CN111166934A - 一种用于体内杀菌且提高生物软骨组织修复性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药支架领域，是一种有利于软骨修复的纤维蛋白材料。该纤维蛋白材料是凝血酶作用下凝胶化的纤维蛋白原支架，支架中PLGA可携带Ag离子用于人体杀菌，可降解。高浓度纤维蛋白原提高了力学性能，提升了支架材料的耐降解性能。由于多孔的存在物质交换和生物信号交流的速度加快。营养物质在人体内经过多孔时交换速度增加。当多孔结构的纤维蛋白软骨修复材料移植到体内后，与人体骨组织具有良好的相容性，具有良好的结合能力，将实现软骨的再生。可实现软骨原位诱导再生，达到原位再生修复的目的，具有良好的临床应用前景。克服了目前临床胶原蛋白不能良好地修复骨软骨组织损伤的现象。

Description

一种用于体内杀菌且提高生物软骨组织修复性能的方法
技术领域
本发明涉及医药支架领域，涉及一种体内杀菌并且提高软骨组织修复性能的方法。
背景技术
关节表面是由软骨覆盖成为关节软骨，软骨正常情况下是对关节有很好的保护作用，摩擦力很低，允许关节能够正常的做各种弯曲和伸直的活动，这样的关节是正常的，不会有任何不适疼痛肿胀甚至弯曲受限都不会有这样的问题。但是如果由于一些原因软骨发生损伤，就会造成软骨的肿胀，表面起毛侵蚀龟裂破碎甚至脱落，严重的时候软骨下面的骨会暴露出来，这种软骨损伤治疗起来有一定的困难。软骨是没有血管的，里面有没有神经，软骨损伤开始可能没有症状但是随着软骨损伤加重，软骨下的骨暴露，软骨下的骨是有血管神经的，这样软骨下的骨也会受到损伤就会出现症状，出现的症状主要是疼痛为主，有的时候这种疼痛可能会比较模糊有时候可能比较尖锐在一些活动时候都会出现，例如上下楼梯膝盖正软骨损伤造成疼痛感会加重。
为克服这个问题，通过制作多孔纤维蛋白原支架，实现一端硬度高似固体可以黏附骨致密部，另一端弹性好似海绵可填补软骨的损伤空间，可以提高组织再生过程中细胞与细胞以及新生组织与原生组织之间的相互信号沟通，更好地实现新生组织的结构和功能化重塑。这样同时促进了骨软骨的再生以及与骨致密部的融合。
胶原，胶原是细胞外基质的主要成分，是人体中含量最丰富的一种结构蛋白。常用作组织工程材料的胶原主要是I型胶原，其中I型胶原在临床应用最为广泛。优点:来源广泛,容易获得、免疫原性低、生物安全性及生物相容性好、可降解吸收，且降解速率可控带有较多功能基团、利于改性、便于加工成多种形状。缺点:降解速率过快、机械强度不足、获得高纯度的胶原费用高。细胞外基质有其特殊的结构及功能蛋白组合,异体或异种的细胞抗原会被宿主细胞认作异物,从而诱导炎症反应或免疫排斥反应，脱细胞的方法通过去除组织或器官的细胞，而保留细胞外基质成分及结构。脱细胞材料也一直是组织工程产品构建原材料来源,由于软骨组织结构致密,难于将较厚的软骨进行脱细胞，研究发现通过粉碎软骨基质后再运用脱细胞试剂处理的方法可以将软骨内细胞成分去除，保留软骨细胞外基质成分，并通过冻干及交联的方法制备多孔生物支架。
发明内容
本发明公开了一种有利于软骨修复的纤维蛋白材料。为了修复软骨，特意研发了一种用于修复人体软骨的多孔结构。配制PVA17-88的水溶液。
取100mgPLGA(LA/GA=50/50，分子量5.5万)，溶于1ml的氯仿中:另取10 mgAgCl粉末沉淀物，加入此氯仿中，加入10uL三乙胺，静置10分钟，观察是否溶解，若不溶解，继续加5uL即可。
在1000rpm不停搅拌下，取上述氯仿溶液，逐滴加入含PVA17-88的水溶液中，水溶液的体积是是氯仿体积的25倍，加完后，高速（7000rpm）均质15s。转移至通风橱中，继续搅拌(600rpm)2分钟后。补加等体积蒸馏水，继续搅拌4小时。
待氯仿挥发完后，取溶液高速离心(15000rpm，温度4度) 1min，加适量蒸馏水分散后，冻干。由于小孔的孔径是2～10μm，我们根据要求标准选择粒径为2～10μm的PLGA微球作为致孔剂。
将PLGA微球和纤维蛋白粉按不同配比浓度1:1、1:2、1:3(g/mL)混合制成不同形状的复合材料，将混合物填入模具中压实，排出混合物中的空气，将模具及混合物放置65度温度下，达到使PLGA微球熔融粘结的温度，然后冷却到室温。
将纤维蛋白原溶解在生理盐水中,充分孵育10分钟至纤维蛋白原完全溶解，配制成10-40mg/ml的纤维蛋白原溶液。
将凝血酶溶解在40mlCaCl溶液中，配制成1-20U/ml的凝血酶溶液。将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的氯化钙溶液(1-20U/ml. 40mlCaCl)混合，并放置到装有碎冰的烧杯中，然后置于超声波破碎仪中（超声波探头频率为20KHz，直径6mm的钛金属探头），超生时间设置为6min，加碎冰控制样品温度为4-8度，将超声处理后的溶液置于模具中放于37度环境中保持1天，获得纤维蛋白凝胶。
将纤维蛋白凝胶从模具中移出，转移到丙酮溶液中浸泡，真空冷冻干燥得到纤维蛋白原支架。植入人体后，等PLGA携带药物的释放及PLGA微球降解便获得多孔纤维蛋白原支架。
本发明的优点：该纤维蛋白材料是凝血酶作用下凝胶化的纤维蛋白原支架，支架中含有相互连通的多孔结构。高浓度纤维蛋白原提高了力学性能，提升力支架材料的耐降解性能；对于多孔磷酸钙粉末中，能有效的改善磷酸钙骨的力学性能，同时加速其在体内的新陈代谢。多孔结构可以促进了物质交换及生物信号交流的速度。当多孔结构的纤维蛋白软骨修复材料移植到体内后，与人体骨组织具有良好的相容性，具有良好的结合能力。能实现软骨的再生。可实现软骨和软骨下骨缺损的原位诱导再生，达到原位再生修复的目的，具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
实例
配制PVA17-88的水溶液（1%）。；取100mgPLGA(LA/GA=50/50，分子量5.5万)，溶于1ml的氯仿中: 另取10 mgAgCl粉末沉淀物，加入此氯仿中，加入10uL三乙胺，静置10分钟，观察是否溶解，若不溶解，继续加5uL即可。在1000rpm不停搅拌下，取上述氯仿溶液，逐滴加入含PVA17-88的水溶液中，水溶液的体积是是氯仿体积的25倍，加完后，高速（7000rpm）均质15s。转移至通风橱中，继续搅拌(600rpm)2分钟后。补加等体积蒸馏水，继续搅拌4小时。待氯仿挥发完后，取溶液高速离心(15000rpm，温度4度) 1min，加适量蒸馏水分散后，冻干。我们所需要的支架中的多孔结构孔径为2～10μm，根据要求标准选择粒径为10～20μm的PLGA微球作为致孔剂; 将PLGA微球和纤维蛋白粉按不同配比浓度1:1(g/mL)混合制成不同形状的复合材料，将混合物填入模具中压实，排出混合物中的空气，将模具及混合物放置65度温度下，达到使PLGA微球熔融粘结的温度，然后冷却到室温。将纤维蛋白原溶解在生理盐水中,充分孵育10分钟至纤维蛋白原完全溶解，配制成30mg/ml的纤维蛋白原溶液。将凝血酶溶解在40mlCaCl溶液中，配制成1-20U/ml的凝血酶溶液。将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的氯化钙溶液(1-20U/ml. 40mlCaCl)混合，并放置到装有碎冰的烧杯中，然后置于超声波破碎仪中（超声波探头频率为20KHz，直径6mm的钛金属探头），超生时间设置为6min，加碎冰控制样品温度为4-8度，将超声处理后的溶液置于模具中放于37度环境中保持1天，获得纤维蛋白凝胶。将纤维蛋白凝胶从模具中移出，真空冷冻干燥得到纤维蛋白原支架。植入人体后，等PLGA携带药物的释放及PLGA微球降解便获得多孔纤维蛋白原支架。
配制PVA17-88的水溶液（1%）。；取100mgPLGA(LA/GA=50/50，分子量5.5万)，溶于1ml的氯仿中: 另取10 mgAgCl粉末沉淀物，加入此氯仿中，加入10uL三乙胺，静置10分钟，观察是否溶解，若不溶解，继续加5uL即可。在1000rpm不停搅拌下，取上述氯仿溶液，逐滴加入含PVA17-88的水溶液中，水溶液的体积是是氯仿体积的25倍，加完后，高速（7000rpm）均质15s。转移至通风橱中，继续搅拌(600rpm)2分钟后。补加等体积蒸馏水，继续搅拌4小时。待氯仿挥发完后，取溶液高速离心(15000rpm，温度4度) 1min，加适量蒸馏水分散后，冻干。我们所需要的支架中的多孔结构孔径为2～10μm，根据要求标准选择粒径为10～20μm的PLGA微球作为致孔剂; 将PLGA微球和纤维蛋白粉按不同配比浓度1:3(g/mL)混合制成不同形状的复合材料，将混合物填入模具中压实，排出混合物中的空气，将模具及混合物放置65度温度下，达到使PLGA微球熔融粘结的温度，然后冷却到室温。将纤维蛋白原溶解在生理盐水中,充分孵育10分钟至纤维蛋白原完全溶解，配制成30mg/ml的纤维蛋白原溶液。将凝血酶溶解在40mlCaCl溶液中，配制成1-20U/ml的凝血酶溶液。将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的氯化钙溶液(1-20U/ml. 40mlCaCl)混合，并放置到装有碎冰的烧杯中，然后置于超声波破碎仪中（超声波探头频率为20KHz，直径6mm的钛金属探头），超生时间设置为6min，加碎冰控制样品温度为4-8度，将超声处理后的溶液置于模具中放于37度环境中保持1天，获得纤维蛋白凝胶。将纤维蛋白凝胶从模具中移出，真空冷冻干燥得到纤维蛋白原支架。植入人体后，等PLGA携带药物的释放及PLGA微球降解便获得多孔纤维蛋白原支架。
配制PVA17-88的水溶液（1%）。；取100mgPLGA(LA/GA=50/50，分子量5.5万)，溶于1ml的氯仿中: 另取10 mgAgCl粉末沉淀物，加入此氯仿中，加入10uL三乙胺，静置10分钟，观察是否溶解，若不溶解，继续加5uL即可。在1000rpm不停搅拌下，取上述氯仿溶液，逐滴加入含PVA17-88的水溶液中，水溶液的体积是是氯仿体积的25倍，加完后，高速（7000rpm）均质15s。转移至通风橱中，继续搅拌(600rpm)2分钟后。补加等体积蒸馏水，继续搅拌4小时。待氯仿挥发完后，取溶液高速离心(15000rpm，温度4度) 1min，加适量蒸馏水分散后，冻干。我们所需要的支架中的多孔结构孔径为2～10μm，根据要求标准选择粒径为10～20μm的PLGA微球作为致孔剂; 将PLGA微球和纤维蛋白粉按不同配比浓度1:5(g/mL)混合制成不同形状的复合材料，将混合物填入模具中压实，排出混合物中的空气，将模具及混合物放置65度温度下，达到使PLGA微球熔融粘结的温度，然后冷却到室温。将纤维蛋白原溶解在生理盐水中,充分孵育10分钟至纤维蛋白原完全溶解，配制成30mg/ml的纤维蛋白原溶液。将凝血酶溶解在40mlCaCl溶液中，配制成1-20U/ml的凝血酶溶液。将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的氯化钙溶液(1-20U/ml. 40mlCaCl)混合，并放置到装有碎冰的烧杯中，然后置于超声波破碎仪中（超声波探头频率为20KHz，直径6mm的钛金属探头），超生时间设置为6min，加碎冰控制样品温度为4-8度，将超声处理后的溶液置于模具中放于37度环境中保持1天，获得纤维蛋白凝胶。将纤维蛋白凝胶从模具中移出，真空冷冻干燥得到纤维蛋白原支架。植入人体后，等PLGA携带药物的释放及PLGA微球降解便获得多孔纤维蛋白原支架。

Claims (4)

1.一种用于软骨修复的纤维蛋白材料的制备，该纤维蛋白材料是凝血酶作用下凝胶化的纤维蛋白原支架，支架中含有相互连通的多孔结构，小孔孔径为2～10μm，支架的孔隙率为40～70％，该方法步骤如下：
(1)PLGA微球的制备
a)配制PVA17-88的水溶液（1%），（17 表示平均聚合浓度1700~1800，88 表示醇解度均为88%）；
b)取100mgPLGA(LA/GA=50/50，分子量5.5万)，溶于1ml的氯仿中:另取10mgAgCl粉末沉淀物，加入此氯仿中，加入10uL三乙胺，静置10分钟，观察是否溶解，若不溶解，继续加5uL即可；
c）在1000rpm不停搅拌下，取上述氯仿溶液，逐滴加入含PVA17-88的水溶液中，水溶液的体积是是氯仿体积的25倍，加完后，高速（7000rpm）均质15s，转移至通风橱中，继续搅拌(600rpm)2分钟后，补加等体积蒸馏水，继续搅拌4小时；
d) 待氯仿挥发完后，取溶液高速离心(15000rpm，温度4度) 1min，加适量蒸馏水分散后，冻干；
e）因为我们所需要的支架中的多孔结构孔径为2～10μm，根据要求标准选择粒径为10～20μm的PLGA微球作为致孔剂；
f）将PLGA微球和纤维蛋白粉按不同配比浓度1:1、1:2、1:3(g/mL)混合制成不同形状的复合材料，将混合物填入模具中压实，排出混合物中的空气，将模具及混合物放置65度温度下，达到使PLGA微球熔融粘结的温度，然后冷却到室温；
(2) 纤维蛋白凝胶制备
a)将纤维蛋白原溶解在生理盐水中,充分孵育10分钟至纤维蛋白原完全溶解，
配制成10-40mg/ml的纤维蛋白原溶液；
b)将凝血酶溶解在40mlCaCl溶液中，配制成1-20U/ml的凝血酶溶液，将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的氯化钙溶液(1-20U/ml. 40mlCaCl)混合，并放置到装有碎冰的烧杯中，然后置于超声波破碎仪中（超声波探头频率为20KHz，直径6mm的钛金属探头），超生时间设置为6min，加碎冰控制样品温度为4-8度，将超声处理后的溶液置于模具中放于37度环境中保持1天，获得纤维蛋白凝胶；
(3) 将纤维蛋白凝胶从模具中移出，真空冷冻干燥得到纤维蛋白原支架，植入人体后，等PLGA携带药物的释放及PLGA微球降解便获得多孔纤维蛋白原支架。
2.根据权利要求1所述的一种用于体内杀菌且提高生物软骨组织修复性能的方法，PLGA微球可以携带对人体有益的物质，在此基础上，在PLGA微球内混入了银离子，人体可以对银离子吸收，有杀菌的效用，多孔结构增加了物质交换和生物信号交流的速度，营养物质在人体内经过多孔时交换速度增加。
3.根据权利要求1所述的一种用于体内杀菌且提高生物软骨组织修复性能的方法，PLGA微球进入人体后可降解，并且高浓度纤维蛋白原提高了力学性能，当多孔结构的纤维蛋白软骨修复材料移植到体内后，与人体骨组织具有良好的相容性，具有良好的结合能力，将实现软骨的再生。
4.根据权利要求1所述的一种用于体内杀菌且提高生物软骨组织修复性能的方法，超声对纤维蛋白凝胶的制备具有促进作用，可以加快凝血酶溶液溶解的速度，且在超声的作用下，溶液制备的更加均匀。
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