CN109897846B - 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用。所述固定化葡萄糖氧化酶,是以金属有机骨架材料MIL‑125为载体,吸附葡萄糖氧化酶制得的固定化葡萄糖氧化酶,属于酶工程领域。本发明所制备的固定化酶具有催化效率高,可循环使用,稳定性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程领域,特别涉及一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶,能够在有氧条件下将葡萄糖催化生成葡萄糖酸和过氧化氢,具有去氧、杀菌等作用,被广泛应用于医药、食品、饲料等行业。由于游离的葡萄糖氧化酶在应用过程中存在易失活、稳定性差、难以回收等缺点,因此有必要对葡萄糖氧化酶进行固定化。
酶的固定化就是在保持酶活力和特性的情况下,将酶固定在载体基质上,使酶及其衍生物可以循环使用的一项技术。目前固定化葡萄糖氧化酶,主要制备方法有四种:吸附、交联、包埋和共价结合。由于传统方法所制备的固定化酶的回收率相对较低,固定化酶在使用一定时间后,酶活力下降明显,大大降低了酶的应用性能,因此有必要寻求一种合适的载体,使固定化酶具有稳定性高、操作性强及工艺简便等特性,以期应用于工业化生产。
在过去的几十年中,与控制合成介孔材料取得的成果相比,介孔材料的发展一直非常缓慢。严格来说,目前在介孔材料的应用方面还没有突破性的进展。介孔材料具有连续可调的孔径,比表面积大,孔隙化学组成容易调节,生物相容性和稳定性好等优点。与传统无机纳米材料相比,金属有机骨架材料(MOFs)的分子结构中含有大量有机配体(官能团),可以与生物蛋白分子形成特定的分子间氢键,共价键或疏水分子间相互作用,有望在酶固定领域具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种以金属有机骨架材料材料MIL-125为载体固定葡萄糖氧化酶的方法,并将其应用于催化葡萄糖等氧化反应,得到具有高酶活性和稳定性且可循环使用的固定化葡萄糖氧化酶。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:一种固定化葡萄糖氧化酶,是以金属有机骨架材料MIL-125为载体,吸附葡萄糖氧化酶制得的固定化葡萄糖氧化酶。
固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,包括如下步骤:将金属有机骨架材料MIL-125与葡萄糖氧化酶溶液混合,在pH为2.0~6.0,转速为150~200r/min,温度为20~60℃下,吸附1~9h;离心,洗涤,干燥,得固定化葡萄糖氧化酶。
进一步的,所述金属有机骨架材料MIL-125的制备方法包括如下步骤:采用热熔法,将对苯二甲酸及钛酸四丁酯加入到N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇的混合溶液中,室温搅拌后,将混合溶液转移到反应釜中,140~160℃反应后,冷却至室温,离心,所得沉淀用DMF和甲醇洗涤,干燥,得金属有机骨架材料MIL-125。
进一步的,按质量比,葡萄糖氧化酶:MIL-125=(3~18):1。
更进一步的,按质量比,葡萄糖氧化酶:MIL-125=12:1。
进一步的,将金属有机骨架材料MIL-125与葡萄糖氧化酶溶液混合,在pH为3.0,转速为170r/min,温度为50℃下,吸附7.5h;离心,洗涤,干燥,得固定化葡萄糖氧化酶。
上述的固定化葡萄糖氧化酶在催化葡萄糖氧化反应中的应用。方法如下:将固定化葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合,在pH为2.0~5.0,转速为100~150r/min,温度10~50℃下,酶解葡萄糖10min。
进一步的,按质量比,葡萄糖:固定化葡萄糖氧化酶(62~495):1。
更进一步的,按质量比,葡萄糖:固定化葡萄糖氧化酶245:1。
进一步的,将固定化葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合,在pH为3.0,转速为130r/min,温度30℃下,酶解葡萄糖10min。
本发明的有益效果如下:
1、目前,金属有机骨架材料中应用的金属离子主要是包括3d过渡金属、3p金属或镧系的二价或三价离子。其中,钛因其具有低毒性、良好的氧化还原活性和光催化性能,广泛应用于金属有机骨架材料材料中。MIL-125是一种晶状二羧酸钛,由角或边共享的八面体钛单元构成,通过1,4苯二甲酸酯(BDC)连接体与12个其他环状八聚体连接形成多孔三维结构。与其他金属有机骨架材料材料相比,MIL-125具有较大的表面积和良好的孔隙度,且热稳定性强。本发明以MIL-125为载体,对葡萄糖氧化酶进行吸附,制备固定化葡萄糖氧化酶,具有低毒、稳定等特性,可应用于食品、医药等酶应用行业。
2、本发明提供的固定化葡萄糖氧化酶制备过程简单,节约资源,且适合工业化大生产。
3、本发明所制备的固定化葡萄糖氧化酶可循环使用。在最适条件下,重复操作5次后相对酶活性仍高于60%。
附图说明
图1是本发明制备的MIL-125的XRD谱。
图2是本发明制备的MIL-125的SEM扫描电镜图。
图3是本发明制备的固定化葡萄糖氧化酶重复操作5次后的相对酶活。
图4是本发明制备的固定化葡萄糖氧化酶及游离酶的热稳定性考察图。
图5是本发明制备的固定化葡萄糖氧化酶及游离酶的pH稳定性考察图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图,对本发明进行进一步详细的描述。以下描述的具体实施例不用于限定本发明,仅仅用以解释本发明。
以下实施例中葡萄糖氧化酶粗粉购自丹麦诺维信试剂公司;葡萄糖氧化酶固定量的计算方法参照公式(1);固定化葡萄糖氧化酶的反应初速度是根据反应初始阶段(10min)单位时间内产物(葡萄糖酸钠)浓度的增加量来计算,转化率是根据葡萄糖在某时刻转化为产物的量与初始量的比值来表示;对于实施例中所用的各种试剂及操作,除另有说明外,均为本领域常规的试剂和操作。
其中:qe(mg/g)为载体上葡萄糖氧化酶固定量;
C0(mg/L)为葡萄糖氧化酶的初始浓度;
Ce(mg/L)为吸附后离心所得上清液中葡萄糖氧化酶的浓度;
V(L)为葡萄糖氧化酶溶液的体积;
W(mg)为MIL-125的质量。
实施例1
(一)金属有机骨架材料MIL-125的制备
将2.20g的对苯二甲酸及2.4ml的钛酸四丁酯加入到40ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇(9:1,v/v)的混合溶液中,室温搅拌20min后,将混合溶液转移到反应釜中,150℃下反应16h后,冷却至室温,离心。所得沉淀用DMF和甲醇分别洗涤两次,置于70℃的真空干燥箱中干燥12h,即得MIL-125。
图1是制备的MIL-125的XRD谱。由图1可见,峰位置位于2θ=6.7°,9.7°,11.6°等,为MIL-125的特征峰。
图2是制备的MIL-125的SEM扫描电镜图。由图2可见,所制备的MIL-125呈圆盘状,粒径在2μm左右。
(二)固定化葡萄糖氧化酶的制备
1、称取4.00g葡萄糖氧化酶溶解在pH=6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中,得到浓度为6mg/mL的溶液,离心取上清,为葡萄糖氧化酶溶液,测定其酶蛋白含量(C0)并在4℃下保存备用。
2、取葡萄糖氧化酶溶液9mL,加入6mg MIL-125,混合均匀,置于转速为170r/min的恒温振荡器于50℃下进行固定。固定6.0h后,将混合液离心,所得沉淀洗涤后冷冻干燥,即得固定化葡萄糖氧化酶。对离心所得上清测定其酶蛋白含量(Ce)。
参照公式(1)计算葡萄糖氧化酶固定量,本实施例中固定化葡萄糖氧化酶的酶蛋白固定量为128mg/g,重复使用5次后,仍保留45%的酶活性。
实施例2
(一)金属有机骨架材料MIL-125的制备
同实施例1
(二)固定化葡萄糖氧化酶的制备
1、称取3.00g葡萄糖氧化酶溶解在pH=3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中,得到浓度为6mg/mL的溶液,离心取上清,为葡萄糖氧化酶溶液,测定其酶蛋白含量(C0)并在4℃下保存备用。
2、取葡萄糖氧化酶溶液9ml,加入6mg MIL-125,混合均匀,置于转速为170r/min的恒温振荡器于50℃下进行固定。固定7.5h后,将混合液离心,所得沉淀洗涤后冷冻干燥,即得固定化葡萄糖氧化酶。对离心所得上清测定其酶蛋白含量(Ce)。
参照公式(1)计算葡萄糖氧化酶固定量,本实施例中固定化葡萄糖氧化酶的酶蛋白固定量为268mg/g,重复使用5次后,仍保留58%的酶活性。
实施例3
(一)金属有机骨架材料MIL-125的制备
同实施例1
(二)固定化葡萄糖氧化酶的制备
1、称取4.00g葡萄糖氧化酶溶解在pH=3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中,得到浓度为8mg/ml的溶液,离心取上清,为葡萄糖氧化酶溶液,测定其酶蛋白含量(C0)并在4℃下保存备用。
2、取葡萄糖氧化酶溶液9ml,加入6mg MIL-125,混合均匀,置于转速为170r/min的恒温振荡器于50℃下进行固定。固定7.5h后,将混合液离心,所得沉淀洗涤后冷冻干燥,即得固定化葡萄糖氧化酶。对离心所得上清测定其酶蛋白含量(Ce)。
参照公式(1)计算葡萄糖氧化酶固定量,本实施例中固定化葡萄糖氧化酶的酶蛋白固定量为335mg/g,重复使用5次后,如图3所示,仍保留60%的酶活性。
(三)热稳定性
取固定化葡萄糖氧化酶及游离葡萄糖氧化酶各20mg分别加入到10ml浓度为0.2mol/L的葡萄糖溶液中与葡萄糖溶液混合,在pH为3.0,转速为130r/min,温度10~50℃下,酶解葡萄糖10min。结果如图4所示。由图4可见,游离酶与固定化酶的最适酶解温度为30℃,但固定化葡萄糖氧化酶的催化性能在10~50℃的温度范围内稳定性较好,保留了70%的活性,说明固定化葡萄糖氧化酶可以在较宽的温度范围内使用。
(四)pH稳定性
取固定化葡萄糖氧化酶及游离葡萄糖氧化酶各20mg分别加入到10ml浓度为0.2mol/L的葡萄糖溶液中与葡萄糖溶液混合,在pH为2.0~5.0,转速为130r/min,温度30℃下,酶解葡萄糖10min。结果如图5所示。由图5可见,游离酶和固定化酶的最佳pH值分别为2.5和3.0。在较高的pH值下,固定化葡萄糖氧化酶更稳定。最佳pH值变化的原因可能是由于葡萄糖氧化酶的带电基团与MIL-125上的固定电荷相互作用所引起的微环境的改变。
(五)固定化葡萄糖氧化酶在催化葡萄糖氧化反应中的应用
取20mg固定化葡萄糖氧化酶,加入到10ml浓度为2.5mmol/L的葡萄糖溶液中混合,在pH为3.0,转速为130r/min,温度30℃下,酶解葡萄糖10min。在上述条件下,反应初速度为1.02mmol/L·min,转化率为65.11%。
Claims (5)
1.一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,其特征在于,是以金属有机骨架材料MIL-125为载体,吸附葡萄糖氧化酶制得的固定化葡萄糖氧化酶;制备方法包括如下步骤:按质量比,葡萄糖氧化酶 : MIL-125=12 : 1,将金属有机骨架材料MIL-125与葡萄糖氧化酶溶液混合,在pH为 3.0,转速为170 r/min,温度50 ℃下,吸附7.5 h;离心,洗涤,干燥,得固定化葡萄糖氧化酶;所述葡萄糖氧化酶溶液是将葡萄糖氧化酶溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得的溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述金属有机骨架材料MIL-125的制备方法包括如下步骤:将对苯二甲酸及钛酸四丁酯加入到N,N-二甲基甲酰胺和甲醇的混合溶液中,室温搅拌后,将混合溶液转移到反应釜中,140~160℃反应后,冷却至室温,离心,所得沉淀用DMF和甲醇洗涤,干燥,得金属有机骨架材料MIL-125。
3.按照权利要求1所述的方法制备的固定化葡萄糖氧化酶在催化葡萄糖氧化反应中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,方法如下:将固定化葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合,在pH为 2.0~5.0,转速为100~150r/min,温度10~50℃下,酶解葡萄糖10min。
5.根据权利要求4所述的应用方法,其特征在于,按质量比,葡萄糖 : 固定化葡萄糖氧化酶=(62~495): 1。
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