CN114404651A - 一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法和应用。所述二肽水凝胶支架以二肽水凝胶为骨架装载碳酸钙粒子,且所述碳酸钙粒子中包括生长因子。所得二肽水凝胶支架的纳米纤维结构具有合适的孔径,能够促进细胞的迁移和增殖,为细胞增殖和分化提供适宜的微环境;凝胶中的碳酸钙能够为骨形成提供钙源,也能够作为生长因子的载体,减缓其释放速度,延长有效作用时间,促进细胞生长及成骨分化。此外,所述二肽水凝胶由氨基酸自组装形成,降解产物也为氨基酸,可被机体进一步吸收,具有良好的生物相容性和安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物复合材料技术领域,特别涉及一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法。
背景技术
随着人口老龄化的加剧,骨缺损类疾病的发生率逐年增加,并且交通事故、工伤也是造成的骨组织缺损或缺失的重要原因。目前,临床中使用的骨修复策略主要自体移植、同种异体移植和异种移植。然而,自体移植难以适应缺损轮廓的形状,且可用于嫁接的材料有限;而同种异体移植和异种移植同样受到可供移植骨源有限的限制,存在一定的免疫排斥反应。异种骨移植虽然材料来源丰富,但可能会引起免疫原性排斥反应,感染风险大,需要长期服用免疫抑制药物,给患者带来身体和经济上的双重压力。骨组织工程的出现为骨缺损的再生提供了新的解决方法。骨组织工程联合使用支架材料、种子细胞、生长因子促进骨组织的再生,即将体外培养的种子细胞接种到支架材料上,辅以生长因子促进细胞增殖分化形成具有与自体骨功能结构相似的新生骨组织。
近年来,自组装短肽水凝胶因其独特的优势在组织工程方面受到越来越多的关注。短肽及其衍生物具有确定的化学结构,因此可以精确设计和合成,并在分子水平上有效地改变肽序列和结合官能团,这使得短肽水凝胶相比其他水凝胶更具有精确的可调控特性。短肽水凝胶组成成分为氨基酸,降解产物也为氨基酸,可被机体进一步吸收,具有良好的生物相容性,能够支持细胞的正常活动而不会引起宿主局部或全身不良反应。且短肽水凝胶中的纳米纤维结构具有合适的孔径,能够促进细胞的迁移和增殖,为细胞增殖和分化提供适宜的微环境,并有利于结构内营养物质、氧气和代谢产物的转移。近年来已有很多研究将肽凝胶用于细胞培养,生物打印以及组织工程,且已在组织再生方面取得了令人瞩目的进展,如心脏再生,肝脏再生和粘膜再生等。尽管许多研究表明,短肽水凝胶可以支持成骨相关细胞的附着、迁移和成骨增殖,但到目前为止,很少有关于短肽水凝胶应用于骨组织工程的报道在动物模型中取得令人满意的骨再生结果,这主要是受限于它们的机械强度不够。因此,如何提高肽凝胶力学性能,仍是肽凝胶用于骨组织工程领域亟待解决的热点问题。
此外,在骨组织工程中,生长因子是必不可少的要素之一。如果直接将生长因子混入水凝胶支架材料中往往会造成其在初期的爆释,不能维持较长的作用时间。而与材料共价连接常常会造成生长因子在骨修复体系中的前期浓度很低,在后期材料降解后浓度突然增加。因此,利用合适的载体来维持生长因子的释放并维持其有效水平,对于材料在骨修复过程中的成骨能力有至关重要的影响。
为了提高肽凝胶力学强度并实现其中生长因子的缓释,本发明将骨诱导生长因子载入球霰石中,与二肽水凝胶体系制备复合凝胶。球霰石是碳酸钙的一种结晶多晶体,具有较好的生物相容性、生物降解性、高表面积和多孔性,可以作为纳米复合水凝胶的强化填充物和生物信号载体。同时,球霰石很容易转化为羟基磷灰石,因此可以作为矿物前体诱导羟基磷灰石在二肽水凝胶的纳米纤维上的原位矿化,提高水凝胶的机械强度和骨传导性。此外,Ca2+的长期释放可以抑制破骨细胞的骨代谢,使骨平衡转向成骨细胞的骨形成,促进骨缺损部位的新骨再生。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法和应用。所述二肽水凝胶支架具有良好的生物相容性,其装载的碳酸钙粒子携带生长因子,可达到缓释生长因子的目的以促进细胞生长及成骨分化。且碳酸钙粒子具有较高的比表面积,可增强与凝胶纤维网络的相互作用,从而增强复合凝胶的力学强度。球霰石具有高比表面积,与水凝胶网络有很强的界面相互作用,因此可作为交联剂提高水凝胶的机械性能。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架,所述二肽水凝胶支架以二肽水凝胶为骨架装载碳酸钙粒子,且所述碳酸钙粒子中包括生长因子。
本发明中,所述二肽水凝胶支架具有良好的生物兼容性,与普通的固体支架材料相比,能够与细胞更加充分地接触,能为细胞提供更多的营养和氧气,且具有较好的骨诱导特性;且二肽水凝胶支架的纳米纤维结构具有合适的孔径,能够促进细胞的迁移和增殖,为细胞增殖和分化提供适宜的微环境,有利于结构内营养物质、氧气和代谢产物的转移。
作为本发明优选的技术方案,所述碳酸钙粒子晶型为球霰石,平均粒径为400~500nm,例如可以是400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm或500nm等。
优选地,所述碳酸钙粒子中还包括嗜热菌蛋白酶。
优选地,所述二肽水凝胶中的氨基酸残基为酪氨酸和亮氨酸。
作为本发明优选的技术方案,所述生长因子包括成骨细胞增殖/分化剂。
优选地,所述成骨细胞增殖/分化剂为蛋白、多肽或小分子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,所述生长因子包括骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic protein,BMP)、成骨多肽、β-连环蛋白、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松或辛伐他汀中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的二肽水凝胶支架的制备方法,包括:
制备碳酸钙粒子,再将生长因子装载于所述碳酸钙粒子中;
将装载有生长因子的碳酸钙粒子置于氨基酸溶液中,震荡混合后静置,得到所述二肽水凝胶支架。
作为本发明优选的技术方案,所述碳酸钙粒子的制备方法包括:将含有氯化钙的乙二醇溶液与碳酸钠溶液混合,在搅拌条件下反应,收集沉淀得到所述碳酸钙粒子。
优选地,所述搅拌的转速为700~1500rpm,例如可以是700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm等。
优选地,所述反应的时间为2~4h,例如可以是2h、2.2h、2.5h、2.8h、3h、3.2h、3.4h、3.5h、3.6h、3.8h或4h等。
优选地,所述含有氯化钙的乙二醇溶液中氯化钙的摩尔浓度为5~10mM,例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM等。
优选地,所述碳酸钠溶液中碳酸钠的摩尔浓度为20~30mM,例如可以是20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM等。
优选地,所述含有氯化钙的乙二醇溶液与碳酸钠溶液的体积比为(3~5):1,例如可以是3:1、3.2:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.8:1、4:1、4.2:1、4.5:1、4.6:1、4.8:1或5:1等。
作为本发明优选的技术方案,所述将生长因子装载于碳酸钙粒子中的具体步骤包括:
将所述碳酸钙粒子和生长因子混合,震荡分散后在水浴条件下旋蒸干燥,得到装载有生长因子的碳酸钙粒子。
优选地,所述生长因子为重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2,Recombinant HumanBone Morphogenetic protein-2),其与碳酸钙粒子混合的质量比为(5~10)μg:(10~30)mg。
优选地,所述碳酸钙粒子和生长因子混合时还包括加入嗜热菌蛋白酶的操作。优选地,所述嗜热菌蛋白酶与碳酸钙粒子的质量比为1mg:(10~30)mg,例如可以是1mg:10mg、1mg:15mg、1mg:20mg、1mg:30mg等。
优选地,所述水浴的温度为40~50℃,例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃等。
作为本发明优选的技术方案,所述氨基酸溶液为含有N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸(Fmoc-Y)和亮氨酰胺(L-NH2)的PBS缓冲液。
优选地,所述Fmoc-Y的摩尔浓度为20~80mM,例如可以是20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或80mM等。
优选地,所述Fmoc-Y与L-NH2的摩尔比为1:(3~4),例如可以是1:3、1:3.2、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.8、1:3.9或1:4等。
优选地,所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01~0.1M,例如可以是0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.06M、0.08M、0.09M或0.1M等。
优选地,所述PBS缓冲液的pH值为7.2~8.0,例如可以是7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0等。
作为本发明优选的技术方案,所述制备方法中还包括:将装载有生长因子的碳酸钙粒子分散于PBS缓冲液中,再与氨基酸溶液等体积混合的步骤。
优选地,所述装载有生长因子的碳酸钙粒子与PBS缓冲液的固液比为(10~30)mg/mL。
优选地,所述氨基酸溶液与含有碳酸钙粒子的溶液的体积比为1:(1~2)。
优选地,每1mL肽凝胶中,嗜热菌蛋白酶的含量为1mg。
作为本发明优选的技术方案,所述二肽水凝胶支架的制备方法包括如下步骤:
(1)将含有5~10mM氯化钙的乙二醇溶液与20~30mM的碳酸钠溶液按(3~5):1的体积比混合,在700~1500rpm搅拌条件下反应2~4h,收集沉淀,得到碳酸钙粒子;
(2)将所述碳酸钙粒子、生长因子和嗜热菌蛋白酶混合,震荡分散后在40~50℃的水浴条件下旋蒸干燥,得到装载有生长因子的碳酸钙粒子;
(3)将Fmoc-Y和L-NH2溶于PBS缓冲液中,所得PBS缓冲液中Fmoc-Y的摩尔浓度为20~80mM,所述Fmoc-Y与L-NH2的摩尔比为1:(3~4);
并将步骤(2)所得碳酸钙粒子溶于PBS缓冲液中,再与氨基酸溶液混合,所述氨基酸溶液与含有碳酸钙粒子的溶液的体积比为1:(1~2),静置,得到碳酸钙复合的二肽水凝胶支架。
本发明中,通过将载有嗜热菌蛋白酶及生长因子的碳酸钙粒子加入至Fmoc-Y和L-NH2的溶液中,得到装载有生长因子的碳酸钙复合的Fmoc-YL-NH2二肽水凝胶。
所述二肽水凝胶中不含有任何的交联剂,是通过嗜热菌蛋白酶的催化作用,促进Fmoc-Y和L-NH2的反应生成Fmoc-YL-NH2二肽分子从而快速自组装形成凝胶。本发明中的碳酸钙既可以作为交联点增强凝胶强度,又可以作为生长因子的载体实现缓释的目的,同时可以提供钙源促进羟基磷灰石矿化沉积,增强凝胶强度并提高骨诱导性能,从而促进骨修复。
第三方面,本发明还提供一种如第一方面所述的二肽水凝胶支架在制备骨组织材料和/或在骨组织工程中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明提供的碳酸钙复合的二肽水凝胶支架,以二肽水凝胶为骨架装载碳酸钙粒子,碳酸钙粒子上携带生长因子,所得二肽水凝胶支架的纳米纤维结构具有合适的孔径,能够促进细胞的迁移和增殖,为细胞增殖和分化提供适宜的微环境,并有利于结构内营养物质、氧气和代谢产物的转移;并且,所述二肽水凝胶由氨基酸自组装形成,降解产物也为氨基酸,可被机体进一步吸收,具有良好的生物相容性和安全性;凝胶中的碳酸钙能够为骨形成提供钙源,且碳酸钙在该体系中可发生向羟基磷灰石的转变,使材料具有较好的骨诱导特性;所述碳酸钙也能作为多种促进细胞生长、促进细胞成骨分化的生长因子的载体,减缓其释放速度,延长有效作用时间,从而促进细胞生长及成骨分化。
(2)本发明提供的碳酸钙复合的二肽水凝胶支架的制备方法中,通过在碳酸钙粒子制备过程中添加嗜热菌蛋白酶,使得二肽水凝胶的自组装过程不需要任何的交联剂,在所述嗜热菌蛋白酶的催化下,促进Fmoc-Y和L-NH2的反应从而快速自组装形成Fmoc-YL-NH2二肽分子;该制备方法操作简便,技术条件温和,制备过程不产生对环境有害的物质,具有良好的应用前景。
附图说明
为了更直观清晰地说明本发明实施例的技术方案,下面对实施例描述中的附图作简单介绍:
图1为本发明制备的二肽复合水凝胶的成胶原理及内部结构示意图。
图2为本发明制备的二肽复合水凝胶成胶前后样品图;
图3为本发明制备的二肽复合水凝胶的扫描电子显微镜图;
图4为本发明制备的二肽复合水凝胶(B&TM@CC Gel)的透射电子显微镜图;
图5为本发明制备的二肽复合水凝胶中的BMP-2释放曲线图;
图6为本发明制备的二肽复合水凝胶培养成肌细胞3天后的扫描电子显微镜图。
图7为本发明制备的二肽复合水凝胶培养成肌细胞3天后经细胞骨架染色后的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但下述的实例仅仅是本发明的简易例子,并不代表或限制本发明的权利保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中,若无特殊说明,所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商;若无特殊说明,所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
本实施例提供一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法。具体步骤如下:
(1)碳酸钙粒子的合成
在乙二醇中加入氯化钙二水合物(CaCl2·2H2O)超声使其溶解得到40mL摩尔浓度为5mM的氯化钙的乙二醇溶液;
将碳酸钠(Na2CO3)溶解于去离子水中得到10mL摩尔浓度为25mM的碳酸钠的水溶液,加入至上述氯化钙的乙二醇溶液中;
700rpm下搅拌反应2h,离心去掉上清溶液,将沉淀用水和无水乙醇分别洗涤2次后离心收集,真空干燥后密封,4℃保存;
(2)生长因子装载于碳酸钙粒子中
将40mg碳酸钙粒子、2mg嗜热菌蛋白酶、20μg BMP-2混匀,加入2mL去离子水,用震荡器充分震荡使其分散混匀,在40℃水浴条件下使用旋转蒸发仪干燥,得到载有嗜热菌蛋白酶及BMP-2的碳酸钙粒子(BMP-2and thermolysin-loaded CaCO3,记为:B&TM@CC),密封,低温保存;
(3)碳酸钙-二肽复合水凝胶的制备
将Fmoc-Y和L-NH2溶于0.5mL PBS缓冲液(0.1M,pH为8)中,超声使其溶解得到Fmoc-Y(20mM)和L-NH2(80mM)的透明溶液;
将21mg B&TM@CC粒子分散于0.5mL PBS缓冲液中,将其加入至0.5mL Fmoc-Y和L-NH2的PBS溶液中,用震荡器震荡混匀后静置3min,得到碳酸钙复合的二肽自组装水凝胶(记为B&TM@CC Gel)。
本实施例中所述制备的二肽水凝胶的成胶原理及内部结构如图1所示,制备得到碳酸钙粒子后,使其负载嗜热菌蛋白酶和生物活性物质,得到B&TM@CC,再将其与底物(氨基酸溶液)混合,嗜热菌蛋白酶催化氨基酸形成二肽,二肽产物经过自组装得到二肽自组装水凝胶B&TM@CC Gel。
二肽水凝胶成胶前后样品图如图2所示,在加入B&TM@CC前,溶液透明,加入B&TM@CC后,得到凝胶状态的产物,即二肽自组装水凝胶B&TM@CC Gel。
实施例2
本实施例提供一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法。具体步骤如下:
(1)碳酸钙粒子的合成
在乙二醇中加入氯化钙二水合物(CaCl2·2H2O)超声使其溶解得到30mL摩尔浓度为10mM的氯化钙的乙二醇溶液;
将碳酸钠(Na2CO3)溶解于去离子水中得到10mL摩尔浓度为30mM的碳酸钠的水溶液,加入至上述氯化钙的乙二醇溶液中;
1500rpm下搅拌反应3h,离心去掉上清溶液,将沉淀用水和无水乙醇分别洗涤2次后离心收集,真空干燥后密封,4℃保存;
(2)生长因子装载于碳酸钙粒子中
将60mg碳酸钙粒子、2mg嗜热菌蛋白酶、10μg BMP-2混匀,加入2mL去离子水,用震荡器充分震荡使其分散混匀,在50℃水浴条件下使用旋转蒸发仪干燥,得到载有嗜热菌蛋白酶及BMP-2的碳酸钙粒子(记为B&TM@CC),密封,低温保存;
(3)碳酸钙-二肽复合水凝胶的制备
将Fmoc-Y和L-NH2溶于0.5mL PBS缓冲液(0.01M,pH为7.2)中,超声使其溶解得到Fmoc-Y(40mM)和L-NH2(160mM)的透明溶液;将31mg的B&TM@CC分散于0.5mL PBS缓冲液中,将其加入至Fmoc-Y和L-NH2的PBS溶液中,用震荡器震荡混匀后静置约3min,得到碳酸钙复合的二肽自组装水凝胶(记为B&TM@CC Gel)。
实施例3
本实施例提供一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架及其制备方法。具体步骤如下:
(1)碳酸钙粒子的合成
在乙二醇中加入氯化钙二水合物(CaCl2·2H2O)超声使其溶解得到50mL摩尔浓度为8mM的氯化钙的乙二醇溶液;
将碳酸钠(Na2CO3)溶解于去离子水中得到10mL摩尔浓度为28mM的碳酸钠的水溶液,加入至上述氯化钙的乙二醇溶液中;
1000rpm下搅拌反应3h,离心去掉上清溶液,将沉淀用水和无水乙醇分别洗涤2次后离心收集,真空干燥后密封,4℃保存;
(2)生长因子装载于碳酸钙粒子中
称取50mg碳酸钙、2mg嗜热菌蛋白酶、18μg BMP-2,加入2mL去离子水,用震荡器充分震荡使其分散混匀,在45℃水浴条件下使用旋转蒸发仪干燥,得到载有嗜热菌蛋白酶及BMP-2的碳酸钙粒子(记为:B&TM@CC),密封,低温保存;
(3)碳酸钙-二肽复合水凝胶的制备
将Fmoc-Y和L-NH2溶于0.5mL PBS缓冲液(0.05M,pH为7.5)中,超声使其溶解得到Fmoc-Y(80mM)和L-NH2(320mM)的透明溶液;
将26mg的B&TM@CC分散于0.5mL PBS缓冲液中,将其加入至Fmoc-Y和L-NH2的PBS溶液中,用震荡器震荡混匀后静置约3min,得到碳酸钙复合的二肽自组装水凝胶(记为B&TM@CC Gel)。
实施例4
与实施例1的区别在于,本实施例中步骤(1)中搅拌的转速为500rpm;其余制备方法和参数均与实施例1保持一致。
实施例5
与实施例1的区别在于,本实施例中步骤(1)中搅拌的转速为1400rpm;其余制备方法和参数均与实施例1保持一致。
实施例6
与实施例1的区别在于,本实施例中步骤(3)中溶解得到Fmoc-Y(60mM)和L-NH2(180mM)的透明溶液;
其余制备方法和参数均与实施例1保持一致。
实施例7
与实施例1的区别在于,本实施例中步骤(3)中溶解得到Fmoc-Y(50mM)和L-NH2(200mM)的透明溶液;
其余制备方法和参数均与实施例1保持一致。
实施例8
与实施例1的区别在于,本实施例中步骤(2)中的生长因子为成骨多肽BFP-1;
其余制备方法和参数均与实施例1保持一致。
性能参数测试
(1)二肽水凝胶支架的形态特征
对实施例1~8提供的碳酸钙复合的二肽水凝胶支架进行性能测试,并在扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜下观察其形态。
其中,实施例1制备得到的二肽自组装水凝胶B&TM@CC Gel的扫描电子显微镜图如图3所示,透射电子显微镜图如图4所示;
由图3可知,凝胶由二肽纤维网络组成,碳酸钙粒子被缠绕其中。图4显示,凝胶纤维上有小颗粒物质沉积。
此外,实施例2-8所制备的二肽自组装水凝胶B&TM@CC Gel具有与实施例1中相同的形态特征。
(2)BMP-2释放时间测试
所述测试的方法为:将制备好的凝胶浸泡于PBS缓冲液中,每到固定时间点取样100μL,低温保存,直至最后取样时间点利用BMP-2检测试剂盒进行BMP-2测试。
图5为实施例1制备得到的二肽自组装水凝胶B&TM@CC Gel的BMP-2释放曲线,由图可知,所述二肽自组装水凝胶在30小时左右的累积释放量为40%左右;释放速度较慢,能够达到长效持久起效的作用;
此外,实施例2-8所制备的二肽自组装水凝胶也同样能够起到缓释的作用。
(3)培养成肌细胞
成肌细胞所用培养基为DMEM+10%FBS+1%青链霉素双抗,在含有5%CO2气体的培养箱中静置培养。细胞长满培养基后,PBS冲洗3次并用胰酶消化后进行传代,传代比例约1:5。
其中,图6为实施例1的二肽水凝胶培养成肌细胞3天后的扫描电子显微镜图;图7为实施例1的二肽水凝胶培养成肌细胞3天后的激光共聚焦显微镜图。由图可知,成肌细胞可以较好地贴附生长在凝胶支架上,形态接近纺锤形。此外,实施例2-8的二肽自组装水凝胶培养成肌细胞的效果近似。
综上所示,本发明提供的碳酸钙复合的二肽水凝胶支架具有良好的生物兼容性,能够与细胞更加充分地接触,能为细胞提供更多的营养和氧气,且具有较好的骨诱导特性,对于维持生长因子的释放和促进骨修复具有的重要意义。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种碳酸钙复合的二肽水凝胶支架,其特征在于,所述二肽水凝胶支架以二肽水凝胶为骨架装载碳酸钙粒子,且所述碳酸钙粒子中包括生长因子。
2.根据权利要求1所述的二肽水凝胶支架,其特征在于,所述碳酸钙粒子的平均粒径为400~500nm;
优选地,所述碳酸钙粒子中还包括嗜热菌蛋白酶;
优选地,所述二肽水凝胶中的氨基酸残基为酪氨酸和亮氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的二肽水凝胶支架,其特征在于,所述生长因子包括成骨细胞增殖/分化剂;
优选地,所述成骨细胞增殖/分化剂为蛋白、多肽或小分子中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述生长因子包括骨形态发生蛋白、成骨多肽、β-连环蛋白、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松或辛伐他汀中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的二肽水凝胶支架的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
制备碳酸钙粒子,再将生长因子装载于所述碳酸钙粒子中;
将装载有生长因子的碳酸钙粒子置于氨基酸溶液中,震荡混合后静置,得到所述二肽水凝胶支架。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述碳酸钙粒子的制备方法包括:将含有氯化钙的乙二醇溶液与碳酸钠溶液混合,在搅拌条件下反应,收集沉淀得到所述碳酸钙粒子;
优选地,所述搅拌的转速为700~1500rpm;
优选地,所述反应的时间为2~4h;
优选地,所述含有氯化钙的乙二醇溶液中氯化钙的摩尔浓度为5~10mM;
优选地,所述碳酸钠溶液中碳酸钠的摩尔浓度为20~30mM;
优选地,所述含有氯化钙的乙二醇溶液与碳酸钠溶液的体积比为(3~5):1。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,所述将生长因子装载于所述碳酸钙粒子中的具体步骤包括:
将所述碳酸钙粒子和生长因子混合,震荡分散后在水浴条件下旋蒸干燥,得到装载有生长因子的碳酸钙粒子;
优选地,所述碳酸钙粒子和生长因子混合时还包括加入嗜热菌蛋白酶的操作;
优选地,所述嗜热菌蛋白酶与碳酸钙粒子的质量比为1:(10~30);
优选地,所述水浴的温度为40~50℃。
7.根据权利要求4~6任一项所述的制备方法,其特征在于,所述氨基酸溶液为含有N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸和亮氨酰胺的PBS缓冲液;
优选地,所述N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸的摩尔浓度为20~80mM;
优选地,所述N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸与亮氨酰胺的摩尔比为1:(3~4);
优选地,所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01~0.1M;
优选地,所述PBS缓冲液的pH值为7.2~8.0。
8.根据权利要求4~7任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法中还包括:将装载有生长因子的碳酸钙粒子分散于PBS缓冲液中,再与氨基酸溶液等体积混合的步骤;
优选地,所述装载有生长因子的碳酸钙粒子与PBS缓冲液的固液比为(10~30)mg/mL;
优选地,所述氨基酸溶液与含有碳酸钙粒子的溶液的体积比为1:(1~2)。
9.根据权利要求4~8任一项所述的制备方法,其特征在于,所述二肽水凝胶支架的制备方法包括如下步骤:
(1)将含有5~10mM氯化钙的乙二醇溶液与20~30mM的碳酸钠溶液按(3~5):1的体积比混合,在700~1500rpm搅拌条件下反应2~4h,收集沉淀,得到碳酸钙粒子;
(2)将所述碳酸钙粒子、生长因子和嗜热菌蛋白酶混合,震荡分散后在40~50℃的水浴条件下旋蒸干燥,得到装载有生长因子的碳酸钙粒子;
(3)将N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸和亮氨酰胺溶于PBS缓冲液中,所得PBS缓冲液中N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸的摩尔浓度为20~80mM,所述N-芴甲氧羰基保护的酪氨酸与亮氨酰胺的摩尔比为1:(3~4);
并将步骤(2)所得碳酸钙粒子溶于PBS缓冲液中,再与氨基酸溶液混合,所述氨基酸溶液与含有碳酸钙粒子的溶液的体积比为1:(1~2),静置,得到碳酸钙复合的二肽水凝胶支架。
10.如权利要求1~3任一项所述的二肽水凝胶支架在制备骨组织材料和/或在骨组织工程中的应用。
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