CN114652855A - 基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及金属有机骨架材料包封蛋白质技术领域，公开了一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备方法和应用。该纳米复合材料包括蛋白质和包封所述蛋白质的金属有机骨架材料壳层；其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度为2‑50nm。本发明提供的纳米复合材料在蛋白质表面增加了具有刚性结构的多孔纳米壳层，由此提高了蛋白质的稳定性；同时本发明的金属有机骨架材料蛋白质纳米笼结构可以实现对蛋白质的缓慢释放，从而延长蛋白质的作用时间。

Description

基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及金属有机骨架材料包封蛋白质技术领域，具体涉及一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质在调节细胞信号转导和控制细胞命运中起着关键作用；在疾病细胞中取代功能失调的蛋白质在开发精确药物方面具有巨大的潜力。然而，蛋白质的生物医学应用在很大程度上受到蛋白质低细胞渗透性的限制。因此，为了充分发挥蛋白质的治疗潜力，需要将蛋白质以其活性形式输送到细胞中。而金属有机骨架(MOFs)已被证明是传递蛋白质的有效载体，它是由金属离子/簇合物和有机配体自组装而成的一类新型多孔杂化材料，在过去的二十年里引起了人们的极大关注，并取得了巨大的发展。
作为药物载体，金属有机骨架材料不但克服了传统药物载体所面临的载药量低、不稳定、不环保等问题，还凸显出许多优良的特性：(1)较高的孔隙率和表面积可有效提高载药量；(2)易于进行表面结构修饰，如通过连接特定的分子使材料具有靶向性，得到功能化的载药体系，实现精确的疾病治疗；(3)具有良好的生物可降解性；这也是MOFs在药物载体方面得到广泛关注的原因。例如，MOFs的可调孔径和刚性分子结构可以将核酸和蛋白质封装到MOFs中，增强了生物大分子在恶劣环境下的稳定性。此外，纳米尺度的MOFs可以有效地被细胞内化，用于细胞内药物递送。MOFs的载药方式一般有以下两种：一是将MOFs的反应物与药物分子一同加入，此方法可以将药物分子包裹在纳米粒子中，且尺寸均匀、载药量大、毒性低，但在控制其形貌和物化性能方面存在一些问题，比如所合成的颗粒粒径尺寸偏大；另外一种方法是在首先进行MOFs合成，之后再将药物负载在MOFs孔道内，两者之间通过键合作用连接，由此可以减少给药次数同时实现药物分子的控释进而达到治疗的效果，但其不足之处是载药量较小。由于上述问题的存在限制了金属有机骨架材料在载药方面的许多实际应用。
因此，开发新的高载药量的药物载体，并使其满足生物相关性的实际应用，仍然具有深远的理论与实际意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述技术问题，提供一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料及其制备方法和应用，该纳米复合材料包括蛋白质和包封所述蛋白质的金属有机骨架材料壳层；其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度为2-50nm。
本发明第二方面提供一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的制备纳米复合材料的方法，该方法包括：在蛋白质的表面构建金属有机骨架材料壳层，
其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度为2-50nm。
本发明第三方面提供一种前述方法制备的基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料。
本发明第四方面提供一种前述第一方面或第三方面所述的纳米复合材料在制备用于治疗抑制炎症药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的纳米复合材料的结构包括蛋白质和包封所述蛋白质的金属有机骨架材料壳层；其中，通过透射电子显微镜观察能够确定本发明的纳米复合材料的平均粒径在10nm左右，进一步通过透射电镜的Mapping对本发明的纳米复合材料进行分析，能够确定本发明的金属有机骨架材料实现了对蛋白质的包封。该纳米复合材料在蛋白质表面增加了具有刚性结构的多孔纳米壳层，由此提高了蛋白质的稳定性。进一步地，本发明通过加入纳米复合材料培养的巨噬细胞所表达的抗炎症因子和促炎症因子的表达情况能够确定本发明的金属有机骨架材料蛋白质纳米笼结构对炎症有明显的治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼(纳米复合材料)的透射电子显微镜照片；
图2为本发明实施例1制备的金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼(纳米复合材料)的Mapping图片；
图3为本发明实施例2制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)的透射电子显微镜照片；
图4为本发明实施例2制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)的原子力显微镜照片；
图5为本发明实施例3制备的金属有机骨架材料脂肪酶纳米笼(纳米复合材料)的透射电子显微镜照片；
图6为含有纯超氧化物歧化酶和本发明实施例2制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)的稳定性测试结果；
图7为本发明含有纯超氧化物歧化酶和实施例2制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)培养基的巨噬细胞中抗炎症因子表达情况；
图8为本发明含有纯超氧化物歧化酶和实施例2制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)培养基的巨噬细胞中促炎症因子表达情况。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料，该纳米复合材料包括蛋白质和包封所述蛋白质的金属有机骨架材料壳层；
其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度为2-50nm(2nm、4nm、6nm、8nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm或以上数值之间的任意值)。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米复合材料的粒径可以为5-100nm(5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm或以上数值之间的任意值)，优选为7-80nm。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米复合材料为球形；所述纳米复合材料的比表面积为500-800m2/g(400m2/g、500m2/g、550m2/g、600m2/g、650m2/g、700m2/g、800m2/g或以上数值之间的任意值)、蛋白质包封率约为80-95％。其中，包封率是指“金属有机骨架对蛋白质成功包封的比率”。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米复合材料中，蛋白质直径与金属有机骨架材料壳层厚度的比为(0.25-5)：1。
本发明对蛋白质的种类没有特别的限制，对多种蛋白质具有普适性，例如，所述蛋白质可以选自牛血清蛋白、超氧化物岐化酶、脂肪酶和过氧化物酶(如过氧化氢酶)中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米复合材料由内到外依次包括蛋白质、有机配体部分和配位金属离子(金属中心离子)；其中，所述蛋白质与有机配体部分共价连接(例如，蛋白质可以通过其氨基与有机配体中的羧基或醛基反应生成酯基的方式连接)，所述有机配体部分和配位金属离子通过配位作用连接。
为了获得更好的效果，对蛋白质和有机配体部分的摩尔比、有机配体部分和配位金属离子的摩尔比均有一定限制，优选情况下，所述蛋白质和有机配体部分的摩尔比可以为1：(80-400)(如1:80、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400或以上比值之间的任意值)。
所述有机配体部分和配位金属离子的摩尔比可以为(20-400)：1(20:1、40:1、60:1、80:1、100:1、120:1、160:1、180:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1或以上比值之间的任意值)。
根据本发明的一些实施方式，所述有机配体部分由咪唑类化合物提供。其中，对所述有机配体的种类没有特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可，例如，所述有机配体部分可以由咪唑-2-甲醛、咪唑-2甲酸和2,5-二羟基对苯二甲酸中的至少一种提供。
根据本发明的一些实施方式，所述配位金属离子选自Zn2+、Co2+和Mg2+中的至少一种。
本发明第二方面提供一种制备纳米复合材料的方法，该方法包括：在蛋白质的表面构建金属有机骨架材料壳层，
其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度可以为2-50nm。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米复合材料的粒径为5-100nm，优选为7-80nm。
根据本发明的一些实施方式，所述方法可以包括按照以下方式在蛋白质的表面构建金属有机骨架材料壳层的步骤：
(1)将蛋白质与有机配体混合，使蛋白质表面的氨基与有机配体中的羧基或醛基发生缩合反应，得到纳米复合材料前体；
(2)使纳米复合材料前体与配位金属源进行配位。
本发明对所述缩合反应的条件没有特别的限制，可以参照本领域常规的制备方法进行。例如，所述缩合反应的条件可以包括：温度为20-35℃，时间为1-5h。
根据本发明的一些实施方式，所述蛋白质和有机配体的摩尔比可以为1：(80-400)。
根据本发明的一些实施方式，所述缩合反应在水的存在下进行；其中，相对于1mg的蛋白质，水的用量可以为0.2-3.8mL。
本发明中，对步骤(1)中反应后的体系可以不进行特别的后处理，可以直接用于下一步的配位。
根据本发明的一些实施方式，步骤(2)中，所述配位的条件可以包括：温度为20-35℃，时间为10-60min。
根据本发明的一些实施方式，所述配位金属源选自乙酸锌(优选为二水合乙酸锌)、硝酸锌(优选为六水合硝酸锌)、乙酸镁(优选为四水合乙酸镁)和乙酸钴中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述有机配体与所述配位金属源摩尔比可以为(20-400)：1。
本发明中，对步骤(2)中得到的含金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼(纳米复合材料)的体系的后处理没有特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可，优选情况下，可以按照以下方式进行后处理：采用乙醇对步骤(2)中得到的含金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼(纳米复合材料)的溶液进行离心(3000-12500rpm)和洗涤(其中，离心和洗涤的次数可以为2-5次)。其中，对乙醇的用量没有特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。
本发明中，步骤(2)中还包括将得到纳米复合材料分散于乙醇中或冷冻干燥(-80至-60℃左右，干燥4-8h)、室温干燥进行保存。
本发明第三方面提供一种前述方法制备的基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料。
本发明第四方面提供一种前述第一方面或第三方面所述的纳米复合材料在制备用于治疗抑制炎症药物中的应用。
按照一种具体的实施方式，本发明提供的纳米复合材料在作为抑制炎症的药物时，优选情况下，纳米复合材料的浓度可以为30-80μg/mL。
本发明还涉及(在体外)抑制炎症的方法，该方法包括：将本发明的纳米复合材料与具有炎症的细胞接触。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，牛血清蛋白购自阿拉丁(货号为A116563)；超氧化物岐化酶购自阿拉丁(货号为S128537)；脂肪酶购自阿拉丁(货号为L299010)；过氧化氢酶购自阿拉丁(货号为C128526)；过氧化物酶购自阿拉丁(货号M341240)。
纳米复合材料的比表面积的测试方法：BET比表面积测试法；
蛋白质包封率的测试方法：TGA热重分析；
蛋白质和金属有机骨架材料壳层的直径的测试方法：透射扫描电子显微镜；
金属有机骨架材料壳层的厚度的测试方法：透射电子扫描显微镜。
实施例1
该实施例用于说明金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼(纳米复合材料)的制备
(1)将1.5mg(0.015mmol)咪唑-2-甲醛(2-ICA)加入到2mL水中，加入5mg(0.075×10-3mmol)牛血清蛋白(BSA)，搅拌使其混合均匀；并在室温下搅拌进行缩合反应2h；得到纳米复合材料前体；
(2)将0.049mg(0.22×10-3mmol)二水合乙酸锌((CH3COO)2Zn·2H2O)加入步骤(1)反应后的体系中，室温下继续搅拌30min，进行配位，得到含金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼(纳米复合材料)的溶液；之后将得到的纳米复合材料溶液用乙醇离心洗涤3次(离心和洗涤均3次；每次洗涤用的乙醇的用量5mL、离心的条件12500rpm、10mim)，得到纳米复合材料，并将其分散于乙醇中或冷冻干燥、室温干燥保存。其中，纳米复合材料的比表面积为657m2/g；蛋白质包封率约为91％；牛血清蛋白直径(8nm)与金属有机骨架材料壳层厚度(2nm)的比例为4：1。
对该实施例得到的纳米复合材料进行透射扫描电子显微镜测试，得到如图1所示的透射电镜照片，并从TEM(透射电子显微镜)右上角的粒径分布图可以看出纳米复合材料的平均粒径为10.28nm。
对该实施例得到的纳米复合材料进行透射电镜Mapping测试，得到如图2所示的Mapping照片，由图2可以看出该纳米复合材料的核中富含硫和磷元素，也即核中为牛血清蛋白，壳层主要由锌、氧、碳和氮构成，即壳层为包封牛血清蛋白的金属有机骨架材料。由图2中不同的元素分布可以看出，金属有机骨架蛋白质纳米笼纳米复合材料的成功制备。
实施例2
该实施例用于说明金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)的制备
(1)将1.5mg咪唑-2-甲醛(2-ICA)加入到2mL水中，加入5mg(0.156×10-3mmol)超氧化物岐化酶(SOD)，搅拌使其混合均匀；并在室温下搅拌进行缩合反应2h；得到纳米复合材料前体；
(2)将0.049mg(0.22×10-3mmol)二水合乙酸锌((CH3COO)2Zn·2H2O)加入步骤(1)反应后的体系中，室温下继续搅拌20min，进行配位，得到含金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)的溶液；之后将得到的纳米复合材料溶液用乙醇离心洗涤3次(每次洗涤用的乙醇的用量5mL、离心的条件12500rpm、10min)，得到纳米复合材料，并将其分散于乙醇中或冷冻干燥、室温干燥保存。其中，纳米复合材料的比表面积为623m2/g；蛋白质的包封率约为89％；超氧化物歧化酶直径(5nm)与金属有机骨架材料壳层厚度(5nm)的比例为1：1。
对该实施例得到的纳米复合材料进行透射扫描电子显微镜测试，得到如图3所示的透射电镜照片，由图3可以看出该实施例制备的纳米复合材料与实施例1得到的金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼的平均粒径基本一致，均为10nm左右。
对该实施例得到的纳米复合材料进行原子力显微镜测试，得到如图4所示的原子力显微镜照片，可以看出该金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼的高度为10nm左右，结果与透射电子显微镜图3透射电镜照片一致。
实施例3
该实施例用于说明金属有机骨架材料脂肪酶纳米笼(纳米复合材料)的制备
(1)将0.0155g(0.072mmol)2,5-二羟基对苯二甲酸(H4DHTP)加入到3.8mL水中，加入5mg(0.214×10-3mmol)脂肪酶，搅拌使其混合均匀；并在室温下搅拌进行缩合反应2h；得到纳米复合材料前体；
(2)将0.0386mg(0.18×10-3mmol)四水合乙酸镁(C4H6O4Mg·4H2O)加入步骤(1)反应后的体系中，室温下继续搅拌20min，进行配位，得到含金属有机骨架材料脂肪酶纳米笼(纳米复合材料)的溶液；之后将得到的纳米复合材料溶液用乙醇离心洗涤3次(每次洗涤用的乙醇的用量5mL、12500rpm、离心10min)，得到纳米复合材料，并将其分散于乙醇中或冷冻干燥、室温干燥保存。其中，纳米复合材料的比表面积为579m2/g，蛋白质的包封率约为87％；脂肪酶直径6nm和金属有机骨架材料壳层厚度4nm的直径比为1.5：1。
对该实施例得到的纳米复合材料进行透射电子显微镜测试，得到如图5所示的透射电镜照片，由图5可以看出该实施例制备的纳米复合材料与实施例1得到的金属有机骨架材料牛血清蛋白纳米笼的平均粒径基本一致，均为10nm左右。
测试例1
利用邻苯三酚自氧化原理，使用紫外-可见分光光度计对超氧化物歧化酶以及上述实施例2制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)进行稳定性测试。具体实验步骤和方法如下：
将缓冲液在37℃下预热20min，之后在两支试管中分别依次加入预热后的缓冲液，预热后的待测酶液，在相同条件下预热后的苯三酚溶液，迅速混合摇匀，立即倒入比色皿中，测定吸光度值(波长为325nm)，每隔30s读数一次，测定4min内溶液吸光度值的变化。试剂加入量参照表1。稳定性测试结果如图6。
表1
Figure BDA0003553464440000101
Figure BDA0003553464440000111
由图6可以看出，本发明制备的金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼(纳米复合材料)和纯超氧化物歧化酶处理邻苯三酚不同时间后，溶液中的邻苯三酚氧化速率均有所下降，但金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼处理后的溶液的吸光度值明显小于纯超氧化物歧化酶处理后的吸光度，这说明金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼能够更好的阻止中间产物的积累。这归因于金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼(复合材料)中金属有机骨架壳层对超氧化物歧化酶的保护作用。
由以上测试结果可知，本发明提供的纳米复合材料相比于纯超氧化物歧化酶具有更高的稳定性。
测试例2
将巨噬细胞(来源大鼠的巨噬细胞)在细胞培养基(Eagle培养基，置37℃，5％CO2温箱中培养)上培养，待细胞贴壁后加入细菌脂多糖(内毒素，LPS)刺激产生炎症；其中，LPS的浓度为1μg/mL，处理时间为12h；之后上述实施例2得到的纳米复合材料(也即金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼)作为实验组，纯超氧化物歧化酶作为对照组加入到巨噬细胞培养基中；其中，金属有机骨架材料超氧化物歧化酶纳米笼的浓度为50μg/mL，纯超氧化物歧化酶的加入量为1μg/mL；
培养24h后检测巨噬细胞中抗炎症因子和促炎症因子的表达情况；其中，抗炎症因子检测的为精氨酸酶-1(Arg-1)的表达情况，促炎症因子检测的为白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。
实施例2制备的金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼和纯超氧化物歧化酶处理巨噬细胞后，抗炎症因子表达情况见图7；由图7可以看出，金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼处理巨噬细胞后抗炎症因子的表达量明显高于纯超氧化物歧化酶。
实施例2制备的金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼和纯超氧化物歧化酶处理巨噬细胞后，促炎症因子表达情况见图8；由图8可以看出，金属有机骨架材料超氧歧化酶纳米笼处理巨噬细胞后促炎症因子的表达量明显低于纯超氧化物歧化酶。
由以上测试结果可知，本发明提供的纳米复合材料在作为抑制炎症的药物时具有优异的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料，其特征在于，该纳米复合材料包括蛋白质和包封所述蛋白质的金属有机骨架材料壳层；
其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度为2-50nm。
2.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其中，所述纳米复合材料的粒径为5-100nm，优选为7-80nm；
和/或，所述纳米复合材料为球形；所述纳米复合材料的比表面积为500-800m2/g、蛋白质包封率为80-95％。
3.根据权利要求1或2所述的纳米复合材料，其中，所述纳米复合材料中，蛋白质直径与金属有机骨架材料壳层厚度的比为(0.25-5)：1。
4.根据权利要求1或2所述的纳米复合材料，其中，所述蛋白质选自牛血清蛋白、超氧化物岐化酶、脂肪酶和过氧化物酶中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述的纳米复合材料，其中，所述纳米复合材料由内到外依次包括蛋白质、有机配体部分和配位金属离子；其中，所述蛋白质与有机配体部分共价连接，所述有机配体部分和配位金属离子通过配位作用连接；
优选地，所述蛋白质和有机配体部分的摩尔比为1：(80-400)；
优选地，所述有机配体部分和配位金属离子的摩尔比为(20-400)：1。
6.根据权利要求5所述的纳米复合材料，其中，所述有机配体部分由咪唑类化合物提供，所述有机配体部分由咪唑-2-甲醛、咪唑-2-甲酸和2,5-二羟基对苯二甲酸中的至少一种提供；
优选地，所述配位金属离子选自Zn2+、Co2+和Mg2+中的至少一种。
7.一种制备基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料的方法，其特征在于，该方法包括：在蛋白质的表面构建金属有机骨架材料壳层，
其中，所述金属有机骨架材料壳层的厚度为2-50nm；
优选地，所述纳米复合材料的粒径为5-100nm。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法包括按照以下方式在蛋白质的表面构建金属有机骨架材料壳层的步骤：
(1)将蛋白质与有机配体混合，使蛋白质表面的氨基与有机配体中的羧基或醛基发生缩合反应，得到纳米复合材料前体；
(2)使纳米复合材料前体与配位金属源进行配位。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)中，所述缩合反应的条件包括：温度为20-35℃，时间为1-5h；
和/或，所述蛋白质和有机配体的摩尔比为1：(80-400)；
和/或，所述蛋白质选自牛血清蛋白、超氧化物岐化酶和过氧化物酶中的至少一种；
和/或，所述缩合反应在水的存在下进行；其中，相对于1mg的蛋白质，水的用量为0.2-3.8mL。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中，步骤(2)中，所述配位的条件包括：温度为20-35℃，时间为10-60min；
和/或，所述配位金属源选自乙酸锌、硝酸锌、乙酸镁和乙酸钴中的至少一种；
和/或，所述有机配体与所述配位金属源摩尔比为(20-400)：1。
11.权利要求7-9中任意一项所述的方法制备的基于金属有机骨架与蛋白质纳米笼的纳米复合材料。
12.权利要求1-6和10中任意一项所述的纳米复合材料在制备用于治疗抑制炎症药物中的应用。
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