KR102124579B1 - 세포 괴사를 최소화하는 바이오잉크 조성물 및 이를 이용한 생체구조체의 제조방법 - Google Patents

세포 괴사를 최소화하는 바이오잉크 조성물 및 이를 이용한 생체구조체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 캡슐은 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어, 및 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면 상 또는 내부에 제공되는 보호제를 포함한다.

Description

세포 괴사를 최소화하는 바이오잉크 조성물 및 이를 이용한 생체구조체의 제조방법{Bio-ink composition for minimizing cell necrosis and method for manufacturing a biostructure using the same}
본 발명은 세포 괴사를 최소화하기 위한 세포 캡슐, 이를 포함하는 바이오잉크 조성물, 상기 바이오잉크 조성물의 제조방법, 및 상기 바이오잉크를 이용하는 생체구조체의 제조방법에 관한 것이다.
조직 공학은 다양한 세포 유형, 생체 적합 물질 및 자극성 신호를 독창적으로 융합하여 조직 복구 및 재생을 목적으로 인간 조직의 구조와 기능을 복제하는 것을 목표로 한다. 생체제조(biofabrication) 기술의 출현으로, 세포와 생체 재료의 배치를 고도로 제어함에 따라 복잡한 생체 구조물을 제조할 수 있게 되었다.
광학적 가교결합은 물리/화학적 가교결합에 비해 일반적으로 많은 장점을 가지고 있기 때문에 안정된 세포함유 하이드로겔을 생성할 목적으로 생체제조와 함께 사용된다. 광학적 가교결합은 중합 공정에서의 정밀 제어가 가능한 점, 짧은 가교 소요시간 및 발열 최소화의 이점이 있다.
그러나, 광학적 가교결합은 세 가지 주요 단점이 존재한다. 즉, 1) DNA 손상이나 세포 암화와 같은 자외선 조사의 유해한 영향, 2) 반응성 산소종(ROS)의 형성을 또는 직접 세포와 반응하는 광개시제 해리에 의해 생성된 라디칼, 3) 미반응 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 비닐에스테르와 같은 광 반응성 잔기로 작용화된 하이드로겔의 이중결합에 의한 세포독성을 말한다.
광학적 가교결합과 연관된 제약으로 인해, 생체제조로 만들어진 구조체의 확장성 및 연장된 가교결합 시간은 여전히 임상 번역에 있어 문제로 남아있다. 현 시점에서 생체제조 접근법은 민감한 세포의 생존력과 증식을 심각하게 손상시키지 않으면서도 제한된 자외선 강도에서 10 분 이하의 광학적 가교결합 시간을 허용한다. 이것은 압출 3D 프린팅에서의 전단 응력, 미생물(예: 세균, 진균) 오염 및 과도한 발열과 같은 생체제조 공정에 수반되는 기타 유해한 스트레스 요인에 의해 더욱 복잡해진다. 광조형 기술 또는 연속 액체 인터페이스 생산(CLIP)과 같은 통(vat) 광중합 인쇄법을 채택할 경우, 수 분 이내로 입방 센티미터 크기의 물체를 제조할 수 있다. 그러나, 생체 및 세포적합성 광중합체의 부재로 대규모 생체제조에서 이러한 접근법은 심각하게 제한된다.
따라서, 이러한 광학적 가교결합을 통해 생체제조 공정을 수행하면서도 위의 단점을 극복하기 위한 바이오프린팅 시스템의 개발이 지속적으로 요청되어왔다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0112436호
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 광학적 가교결합 시 세포괴사를 최소화하기 위한 바이오프린팅 시스템을 제공하는 것이다.
이를 위하여, 본 발명은 바이오프린팅 시 세포를 안정화시킬 수 있는 세포 캡슐을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 세포 캡슐을 포함하는 바이오잉크 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 바이오잉크 조성물을 이용하는 생체구조체의 제조방법을 및 이에 의해 제조되는 생체구조체를 제공하고자 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어, 및 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면 상 또는 내부에 제공되는 보호제를 포함하는 세포 캡슐을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 캐리어는 구형의 상기 하이드로겔 캐리어 중에 상기 세포가 분산된 형태 또는 쉘 형태의 상기 하이드로겔 캐리어에 세포가 봉입되는 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 캐리어는 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 보호제는 탄닌산, 피로갈롤, 폴리도파민, 인산칼슘, 탄산칼슘, 실리카, 이산화망간, 이산화티타늄, 폴리(노르에피네프린), 황산 덱스트란, 폴리(L-아르기닌), 폴리(글루탐산), 폴리(L-라이신) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 캐리어는 10 μm 내지 1,000 μm의 크기로 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 보호제는 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면에 0.1 μm 내지 100 μm의 두께로 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 복수의 상기 세포 캡슐 및 하이드로겔 매질을 포함하는 바이오잉크 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 캡슐은 상기 바이오잉크 조성물 중 1 중량% 내지 40 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 매질은 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 매질은 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포는 동물세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계; 상기 하이드로겔 캐리어의 표면 또는 내부에 보호제를 코팅 또는 담지하는 단계; 및 상기 코팅 또는 담지된 하이드로겔 캐리어를 하이드로겔 매질과 혼합하는 단계를 포함하는 바이오잉크 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계는 하이드로겔 전구체에 세포를 혼합한 후 입자화를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 입자화는 통해 유화법 또는 압출적하법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계는 하이드로겔 전구체에 의해 세포 현탁액을 캡슐화함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 바이오잉크 조성물을 이용하여 하이드로겔 골격을 제조하는 단계; 상기 바이오잉크 조성물 중의 상기 하이드로겔 캐리어 또는 보호제를 분해하여, 상기 세포를 하이드로겔 골격으로 방출하는 단계; 및 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 생체구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 구조체를 제조하는 단계는 상기 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅, 3D 플로팅, 광학적 조형 또는 광학적 주조함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 바이오잉크 조성물은 광 가교결합 시, 연장된 광학적 가교시간, 기계적 전단, 높은 반응성 또는 유해한 화학물질 또는 화학종의 조건 하에서도 조성물 중에 포함된 세포를 안정화시켜 그의 생존력을 현저히 개선할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체구조체의 제조방법의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 캡슐의 크기 분포(A) 및 광학 이미지(B)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로겔 골격의 이미지(A) 및 SEM 이미지(B)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로겔 골격에서 성장한 세포의 이미지이다.
도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 세포 캡슐을 이용한 생체구조체에서, 자외선을 5분, 10분 및 15분 간 조사 후 각각 72시간 및 144 시간 후 관찰한 세포 증식도의 결과이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본 발명은 광학적 가교결합 시 세포괴사를 최소화하기 위한 바이오프린팅 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따른 세포 캡슐은 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어, 및 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면 상 또는 내부에 제공되는 보호제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어 만들어지는 3차원 망상구조물을 의미한다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성 환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는다. 구성 성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔을 제조할 수 있으며, 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 가질 수 있다.
본 명세서에서 용어 “하이드로겔 캐리어”는 하이드로겔로 구성되고 캐리어 내에 세포를 포함하는 하이드로겔 입자를 의미한다.
예를 들어, 상기 하이드로겔 캐리어는 구형으로 형성될 수 있으며, 상기 하이드로겔 캐리어 중에 세포가 분산된 형태로 포함될 수 있다.
또는, 예를 들어, 상기 하이드로겔 캐리어는 쉘 형태로 형성될 수 있으며, 상기 하이드로겔 캐리어에, 구체적으로는 상이 하이드로겔로 구성된 중공에 세포, 예를 들어, 세포 현탁액이 봉입되는 형태로 포함될 수 있다.
상기 하이드로겔 캐리어는 생체친화성 하이드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 하이드로겔 캐리어는, 예를 들어, 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 생체친화적인 광 가교성 하이드로겔이라면 이에 포함될 수 있다.
상기 하이드로겔 캐리어는 천연 상태로 사용되거나, 광 반응성의, 화학적으로 불안정한 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 잔기로 개질하거나, 또는 첨가제를 첨가하여 화학적으로 변형시켜 사용될 수 있다.
상기 하이드로겔 캐리어는 세포의 생존 및 증식 촉진을 위해 요구되는 영양소, 세포외 매트릭스 인자, 세포 인자, 의약적 활성제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 하이드로겔 캐리어는 줄기세포의 분화를 유도하는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포는 동물세포, 예를 들어, L929, HuH 7.5 등과 같은 포유동물 세포일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포, 예컨대 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 골수유래 중간엽줄기세포, 신경유래 중간엽줄기세포, 태반유래 중간엽줄기세포, 아세포, 간세포, 섬유아세포, 근육아세포, 성체줄기세포, 제대혈줄기세포 등, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포, 암세포 또는 그들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 하이드로겔 캐리어는 10 μm 내지 5 mm, 예를 들어, 50 μm 내지 1 mm, 예를 들어, 75 μm 내지 575 μm의 크기로 형성될 수 있다.
상기 보호제는 폴리페놀, 무기염류 또는 중합체와 같은, 세포적합성 및 세포보호성 화합물을 포함할 수 있다. 상기 보호제는, 예를 들어, 항산화 및 항미생물성 특성을 갖는 물질(예를 들어, 탄닌산, 피로갈롤, 갈릭산, 카테콜 등), 자외선 흡수성 물질(예를 들어, 폴리도파민 등 페놀 화합물 또는 히드록실화 페놀), 기계적 특성을 향상시키는 물질(예를 들어, 인산칼슘, 탄산칼슘, 실리카, 이산화망간, 이산화티타늄, 폴리(노르에피네프린), 황산 덱스트란, 폴리(L-아르기닌), 폴리(글루탐산), 폴리(L-라이신) 등의 무기염류) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 보호제는 천영 형태로 사용되거나 화학적으로 변형시켜 사용될 수 있다.
상기 보호제가 항산화 특성을 갖는 물질을 포함하는 경우, ROS와 같은 라디컬 종을 소거하며, 자유 라디칼 생성에 관여하는 특정 효소를 억제하거나 미량 금속을 킬레이트시킴으로써 ROS 형성을 억제하고, 항산화 방어력을 상승시킬 수 있다.
상기 보호제가 항미생물성 특성을 갖는 물질을 포함하는 경우, 이들 고도로 산화된 페놀은 화합물에 의한 효소 저해, 설프하이드릴기와의 특정 반응 또는 단백질과의 비특이적 상호작용에 기인하여, 미생물에 대한 독성을 나타낼 수 있다.
상기 보호제가 자외선 흡수성 물질, 예를 들어, 자외선 스펙트럼(200 내지 400 nm)에서 높은 감쇠 계수(μ)를 나타내는 물질을 보호제로서 포함하는 경우, 필요한 최적의 자외선 UV 흡광도(A=μ1)를 달성하기 위한 재료 파라미터의 설계가 용이해지며, 이를 통해 제한된 자외선 강도에서 10분 이하로 제한되는 광학적 가교결합 생체제조 공정의 제한을 능가하는 것을 가능하게 한다.
상기 보호제가 기계적 특성을 향상시키는 물질을 포함하는 경우, 기계적으로 강화된 가교결합된 하이드로겔은 세포 캡슐에 대하여 우수한 물리적 장벽 역할을 할 수 있다. 따라서, 3D 바이오프린팅 등의 생체제조 공정 중에 발생하는 외부 전단 응력에 대항하여 기계적 보호 기능을 제공하고 광반응 또는 광반응성 잔기를 가진 광중합체 형성 시 생성되는 활성 산소종(ROS)과 같은 세포 독성 화합물에 대한 확산 장벽으로도 작용할 수 있다.
상기 보호제층은 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면 상에 제공되며 보호제를 포함하는 막을 의미한다.
상기 보호제층은 0.1 μm 내지 100 μm의 두께로 제공될 수 있다.
상기 보호제층은 보호제층을 이루는 보호제의 농도 또는 보호제층의 두께를 변경함으로써 제공되는 보호제의 양을 제어할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따른 바이오잉크 조성물은 복수의 세포 캡슐 및 하이드로겔 매질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 복수의 세포 캡슐은 상기 하이드로겔 매질 중에 균질하게 또는 불균질하게 현탁될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "바이오잉크(bio-ink)"는 바이오프린팅에 사용되는 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물을 의미한다.
상기 세포 캡슐은 상기 바이오잉크 조성물 중 1 중량% 내지 40 중량%로 포함될 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물 중의 세포 보호용 성분의 함량이 0.2 mg/ml 미만이면 세포 보호 성능이 부족할 수 있고, 10 mg/ml 초과이면 세포 성장을 지나치게 억제할 수 있다.
상기 하이드로겔 매질은 생체친화성 하이드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 하이드로겔 매질은, 예를 들어, 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 하이드로겔 매질은 성장인자, 분화인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다. 상기 성장인자 또는 분화인자는 형질전환성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 사이토카인, 캐모카인을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 하이드로겔 매질은 1 Pas 내지 1,000 Pas의 점도를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 세포독성이 매우 강한 제조 조건 하에서도 세포를 3D 프린팅할 수 있을 만큼 높은 세포 생존력을 가지도록 한다.
상기 세포 캡슐은 가교화된 하이드로겔 캐리어 내에서 100%에 가까운 높은 효율로 캡슐화되기 때문에, 외부 환경과 완전히 별개인 구획을 생성한다. 이를 통해 이종의 세포를 포함하는 세포 캡슐을 혼합하여 바이오잉크 조성물을 제조하더라도, 여러 세포의 교차 오염 없이 단일 인쇄로 다세포 생체구조체를 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따른 바이오잉크 조성물의 제조방법은 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계; 상기 하이드로겔 캐리어의 표면 또는 내부에 보호제층을 코팅하는 단계; 및 상기 코팅 또는 담지된 하이드로겔 캐리어를 하이드로겔 매질과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계는 하이드로겔 전구체에 세포를 혼합한 후 입자화를 수행할 수 있다. 상기 입자화는 통해 유화법 또는 압출적하법을 이용하여 수행될 수 있다.
또는 상기 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계는 하이드로겔 전구체에 의해 세포 현탁액을 캡슐화함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따른 생체구조체의 제조방법은 바이오잉크 조성물을 이용하여 하이드로겔 골격을 제조하는 단계; 바이오잉크 조성물 중의 보호제 성분이 코팅 또는 담지된 하이드로겔 캐리어를 분해하여, 상기 세포를 하이드로겔 골격으로 방출하는 단계; 및 상기 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다(도 1).
상기 하이드로겔 구조체를 제조하는 단계는 상기 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅, 3D 플로팅, 광학적 조형 또는 광학적 주조함으로써 수행될 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물 중의 보호제 성분이 코팅 또는 담지된 하이드로겔 캐리어를 분해하는 단계는 등의 외부 자극, 바람직하게는 세포친화적인 외부 자극을 통하여 수행될 수 있다. 상기 외부 자극은 세포 캡슐의 조립 방법에 의존한다. 물리적 또는 화학적으로 변형된 보호제를 사용한 세포 캡슐의 경우, 보호제는 EDTA와 같은 킬레이트제를 사용하거나, 온도 저하와 같은 세포적합성 처리를 통해 집합적으로 제거될 수 있다. 하이드로겔 캐리어가 쉘 형태로 형성된 경우 또는 다층 구조 입자의 경우, 세포 캡슐의 하이드로겔 캐리어 및/또는 보호제층은 단백질 분해효소 분해, 산 처리 등에 의하여 분해될 수 있다.
상기 방출된 세포는 하이드로겔 골격 표면의 내부 또는 외부에 시딩되어 그곳에서 성장할 수 있다. 세포가 시딩된 후에는 당업계에 공지된 조건 및 방법에 의하여 세포를 배양할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크는 3D 바이오프린팅 기술과 결합 시, 개선된 세포 생존 능력을 갖는 세포 함유 구조체를 생성할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 분산 형태의 세포 캡슐의 제조 (PG0.5-Alg)
1.1. L929 세포를 포함하는 알긴산 하이드로겔 캐리어의 제조
알긴산 150 g 및 증류수 100 ml를 혼합하여 1.5 w/v% 하이드로겔 전구체 용액을 제조하였다. 쥐의 L929 세포 현탁액 3 Χ 106 cells/ml를 상기 하이드로겔 전구체 용액에 혼합하고, 이를 공기구동식 압출 적하법을 이용하여 캡슐화시켰다.
이를 통하여, 세포를 포함하고, 약 75 μm 내지 약 575 μm의 다양한 입자 크기의 분포를 갖는 알긴산 하이드로겔 캐리어를 수득하였다(도 2의 A 및 B 참조).
1.2. 세포 캡슐에의 보호제의 담지
상기 실시예 1.1에서 수득된 알긴산 세포 캡슐을 0.5 mg/ml의 피로갈롤 용액에 함침시켜, 세포 캡슐의 내부에 피로갈롤을 담지하였다.
실시예 2. 분산 형태의 세포 캡슐의 제조 (PG1.0-Alg)
상기 실시예 1에서, 0.5 mg/ml의 피로갈롤 용액 대신, 1.0 mg/ml 의 피로갈롤 용액을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 세포 캡슐을 제조하였다.
실시예 3. 분산 형태의 세포 캡슐의 제조 (PG0.5-Alg-c)
상기 실시예 1에서, 0.5 mg/ml의 피로갈롤 용액에 함침시켜 세포 캡슐 내부에 피로갈롤을 담지하는 것 대신, 0.5 mg/ml의 피로갈롤 용액을 함침시켜 세포 캡슐 표면에 피로갈롤층을 형성한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 세포 캡슐을 제조하였다.
실시예 4. 분산 형태의 세포 캡슐의 제조 (PG1.0-Alg-c)
상기 실시예 1에서, 0.5 mg/ml의 피로갈롤 용액에 함침시켜 세포 캡슐 내부에 피로갈롤을 담지하는 것 대신, 1.0 mg/ml의 피로갈롤 용액을 함침시켜 세포 캡슐 표면에 피로갈롤층을 형성한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 세포 캡슐을 제조하였다.
비교예 1. 분산 형태의 세포 캡슐의 제조 (Alg)
알긴산 150 g 및 증류수 100 ml를 혼합하여 1.5 w/v% 하이드로겔 전구체 용액을 제조하였다. 쥐의 L929 세포 현탁액 3 Χ 106 cells/ml을 상기 하이드로겔 전구체 용액에 혼합하고, 이를 공기구동식 압출 적하법을 이용하여 캡슐화시켜, 보호제가 담지되거나 코팅되지 않은 세포 캡슐을 제조하였다.
실시예 5. 바이오 잉크의 제조 (PG0.5-Alg)
상기 실시예 1에서 수득된 담지된 세포 캡슐을 하이드로겔 매질로서 4 중량%의 젤라틴 메타크릴로일 (GelMA) 용액과 2:3의 질량비로 혼합하여, 바이오 잉크를 수득하였다.
실시예 6. 바이오 잉크의 제조 (PG1.0-Alg)
상기 실시예 2에서 수득된 코팅된 세포 캡슐을 하이드로겔 매질로서 4 중량%의 젤라틴 메타크릴로일 (GelMA) 용액과 2:3의 질량비로 혼합하여, 바이오 잉크를 수득하였다.
비교예 2. 바이오 잉크의 제조 (Alg)
상기 비교예 1에서 수득된 코팅되지 않은 세포 캡슐을 하이드로겔 매질로서 4 중량%의 젤라틴 메타크릴로일 (GelMA) 용액과 2:3의 질량비로 혼합하여, 바이오 잉크를 수득하였다.
실시예 7. 바이오 잉크를 이용한 하이드로겔 구조체의 생체제조 및 세포 배양
7.1. 하이드로겔 골격의 제조
상기 실시예 5, 6 및 비교예 2에서 수득된 바이오 잉크를 압출 3D 프린팅에 의하여 제조하고, 5분간 자외선을 조사하여, 격자 구조의 3차원 하이드로겔 골격을 제조하였다. 상기 하이드로겔 골격은 압출과 함께 조사되는 빛에 의하여 가교결합되었다 (도 3 의 A 및 B).
7.2. 세포의 방출
상기 실시예 7.1에서 수득한 하이드로겔 지지체를 킬레이트제인 EDTA로 처리하여, 코팅층 및 캐리어를 분해함으로써 세포를 하이드로겔 지지체로 방출시켰다.
7.3. 세포의 배양
상기 실시예 7.2에서 방출된 세포를 세포배양액(DMEM) 내에서 37°C 및 5% CO2 분위기 하에서 14일 동안 배양하여 증식시켰다.
배양 시작으로부터 14일 후 배양 결과를 공초점 레이저 스캔 현미경(CLSM)으로 관찰한 결과, 피로갈롤이 담지된 세포보호용 캐리는EDTA 처리 후 사라지고, 방출된 세포가 증식하며 넓게 분포되어 있음을 확인하였다(도 4).
실험예 1. 세포의 생존력 평가
본 발명에 따른 바이오잉크에서의 세포 생존력을 평가하기 위하여, 상기 실시예 7.1에서 자외선 조사 시간을 5분, 10분 및 15분으로 달리하여 조사한 후, 각각 72시간 및 144 시간 이후의 세포 증식도를 확인하였다.
실험 결과, 상기 실시예 1 및 2에서 수득된 세포 캡슐을 포함하는 바이오잉크 조성물을 이용하여 제조된 하이드로겔 골격체에서, 비교예에 비하여 우수한 세포 생존력을 가짐을 확인하였다. 특히, 자외선 조사시간이 15분까지 길어질수록 현저하게 높은 생존력과 증식을 나타내는 것을 확인하였다(도 5).
이를 통해 보건대, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 캡슐과 이를 포함하는 바이오잉크는 이를 통해 제조된 생체구조체의 확장성을 크게 늘리고 보다 긴 가교 시간을 허용할 수 있을 것으로 고려되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 세포 캡슐을 포함하는 바이오잉크 조성물에서,
    세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어, 및 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면 상 또는 내부에 제공되는 보호제를 포함하고,
    상기 보호제는 탄닌산, 피로갈롤, 폴리도파민, 인산칼슘, 탄산칼슘, 실리카, 이산화망간, 이산화티타늄, 폴리(노르에피네프린), 황산 덱스트란, 폴리(L-아르기닌), 폴리(글루탐산), 폴리(L-라이신) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하고,
    하이드로겔 매질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 하이드로겔 매질은 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하고,
    상기 하이드로겔 매질은 성장인자, 분화인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 캐리어는 구형의 상기 하이드로겔 캐리어 중에 상기 세포가 분산된 형태 또는 쉘 형태의 상기 하이드로겔 캐리어에 세포가 봉입되는 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 캐리어는 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 캐리어는 10 μm 내지 1,000 μm의 크기로 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 보호제는 상기 하이드로겔 캐리어의 일 표면에 0.1 μm 내지 100 μm의 두께로 제공되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 동물세포인 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 세포 캡슐은 상기 바이오잉크 조성물 중 1 중량% 내지 40 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계;
    상기 하이드로겔 캐리어의 표면 또는 내부에 보호제를 코팅 또는 담지하는 단계; 및
    상기 코팅 또는 담지된 하이드로겔 캐리어를 하이드로겔 매질과 혼합하는 단계
    를 포함하고,
    상기 보호제는 탄닌산, 피로갈롤, 폴리도파민, 인산칼슘, 탄산칼슘, 실리카, 이산화망간, 이산화티타늄, 폴리(노르에피네프린), 황산 덱스트란, 폴리(L-아르기닌), 폴리(글루탐산), 폴리(L-라이신) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하고,
    상기 하이드로겔 매질은 알긴산, 아가로오스, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하고,
    상기 하이드로겔 매질은 성장인자, 분화인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조방법.
  13. 상기 제12항에 있어서,
    상기 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계는 하이드로겔 전구체에 세포를 혼합한 후 입자화를 수행하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조방법.
  14. 상기 제13항에 있어서,
    상기 입자화는 통해 유화법 또는 압출적하법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조방법.
  15. 상기 제12항에 있어서,
    상기 세포를 포함하는 하이드로겔 캐리어를 제조하는 단계는 하이드로겔 전구체에 의해 세포 현탁액을 캡슐화함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조방법.
  16. 제1항의 바이오잉크 조성물 또는 제12항의 제조방법에 의해 제조되는 바이오잉크 조성물을 이용하여 하이드로겔 골격을 제조하는 단계;
    상기 바이오잉크 조성물 중의 상기 하이드로겔 캐리어 또는 보호제를 분해하여, 상기 세포를 하이드로겔 골격으로 방출하는 단계; 및
    상기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 생체구조체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 하이드로겔 골격을 제조하는 단계는 상기 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅, 3D 플로팅, 광학적 조형 또는 광학적 주조함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 생체구조체의 제조방법.
  18. 제16항의 생체구조체의 제조방법에 의해 제조되는 생체구조체.
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