中培养。将细胞以3000个细胞/cm2的密度接种在组织培养瓶(BD Biosciences)中。细胞在37℃下在潮湿的5％CO2/95％空气培养箱中扩增，培养基每周更换两次。大约4-7天后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS；GIBCO，美国)洗涤亚融合的传代细胞，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，加拿大)分离，通过台盼兰拒染法(trypan blue exclusion)在血细胞计数器中计数，在组织培养瓶中以3,000个细胞/cm2铺板。将细胞传代直至有足够数目的细胞，之后收集细胞以形成包封细胞的微球。所有用于该研究的HFF在第24和28代之间，SKOV3在第44和48代之间。
使用Qtracker细胞标记试剂盒(Life technologies，美国)追踪共培养环境中的细胞。用Qtracker 655标记HFF，用Qtracker 800标记SKOV3。为了用Qtracker标记细胞，通过以700g离心5分钟将细胞浓缩至107个细胞/ml，并重悬于培养基中。通过在1.5ml微量离心管中混合1μL的Qtracker组分A和1μL的Qtracker组分B并在室温下温育5分钟来制备10nM标记溶液。向混合物中加入0.2ml DMEM并涡旋30秒。将浓度为107个细胞/ml的106个细胞加入标记混合物并温育60分钟。随后将细胞用培养基洗涤两次并重悬于培养基中以供使用。
未标记的细胞用于形成SKOV3微球和成纤维细胞微球。将标记的SKOV3和HFF混合，使得SKOV3在混合物中的比例为75％并用于形成共培养微球。将干燥的无菌Gel-MA(10wt％)在37℃下溶解于PBS中，并在室温放置冷却过夜。通过以0.7rff离心细胞形成细胞团块，弃去上清液。然后将细胞团块溶于含有无菌过滤引发剂(0.2mM钌(Ru；Sigma-Aldrich，美国)和2mM过硫酸钠(SPS；Sigma-Aldrich，美国))的10wt％Gel-MA大分子单体溶液中，得到的终浓度为10×106个细胞/ml。将含有细胞的溶液注入注射器中。食品级向日葵油用作连续相，含有光引发剂和细胞的Gel-MA溶液制成分散相。对于连续油相，流速设定为1ml/min，对于分散凝胶相流速设定为40μl/min。然后在可见光(
S1500，Excelitas Technologies)下照射形成的微球。用仅允许波长400-450nm的光和100mW/cm2的最终强度的光通过的滤光器(Rosco IR/UV滤光器)照射光。将形成的微球收集在含有PBS的聚丙烯(Falcon)离心管中。为了从微球中分离油，离心管以0.1g离心5分钟。然后吸出油并用滴管收集PBS中的球粒，然后悬浮在新鲜的PBS中并重复洗涤步骤。然后将每个包封细胞的微球转移到96孔聚苯乙烯板(Falcon)中的孔中。然后将150μL细胞培养基移液到孔中并置于培养箱中，培养基每周更换两次。
使用CyQUANT试剂盒(Molecular Probes)对第0天，第7天和第12天的样品定量微球水凝胶中的DNA。简言之，在蛋白酶-K消化后，裂解样品中的细胞，并通过使用提供的添加有RNA酶A(1.35KU/ml)的裂解缓冲液在室温下降解RNA 1小时。将样品移液到96孔白色聚丙烯板(Nunc)中并加入GR-染料溶液。然后将平板在室温下温育15分钟并测量荧光(FluostarGalaxy BMG Labtechnology)。使用试剂盒中提供的λ-DNA构建标准曲线。
表1：制造后每个微球的细胞(第0天)。
| 细胞 | SKOV3 | 成纤维细胞 | 共培养 | 理论值 |
| 每个微球的细胞 | 5828.63±263.31 | 6168.01±158.77 | 5609.71±540.06 | 5235.99 |
| 变化系数 | 0.045 | 0.025 | 0.096 | - |
a n＝3
b不同细胞类型的微球与理论值之间没有显著差异(p>0.05)。
c理论值是对于用包含10×106个细胞/ml的细胞接种密度的大分子单体形成的1mm直径微球的细胞的计算数目。
在制造微球后，测定每个微球的细胞数目。每个微球测定的细胞值与预期值或理论值相当。变化系数表明每个微球的细胞变化很小。对于SKOV3细胞、成纤维细胞或共培养的包封微球，每个微球的细胞和理论值也没有显著差异(p>0.05)。
图24中显示了直至第12天，SKOV3、成纤维细胞和共培养微球培养物的DNA含量的n倍变化。对于SKOV3微球，在第0天和第7天之间存在略微显著的DNA增加(p＝0.055)，但是在第7天和第12天之间DNA没有显著增加(p>0.05)。但是对于成纤维细胞微球，DNA没有随时间显著增加或减少(p<0.05)。然而，对于共培养微球，观察到从第0天到第7天到第12天，DNA含量增加(p<0.05)。
实施例25：3D绘制的支架的制造
使用BioScaffolder(SYS+ENG，德国)3D绘制尺寸为25×25×1.8mm的多孔支架。纤维以重复的0-90°-90°-0°图案取向以提供用于微组织掺入的空间。在制造过程中，设置下列打印参数：(i)x和y方向上纤维间距均为1mm，(ii)纤维高度偏移为0.22mm，(iii)包含加热至温度200°并加压至5巴的聚合物的打印头储液器，(iv)螺旋钻速度为63RPM，以及(v)配有25mm间距喷嘴(gauge nozzle)的打印头以500mm/min的移动速度移动。
实施例26：用癌症微球进行自动化组织组装
通过使用含有Polyactive 300PEGT55PBT45的高温打印头打印支架，然后使用微球注射头插入包封细胞(75％SKOV3和25％HFF)的微球，来展示具有癌微球的构建体的自动组装。为了打印组装的构建体(n＝3)，选择逐层方法以便不限制可以使用该系统构建的支架的高度。在该方案中，打印第一层支架(8层纤维股)(如前所述)，然后将4个(2×2样式)活微球插入3D绘制的支架的孔中。重复该过程以产生第二层支架(4层纤维股)，然后将另外4个微球插入到该支架中。但是对于手动组装的支架，整个支架一次打印并且微组织以与自动化系统组装的那些类似的方式被手动插入到预先打印的支架中。
对于存活/死亡分析，将样品在37℃下在含有1μM钙黄绿素AM(Molecular Probes)的0.5ml杜氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS；Invitrogen)中温育15分钟，然后加入1.5μM碘化丙啶(Molecular Probes)再温育10分钟。此后，样品用D-PBS洗涤两次，并使用ZeissAxioimager Z1显微镜使z-堆叠的样品成像。
对于阿尔玛蓝分析，向培养基中加入阿尔玛蓝(Invitrogen，美国)，使最终浓度为10％(v/v)，并将样品在37℃下温育20小时。在使用600nm作为参比波长测量570nm处的吸光度(Fluostar Galaxy BMG Labtechnology)之后，使用由制造商提供的公式比色计算阿尔玛蓝试剂的还原。
共培养微球通过逐层方法通过自动化系统进行组装，并与人工组装的构建体比较存活率。目视考察手动组装的构建体和使用组装系统组装的构建体的存活/死亡荧光显微镜图像显示没有明显差异。阿尔玛蓝分析结果支持这一结果，在手动组装构建体和使用自动组装系统组装的构建体之间还原的阿尔玛蓝的百分比没有显著差异(p>0.05)。
实施例27：细胞毒性试验
使用细胞毒性试验评价阿霉素对2D、微球和组装的癌构建体中的细胞的体外抗肿瘤活性。将阿霉素溶解于DMSO中，使得培养基中DMSO的最大终浓度不超过0.5％v/v的DMSO。在第0天，将制造的SKOV3、HFF和共培养微组织转移到96孔板中并且每孔加入150μl培养基。在形成微球的第1天，将SKOV3、HFF和共培养癌构建体手动组装并转移到每孔具有1.2ml培养基的24孔板中。在第7天，对于2D模型的细胞毒性测试，将SKOV3，HFF和共培养物(75％SKOV3和25％HFF)细胞以每孔30,000个细胞和200μl培养基接种到48孔板上。第二天(第8天)，所有样品用不同浓度的阿霉素处理-无药物对照，0.001μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM。具有含有特定药物浓度的5％FBS的培养基每两天更换一次。暴露于药物4天后，进行阿尔玛蓝分析以测量样品细胞的代谢活性。对于阿尔玛蓝分析，将所有样品转移到新鲜孔板中，将阿尔玛蓝(Invitrogen，美国)加入到培养基中以使终浓度为10％(v/v)，并将样品在37℃下温育20小时。在545nm的激发波长和590nm的发射波长下进行荧光测定。
对于所有细胞类型观察到的总体趋势是药物的IC50值(表2)对于2D中的细胞最低，对于微球稍高(与2D中的细胞相比增加1-4倍)，而对于组装的构建体最高(与2D中的细胞相比增加48-70倍)。所有模型中，SKOV3具有最低的IC50值。共培养微球和组装的构建体与仅具有SKOV3或HFF的微球和组装构建体相比具有更高的IC50值。然而，对于2D中的细胞，HFF具有最高的IC50值。
图25中显示了以对照相对于微球的药物浓度的百分比表示的DNA含量。随着药物浓度增加DNA含量减少的趋势与剂量–响应曲线相似。SKOV3和共培养微球显示出相似的趋势，但与SKOV3和共培养微球相比，成纤维细胞微球显示DNA含量降低略微滞后。癌构建体的暗视野图像显示，在药物浓度较高时，存在于构建体中的组织萎缩，其在1μM药物浓度时尤其明显，并且在10μM时，构建体内几乎没有组织存在。
表2：阿霉素的细胞毒性
实施例28：肝素-甲基丙烯酰基(Hep-MA)的合成
使用实施例1的方案合成甲基丙烯酰化的肝素(Hep-MA)。简言之，将肝素以10％和1％溶解于PBS中，并使其与MAAh反应，相应地，其相对于羟基以20和10倍摩尔过量。在连续搅拌下将反应保持在4℃，并在24小时内反复调节pH至8。将反应溶液用去离子水透析(MWCO14,000Da)以除去未反应的分子。将官能化聚合物无菌过滤并冻干，然后在-20℃下储存直至使用。
实施例29：将Hep-MA掺入Gel-MA水凝胶中
使用补充有终浓度为0.2/2mM Ru/SPS的PBS制备水凝胶前体溶液(9.5wt％Gel-MA+0.5wt％Hep-MA)，将其注入定制的Teflon模具中，该模具覆盖有载玻片以使氧抑制作用最小化，并用3mW/cm2强度的400-450nm可见光照射15分钟。所有制造的水凝胶的初始尺寸约为
或者，使用由PTFE管、T形接头和熔融石英毛细管构成的微流体装置制造Gel-MA/Hep-MA水凝胶珠。连续相是向日葵油，分散相是9.5wt％Gel-MA+0.5wt％Hep-MA+0.2/2Ru/SPS(mM)。将油和水凝胶前体溶液分别以1ml/min和50μl/min的速率通过所述装置泵入。用油剪切水凝胶珠并使其经受100mW/cm2的可见光以便交联。总暴露时间保持在3分钟。
实施例30：在无细胞水凝胶中大分子单体保留的定量
将四种水凝胶组合物聚合并在含有0.1％叠氮化钠的PBS中在37℃温育长达14天。在每个时间点，从PBS中取出样品并在1mg/ml蛋白酶K中56℃下消化，将其溶解于10mMTris-HCl和1mM EDTA二钠溶液中，并与相应的液体溶液一起在-20℃下储存直至分析。使样品与DMMB反应以定量肝素含量。简言之，将50μl各消化的凝胶样品，相应的PBS液体和标准曲线稀释液一式三份地转移至96孔微量平板，向其中加入200μl DMMB溶液，并在535nm处(Thermo Scientific Varioskan Flash)读取吸光度两次。可通过由已知量的肝素和HepMA与DMMB剂反应产生的匹配标准曲线计算水凝胶和周围液体中的肝素含量。然后可以使用以下公式计算每个时间点的保留率，其定义为没有释放到周围液体的大分子单体的百分比：
其中mg是在消化的水凝胶中发现的肝素大分子单体的质量，ml是发现浸出到周围PBS(相应的水凝胶淹没在其中)中的肝素大分子单体的质量。
实施例31：将MgCO3纳米颗粒掺入Gel-MA水凝胶中
通过氯化镁与碳酸钠之间的沉淀反应合成了MgCO3纳米结构(nMgCO3)。将所制备的纳米结构洗涤，离心并干燥。在0.2/2mM Ru/SPS存在下用MgCO3(0.5mg/ml或1.5mg/ml)和不用MgCO3纳米结构制造5wt％Gel-MA水凝胶并用30mW/cm2可见光照射10分钟。
实施例32：将MSC包封在Gel-MA/MgCO3水凝胶中
将人骨髓来源的间充质基质细胞(MSC)以5×106个细胞/ml的密度包封到Gel-MA/MgCO3水凝胶中。样品在成骨分化培养基(α-MEM+FBS+地塞米松+β-甘油磷酸+抗坏血酸)中培养长达28天。
实施例33：明胶-降冰片烯(Gel-NOR)水凝胶的合成
在圆底烧瓶中，50℃下将明胶以10wt％溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将降冰片烯二酸酐(CA)加入到明胶溶液中以达到20wt％的最终浓度，并在50℃下搅拌。向反应溶液中滴加1M氢氧化钠溶液以促进CA溶解。一旦所有的CA溶解，将pH调节至7.7-8。继续反应24小时。反应完成后，溶液用温PBS稀释3次，然后以4000rpm离心3分钟以除去所有未反应的CA。然后将上清液在50℃下用H2O透析3天，定期更换水，用0.22μm过滤器无菌过滤，然后冷冻干燥以获得干燥的无菌Gel-NOR大分子单体。使用fluoraldehyde分析法来定量Gel-NOR的官能化程度。
在PBS中以不同重量百分比(2.5，5，10wt％)制备Gel-NOR水凝胶，然后与不同硫醇化分子(DTT、PEG4SH和PEG8SH)混合以实现NOR:SH(1:1，1:2，1:3，1:6和1:12)的官能团比例。加入光引发剂(1/10mM RU/SPS)后，将水凝胶前体溶液用30mW/cm2的可见光(装配到
S1500的Rosco IR/UV滤光器，Excelitas Technologies)光聚合3分钟。使用定制模具制备圆柱形构建体(h＝2mm，
)。聚合后，称量每个水凝胶，并将每个水凝胶组合物的三个样品直接冻干以记录其初始干重并测定实际大分子单体重量分数、剩余样品的初始干重、质量损失和质量溶胀比(q)和溶胶分数(使用与实施例16相同的方法)。
使用DTT以高于1:2的NOR:SH比例成功制造具有良好交联效率的Gel-NOR水凝胶(溶胶分数<20％)(图29)。该结果证明可见光引发剂与巯基-降冰片烯逐步增长聚合相容。还观察到质量溶胀比随着溶胶分数值的降低而降低。
使用DTT(MW＝154.23Da)并保持NOR:SH比例恒定在1:2，成功地制备了5wt％Gel-NOR凝胶，其具有与10wt％凝胶相当的溶胶分数，表明良好的交联效率(图30)。降低大分子单体浓度也显著增加了质量溶胀比，这与之前文献中报道的结果一致。但是，在2.5wt％下没有凝胶能够形成。
然而，当使用分子量更大的硫醇化分子(PEG4SH和PEG8SH，MW＝10kDa)时，使用类似比例1:2NOR:SH成功制造了2.5wt％的Gel-NOR水凝胶(图31)。这个结果并不出乎意料，因为较大的硫醇化分子提高了接枝在明胶上的NOR基团的可及性，使得NOR和硫醇基团之间更容易逐步增长聚合。
实施例34：在Gel-NOR水凝胶中的细胞包封
使用DTT作为交联剂，以1:2(NOR:SH)比例将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人间充质基质细胞(MSC)包封在5wt％Gel-NOR水凝胶中。HUVEC:MSC的细胞密度保持在4:1的比例，4×106个HUVEC/ml和1x106MSC/ml密度。在补充有5ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)、5ng/ml表皮生长因子(EGF)、5ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF)、15ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)、10mM L-谷氨酰胺、0.75单位/ml肝素硫酸盐、1μg/ml氢化可的松、50μg/ml抗坏血酸和2w/v％胎牛血清的血管细胞基础培养基(购自ATCC)中培养载有Gel-NOR的水凝胶。将样品培养14天，然后在4％多聚甲醛中固定，并对血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)和F-肌动蛋白进行免疫染色。
HUVEC和MSC被成功包封在具有良好存活和代谢活性的Gel-NOR水凝胶中。在培养14天后通过水凝胶内血管网络的形成来评价HUVEC细胞的血管生成功能。图32显示了由HUVEC形成的管状网络(PECAM染色为阳性)，并且MSC围绕管状结构共定位以稳定形成的网络。该结果表明Gel-NOR水凝胶可用于软组织工程，例如骨支架的预血管化。
尽管已经通过实施例描述了本发明，但是应该理解的是，可以在不脱离如权利要求中限定的本发明的范围的情况下做出变化和修改。此外，对于特定特征存在已知等同物的情况下，如同在本说明书中特别提到的那样并入这些等同物。
Claims (126)
1.一种制备水凝胶的方法，包括以下步骤：
(i) 将聚合物溶液与光引发剂混合，其中所述光引发剂包括钌(II)化合物和过硫酸钠、过硫酸铵或过硫酸钾，并且其中所述聚合物包含各自具有非芳族不饱和官能团的多个亚单元，其中所述不饱和官能团包括双键或三键，其中所述水凝胶通过链增长聚合方法或逐步增长聚合方法通过不饱和官能团的交联而形成；以及
(ii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述不饱和官能团选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、降冰片烯、丙炔酸酯和烯丙基。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述逐步增长聚合方法包括一个聚合物链的一个或多个不饱和官能团与另一个聚合物链的硫醇化官能团之间的反应。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述钌(II)化合物是三(2,2-联吡啶基)二氯化钌(II)六水合物。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚合物是合成聚合物。
6.如权利要求1、3或4所述的方法，其中所述聚合物是合成聚合物，并且其中所述合成聚合物选自聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)(pHEMA)、聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)(PTMC)、聚富马酸酯、聚(乳酸)(PLA)、聚己内酯(PCL)和聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚合物是天然聚合物。
8.如权利要求1、3或4所述的方法，其中所述聚合物是天然聚合物，并且其中所述天然聚合物选自藻酸盐、透明质酸、肝素、丝素蛋白、丝胶蛋白、甲基纤维素、结冷胶、硫酸软骨素、壳聚糖、纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)和转化生长因子(TGF)。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述可见光具有400-450nm范围内的波长。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述可见光具有400-450nm范围内的波长。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述可见光具有400-450nm范围内的波长。
12.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚(乙烯醇)-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述明胶-甲基丙烯酰基水凝胶根据包括以下步骤的方法制备：
(i) 将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii) 将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
14.如权利要求5所述的方法，其中所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚(乙烯醇)-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述明胶-甲基丙烯酰基水凝胶根据包括以下步骤的方法制备：
(i) 将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii) 将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
16.如权利要求7所述的方法，其中所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚(乙烯醇)-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述明胶-甲基丙烯酰基水凝胶根据包括以下步骤的方法制备：
(i) 将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii) 将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
18.如权利要求9所述的方法，其中所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚(乙烯醇)-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述明胶-甲基丙烯酰基水凝胶根据包括以下步骤的方法制备：
(i) 将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii) 将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
20.如权利要求10所述的方法，其中所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚(乙烯醇)-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述明胶-甲基丙烯酰基水凝胶根据包括以下步骤的方法制备：
(i) 将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii) 将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
22.如权利要求11所述的方法，其中所述水凝胶是明胶-甲基丙烯酰基水凝胶、肝素-甲基丙烯酰基水凝胶、聚(乙烯醇)-甲基丙烯酰基水凝胶、明胶-烯丙基水凝胶或明胶-降冰片烯水凝胶。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述明胶-甲基丙烯酰基水凝胶根据包括以下步骤的方法制备：
(i) 将明胶水溶液与甲基丙烯酸酐接触以制备明胶-甲基丙烯酰基；
(ii) 将明胶-甲基丙烯酰基与钌(II)化合物和过硫酸钠混合；以及
(iii) 用可见光照射混合物以产生所述水凝胶。
24.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
25.如权利要求5所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
26.如权利要求7所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
27.如权利要求9所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
28.如权利要求10所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
29.如权利要求11所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
30.如权利要求12所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
31.如权利要求13所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
32.如权利要求14所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
33.如权利要求15所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
34.如权利要求16所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
35.如权利要求17所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
36.如权利要求18所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
37.如权利要求19所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
38.如权利要求20所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
39.如权利要求21所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
40.如权利要求22所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
41.如权利要求23所述的方法，其中所述可见光具有10-50mW/cm2的强度。
42.如权利要求13所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
43.如权利要求15所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
44.如权利要求17所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
45.如权利要求19所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
46.如权利要求21所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
47.如权利要求23所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
48.如权利要求24所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
49.如权利要求25所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
50.如权利要求26所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
51.如权利要求27所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
52.如权利要求28所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
53.如权利要求29所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
54.如权利要求30所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
55.如权利要求31所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
56.如权利要求32所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
57.如权利要求33所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
58.如权利要求34所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
59.如权利要求35所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
60.如权利要求36所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
61.如权利要求37所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
62.如权利要求38所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
63.如权利要求39所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
64.如权利要求40所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
65.如权利要求41所述的方法，其中钌(II)化合物与过硫酸钠的比例为1:10。
66.如权利要求13所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
67.如权利要求15所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
68.如权利要求17所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
69.如权利要求19所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
70.如权利要求22所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
71.如权利要求23所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
72.如权利要求24所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
73.如权利要求25所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
74.如权利要求26所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
75.如权利要求27所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
76.如权利要求28所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
77.如权利要求29所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
78.如权利要求30所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
79.如权利要求31所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
80.如权利要求32所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
81.如权利要求33所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
82.如权利要求34所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
83.如权利要求35所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
84.如权利要求36所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
85.如权利要求37所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
86.如权利要求38所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
87.如权利要求39所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
88.如权利要求40所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
89.如权利要求41所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
90.如权利要求42所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
91.如权利要求43所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
92.如权利要求44所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
93.如权利要求45所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
94.如权利要求46所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
95.如权利要求47所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
96.如权利要求48所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
97.如权利要求49所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
98.如权利要求50所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
99.如权利要求51所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
100.如权利要求52所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
101.如权利要求53所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
102.如权利要求54所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
103.如权利要求55所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
104.如权利要求56所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
105.如权利要求57所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
106.如权利要求58所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
107.如权利要求59所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
108.如权利要求60所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
109.如权利要求61所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
110.如权利要求62所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
111.如权利要求63所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
112.如权利要求64所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
113.如权利要求65所述的方法，其中步骤(iii)中照射所述混合物的时间为2-15分钟。
114.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含包封的生物细胞和/或细胞球体。
115.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含一种或多种包封的生长因子。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述一种或多种生长因子选自VEGF、BMP2、EGF、BDNF和TGF-β。
117.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含纳米颗粒。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述纳米颗粒包含镁或锶化合物。
119.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水凝胶呈珠或微球的形式。
120.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中与使用紫外光照射聚合物和光引发剂相比，在所述照射步骤中氧对于所述水凝胶形成的抑制减少。
121.权利要求1至120中任一项所述的方法制备的水凝胶在制备修复人类或非人类动物中的组织的药物中的用途。
122.如权利要求121所述的用途，其中所述组织是软骨。
123.如权利要求1至120中任一项所述的方法制备的水凝胶作为生物墨水或生物树脂的用途。
124.如权利要求123所述的用途，其中所述生物墨水或生物树脂用于三维生物制造生物构建体。
125.如权利要求123所述的用途，其中所述生物墨水或生物树脂用于三维生物打印生物构建体。
126.如权利要求124或125所述的用途，其中所述构建体是含有细胞的多孔支架。
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