CN111790004A - 一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,包括：⑴利用乳化法制备PLGA微球；⑵配制骨水泥粉末；⑶制备钙磷骨水泥微球混合支架；⑷多孔支架的制备及灭菌；⑸缓释曲线测定。本方法能通过控制PLGA微球的大小从而控制钙磷骨水泥的孔径大小。为制备钙磷骨水泥多孔支架提供了参考，为干细胞完成体内成骨细胞转化提供了合适的“巢穴”，为开发制备最优骨缺损移植物提供了技术基础。

Description

一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及多孔支架制备技术，尤其是一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法。
背景技术
骨是一种动态组织，不断通过重塑进行修复和自我更新，骨组织中涉及多种细胞、信号因子、生长因子等。人体骨组织细胞主要包含成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、骨内膜细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞等。而人成骨细胞的直径在10-100um之间，是由骨髓间充质干细胞分化而成。目前骨组织研究主要集中于生物支架材料、种子细胞及因子的研究。
钙磷骨水泥是一种非陶瓷羟基磷灰石，是具有生物活性的骨修复材料，通常由液相、固相和改性剂组成。磷酸钙骨水泥(CPC)的固相至少有磷酸三钙(PCP)、二水磷酸氢钙(DCPD)、磷酸二氢钙(MCPM)、磷酸四钙(TTCP)、无水磷酸氢钙(DCPA)等其中2种磷酸钙盐组合而成。液相通常为血液、生理盐水、稀酸等液体。为了提高骨水泥的性能，可以在液相或固相中加入一定量的改性剂，如加入磷灰石晶种可以提高骨水泥强度、缩短凝结时间，添加氟化物可以促进骨水泥凝固，加入钾、钠离子基团可以促进骨代谢等。
人的骨骼中约有33-43％是磷灰石矿物，与磷酸钙骨水泥水解后的产物羟基磷灰石的组成完全一致。因此，自1985年Brown等最早研制出此类可生物降解的骨替代材料后，钙磷骨水泥在修复人骨缺损上“大展拳脚”。
人骨组织中通过大量尺寸不一的孔来增强骨硬度、养分的运输、细胞行为的展开、有机物质的沉积等等。通过不断研究，研究人员将种子细胞的目标逐渐锁定为间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。所以在骨组织工程学的应用于治疗骨缺损时，应注意支架孔径大小与孔隙率对干细胞向成骨细胞转化的影响。常用的钙磷骨水泥致孔方法包括添加碳酸盐类致孔剂气体致孔，添加明胶微球、石蜡微球类致孔剂，冷冻干燥法制备骨水泥支架等。其中，传统的冷冻干燥法步骤复杂，通常需要预冷冻、添加交联剂、冷冻干燥等多个步骤，增加了材料制备的成本。而钙磷骨水泥支架的载药难题也一直困扰广大骨组织工程学的研究学者。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法，有效解决控制钙磷骨水泥孔径和解决钙磷骨水泥载药难的技术问题。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,所述的钙磷骨水泥支架可载多种蛋白类、多肽类、细胞因子或激素，并且拥有相同的孔径，所述的通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法具体步骤如下：
(1)利用乳化法制备粒径在200-400μm的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)微球；
(2)配制骨水泥粉末：将磷酸四钙Ca4(PO4)2O(TTCP)和无水磷酸氢钙CaHPO4(DCPA)粉末进行混合制备成CPC粉末，其中Ca4(PO4)2O的摩尔分数为33-50％，CaHPO4的摩尔分数为77-50％；
(3)制备钙磷骨水泥微球混合支架：将CPC粉末与固化液按照10g：3-10mL调和均匀后，与PLGA微球混合均匀后迅速填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温静置2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻3-8h，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时以上，即得到混合支架。
(4)多孔支架的制备及灭菌：使用4℃丙酮浸泡混合支架，后用冷无水乙醇浸泡，而后依次用冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥后用紫外灯进行灭菌待用，低温干燥温度低于25℃。
(5)缓释曲线测定：将支架浸渍在PBS中，置于摇床上。在预定的时间点取出1mlPBS，并及时补充1ml新鲜PBS。待收集完毕时，对收集的清液用定量分析法测定蛋白浓度，并绘制释放曲线。
步骤(3)中的固化液是指将蛋白类、多肽类、细胞因子或激素溶于无菌PBS中，其中蛋白类的PBS溶液的浓度为0.1mg/ml。PLGA微球与CPC粉末的重量比为1：10。
步骤(3)中的固化液可以为蛋白类的PBS溶液,包括纤连蛋白(Fibronectin，Fn)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、重组人BMP-2蛋白(Recombinant human BMP-2protein,rhBMP-2)、骨延蛋白(Bone sialoprotein,IBSP)、cRGD多肽等具有增加细胞对支架的黏附和促进干细胞向成骨方向分化功能的蛋白。
步骤(3)中的固化液可以为化学药物的PBS溶液,包括地塞米松(Dexamethasone，DEX)、L-抗坏血酸(Ascorbic Acid)等具有促进干细胞向成骨方向或成脂方向分化功能的化学药物。
步骤(3)中的固化液可以为细胞因子的PBS溶液,包括血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)、外泌体等存在促进血管生成增加支架微环境营养含量的功能的细胞因子。
步骤(3)中的固化液可为极少数抗炎症药物和抗生物类药物。
PBS溶液，其溶质皆溶于水而不溶于丙酮和乙醇或极少溶于乙醇。
步骤(5)中的预定时间点为1、2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72天。
步骤(5)的蛋白浓度定量分析法中，纤连蛋白检测使用厂家为上海酶联生物科技有限公司试剂盒，货号：ml001410。其中BSA检测使用酶标仪，检测波长为595nm。其中地塞米松的检测使用酶标仪，检测波长为241nm。
本发明的优点和积极效果是：
本发明鉴于涉及支架中药物的活性和释放属性，载药钙磷骨水泥多孔支架，全程处于温和、低温、无失活剂存在等条件下进行的，且整个过程中使用的丙酮、乙醇都不会减少目的蛋白的浓度，可以保证目的蛋白在整个过程中不会变性、浓度保持在较高水平，且整个支架可缓慢持续的释放药物。
本发明提供了一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法，并能通过控制PLGA微球的大小从而控制钙磷骨水泥的孔径大小。为制备钙磷骨水泥多孔支架提供了参考，为干细胞完成体内成骨细胞转化提供了合适的“巢穴”，为开发制备最优骨缺损移植物提供了理论基础。
附图说明
图1为空白钙磷骨水泥多孔支架的照片；
图2为载纤连蛋白钙磷骨水泥多孔支架的照片和纤连蛋白的缓释曲线。
图3为载BSA钙磷骨水泥多孔支架的照片和BSA的缓释曲线；
图4为载DEX钙磷骨水泥多孔支架的照片和DEX的缓释曲线；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,方法步骤如下：
⑴利用乳化法制备PLGA微球；
⑵配制骨水泥粉末：将磷酸四钙Ca4(PO4)2O和无水磷酸氢钙CaHPO4粉末进行混合制备成CPC粉末；
⑶制备钙磷骨水泥微球混合支架：将CPC粉末与固化液按照10g：3-10mL调和均匀后，与PLGA微球混合均匀后迅速填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温静置2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻3-8h，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时以上，即得到混合支架；
⑷多孔支架的制备及灭菌：使用4℃丙酮浸泡混合支架，后用冷无水乙醇浸泡，依次用冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥后用紫外灯进行灭菌待用，低温干燥温度低于25℃；
⑸缓释曲线测定：将支架浸渍在PBS中，置于摇床上后取出1mlPBS，并及时补充1ml新鲜PBS，待收集完毕，对收集的清液用定量分析法测定蛋白浓度，并绘制释放曲线。
而且，PLGA微球粒径在200-400μm。
而且，Ca4(PO4)2的摩尔分数为33-50％，CaHPO4的摩尔分数为77-50％。
而且，步骤⑶中的固化液包括蛋白类、多肽类、细胞因子或激素，溶于无菌PBS中，其中蛋白类的PBS溶液的浓度为0.1mg/ml，PLGA微球与CPC粉末的重量比为1：10。
而且，蛋白类的PBS溶液包括纤连蛋白、牛血清白蛋白、重组人BMP-2蛋白、骨延蛋白、多肽。
而且，步骤⑶中的固化液包括化学药物的PBS溶液：地塞米松、L-抗坏血酸。
而且，步骤⑶中的的固化液包括细胞因子的PBS溶液：血小板源性生长因子、血管内皮内皮生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、外泌体。
而且，步骤⑶中的固化液包括抗炎症药物和抗生物类药物。
而且，步骤⑸中的预定时间点为1、2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72天。
实施例1
将磷酸四钙Ca4(PO4)2O(TTCP)和无水磷酸氢钙CaHPO4(DCPA)粉末按照摩尔比为1:2进行混合制备成CPC粉末。将CPC粉末与无菌PBS溶液按照10g：3mL调和均匀后，与1gPLGA微球混合均匀后填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平，室温预固化2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻5h以上，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时。而后将此水化的骨水泥在4℃丙酮浸泡20min，后依次用冷无水乙醇、冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥干燥后用紫外灯进行灭菌待用。测得支架的孔与孔之间相互连通，孔径大小为150-400μm，孔隙率分43.5％(图1)。
实施例2
将磷酸四钙Ca4(PO4)2O(TTCP)和无水磷酸氢钙CaHPO4(DCPA)粉末按照摩尔比为1:2进行混合制备成CPC粉末。将CPC粉末与Fn的PBS溶液按照10g：3mL调和均匀后，与1gPLGA微球混合均匀后填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温预固化2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻5h以上，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时。而后将此水化的骨水泥在4℃丙酮浸泡20min，后依次用冷无水乙醇、冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥干燥后用紫外灯进行灭菌待用。使用Fn检测试剂盒检测纤连蛋白的释放并绘制了Fn的释放曲线(图2)。
实施例3
将磷酸四钙Ca4(PO4)2O(TTCP)和无水磷酸氢钙CaHPO4(DCPA)粉末按照摩尔比为1:2进行混合制备成CPC粉末。将CPC粉末与BSA的PBS溶液按照10g：3mL调和均匀后，与1gPLGA微球混合均匀后填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温预固化2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻5h以上，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时。而后将此水化的骨水泥在4℃丙酮浸泡20min，后依次用冷无水乙醇、冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥干燥后用紫外灯进行灭菌待用。使用酶标仪在595nm处检测BSA的释放并绘制了BSA的释放曲线(图3)。
实施例4
将磷酸四钙Ca4(PO4)2O(TTCP)和无水磷酸氢钙CaHPO4(DCPA)粉末按照摩尔比为1:2进行混合制备成CPC粉末。将CPC粉末与地塞米松(DEX)的PBS溶液按照10g：3mL调和均匀后，与1gPLGA微球混合均匀后填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温预固化2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻5h以上，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时。而后将此水化的骨水泥在4℃丙酮浸泡20min，后依次用冷无水乙醇、冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥干燥后用紫外灯进行灭菌待用。使用酶标仪在241nm处检测DEX的释放并绘制了DEX的释放曲线(图4)。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (9)

1.一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：方法步骤如下：
⑴利用乳化法制备PLGA微球；
⑵配制骨水泥粉末：将磷酸四钙Ca4(PO4)2O和无水磷酸氢钙CaHPO4粉末进行混合制备成CPC粉末；
⑶制备钙磷骨水泥微球混合支架：将CPC粉末与固化液按照10g：3-10mL调和均匀后，与PLGA微球混合均匀后迅速填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温静置2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻3-8h，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时以上，即得到混合支架；
⑷多孔支架的制备及灭菌：使用4℃丙酮浸泡混合支架，后用冷无水乙醇浸泡，依次用冷无菌水、冷无菌PBS快速清洗，低温干燥后用紫外灯进行灭菌待用，低温干燥温度低于25℃；
⑸缓释曲线测定：将支架浸渍在PBS中，置于摇床上，取出1mlPBS，并及时补充1ml新鲜PBS，待收集完毕，对收集的清液用定量分析法测定蛋白浓度，并绘制释放曲线。
2.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：PLGA微球粒径在200-400μm。
3.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：Ca4(PO4)2O的摩尔分数为33-50％，CaHPO4的摩尔分数为77-50％。
4.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：步骤⑶中的固化液包括蛋白类、多肽类、细胞因子或激素，溶于无菌PBS中，其中蛋白类的PBS溶液的浓度为0.1mg/ml，PLGA微球与CPC粉末的重量比为1：10。
5.根据权利要求4所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：蛋白类的PBS溶液包括纤连蛋白、牛血清白蛋白、重组人BMP-2蛋白、骨延蛋白、多肽。
6.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：步骤⑶中的固化液包括化学药物的PBS溶液：地塞米松、L-抗坏血酸。
7.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：步骤⑶中的的固化液包括细胞因子的PBS溶液：血小板源性生长因子、血管内皮内皮生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、外泌体。
8.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：步骤⑶中的固化液包括抗炎症药物和抗生物类药物。
9.根据权利要求1所述的一种通用型载药钙磷骨水泥多孔支架制备方法,其特征在于：步骤⑸中的预定时间点为1、2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72天。
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