KR20100085982A

KR20100085982A - 성장 인자가 탑재된 입자를 제조하는 방법 및 이 방법으로 수득된 입자

Info

Publication number: KR20100085982A
Application number: KR1020107010886A
Authority: KR
Inventors: 허벌트 제니슨; 크리스틴 주린든
Original assignee: 허벌트 제니슨
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2010-07-29
Also published as: AU2008320842A1; HK1146812A1; JP5596548B2; CA2704123C; US20100255042A1; CN101883593A; WO2009056567A2; AU2008320842B2; CA2704123A1; JP2011500299A; ES2603273T3; WO2009056567A3; EP2209505B1; EP2209505A2; DE102007051914A1

Abstract

본 발명은 성장 인자를 사용하여 탑재된 입자 물질(입자)을 제조하는 방법, 그렇게 하여 수득된 입자 및 골질의 내부로 임플란트 물질의 내증식을 향상시키기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

성장 인자가 탑재된 입자를 제조하는 방법 및 이 방법으로 수득된 입자{Process for producing particles loaded with growth factors as well as the particles thus obtained}

본 발명은 성장 인자가 탑재된(loaded) 미립자 물질(입자)을 제조하는 방법, 이 방법으로 수득된 입자 및 골질(bone substance) 안으로 임플란트 물질의 성장을 향상시키기 위한 이 입자의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로 임플란트는 물론이고 인공뼈, 인공 관절, 치아 임플란트와 같은 임플란트에 사용되는 금속성 또는 세라믹 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

예를 들어 관절 형성이상(joint dysplasia)이나 탈구(luxation)의 치료, 또는 관절 위치이상(joint misplacement)에 의한 관절의 마모에 의한 질환과 관련해서, 인공 관절이나 인공뼈의 이식은 지난 몇 년 동안에 점점 더 중요해지고 있다. 임플란트 및 임플란트를 제조하는데 사용되는 물질 - 이러한 물질로는 티타늄 또는 금속 합금과 같은 금속 외에도 테플론(Teflon) 또는 폴리락타이드(polylactide)와 같은 세라믹 또는 플라스틱 물질을 포함한다. - 의 성능은 끊임없이 개량되어 전체 케이스 중 90 내지 95%의 케이스에서 성공적인 치료 과정이 진행한 후에, 임플란트는 최대 10년까지의 내용 연한(service lifetime)을 제공할 수 있다.

이러한 기술의 진전 및 개량된 수술 공정에도 불구하고, 이식은 여전히 어렵고 부담되는 시술(intervention)로서, 특히 임플란트를 위한 이식은 장기간 지속되는 치료 과정과 연계되어 있어서, 재활 조치를 포함하여 클리닉 또는 요양원에서 장기간의 체제를 포함하게 된다. 이러한 고통 외에도, 치료 기간의 장기화는 물론이고 익숙한 환경에서 떨어져 있게 된다는 사실은 관련된 환자에게는 엄청난 스트레스이다. 아울러, 장기간 지속되는 치료 과정으로 인해, 집중적인 보호가 요구되는 결과, 서비스 및 치료를 위해서 많은 비용이 야기된다.

임플란트가 성공적으로 내증식(ingrowth)하기 위하여 요구되는, 분자 수준에서의 공정에 대한 이해가 지난 몇 년 동안 점진적으로 확대되었다. 임플란트의 조직 적합성(tissue compatibility)을 위해서는 임플란트의 구조 적합성과 표면 적합성이 결정적이다. 보다 좁은 의미에서 생체적합성(biocompatibility)은 오로지 임플란트의 표면에 의해서 좌우된다. 단백질이 모든 수준의 통합(integration)을 위해서 중요한 역할을 수행한다. 후술하는 것과 같이, 초기 흡착 단백질 층(initial adsorbed protein layer)이 형성되기 때문에, 최초 세포(first cells)가 이 초기 흡착 단백질 층으로 침전(settle)될 때, 이식 시술 단계에서 이미 단백질은 임플란트의 내증식이라는 추후의 공정에 대해서 결정하고 있다.

임플란트와, 생체물질(biomaterial)이라고도 또한 언급되는 조직 사이에서의 분자 수준의 상호 작용을 위해서, 다수의 반응이 일어나는데 이러한 반응은 상당히 계층적으로 구성되어 있는 것으로 보인다. 최초의 생물학적 반응으로서, 생체물질의 표면에서 단백질의 흡착이 일어난다. 이렇게 형성된 단백질 층에서, 각각의 단백질 분자가 순차적으로 변환되는데, 이러한 변환의 일예로서, 단백질의 3차원 구조의 변화(conformational change)에 의하여 각각의 단백질 분자가 신호전달 물질(signalling substance)로 변하여 임플란트 표면 위에 제시되거나, 촉매(단백질 분해) 반응에 의하여 단백질 단편들이 신호 전달 물질(분자적 신호(molecular cue))로 운반된다.

전술한 분자적 신호에 의하여 유발되어, 다음 단계에서 세포 침전(cellular settling)이 일어나는데, 이러한 세포 침전은 백혈구, 대식세포(macrophage), 면역세포(immunocyte)와 같은 다수의 세포와, 최종적으로 또한 조직 세포(섬유아세포(fibroblasts), 섬유세포(fibrocytes), 골모세포(osteoblasts), 골세포(osteocytes))를 포함하고 있다. 이 단계에서, 예를 들어 사이토카인(cytokines), 케모카인(chemokines), 모르포겐(morphogens), 조직 호르몬, 진성 호르몬(genuine hormone)과 같은 이른바 매개물질(mediators)인 다른 신호전달 물질이 중요한 역할을 수행한다. 생체적합성과 관련하여, 전체 유기체 내부로 임플란트의 통합이 일어나며, 이상적으로, 영구적 임플란트가 얻어진다.

골형성(osteogenesis)의 분자적 수준의 반응과 관련하여 지난 몇 년 동안 수행되었던 연구를 살펴보면, 화학적 신호전달 물질, 골 성장에 영향을 미치는 이른바 "골형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)"(BMP-1 내지 BMP-15)이 점점 더 중요해지고 있다. BMP(특히 BMP-2 및 BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7)는 골유도 단백질(osteoinductive protein)로서, 전구 세포가 골모세포로 증식하고 분화되는 과정에 영향을 미침으로써 골형성과 뼈의 치료를 자극한다. 뿐만 아니라, BMP는 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 호르몬 수용체(hormone receptor), 콜라겐 타입-1(collagen type 1), 오스테오칼신(ostecocalcin), 오스테오폰틴(osteopontin)과 같은 골-특이 물질(bone-specific substance) 및 최종적으로 석회침착(mineralization)의 형성을 촉진하는데 도움을 준다.

BMP 분자들은 각각의 전구세포에 대한 화학주성(chemotaxis), 체세포분열(mitosis) 및 분화(differentiation)라는 3개의 중요한 반응을 조절한다. 뿐만 아니라, BMP는 뼈와 다른 조직의 배형성(embryogenesis), 기관형성(organogenesis)에서 중요한 역할을 수행하며, 이에 따라 골모세포, 연골모세포(chondroblast), 근모세포(myoblast) 및 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)는 (BMP-2에 의한 증식을 억제하는) 표적 세포로 알려져 있다.

한편, 다수의 이형체(isoform)를 포함하는 15개의 BMP가 알려져 있다. BMP-1을 제외하고, 모든 BMP는 "형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β)" 슈퍼패밀리(superfamily)의 일부로서, 각각의 세포 표면에서는 특정 수용체가 검출된다. 쥐, 개, 토끼 및 원숭이에 대한 질환 치유(defect healing) 공정 실험에서 재조합 BMP-2 및/또는 BMP-7이 성공적으로 사용하였다는 점이 입증됨에 따라, 임의의 종에 대한 특이성은 존재하지 않는 것으로 보인다.

선행기술에서, 골질의 성장을 촉진시키기 위해 사용된 탑재된 물질 및 입자의 분야에 관하여 많은 수의 실험이 알려져 있다. 수산화인회석(hydroxyl apatite, HAP)으로 BMP-2를 결합시키는 것과 관련한 보고는 BMP 연구의 초기로 거슬러 올라가는데, BMP가 수산화인회석 칼럼에서 크로마토그래피 기법에 의하여 정제될 수 있다고 1984년 Urist에 의하여 발견되었다. 같은 해에 이미 Urist는, 쥐에서 연골(cartilage) 형성을 유도하는 BMP와 TCP(tricalcium phosphate, 제3인산칼슘)의 응집물(aggregate)을 설명하고 있다(미국특허 4,596,574호). 그 후 20년 동안, BMP-2와 인산칼슘(수산화인회석, 제3인산칼슘)을 조합하여 사용하는 것에 대하여 다수의 보고서가 발행되었다. 그 중에서도, BMP-2를 소정 양의 콜라겐 또는 수산화인회석과 혼합한 뒤에, 혼합물을 즉시 감압 동결건조 시키고, 동결건조 후에 사용하는 것이 언급되어 있다. 다른 보고서에서, 요소(urea)와 같은 변성제(denaturation agent)가 존재하는 상태에서 변성된 rh-BMP-2를 수산화인회석에 흡착시키는 것이 연구되고 있다. 이와 같은 가혹한 조건에서도, 단지 소량의 BMP-2만이 수산회인회석에 결합된다.

현재, BMP-2는 "흡착성 콜라겐 스펀지(adsorbable collagen sponge)" 표면 위의 Induct Os® (Wyeth사) 또는 Ossigraft® (Stryker사)의 형태로 치료를 위해 제공되고 있다. 단위 부피 당 사용되는 BMP의 농도가 상대적으로 낮다는 점이 이들 물질에 공통적인데, 예를 들어, 1 ㎎의 BMP-2에 대해서 각각 약 2 ㎖ 부피의 입자 또는 스펀지가 필요하다. 알칼리 또는 산성 범위와 같이 극단적인 pH-값을 갖는 비-생리적 조건에서 또는 중성 범위에서는 계면활성제(detergent)가 존재하는 경우에 한하여 다량의 BMP-2가 용해될 수 있다. 많은 경우에 이러한 정도의 양은 BMP-2의 공급을 위해서는 부족하며, 상처의 크기에 맞춰 개조되고, 특히 여분의 골 치환 물질(bone replacement substances)이 존재하는 경우에, 골 성장을 최적으로 자극하기 위해서는 충분하지 않다. BMP-2가 콜라겐에 불충분하게 결합하기 때문에, 동시에 단일 분자의 초기 운송 단계(single early delivery phase, "분출 단계(burst phase))"에서, 이러한 공급 형태로 인하여, 유기체로의 BMP-2의 공급은 방해를 받고 있다.

1. Spassova, E., Gintenreiter, S., Halwax, E., Moser, D., Schopper, C., & Ewers, R. (2007) Chemistry, Ultrastructure and Porosity of Monophasic and Biphasic Bone Forming Materials Derived from Marine Algae. Materialwiss. Werkstofftech., 38, 1027-1034.

2. Lichtinger, T.K., Mㆌller, R.T., Schㆌrmann, N., Wiemann, M., Chatzinikoleidou, M., Rumpf, H.M., & Jennissen, H.P. (2001) Osseointegration of Titanium Implants by Addition of Recombinant Bone Morphogenetic Protein 2 (rhBMP-2). Materialwiss. Werkstofftech., 32, 937-941.

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명의 목적은 보다 많은 양의 성장 인자가 고정되도록 입자 형태의 무기 물질을 제조하는 방법 및 이러한 방법을 통해서 수득된 무기 물질을 제공한다.

하기에서 설명되는 본 발명은, 만약 흡착 단계가 충분히 긴 시간 동안 제어된 pH 값에서 수행되는 경우, 입자 물질, 특히 수산화인회석(hydroxyl apatite, HAP), 제3인산칼슘(tricalcium phosphate, TCP), 탄산칼슘, 산화알루미늄 또는 이들의 혼합물, 특히 이형상(biphasic) 또는 삼형상(triphasic)인 이들 혼합물과 같은 무기 골이식 물질(bone replacement material)인 입자 물질 표면에 BMP-2를 흡착시킴으로써, 위에서 언급한 물질과 비교해서, 단위 부피부(volume part)에 대해서 보다 많은 양의 BMP, 특히 고체상 표면에서 보다 많은 양의 BMP-2가 얻어질 수 있다는 관찰에 기초하고 있다. 이 흡착 단계 후에, 두 번째 단계는, 바람직하게는 흡착 단계에서 사용된 고체상 부피와 비교하여 적어도 10 배의 부피의 액체를 사용하는 광범위한 세척 단계로서 수행된다. 이에 따라, 액체상(liquid phase)에서의 용융성 BMP-2의 양이 제거되었다는 사실을 확인할 수 있다. 그렇게 함으로써, 흡착된 BMP-2 양의 1-2% 수준으로, 소위 분출 단계에서 제거되는 BMP의 양을 상당히 감소시킬 수 있다. 따라서 작은 격벽(compartment) 내에 높은 농도(high dose)로 BMP-2를 공급하는 선택이 수행될 수 있다. 수용성 완충액 내에서 표면을 코팅하는 단계는 특히 pH 4.5인 pH 4 내지 5 범위의 산성 조건이나, 바람직하게는 ph 10인 pH 9 내지 11 사이의 약알칼리성 범위에서 수행될 수 있다. 또한, 전술한 입자 물질이 생체흡착성(bioresorbable) 물질이라면 좋다.

본 발명에 따르면, BMP와 같은 성장 인자로 탑재된 무기 물질을 제조하는 과정에서, 일정한 조건에서 무기 물질을 반응시키는 경우에 다량의 성장 인자가 얻어질 수 있다. 이에 따라 생체적합성이 양호할 뿐만 아니라, 많은 수의 성장 인자가 고정될 수 있어서 영구적 임플란트에 가까운 임플란트를 얻을 수 있다.

본 발명은 첨부하는 도면을 언급하면서 또한 설명된다.
도 1은 석회질 조류(limestone algae, 단위는 10 ㎛에 상응한다.)로부터 수득된 입자인 Algipore®의 미세구조를 보여주고 있다. Algisorb®는 동일한 구조를 가지고 있다. ("Bone Augmentation in Oral Implantology", Khoury, F. et al., 349쪽, 2007, Quintessenz Verlags-GmbH, 베를린에서 얻음)
도 2는 MC353-E1 세포를 사용한 세포 배양액에서 Algisorb 표면에 흡착된 고BMP-2의 생물학적 활성(도 2c, 2d)의 증거를 보여주고 있다. 도 2a는 네거티브 컨트롤인 Algisorb로서 배양액에 용융 rhBMP-2 없이 진행한 것이고, 도 2b는 포지티브 컨트롤인 Algisorb로서 배양액에 50 nM의 용융 rhBMP-2를 첨가하여 진행한 것이며, 도 2c는 Algisorb에 흡착된 rhBMP-2의 상태로서, Algisorb 1 그램당 약 0.5 ㎎의 rhBMP-2를 흡착시키고 습윤 상태를 유지한 상태에서 진행한 것이며, 도 2d는 Algisorb에 흡착된 rhBMP-2의 상태로서, Algisorb 1 그램당 약 0.5 ㎎의 rhBMP-2를 흡착시키고 건조시킨 상태에서 진행한 것이다.
도 3a는 rhBMP-2의 친수성 및 소수성 흡착을 도시한 그래프이고, 도 3b는 (1차 반응에서) rhBMP-2의 방출을 도시한 그래프이다.

본 발명의 공정에 의하여, 입자로부터 세척될 수 있는 증가된 양의 골 성장 인자는 화학 결합의 형태로서의 흡착에 의하여 표면에 흡착되는데, 이 화학 결합은 다음과 같은 형태와는 구별되어야 한다.

- HAP 또는 TCP와의 혼합/조합 (= 혼합물),

- 공극(pore) 내에 함유(including)/포획(entrapping), 예를 들면,

- 융합(incoporation), 일예로, 액체의 동결건조 및 물질 내에 침전에 의한 융합(incorporation),

- 일예로, 입자 또는 성형체(moulded body)가 BMP-용액으로 침지된 뒤 즉각적으로 BMP-2 용액을 제거하기 위한 건조 단계로 진행[BMP-2가 표면 상부에 형성된 층으로서 건조]되는 것에 의한 금속 또는 세라믹의 코팅 (= 흡착이 아니고 부착(adhesion)).

다양한 수산화인회석으로 BMP-2가 결합하는 것에 대한 연구(표 1)에서, 본 발명자들에 의해서 BMPs, 특히 BMP-2는 넓은 범위에 걸쳐서 상당량 인산칼슘에 선형적으로 결합한다는 점이 발견되었다.

다양한 입자 골이식 물질에 대하여 pH 4.5에서의 BMP-2의 흡착과 pH 7.4에서의 BMP-2의 탈착(desorption)

항온 시험에서 사용된 BMP-2	Algisorb® (80% TCP, 20% HAP)		Algipore® (98% HAP)		Bonit® (13% SiO₂, 52% HAP, 35% TCP)		NuOss® (HAP, 소)
	컨트롤	APS	컨트롤	APS	컨트롤	APS	컨트롤	APS
BMP-2 흡착 (㎎/g)
0.1	0.53	0.78	0.58	0.81	0.26	0.23	0.45	0.69
0.2	1.06	1.54	1.27	1.52	0.52	0.39	0.61	1.16
0.3	1.35	2.14	1.52	2.27	0.67	0.52	0.98	1.41
탈착(desorption, t_1/2) (일)
반감기	20.4	31.6			10.1	5.4	28.2	30.8

표 1에서, (20 mM 아세트산나트륨, pH 4.5)을 사용하여 pH 4.5에서의 흡착 실험 결과가 표시되어 있는데, 흡착(adsorption)/항온(incubation)은 적어도 30 분의 기간 동안(t_1/2 = 16일), 바람직하게는 적어도 1-2 시간 (t_1/2 = 19일), 특히 바람직하게는 적어도 4-6 시간(t₁ _/2 = 20일) 동안 수행되었다. 가장 긴 반감기(half life) 값은 15-17 시간(t₁ _/2 = 23일) 동안 항온 처리한 경우에 측정되었다. 알칼리 범위에서의 코팅은, 바람직하게는 SDS(완충액: 125 mM 붕산염/0.066% SDS. pH 10.0)와 같은 계면활성제(detergent)가 존재하는 상태에서 수행될 수 있다. 흡착 단계 후에, 이 계면활성제는 10배 물질 부피의 pH 7.4인 PBS-완충액(137 mM NaCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄)으로 5회 세척하여 제거되었다.

입자 물질 표면으로 BMP-2를 흡착시킨 뒤, 흡착 정도를 측정한다. 흡착 정도를 측정하기 위해서, 샘플들을 각각 2 ㎖ 완충액(50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)으로 옮긴다. 소정의 시간 간격이 지난 뒤, 샘플들을 꺼내고 2 ㎖ 완충액(50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)으로 3회 세척한 뒤 γ-카운터로 측정한다. 이어서, 다음 방출 간격을 위해서 샘플들을 2 ㎖ 새 완충액(fresh buffer)으로 옮긴다. ¹²⁵I의 방사선 표지된 단백질을 사용하여 γ-카운터에서 측정하여 고정된 BMP-2의 양을 분석한다.

모든 골이식 물질들은, 20 mM의 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)에 소정 농도의 BMP-2를 사용하여 상온에서 15 시간 동안 항온 처리되었다. 탈착 정도는 pH 7.4의, 50 mM Tris/HCl 및 150 mM NaCl에서 분석되었다. 흡착된 BMP-2 양의 단지 1-2%와 관련되어 있는, 이른바 "분출 단계"에서의 방출 반감기는 0.4 - 1.1일 사이의 기간이었다(결과 미도시). APS: 아미노프로필 트리에톡시실란(Aminopropyl triethoxysilane); Algipore® (밀도 약 0.63 g/㎤; 약 1.3 × 10⁴ 입자/g); Algisorb® (밀도 약 0.63 g/㎤; 약 1.3 × 10⁴ 입자/g)은 오스트리아 빈 소재의 Co. Algoss GmbH; Rostock 소재의 Boint® company DOT GmbH; NuOss® Collagen Matrix ACE Surgical Supply Co.(미국, 매사추세츠 주, Brockton).

도 1은 석회질 조류(AlgOss 사, 비인)로부터 수득한 미세구조의 Algipore®의 전자현미경 사진을 도시하고 있는데, Algipore®는 다른 다공성 수산화인회석과 비교하여 실질적으로 개선된 치유(healing) 및 재흡착(resorption) 성질을 가지고 있다. 홍색 석회질 조류인 코클레아리아 오피키날리스(Cochlearia officinalis)에 있었던 원래의 탄산칼슘이 수산화인회석(HAP, Algipore®) 또는 제3인산칼슘(TCP, Algisorb®)로 치환되면서도 최초의 미세 구조를 유지하고 있다[참고문헌 1].

Algisorb 표면에 흡착된 rhBMP-2의 생물학적 활성에 대한 증거인 도 2에 도시된 것과 같이, 그 결과는 MC3T3-E1 세포를 사용한 세포 배양에서 성공적이었다. 그에 따라, 새로 트립신으로 처리된(trypsinated) 5 × 10⁵ 개의 MC3T3-E1 세포를 무균 상태(sterile condition)에서, 마이크로 타이터 플레이트(micro titer plate)에 형성된 48개의 웰(well)에 피브린 접착제가 구비된 하단(bottom side)에 고정되어 있는 Algisorb-입자 표면으로 접종(seed)하고, 10% FCS(fetal calf serum)를 함유하는 α-MEM 배양액(Gibco 사)에서 항온 처리하였다. 6 - 12 시간 후에, 플레이트 표면에서 융합 성장된(confluently grown) 세포 배양액을 1% FCS를 함유하는 새로운 α-MEM 배양액으로 교체하고, 컨트롤-Algisorb 또는 BMP-2가 흡착된 Algisorb (APS로 관능화(functionalization) 처리하지 않음) 표면에서 6일 동안 더 성장시켰다. 6일 후, 세포가 군집된(populated) Algisorb-입자들을 Dulbecco 인산 완충액을 사용하여 세척한 뒤 2% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시켰다. 형광 현미경(Nikon Eclipse E400, 10 메가 픽셀 카메라, Nikon GmbH, 뒤셀도르프, 독일, 여기 파장 345 ㎚, 방출 파장 530 ㎚)을 사용하여 인산분해효소 검출 키트 ELF-97 (Molecular Probes, Inc., 오리건 주, 미국)로 알칼리성 인산분해효소(녹색 형광 염료)를 촬영하고 분석하였다.

도 3에 도시된 것과 같이, 본 발명에 따라 얻어진 고밀도의 고체상 BMP-2의 특성에 대해서 다음과 같은 점을 알 수 있다. 입자수가 약 1.3 × 10⁴ 입자/g인 Algisorb에 6.7 ㎎/g의 rhBMP-2가 탑재되었다는 사실에서부터 단위 입자 당 0.5 ㎍의 rhBMP-2가 결합된 것으로 계산할 수 있다. 이러한 사실은, 양(sheep)을 대상으로 한 실험에서 의미 있는 골유도(bone induction)를 형성하기 위해서는 2개의 입자(= 1 ㎍)만으로 충분하다는 점을 의미한다[참고문헌 2].

본 발명자들이 확인한 바에 따르면, Bio-Oss (Geistlich 사)에서 매우 높은 결정 구조를 갖는 수산화인회석과 달리, 위와 같이 개선된 Algipore의 특성은 상호 연결하는 공극(interconnecting pore) 시스템과 등방성(isotropic, 비정질(amorphous)) 수산화인회석 입자가 존재한다는 점에 근거하고 있다. 본 연구에 따르면, 석회질 조류의 제3인산칼슘을 함유하고 있는 형태인 Algisorb®는 Algipore와 비교해서 더욱 향상된 재흡착 성질을 갖는다.

이러한 결합 성질은 Algipore 및 Algisorb에서만 관측되는 것이 아니며, 다른 수산화인회석에 대해서도 유사한 성질을 발견할 수 있다. Algipore 및 Algisorb의 특이점은 결합된 양이 1-2 ㎎/g 이상의 범위에 있다는 점이다. 이러한 결합양은 현재까지 선행기술에서 공지되지 않았다. 본 발명의 방법을 사용하여, 입자의 단위 중량당 7 ㎎ 이상의 BMP-2 (7 ㎎ BMP-2/입자 g, 2.8 - 4.4 ㎎/㎤)를 수득할 수 있다(고밀도 고체상 BMP-2).

본 발명에서 사용된 물질인 Algipore 및 Algisorb에 대한 정보는 참고문헌 [1]에서 얻을 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면, Algipore®: 98% 수산화인회석(HA) - 단일상(monophasic)으로 사용되거나; Algisorb®: 80% 제3인산칼슘(β-TCP), 19.3% HA, 0.7% 방해석 CaCO₃ - 이형상/삼형상이 사용될 수 있다. 후자의 경우, 동일한 전자현미경 구조를 갖는 β-TCP와 HA로 구성된 이형상/삼형상 형태가 사용될 수 있다. 방해석은 0.3 - 0.7%로 존재한다.

본 발명의 고밀도 고체상 BMP-2의 특성에 관한 본 발명자들의 연구 결과, 입자수가 약 1.3 × 10⁴ 입자/g인 Algisorb에 6.7 ㎎/g의 rhBMP-2가 탑재되었다는 사실(도 1)로부터, 단위 입자 당 0.5 ㎍의 rhBMP-2가 결합된 것으로 계측될 수 있다. 이러한 사실은, 양(sheep)을 대상으로 한 실험에서 의미 있는 골유도를 얻기 위해서는 2개의 입자(= 1 ㎍)만으로 충분하다는 점을 의미한다[참고문헌 2]. 결국, 본 발명의 생체내(in vivo) 방법 및 임상적인 방법에서, 분산 손실(diffusion loss) 없이, rhBMP-2가 충분히 적절하게 공급(applied)될 수 있다.

본 발명의 고밀도 고체상 BMP-2를 제조하는 것과 관련하여, 수용액에서 수득될 수 있는 농도에 비해서, 단위 부피당 BMP-2의 함량이 높은 범위에서 작업이 수행된다. 바람직하게는, BMP 완충액이 본 발명에 따라 사용될 수 있는데, 바람직하게는 BMP-2가 0.1 - 1.5 ㎎/㎖ 농도인 완충액, 바람직하게는 0.5 - 1.5 ㎎/㎖ 농도의 완충액이 사용된다. 입자의 단위 그램(g) 당 의도한 수준의 질량(㎎) BMP가 탑재될 수 있을 정도의 양으로, 이러한 농도의 BMP-함유 완충액이 입자로 첨가된다. 예를 들면, 만약 입자 단위 그램 당 2.5 ㎎의 BMP가 탑재될 것을 의도하였다면, 1 ㎎ BMP/㎖를 함유한 5 ㎖ 완충액이 입자 2 g에 첨가된다. 실 중량(net weight)과 관련하여 만약 실험 부피가 4배 증가하면, 입자 단위 그램당 10 ㎎(10 ㎎/입자 g) 대신에 입자 단위 그램당 7 ㎎ (7 ㎎/ 입자 g)이 결합한다.

아울러, 본 발명자들의 아직 끝나지 않은 연구에서는 더욱 많은 양(입자 단위 그램 당 4-5 ㎎의 BMP 내지 8-10 ㎎의 BMP)이 얻어질 수 있다는 것을 보여준다. 이에 따르면, 농도와 관련하여 사전에 결정된 BMP를 함유하는 완충액의 양(㎖)이 사용될 수 있다. 따라서 골유도를 얻기 위해서, 본 발명에 따른 골 성장 인자가 탑재된 입자를 공급하고자 하는 경우에, 그 공급 과정에서(예를 들면 임플란트와 함께 또는 상악동(maxillary antrum)의 골 이식술(bone augmentation) 과정에서), BMP-HAP 조성물의 단지 일부 성분(grain)만 공급되더라도 충분하다. 본 발명자들의 생체외(in vitro) 연구에 따르면, HAP에 결합된 BMP-2는 생물학적으로 활성이 있다는 것을 보여준다. 양(sheep)을 대상으로 한 본 발명자들의 다른 연구가 현재 진행되고 있다.

아울러, 놀랍게도, 골이식 물질로서 수산화인회석과 조합하여 사용되며 위에서 언급한 Algisorb®에서 약 80%를 구성하고 있는 제3인산칼슘은 아미노프로필 트리에톡시실란과 같은 활성화제와 반응하여 활성화 반응을 진행할 수 있다는 점이 본 발명자들에 의해서 발견되었는데, 이에 따라 입자 표면으로의 BMP-2의 흡착이 적어도 2배 증가한다.

따라서 본 발명자들은 약 80%의 TCP와 약 20%의 HAP으로 구성된 입자 물질(Algisorb)의 1 그램 당, 98% HAP로 구성된 입자 물질(Algipore)의 경우와 같은 양의 골 성장 인가가 결합할 수 있다는 점을 보여주었다. 98%의 HAP 함량을 갖는 Algipore와 비교할 때, 만약 HAP만이 반응을 한다면, 통상의 기술자라면 추가적으로 20%의 BMP(Algisorb에서 HAP의 비율)만 결합될 수 있다고 예측할 것이므로, 이러한 사실은 더욱 놀라운 일이다. 추가적으로 결합된 BMP-2의 60-70%는 개질된(modified) TCP에 의해 결합된 것으로 본 발명자들은 추측하고 있다. 따라서 본 발명은 또한 골 성장 인자가 흡착되기 전에, 입자 물질이 활성화 수단에 의한 처리에 의해 활성화되는 것을 개시하고 있다. 이런 활성화제는 실란 그룹에서 선택될 수 있는데, 아미노프로필 트리에톡시실란과 같은 아미노알킬 알콕시실란을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 활성화 처리는, 전술한 골이식 물질(표 1 참고)을 건조 톨루엔에 용해된 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APS, 시그마-알드리치 사, 타우프커첸, 독일)의 5% (v/v) 혼합 용액 50 ㎖에서 끓을 때까지 가열하여, 가열된 유리 장비 내에서 불활성 가스 분위기(질소 5.0)에서 3.5 시간 동안 환류 처리하는 방법에 의하여 통상 수행된다. 이러한 활성화 반응이 종료된 뒤, 샘플들은 냉각되고 10 ㎖ 클로로포름으로 3회, 아세톤으로 3회, 메탄올로 3회 각각 세척된다.

그 후에, 특히 TCP, HAP 또는 이들 혼합물로 구성되어 있는 이와 같이 활성화된 입자 물질(표 1 참조)은 pH 4 내지 5, pH 4.5 (20 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 4.5), 범위의 산성 범위 또는 pH 9 내지 11, 바람직하게는 pH 10 (125 mM 붕산염, 0.066% SDS, pH 10.0), 사이의 약알칼리성 범위에서, 바람직하게는 BMP-2 또는 BMP-7를 함유한 골 성장 인자의 완충액으로 적어도 30분 (t_1/2 = 26일), 바람직하게는 적어도 4 시간(t_1/2 = 36일), 특히 바람직하게는 적어도 15 시간(t_1/2 = 43일)의 기간에 걸쳐 처리될 수 있다. 이 반응을 위해서, 아미노프로필 트리에톡시실란(APS)에 의한 화학적 개질 후에, 전술한 입자 물질은 물로 세척되고, 연속적으로 작은 (2 ㎖) 반응 용기로 옮겨지는데, 이 반응 용기에는 pH 4.5인 20 mM 아세트산나트륨 완충액 또는 pH 10.0인 125 mM 붕산염/0.066% SDS 완충액 내에 각각 용해된 1.0 ㎖의 BMP-2 용액이 존재하고 있다. rhBMP-2가 입자 물질로 흡착할 수 있도록, 3개의 다른 단백질 농도 (0.1, 0.2, 0.3 ㎎/㎖)가 사용된다. 고정된 BMP-2의 양은 ¹²⁵I의 방사선 표지된 단백질을 사용함으로써 분석된다.

분출 단계, 즉, 입자 표면에 흡착되지 못하고 단지 입자 표면에 단순히 잔존하고 있는, 골 성장 인자의 과도한 방출을 방지하기 위해서, 흡착 단계 이후에 입자들은 바람직하게는 세척되는데, 바람직하게는 골 성장 인자가 없는 완충액(pH 4.5의 20 mM 아세트산나트륨 완충액 또는 pH 10.0의 125 mM 붕산염/0.066% SDS)에 용해된 10배 부피의 입자 물질을 각각 사용하여 3회의 세척 단계가 수행된다. 그 후, pH 7.4의 PBS-완충액(137 mm NaCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, pH 7.4)으로 5회의 세척 과정이 수행되었다.

본 발명에 따른 고밀도의 고체상 BMP를 제공함으로써, 생체내에서 그리고 임상적으로 새로운 방법에서 경제적으로 또한 임의의 분산 손실 없이 rhBMP-2를 특히 제공할 수 있다. 고밀도의 고체상 BMP는, 어떠한 활성의 감소도 없이 동결건조 후에 몇 주 동안 저장할 수 있다는 점을 보이고 있다(도 2). 본 발명자들의 첫 번째 연구에서는 본 발명에 따른 고밀도 고체상 BMP의 저장성이 1-2 년의 기간에 걸쳐 연장될 수 있다는 점을 보여주고 있다. 이에 따라, BMP의 생물학적 활성이 유지되는데, 본 발명자들에 따르면 이러한 특성은, 바람직하게는 무균 조건에서 사용된 물질 때문일 수도 있다.

참고문헌

[1] Spassova, E., Gintenreiter, S., Halwax, E., Moser, D., Schopper, C., & Ewers, R. (2007) Chemistry, Ultrastructure and Porosity of Monophasic and Biphasic Bone Forming Materials Derived from Marine Algae. Materialwiss.Werkstofftech.,38, 1027-1034.

[2] Lichtinger, T.K., Mㆌller, R.T., Schㆌrmann, N., Wiemann, M., Chatzinikoleidou, M., Rumpf, H.M., & Jennissen, H.P. (2001) Osseointegration of Titanium Implants by Addition of Recombinant Bone Morphogenetic Protein 2 (rhBMP-2). Materialwiss.Werkstofftech.,32, 937-941.

Claims

성장 인자가 탑재된 입자 무기 물질을 제조하는 방법으로서,
상기 입자 물질은, 적어도 30분의 기간 동안 pH 4 내지 5 범위의 산성 범위 또는 pH 9 내지 11 사이의 약 알칼리성 범위에서 수용성 완충액에 용해된 성장 인자로 처리된 세라믹 물질로부터 선택되는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 수용성 완충액은 pH 값이 4.3 내지 4.7, 특히 4.5를 갖는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 수용성 완충액은 pH 값이 9.5 내지 10.5, 특히 10을 갖는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 입자 물질은 10 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기를 가지며, 상호 연결된 공극 구조를 갖는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 입자 물질은 수산화인회석, 제3인산칼슘, 탄산칼슘, 산화알루미늄 또는 이들 혼합물로 구성되는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
화학적으로 활성화된 표면을 갖는 입자 물질이 사용되는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 화학적으로 활성화된 표면을 갖는 입자 물질은, 상기 입자 물질을 활성화제, 바람직하게는 실란 그룹을 갖는 활성화제로 처리하여 수득되는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
선행하는 어느 한 항에 있어서,
상기 입자 무기 물질은, 탑재 단계 이후에 상기 수용성 완충액과 분리된 뒤, 골 성장 인자가 없는 적어도 같은 부피의 완충액으로 적어도 1회 세척되고, 바람직하게는 건조되는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
제 8항에 있어서,
상기 건조 단계는 동결건조를 포함하는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
선행하는 어느 한 항에 있어서,
성장 인자로서 BMP-2 또는 BMP-7이 사용되는 입자 무기 물질을 제조하는 방법.
선행하는 임의의 한 항에 기재된 방법에 따라 수득 가능한 입자 물질.
골 성장을 촉진시키는 약리학적 조성물의 제조를 위한, 청구항 제11항에 기재된 입자 물질의 용도.