CN111909924A - 一种蛋白质与无定形金属有机骨架复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白质与无定形金属有机骨架复合物及其制备方法。所述有机骨架复合物具有2nm～50nm介孔结构，制备方法包括如下步骤：蛋白质、锌离子和有机配体在溶剂中进行反即得，有机配体为含有咪唑基团的化合物；蛋白质为细胞色素C、细胞色素P450、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、绿色荧光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碳酸酐酶、醛酮还原酶、淀粉酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶、脲酶、过氧化氢酶中任一种或几种的组合。本发明提供的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的制备方法操作简单、条件温和、所得产品蛋白包埋率高、蛋白稳定性好、蛋白的生物活性得到较大程度保留。

Description

一种蛋白质与无定形金属有机骨架复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质与无定形金属有机骨架复合物及其制备方法，属于生物材料制备技术领域。
背景技术
蛋白质具有丰富的生理功能和催化功能。金属有机骨架化合物，是由金属离子与有机配体配位合成的一种复合物，它具有孔结构丰富、比表面积大、化学稳定性好、结构可调控等优点，在催化和分离等领域中都有着很好应用前景。将蛋白质和金属有机骨架化合物相结合，构建蛋白质-金属有机骨架复合物，近年来受到人们广泛关注，在生物催化、药物递送、分析检测等领域都有望发挥重要作用。
前期的专利和文献报道中，都是采用蛋白质与结晶的金属有机骨架化合物结合，制备具有催化功能的复合物。蛋白-结晶态金属有机骨架复合物的制备方法主要包括两类：1)一步法。中国专利申请号CN104087572A公布了一步共沉淀制备蛋白与结晶金属有机骨架复合物的方法，通过蛋白质、锌离子与有机配位在溶剂中通过一步反应得到酶-晶态金属有机骨架复合物。2)两步法。首先合成与蛋白分子尺寸相匹配的介孔型金属有机骨架材料，再利用吸附法将酶分子吸附到孔道内部(P.Li et al.,J.Am. Chem.Soc.,2016,26,8052-8055；P.Li et al.,Chem,2018,5,1022-1034)。第一类制备方法采用结晶态金属有机骨架化合物，通常为微孔结构(孔径在0～2nm之间)，过小的孔结构一方面限制了内部蛋白质在催化过程中的构象变化，另一方面也限制了底物的传质过程，因此制备的复合物活性比天然酶低很多。第二类方法中与蛋白尺寸相匹配的介孔金属有机骨架材料需要首先合成复杂有机配体，再与金属离子配位形成介孔材料，而复杂有机配体通常需要多步有机合成反应，合成步骤繁琐，收率低，能耗高。
无定形金属有机骨架化合物保留了金属有机骨架化合物的基本配位结构，但是缺少长程有序结构。与结晶态的金属有机骨架材料相比，这种无定形金属有机骨架化合物展现出了更高的机械强度、热稳定性和丰富的孔径分布，具有很高的应用价值。相比于结晶型的金属有机骨架化合物作为酶固定化的载体，如果能将无定形金属有机骨架作为载体，将具有以下特别的优势：无定形金属有机骨架化合物缺少长程有序结构，不结晶，金属离子和配体之间的配位存在缺陷，导致内部形成了较多的介孔(可为 20～30nm)。这些无定形态较大的介孔将有利于底物传质，有利于提高酶的表观催化活性。
但是，目前难以通过简便温和的条件合成无定型金属有机骨架，并通过一步法将酶分子包埋其中。无定型金属有机骨架化合物现有的合成方法包括机械研磨、高温加热、高压等物理方式。在这些合成过程中，都比较难以加入酶分子进行一步法的原位包埋。例如，机械研磨法通过研磨产生的局部温度升高加机械外力使其晶格发生变形，从而得到无定型金属有机骨架材料，在此过程中酶容易失活。而高温加热则是通过控制已有晶体的晶格节点离子发生无规律不可控的热运动，从而破坏其规则结构，在此温度下，酶同样容易失活。而Gpa级别的高压制备条件同样无法使酶分子很好保留其活性。
因此，目前无法采用上述物理方法进行有生物活性的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的一步法制备。寻找一种简便高效的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的制备方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种无定形金属有机骨架化合物、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物及它们的制备方法，该方法主要通过调控反应物与溶剂的配比来完成制备，具有操作简单、条件温和、稳定性好、蛋白包埋率高、所得复合物生物催化活性高等特点。
本发明提供的无定形金属有机骨架化合物的制备方法，包括如下步骤：
锌离子和有机配体在溶剂中进行反应，即得到所述化合物；
所述有机配体为含有咪唑基团的化合物。
上述制备方法中，所述锌离子来自于可溶性锌盐，具体可为水合醋酸锌和水合硝酸锌，但不限于此；
所述溶剂可为水、甲醇、二甲基甲酰胺、叔丁醇、乙醇、二甲基亚砜、乙腈和丙酮中任一种或几种的组合，但不限于此；
所述有机配体为2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1-甲基咪唑、苯并咪唑和咪唑中任一种或几种的组合，但不限于此。
上述制备方法中，所述反应的温度可为0～50℃，具体可为4～25℃、25～35℃ 25℃、35℃、4℃；反应时间可为0.01～16小时，具体可为0.01～8小时、0.01小时或8 小时，但不限于此；
上述制备方法中，所述锌离子浓度为0.1～80mmol/L，具体可为1～40mmol/L；
所述锌离子与所述有机配体的摩尔比为1：0.1～8，具体可为1：1～4、1：1、1：4 或1:8；
上述制备方法中，在所述反应之前，可对锌离子溶液和有机配体溶液分别进行超声处理；
所述超声时间可为0～60分钟，但不包括零，具体可为15分钟；
所述锌离子溶液由所述锌离子溶解于所述溶剂中得到；
所述有机配体溶液由所述有机配体溶解于所述溶剂中得到；
上述制备方法中，所述金属有机骨架化合物可经空气干燥或真空干燥后得到，所述干燥时间可为6～48小时，具体可为8～36小时，8小时或36小时。
上述方法制备的金属有机骨架化合物也属于本发明的保护范围；
所述金属有机骨架化合物具有无定形介孔结构，介孔孔径为2～50nm，优选 2～10nm。
本发明提供的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的制备方法，包括如下步骤：
蛋白质、锌离子和有机配体在溶剂中进行反应，即得到所述复合物；
所述有机配体为为含有咪唑基团的化合物。
上述制备方法中，所述蛋白质的分子量可为5～600kDa。
上述制备方法中，所述蛋白质可为细胞色素C、细胞色素P450、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、绿色荧光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碳酸酐酶、醛酮还原酶、淀粉酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶、脲酶和过氧化氢酶中任一种或几种的组合，但不限于此。
上述制备方法，所述蛋白质与所述锌离子的质量比可为0.00001～1：1，具体可为0.015～0.2：1、0.015～0.05：1、0.025～0.03：1、0.025～0.06：1、0.015：1、0.025：1、 0.06：1、0.1：1或0.2：1；
所述的锌离子浓度可为0.1～80mmol/L，具体可为1～40mmol/L。
所述锌离子与所述有机配体的摩尔比可为1：0.1～8，具体可为1：1～4、1：1、1： 4或1:8。
上述制备方法中，所述锌离子来自于可溶性锌盐，具体可为水合醋酸锌和水合硝酸锌；
所述有机配体为2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1-甲基咪唑、苯并咪唑和咪唑中任一种或几种的组合，但不限于此；
所述溶剂可为水、甲醇、二甲基甲酰胺、叔丁醇、乙醇、二甲基亚砜、乙腈和丙酮中任一种或几种的组合，但不限于此。
上述制备方法中，所述反应的温度可为0～50℃，具体可为4～25℃、25～35℃ 25℃、35℃、4℃；反应时间可为0.01～16小时，具体可为0.01～8小时、0.01小时或8 小时。
上述制备方法中，在所述反应之前，可对锌离子溶液和有机配体溶液分别进行超声处理；
所述超声时间可为0～60分钟，但不包括零，具体可为15分钟；
所述锌离子溶液由所述锌离子溶解于所述溶剂中得到；
所述有机配体溶液由所述有机配体溶解于所述溶剂中得到。
上述制备方法中，所述蛋白质与无定形金属有机骨架复合物可经空气干燥或真空干燥后得到，所述干燥时间可为6～48小时，具体可为8～36小时，8小时或36小时。
上述方法制备得到的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物也属于本发明的保护范围；
所述蛋白质与无定形金属有机骨架复合物具有无定形介孔结构，介孔孔径为 2～50nm，优选2～10nm。
本发明具有以下优点：
本发明提供的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的制备方法操作简单、条件温和、所得产品蛋白包埋率高、蛋白稳定性好、蛋白的生物活性得到较大程度保留。
附图说明
图1是实施例1所制备的无定形金属有机骨架化合物的扫描电镜图。
图2是实施例1所制备的无定形金属有机骨架化合物的透射电镜图。
图3是实施例2所制备的复合物的透射电镜图。
图4是实施例2所制备的复合物的扫描电镜图。
图5是实施例3所制备的复合物的透射电镜图。
图6是实施例3所制备的复合物的扫描电镜图。
图7是实施例5所制备的复合物的透射电镜图。
图8是实施例5所制备的复合物的扫描电镜图。
图9是实施例6所制备的复合物的透射电镜图。
图10是实施例6所制备的复合物的扫描电镜图。
图11是实施例7所制备的复合物的扫描电镜图。
图12是实施例10所制备的复合物的扫描电镜图。
图13是实施例11所制备的复合物的扫描电镜图。
图14是实施例13所制备的复合物的扫描电镜图。
图15是实施例18所制备的复合物的扫描电镜图。
图16是实施例19所制备的复合物的扫描电镜图。
图17是实施例20所制备的复合物的扫描电镜图。
图18是实施例21所制备的复合物的扫描电镜图。
图19是实施例22所制备的复合物的扫描电镜图。
图20是实施例3所制备的复合物的扫描电镜图。
图21是实施例24制备的复合物的扫描电镜图。
图22是实施例1所制备的复合物与无定形金属有机骨架化合物的X射线衍射数据图。
图23是实施例1所制备的无定形金属有机骨架化合物和ZIF-8晶体的傅里叶红外分析数据图。
图24是实施例1所制备的无定形金属有机骨架化合物和ZIF-8晶体的氮气吸附曲线图。
图25是实施例1所制备的无定形金属有机骨架化合物和ZIF-8晶体的孔径分布图。
图26是实施例2所制备的复合物和ZIF-8晶体的傅里叶红外分析数据图。
图27是实施例2所制备的复合物和ZIF-8晶体的热重曲线。
图28是实施例2所制备的复合物和ZIF-8晶体的氮气吸附曲线图。
图29是实施例2所制备的复合物和ZIF-8晶体的孔径分布图。
图30是实施例2所制备的复合物的酶活及对比图。
图31是实施例24所制备的复合物的X射线衍射数据图。
图32是实施例24所制备的复合物的酶活及对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所得复合物中蛋白包埋率可通过下式得到：
包埋率＝复合物中蛋白含量/体系中加入的总蛋白量×100％。
下述实施例中蛋白含量是通过测定反应后体系中上层清液的蛋白含量，得到未被包埋的蛋白质的质量，根据该质量所占的比重计算复合物中蛋白的含量。
实施例1、金属有机骨架化合物的合成
1、分别配制浓度为20mmol/L的水合醋酸锌的水溶液，浓度为80mmol/L的2-甲基咪唑的水溶液，对所得溶液分别进行超声处理15分钟。
2、取步骤1所得的锌离子溶液、2-甲基咪唑溶液各1mL混合，在25℃下反应1小时。
4、将步骤3所得产物通过离心分离出，用去离子水重复洗涤3次，将洗涤后的产品冷冻干燥24小时，得到金属有机骨架化合物。
本实施例制备的金属有机骨架化合物的扫描电镜照片和透射电镜照片分别如图1和图2所示，由图1和图2可知，所得化合物的主体形状为球形，颗粒粒径在50nm～100nm 之间。
本实施例制备的金属有机骨架化合物的X射线衍射图如图22所示，由图22可知，复合物没有晶体的衍射峰，是无定形材料。
本实施例制备的金属有机骨架化合物的傅里叶红外分析如图23所示，由图23可知，复合物指纹区红外峰与金属有机骨架化合物(ZIF-8)一致。
本实施例制备的金属有机骨架化合物的氮气吸附曲线如图24所示，由图24可知，该化合物的吸附氮气体积显著低于金属有机骨架化合物(ZIF-8)。
本实施例制备的金属有机骨架化合物的孔径分布分析如图25所示，由图25可知，该化合物呈现微孔和介孔复合结构，其中低于2nm的微孔含量较低，主要含介孔结构，介孔孔径处于2～10nm之间，而金属有机骨架化合物(ZIF-8)仅含微孔结构。
本实施例制备的金属有机骨架化合物的元素分析如表1所示，由表1可知，化合物各元素比例与ZIF-8晶体接近。
表1金属有机骨架化合物的元素分析
Figure RE-GDA0002107949770000061
实施例2、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
1、配制含葡萄糖氧化酶10mg/mL的水溶液。
2、分别配制浓度为20mmol/L的水合醋酸锌的水溶液，浓度为80mmol/L的2-甲基咪唑的水溶液，对所得溶液分别进行超声处理15分钟。
3、取步骤1所得的溶液100μL与步骤2中的锌离子溶液、2-甲基咪唑溶液各1mL混合，在25℃下反应1小时。
4、将步骤3所得产物通过离心分离出，用去离子水重复洗涤3次，将洗涤后的产品冷冻干燥8小时，得到产物中蛋白包埋率100％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片和透射电镜照片分别如图3和图4所示，由图3和图4可知，所得复合物的主体形状为球形，颗粒粒径在50nm～100nm之间。
本实施例制备的复合物的X射线衍射图如图22所示，由图22可知，复合物没有晶体的衍射峰，是无定形材料。
本实施例制备的复合物的傅里叶红外分析如图26所示，由图26可知，复合物指纹区红外峰与金属有机骨架化合物(ZIF-8)基本一致，在1659cm-1处有蛋白质的酰胺峰。
本实施例制备的复合物和ZIF-8晶体的热重分析如图27所示，由图27可知，复合物在300℃左右开始分解，而ZIF-8晶体的分解温度在400℃左右。
本实施例制备的复合物的氮气吸附曲线如图28所示，由图28可知，该复合物的吸附氮气体积显著低于金属有机骨架化合物(ZIF-8)。
本实施例制备的复合物的孔径分布分析如图29所示，由图29可知，该复合物呈现微孔和介孔复合结构，其中微孔低于2nm，含量较低，介孔比例较高，介孔处于2～10nm 之间，而金属有机骨架化合物(ZIF-8)仅含微孔结构。
本实施例制备的复合物的酶活如图30所示，由图30可知，复合物中葡萄糖氧化酶的酶活是天然酶的80％左右。
上述葡萄糖氧化酶酶活的测定具体以葡萄糖和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6- 磺酸)二铵盐(ABTS)为底物。20μL浓度为10μg/mL葡萄糖氧化酶溶液与80μL浓度10 μg/mLHRP溶液同时加入到900μL底物溶液中(含有100mM葡萄糖与0.5mM ABTS)，测定415nm处1min内吸光度值的变化，根据吸光度的变化计算酶活。
实施例3、复合乙醇脱氢酶-金属有机骨架化合物的合成
1、配置10mg/mL的乙醇脱氢酶溶液。
2、分别配制浓度为40mmol/L的水合醋酸锌的水溶液，浓度为160mmol/L的2-甲基咪唑的水溶液。
3、取步骤1所得的锌离子溶液、2-甲基咪唑溶液各1mL与步骤2所得蛋白溶液 100μL，在25℃下反应30min。
4、将步骤3所得产物通过离心分离出，用去离子水重复洗涤3次，将洗涤后的产品冷冻干燥8小时，得到金属有机骨架化合物。
本实施例制备的复合乙醇脱氢酶的复合物的透射电镜图如图5所示，扫描电镜图如图6所示，所得化合物的主体形状为球形，颗粒粒径在50nm～100nm之间。
实施例4-5、蛋白质与无定型金属有机骨架复合物的合成
操作步骤如实施例1，不同之处在于将葡萄糖氧化酶依次替换为南极假丝酵母脂肪酶、过氧化氢酶、葡萄糖脱氢酶和漆酶，得到产物中蛋白包埋率均大于80％。
复合过氧化氢酶的复合物的透射电镜图如图7所示，扫描电镜图如图8所示。
实施例6-7、蛋白质与无定型金属有机骨架复合物的合成
操作步骤如实施例3，不同之处在于将乙醇脱氢酶依次替换为、葡萄糖脱氢酶和漆酶，得到产物中蛋白包埋率均大于80％。复合葡萄糖脱氢酶的复合物的透射电镜图如图9所示，扫描电镜图如图10所示。
复合漆酶的复合物的扫描电镜图如图11所示。
由上述各图可得知，实施例1-7制备得到的复合物主体形状均为球体。
实施例8-9、蛋白质与金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例1，不同之处在于，将步骤3的反应温度由25℃分别替换为4℃和35℃，得到产物中蛋白包埋率均大于80％。
实施例10、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例3，不同之处在于，将步骤1的葡萄糖氧化酶酶替换成乙醇脱氢酶，蛋白浓度替换为1mg/mL，得到产物中蛋白包埋率约82％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图12所示，由图12可知，本实施例制备得到的复合物与实施例1制得的复合物相比不规则程度增加。
实施例11、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例1，不同之处在于，将反应时间替换为0.5小时，得到产物中蛋白包埋率约65％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图13所示，由图13可知，本实施例制备得到的复合物与实施例1制得的复合物粒径分布范围更广。
实施例12、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例1，不同之处在于，将步骤1的蛋白浓度替换为20mg/mL，将步骤2的2-甲基咪唑替换为咪唑，得到产物中蛋白包埋率约67％。
实施例13、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例1，不同之处在于，水合醋酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液浓度替换为10mmol/L和40mmol/L，得到产物中蛋白包埋率约86％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图14所示，由图14可知，本实施例制备得到的复合物与实施例1制得的复合物粒径分布范围更广。
实施例14、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例6，不同之处在于，将2-甲基咪唑替换为苯并咪唑，得到产物中蛋白包埋率约70％。
实施例15、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例14，不同之处在于，将葡萄糖脱氢酶替换为胰蛋白酶，得到产物中蛋白包埋率约68％。
实施例16、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例14，不同之处在于，将水替换为甲醇，得到产物中蛋白包埋率约73％。
实施例17、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例14，不同之处在于，将2-甲基咪唑溶液浓度由80mmol/L替换为40mmol/L，得到产物中蛋白包埋率约88％。
实施例18、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
1、分别配制浓度为10mmol/L的水合醋酸锌水溶液，浓度为20mmol/L的2-甲基咪唑水溶液，对所得溶液分别进行超声处理15分钟。
2、配制浓度为10mg/mL的乙醇脱氢酶溶液。
3、取步骤1所得的锌离子溶液和二甲基咪唑溶液各10mL与步骤2中的乙醇脱氢酶溶液0.5mL混合，在25℃下搅拌反应2小时。
4、将步骤4所得产物通过离心分离出，用水重复洗涤3次，将洗涤后的产品进行冷冻干燥，得到产物中蛋白包埋率约88％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图15所示，由图15可知，本实例所得的复合物为球体，直径在50～100nm之间。
实施例19、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例18，不同之处在于，将步骤1的醋酸锌溶液替换为硝酸锌溶液，得到产物中蛋白包埋率约75％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图16所示，由图16可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大。
实施例20、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
1、配制含过氧化氢酶5mg/mL的水溶液。
2、分别配制浓度为20mmol/L水合醋酸锌的水溶液，浓度为80mmol/L的2-甲基咪唑的水溶液，对所得溶液分别进行超声处理15分钟。
3、取5mL步骤2所得的2-甲基咪唑溶液，加入步骤1所得的溶液100μL，将所得溶液与5mL步骤2所得的水合醋酸锌溶液混合，在25℃下搅拌反应2小时。
4、将步骤3所得产物通过离心分离出，用水重复洗涤3次，将洗涤后的产品冷冻干燥8小时，得到产物中蛋白包埋率约84％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图17所示，由图17可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大。
实施例21、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例20，不同之处在于，将步骤1的过氧化氢酶浓度替换为 10mg/mL，得到产物中蛋白包埋率约78％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图18所示，由图18可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大。
实施例22、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
操作步骤同实施例20，不同之处在于将步骤1的过氧化氢酶替换为淀粉酶，得到产物蛋白包埋率约69％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图19所示，由图19可知，本实施例所得的复合物形状较不规则。
实施例23、蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的合成
1、配制含葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶各5mg/mL的水溶液。
2、分别配制浓度为20mmol/L水合醋酸锌的水溶液，浓度为80mmol/L的2-甲基咪唑的水溶液，对所得溶液分别进行超声处理15分钟。
3、取10mL步骤2所得的2-甲基咪唑溶液，与10mL步骤2所得的水合醋酸锌溶液混合，加入步骤1所得的溶液500μL，在25℃下搅拌反应1小时。
4、将步骤3所得产物通过离心分离出，用水重复洗涤3次，将洗涤后的产品冷冻干燥8小时，得到产物中蛋白包埋率约89％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图20所示，由图20可知，本实例所得的复合物粒径分布范围较大。
实施例24、蛋白质与结晶态金属有机骨架化合物的复合物的合成
1、配制含葡萄糖氧化酶10mg/mL的水溶液。
2、分别配制浓度为25mmol/L的水合硝酸锌的水溶液，浓度为1mol/L的2-甲基咪唑的水溶液，对所得溶液分别进行超声处理10分钟。
3、取步骤1所得的溶液4mL与步骤2中的锌离子溶液4mL、2-甲基咪唑溶液各40mL混合，在25℃下搅拌反应1h。
4、将步骤3所得产物通过离心分离出，用去离子水重复洗涤3次，将洗涤后的产品冷冻干燥6小时，得到产物中蛋白包埋率58％。
本实施例制备的复合物的扫描电镜照片如图21所示，由图21可知，所得复合物的主体形状为菱形正十二面体，颗粒粒径在100nm～1μm之间。
本实施例所制备的复合物X射线衍射图如图31所示，由图31可知，复合物具有衍射峰，为晶体材料。
本实施例所制备的复合物酶活如图32所示，由图32可知，复合物酶活较天然酶低很多。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种无定形金属有机骨架化合物的制备方法，包括如下步骤：
锌离子和有机配体在溶剂中进行反应，得到所述金属有机骨架化合物；
所述锌离子来自于可溶性锌盐；
所述有机配体为含有咪唑基团的化合物。
2.一种蛋白质与无定形金属有机骨架复合物的制备方法，包括如下步骤：
蛋白质、锌离子和有机配体在溶剂中进行反应，得到所述蛋白质-金属有机骨架复合物；
所述锌离子来自于可溶性锌盐；
所述有机配体含有咪唑基团的化合物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述溶剂为水、甲醇、二甲基甲酰胺、乙醇、二甲基亚砜、乙腈和丙酮中任一种或者几种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述反应的温度为0～50℃，时间为0.01～16小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述反应的体系中，所述锌离子浓度为0.1～80mmol/L；
所述锌离子与所述有机配体的摩尔比为1：0.1～8。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述有机配体为2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1-甲基咪唑、苯并咪唑和咪唑中任一种或几种的组合，但不限于此。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白质为细胞色素C、细胞色素P450、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、绿色荧光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碳酸酐酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶、脲酶、过氧化氢酶中任一种或几种的组合；
所述蛋白质的分子量为5～600kDa；
所述蛋白质与所述锌离子的质量比为0.00001～1：1。
8.权利要求1、3、4、5或6所述方法制备的无定形金属有机骨架化合物，其具有无定形介孔结构，介孔孔径为2～50nm。
9.权利要求2-7中任一项所述方法制备的蛋白质与无定形金属有机骨架复合物，其具有无定形介孔结构，介孔孔径为2～50nm。
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