CN111700881A - Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体、其制备方法及其应用 - Google Patents

Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，具体而言，涉及Wnt蛋白\ZIF‑8纳米复合体、其制备方法及其应用。该纳米复合体包括ZIF‑8沸石咪唑酯骨架，所述ZIF‑8沸石咪唑酯骨架负载有Wnt蛋白。本发明通过利用ZIF‑8包裹所述Wnt蛋白，能够有效减缓ZIF‑8的崩解速率，使得锌离子的释放速度变慢，可以提升ZIF‑8的用量极量。同时，ZIF‑8包裹Wnt蛋白，提升了Wnt蛋白的稳定性，使得其在体液环境或者制备、运输等过程中不易失活，提升了生理活性。同时，ZIF‑8和Wnt蛋白合用具有良好的促成骨效果，扩大了Wnt蛋白\ZIF‑8纳米复合体的应用范围。

Description

Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体而言，涉及Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体、其制备方法及其应用。
背景技术
现有技术中常利用蛋白质进行疾病的治疗，但是单纯使用蛋白质存在诸多缺点，(1)蛋白质在体液环境中容易被酶解；(2)在制备或者存放时，容易因为过热或环境pH过高过低而失活；(3)单独的蛋白质难以直接进入细胞，继而影响蛋白质的生理和生化性能，因此，为了保证蛋白质的生理生化性能，常常需要使用载体。同时，即使使用载体负载蛋白质，蛋白质仍存在容易失活或者活性低等问题。而金属-有机骨架(metal-organicframeworks，MOFs)材料因其具有极高的比表面积、高孔隙率、结构多样性，可作为优异的载体。其中，以锌(Zn)为配位中心的沸石咪唑酯骨架(Zeoliticimidazolate framework-8，ZIF-8)是MOFs家族的重要成员，也具有非常优异的载药性能，但是现有技术中ZIF-8释放过多的锌离子，有较强的细胞毒性，且ZIF-8崩解速度较快，因此严格限制了ZIF-8的使用浓度。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体、其制备方法及其应用。该Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体能够有效控制ZIF-8的崩解速率，减缓锌离子的释放速度，降低其细胞毒性，同时，可以提升蛋白的稳定性和活性，并且能够提升该纳米复合体的药效。
本发明是这样实现的：
发明人发现ZIF-8沸石咪唑酯骨架(后文简称ZIF-8)具有可能通过释放锌离子介入Wnt成骨通路，继而具有促成骨作用，但是ZIF-8释放过多的锌离子，有较强的毒性，同时，ZIF-8崩解速度较快，较短时间内，活性成分释放过多，容易达到用药上限，因此，限制了ZIF-8的使用浓度。而Wnt通路是维持骨代谢和稳态的关键，与细胞的成骨分化、维持充足的骨量以及骨密度有密切联系，单纯使用Wnt蛋白容易失活，即使将Wnt蛋白负载于部分载体上，其仍然容易失活，降低了其活性。
因此，第一方面，本发明实施例提供一种Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，纳米复合体包括ZIF-8沸石咪唑酯骨架，所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架负载有Wnt蛋白。
在可选的实施方式中，所述ZIF-8包裹所述Wnt蛋白；
优选地，所述Wnt蛋白包括Wnt3a蛋白；
优选地，所述Wnt蛋白还包括保护蛋白；
优选地，所述保护蛋白为白蛋白，优选为BSA；
优选地，每毫克所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架包裹0.02-0.05毫克所述Wnt蛋白。
在可选的实施方式中，所述Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体为晶体；
优选地，所述晶体为纳米级晶体；
优选地，所述Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的粒径范围为100-500μm。
第二方面，实施例提供一种前述实施方式任一项所述的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的制备方法，包括：Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体以原位合成的方法使得Wnt蛋白负载于所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架。
在可选的实施方式中，所述原位合成的步骤包括：将含有Wnt蛋白的咪唑配体溶液与含有锌离子的锌溶液混合并进行反应，以使得反应生成的ZIF-8沸石咪唑酯骨架负载Wnt蛋白；
优选地，所述原位合成的步骤包括：将所述锌溶液加入所述咪唑配体溶液中混合搅拌形成混浊液；
优选地，混合搅拌的温度为20-37℃，转速为200-500rpm。
在可选的实施方式中，所述制备方法的操作步骤还包括：对所述混浊液进行后处理；
优选地，后处理的步骤包括：依次进行离心、重悬和冻干。
在可选的实施方式中，所述咪唑配体溶液的制备步骤包括：将含有咪唑类物料的原溶液与Wnt蛋白原料混合；
优选地，所述咪唑类物料包括2-甲基咪唑；
优选地，所述Wnt蛋白原料包括Wnt蛋白；
优选地，所述Wnt蛋白原料还包括保护蛋白；
优选地，所述保护蛋白为白蛋白，优选为BSA；
优选地，所述Wnt蛋白原料为Wnt蛋白和保护蛋白形成的混合物；
优选地，所述混合物的制备包括：将Wnt蛋白与BSA按照质量比为1:1-1:9的比例混合。
在可选的实施方式中，所述咪唑类物料与所述锌溶液中的锌盐的摩尔比为40:1-80:1。
在可选的实施方式中，所述咪唑类物料和所述Wnt蛋白原料的质量比为200:1-500:1。
第三方面，实施例提供前述实施方式任一项所述的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体在制备促进成骨药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过利用ZIF-8负载所述Wnt蛋白，不仅仅能够有效减缓ZIF-8的崩解速率，使得锌离子的释放速度变慢，可以提升ZIF-8的用量极量。同时，能够提升了Wnt蛋白的稳定性，使得其在体液环境或者制备、运输等过程中不易失活，提升了生理活性。同时，ZIF-8和Wnt蛋白合用具有良好的促成骨效果，扩大了Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的应用范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的扫描电镜检测结果图；
图2为本发明实施例1制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的透射电镜检测结果放大图；
图3为本发明实施例1和实施例4制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的热重析图；
图4为本发明实施例1和实施例6制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的FTIR检测结果图；
图5为本发明实验例1提供的检测结果；
图6为本发明实验例2提供的检测结果；
图7为本发明实验例3提供的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
ZIF即沸石咪唑酯骨架结构材料，是多孔晶体材料。其中，有机咪唑酯交联连接到过渡金属上，形成一种四面体框架。而ZIF-8沸石咪唑酯骨架是锌(Zn)为配位中心的沸石咪唑酯骨架结构材料，其可作为蛋白质的载体，但是发明人发现，蛋白质负载于载体上，仍然容易导致蛋白质失活。同时，现有技术中ZIF-8释放过多的锌离子，有较强的细胞毒性，且ZIF-8崩解速度较快，因此严格限制了ZIF-8的使用浓度。
因此，本发明实施例提供一种Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，纳米复合体包括ZIF-8沸石咪唑酯骨架，所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架负载有Wnt蛋白，优选地，所述ZIF-8包裹所述Wnt蛋白。利用ZIF-8负载Wnt蛋白，特别是包裹Wnt蛋白能够有效减缓ZIF-8的崩解速率，使得锌离子的释放速度变慢，可以提升ZIF-8的用量极量。同时，ZIF-8包裹Wnt蛋白，提升了Wnt蛋白的稳定性，使得其在体液环境或者制备、运输等过程中不易失活，提升了生理活性。同时，采用Wnt蛋白和ZIF-8合用，提升了Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的促成骨效果。
进一步地，Wnt蛋白包括Wnt3a蛋白，所述Wnt蛋白还包括保护蛋白；所述保护蛋白为白蛋白，优选为BSA。Wnt3a蛋白等对Wnt通路的作用明显，能够进一步提升Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的促成骨效果。
进一步地，每毫克所述ZIF-8包裹0.02-0.05毫克所述Wnt蛋白，采用上述包裹量，能够进一步保证Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的生理效果。该包裹量指的是包括Wnt3a蛋白和BSA等保护蛋白的总量。
进一步地，Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体为晶体；且所述晶体为纳米级晶体；具体地，所述Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的粒径范围为100-500μm。Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体为上述结构能够进一步保证其性能的稳定，更有利于人体吸收，并能够保证活性成分地缓慢释放。
本发明实施例还提供一种Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的制备方法，包括：Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体以原位合成的方法使得Wnt蛋白负载于所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架。
首先，制备咪唑配体溶液：将咪唑类物料溶解形成含有咪唑类物料的原溶液，而后将该原溶液与Wnt蛋白原料混合，继而形成含有Wnt蛋白的咪唑配体溶液。
进一步地，Wnt蛋白原料包括Wnt蛋白；优选地，所述Wnt蛋白原料还包括保护蛋白；优选地，所述保护蛋白为白蛋白，优选为BSA；优选地，所述Wnt蛋白原料为Wnt蛋白和保护蛋白形成的混合物；混合物的制备包括：将Wnt蛋白与BSA按照质量比为1:1-1:9的比例混合。
也就是说本发明实施例采用的Wnt蛋白原料可以仅仅是Wnt蛋白，也可以是Wnt蛋白和保护蛋白形成的混合物。其中，保护蛋白是在蛋白酶存在的情况下，相对Wnt蛋白，更容易与蛋白酶作用的蛋白，例如BSA，继而可以有利于保证Wnt蛋白的活性，避免Wnt蛋白在合成过程中失活，有利于保证形成的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体中含有足够的具有活性的Wnt蛋白。
进一步地，咪唑类物料和所述Wnt蛋白原料的质量比为200:1-500:1。采用上述比例能够保证后续形成的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的性能。
进一步地，咪唑类物料包括2-甲基咪唑，采用2-甲基咪唑能够保证ZIF-8的形成。
接着，将含有Wnt蛋白的咪唑配体溶液与含有锌离子的锌溶液混合并进行反应，形成ZIF-8沸石咪唑酯骨架并使得所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架包裹Wnt蛋白。本发明实施例仅通过上述一步合成法即可得到Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，简化合成步骤。同时，本发明实施例现将Wnt蛋白与咪唑类物料混合，而后再与锌离子作用，能够保证原位反应的顺利进行，也就是以Wnt蛋白为中心，而后咪唑和锌离子作用，形成ZIF-8并对Wnt蛋白进行包裹，同时，提升Wnt蛋白的包裹量，减少Wnt蛋白的浪费。若更改反应顺序，例如现将咪唑类物料与锌溶液混合而后再添加Wnt蛋白，那么就先形成了ZIF-8，Wnt蛋白只能负载于ZIF-8的表面，而无法被ZIF-8包裹，也就无法有效控制ZIF-8中锌离子的释放，也无法进一步提升Wnt蛋白的活性。
其中，锌溶液为盐溶液，例如硝酸锌溶液或醋酸锌溶液，咪唑类物料与所述锌溶液中的锌盐的摩尔比为40:1-80:1，采用上述配比，能够保证ZIF-8的形成。
进一步地，所述原位合成的步骤包括：将所述锌溶液加入所述咪唑配体溶液中混合搅拌形成混浊液；将锌溶液加入咪唑配体溶液中，更有利于锌离子的分散，有利于控制Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的粒径等，继而有利于提升其药效。
具体地，混合搅拌的温度为20-37℃，转速为200-500rpm。上述条件即可满足反应要求，该反应条件更温和，更易于实现，有利于减低生产成本和难度。
制备方法的操作步骤还包括：对所述混浊液进行后处理；优选地，后处理的步骤包括：依次进行离心、重悬和冻干。采用上述后处理能够提升制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的稳定性。
本发明实施例还提供一种上述Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体在制备促进成骨药物中的应用。该Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体有优异的促成骨效果。
实施例1
本实施例提供一种Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的制备方法，包括：
(1)取259mg(3.15mmol)2-甲基咪唑溶于0.9mL无酶水中，充分搅拌溶解(温度30℃，400rpm)，得到溶液A；
(2)取250微克的Wnt3a溶解在250微克BSA溶液中形成Wnt3a/BSA混合物；
(3)后向溶液A中添加500微克Wnt3a/BSA混合物，充分搅拌10min(30℃，400rpm)，得到溶液B；
(4)取13.4mg(0.045mmol)六水硝酸锌溶于0.1mL无酶水中，充分搅拌溶解(30℃，400rpm)，得到溶液C；
(5)将溶液C加入溶液B中，充分搅拌10min(30℃，400rpm)，得到白色悬浊液D；
(6)将悬浊液D离心20min(4000rpm)，弃上清，得到沉淀E；将无水乙醇1mL加入沉淀E中，重悬，离心10min，重复3次，弃上清后得沉淀F；-50℃冻干沉淀F，获得Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体冻干粉。
实施例2-实施例5
实施例2-实施例5提供一种Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的制备方法与实施例1提供的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的制备方法操作基本一致，区别在于原料和具体地操作条件有所不同，具体如下：
实施例2
区别在于：步骤(2)中未采用Wnt3a/BSA混合物，而采用的是500μg的Wnt3a蛋白。
实施例3
区别在于：步骤(2)中Wnt3a和BSA的质量比为1：9；
步骤(3)中2-甲基咪唑和Wnt3a/BSA混合物的质量比为200：1；
步骤(4)中锌盐为无水醋酸锌，2-甲基咪唑和无水醋酸锌的摩尔比为60：1。
实施例4
区别在于：步骤(2)中Wnt3a和BSA的质量比为1：1；
步骤(3)中2-甲基咪唑和Wnt3a/BSA混合物的质量比为500：1；
步骤(4)中锌盐为无水醋酸锌，2-甲基咪唑和无水醋酸锌的摩尔比为80：1。
实施例5
区别在于：步骤(2)中Wnt3a和HSA的质量比为1：1；
步骤(3)中2-甲基咪唑和Wnt3a/BSA混合物的质量比为500：1；
步骤(4)中锌盐为无水醋酸锌，2-甲基咪唑和无水醋酸锌的摩尔比为70：1。
实施例6
参照实施例1提供的制备方法制备Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，区别在于：将溶液A和溶液C先混合均匀，而后再与Wnt3a/BSA混合物混合，其他操作条件以及物料配比等条件均与实施例1的制备方法相同。
表征1
对实施例1得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体进行扫描电镜及透射电镜检测，检测结果参见图1和图2，由此可知，得到Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体。
对实施例1和实施例6制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体进行FTIR检测，检测结果参见图4，根据图4可知，实施例1制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体中ZIF-8包裹所述Wnt蛋白。实施例6制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体中Wnt蛋白负载于ZIF-8表面，经过蛋白洗脱液处置后，BSA/Wnt3a蛋白特征峰明显减弱。
表征2
对实施例1-6制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体进行热重检测，参见图3，而后计算，实施例1中每毫克所述ZIF-8包裹0.05毫克Wnt蛋白和BSA，实施例4中每毫克ZIF-8包裹0.02毫克Wnt蛋白和BSA。
对比例1：参照实施例1提供的制备方法制备ZIF-8纳米，区别在于：将溶液A和溶液C混合均匀形成ZIF-8即可，未负载Wnt3a。
对比例2：为实施例1制备得到的Wnt蛋白/BSA混合物。
实验例1进入细胞实验
方法：
1、利用实施例1制备方法制备Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的过程中，将BSA替换为已接枝FITC荧光染料的FITC-BSA，其余操作条件均与实施例1相同，将制备得到的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体用α-MEM培养基重悬至50微克/毫升备用。BMSC细胞以5万/毫升的浓度接种于6孔板上，37℃培养过夜后，加入上述培养基，37℃孵育3小时后，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定1小时，再次PBS漂洗后，于倒置荧光显微镜下观测复合体入胞情况。
2、将对比例2中的Wnt蛋白/BSA混合物中的BSA替换为FITC-BSA，用α-MEM培养基将蛋白浓度调整至2.5微克/毫升(蛋白浓度与实施例1相同)，其余步骤同上。
检测结果参见图5，其中，图5中A为实施例1的检测结果，图5中B为对比例2的检测结果，根据图5可知，受ZIF-8包裹保护的Wnt3a/FITC-BSA蛋白可有效防止降解，并顺利进入胞内发挥调控作用。
实验例2
测定实施例1以及对比例1-2的纳米复合体的对BMSC细胞的增殖的效果。
检测方法：CCK-8细胞增殖检测。
BMSC细胞3万/毫升接种于24孔板内，分组为：空白组，对比例1(50微克/毫升)；对比例2(2.5微克/毫升)；实施例1(50微克/毫升)；37℃培养，隔天换液，分别于4天和7天通过CCK-8试剂盒测得细胞增殖数目。
检测结果见图6，根据图6可知，实施例1中的纳米复合体拥有优于对比例1和对比例2的促BMSC细胞增殖效果(*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001；****代表P值＜0.0001)。
实验例3
测定实施例1以及对比例1-2的纳米复合体对BMSC细胞分化的影响。
检测方法：碱性磷酸酶定量测试
BMSC细胞3万/毫升接种于24孔板内，分组为：空白组，对比例1(50微克/毫升)；对比例2(2.5微克/毫升)；实施例1(50微克/毫升)；37℃培养，隔天换液，7天时通过AKP定量试剂盒及BCA试剂盒检测BMSC胞内碱性磷酸酶相对浓度。
检测结果见图7，根据图7可知，实施例1中的纳米复合体拥有优于对比例1和对比例2的促BMSC细胞分化效果，(*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001；****代表P值＜0.0001)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，其特征在于，所述纳米复合体包括ZIF-8沸石咪唑酯骨架，所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架负载有Wnt蛋白。
2.根据权利要求1所述的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，其特征在于，所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架包裹所述Wnt蛋白；
优选地，所述Wnt蛋白包括Wnt3a蛋白；
优选地，所述Wnt蛋白还包括保护蛋白；
优选地，所述保护蛋白为白蛋白，优选为BSA；
优选地，每毫克所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架包裹0.02-0.05毫克所述Wnt蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体，其特征在于，所述Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体为晶体；
优选地，所述晶体为纳米级晶体；
优选地，所述Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的粒径范围100-500μm。
4.一种权利要求1-3任一项所述的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体的制备方法，其特征在于，包括：Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体以原位合成的方法使得Wnt蛋白负载于所述ZIF-8沸石咪唑酯骨架。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述原位合成的步骤包括：将含有Wnt蛋白的咪唑配体溶液与含有锌离子的锌溶液混合并进行反应，以使得反应生成的ZIF-8沸石咪唑酯骨架负载Wnt蛋白；
优选地，所述原位合成的步骤包括：将所述锌溶液加入所述咪唑配体溶液中混合搅拌形成混浊液；
优选地，混合搅拌的温度为20-37℃，转速为200-500rpm。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的操作步骤还包括：对所述混浊液进行后处理；
优选地，后处理的步骤包括：依次进行离心、重悬和冻干。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述咪唑配体溶液的制备步骤包括：将含有咪唑类物料的原溶液与Wnt蛋白原料混合；
优选地，所述咪唑类物料包括2-甲基咪唑；
优选地，所述Wnt蛋白原料包括Wnt蛋白；
优选地，所述Wnt蛋白原料还包括保护蛋白；
优选地，所述保护蛋白为白蛋白，优选为BSA；
优选地，所述Wnt蛋白原料为Wnt蛋白和保护蛋白形成的混合物；
优选地，所述混合物的制备包括：将Wnt蛋白与BSA按照质量比为1:1-1:9的比例混合。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述咪唑类物料与所述锌溶液中的锌盐的摩尔比为40:1-80:1。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述咪唑类物料和所述Wnt蛋白原料的质量比为200:1-500:1。
10.权利要求1-3任一项所述的Wnt蛋白\ZIF-8纳米复合体在制备促进成骨药物中的应用。
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