CN110484527A - 一种缺陷型金属有机骨架-酶复合物及其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缺陷型金属有机骨架‑酶复合物及其制备方法。该复合物通过如下方式制得：有机配体添加有机配体类似物在水溶液中混合，然后加入金属离子溶液和酶蛋白混合，进行共沉淀反应。它的制备方法，包括如下步骤：(1)将有机配体类似物与有机配体溶液混合，搅拌混匀，得到混合液；(2)将金属离子溶液与酶蛋白加入混合液中，搅拌进行共沉淀反应，即得到缺陷型金属有机骨架‑酶复合物。本发明得到一种制备成本低、催化活性高、稳定性好、分散性好且能够重复利用的固定化酶，该固定化酶可以快速批量制备，在生物医药、食品、生物检测、精细化工品等领域有着广泛的应用前景。

Description

一种缺陷型金属有机骨架-酶复合物及其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种缺陷型金属有机骨架-酶复合物及其制备方法及其应用，属于固定化酶领域。
背景技术
酶是一种具有较高的催化活力、高度的专一性以及优异的选择性的生物催化剂，可以在温和的环境中实现许多复杂的化学反应过程，在医药中间体合成、精细化工品制备、生物检测、食品加工等领域中有着广泛的应用。针对天然酶在一系列复杂的应用环境中稳定性较差的问题，对酶分子进行固定化可以有效保护其催化构象，防止在催化过程中出现失活的现象，提高其操作稳定性，并且可以使酶分子重复再利用。
得益于纳米生物技术的飞速发展，纳米材料固定化酶展现出了优异的应用前景。纳米颗粒的尺寸效应、纳米孔道的限域效应、纳米界面的多功能性为生物催化剂带来了许多可设计调控的特性，可以满足其在各类领域中的应用。但是，由于纳米材料的孔道通常低于2nm，限制了底物分子与固定化酶内部的酶分子接触，大幅度降低了酶催化剂的催化能力。在分子层次对纳米材料的组成进行调控，使其在合成的过程中形成部分缺陷型介孔孔道，能够促进底物分子与酶分子的接触，提高酶催化剂的催化效率，降低固定化成本。文献“Exceptional CO2capture in a hierarchically porous carbon with simultaneoushigh surface area and pore volume”报道了一种制备具有介孔孔道的MOF的方法，该方法在氮气氛围内将温度加热到600℃以上，使MOF发生碳化反应。虽然制备的MOF具有介孔孔道，但是该方法耗能较多、合成成本较高，也不能一步法共沉淀制备缺陷型金属有机骨架-酶复合物。文献“Synthesis Modulation as a Tool To Increase the CatalyticActivity of Metal-Organic Framework:The Unique Case of UiO-66(Zr)”报道了一种制备缺陷型金属有机骨架的方法，该方法在合成金属有机骨架的过程中加入三氟乙酸与盐酸来改造其孔道结构。虽然该方法也能增大金属有机骨架的孔径，但是该方法使用的三氟乙酸与盐酸容易对环境造成污染。
专利文件CN 106669822A公开了一种复合仿生矿化纳米生物催化剂的制备，该方法先使用N-丙烯酰氧基琥珀酰胺对酶进行修饰，然后制备单酶微囊，最后使用锌离子与2-甲基咪唑对单酶微囊进行矿化，制备出复合仿生矿化纳米生物催化剂。该方法虽然解决了金属有机骨架固定化酶在极端环境中酶活损失较快和纳米胶囊难以回收的问题，但是在修饰酶的过程中会破坏酶分子的催化构象，使其酶活降低，并且固定化过程较为繁琐，固定化成本较高。
专利文件CN 104087572A公开了一种蛋白质与金属有机骨架化合物复合材料及其制备方法，该方法在室温水溶液中，添加蛋白质、锌离子和有机配体便可快速制备所述复合材料。该方法的制备过程操作简单、条件温和、蛋白包埋率高，但是所制备的复合材料的孔道较小，限制了底物分子与酶分子之间的接触。
专利CN 106311152A公开了一种介孔类沸石酯骨架材料及其制备，该方法将金属盐与咪唑衍生物配体加入DMF中搅拌均匀后转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中反应，离心分离、超声洗涤干燥后得到介孔类沸石咪唑酯骨架材料。该方法虽然有效提高了该介孔类沸石咪唑酯骨架材料的吸附容量及吸附选择性，但是其制备过程较为繁琐，成本较高。
金属有机骨架是一种既具有笼状结构的刚性和稳定性同时也具有一定的有机材料的结构可变性，可以通过对金属离子与有机配体的设计得到不同化学组成、孔径结构、刚柔平衡的MOFs材料。但是这些用于固定化酶蛋白的有机金属骨架材料的孔径较小(小于2nm)，严重阻碍了底物分子与固定化其中的酶分子的接触。现急需通过一种制备方法得到一种工艺过程简单，催化活性高、稳定性与分散性好的金属有机骨架固定化酶，克服上述现有技术的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种缺陷型金属有机骨架-酶复合物及其制备方法及其应用，本发明通过在水溶液中利用有机配体、金属离子、酶蛋白一步共沉淀合成金属有机骨架-酶复合物的过程中添加有机配体类似物后，再经过离心洗涤、干燥得到一种制备成本低、催化活性高、稳定性好、分散性好且能够重复利用的固定化酶，该固定化酶可以快速批量制备，在生物医药、食品、生物检测、精细化工品等领域有着广泛的应用前景。
本发明提供的一种缺陷型金属有机骨架-酶复合物，该复合物通过如下方式制得：有机配体添加有机配体类似物在水溶液中混合，然后加入金属离子溶液和酶蛋白混合，进行共沉淀反应。
上述的复合物中，所述有机配体选自2-甲基咪唑、2-咪唑甲醛、咪唑和苯并咪唑中的至少一种，优选2-甲基咪唑。
上述的复合物中，所述有机配体类似物选自1-甲基咪唑、吡咯和2-巯基-1-甲基咪唑中的至少一种，优选为1-甲基咪唑。
上述的复合物中，所述金属离子溶液金属离子选自锌离子、铜离子、亚铁离子和钴离子中的至少一种，优选为锌离子。
上述的复合物中，所述酶蛋白选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶、细胞色素c、乙醇脱氢酶、漆酶、超氧化物歧化酶、蛋白酶、碳酸酐酶和蔗糖酶中的至少一种。
上述的复合物中，在所述水溶液中，所述有机配体的浓度为0.1～2mol/L，所述金属离子的浓度为0.01～1mol/L，所述酶蛋白的浓度为0.1～50mg/mL，所述有机配体类似物的浓度可为0.1～2mol/L。
上述的复合物中，所述的复合物在制备时，还包括对所述共沉淀反应后的体系进行离心、洗涤、干燥的步骤。
上述的复合物中，所述离心的转速可为4000～15000rpm，离心时间可为2～30min；
所述干燥方式选自真空干燥、冷冻干燥和自然风干中的至少一种。
本发明所述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物应用于生物医药、食品、生物检测、精细化工品领域中。
本发明还提供了上述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述有机配体类似物与所述有机配体溶液混合，搅拌混匀，得到混合液；
(2)将所述金属离子溶液与所述酶蛋白加入所述混合液中，搅拌进行共沉淀反应，即得到所述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述搅拌混匀的时间为1min～1h，温度为室温；
步骤(2)中，所述搅拌的时间为5min～4h，所述共沉淀反应的温度为室温。
本发明中，所述室温为本领域公知的常识，具体可为20～30℃。
上述的制备方法，步骤(2)中还包括对所述共沉淀反应后的体系进行离心、洗涤、干燥的步骤。
上述的制备方法中，所述离心的转速为4000～15000rpm，离心时间为2～30min；
所述干燥方式选自真空干燥、冷冻干燥和自然风干中的至少一种。
本发明具有以下优点：
(1)本发明添加有机配体类似物能大大提高金属有机骨架-酶复合物的催化活性。
(2)本发明提供的缺陷型金属有机骨架-酶复合物利用有机配体类似物进行修饰，构建出了的复合物平均孔径较大，具体如平均孔径大于3.5nm的复合物，含有介孔孔道，更利于底物分子与酶分子的接触。
(3)本发明提供的缺陷型金属有机骨架-酶复合物的制备方法只需在常温水溶液中通过一步共沉淀法获得，减少了实验合成的成本。
(4)本发明缺陷型金属有机骨架-酶复合物具有较好的稳定性与分散性，并能通过简单的离心分离进行回收再利用，且能够经过多次重复使用后仍能保持较高的催化活力，具体如经过20次重复使用后，酶活仍能保持90％以上。
(5)本发明所述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物可以批量快速便捷制备，在生物医药、食品、生物检测、精细化工品等领域有着广泛的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、缺陷型ZIF-酶复合物及其制备
(1)将0.8mmol的1-甲基咪唑加入1.6mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑中，室温(25℃)搅拌10min。
(2)将160μL 0.3mol/L的硝酸锌溶液与50μL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)同时加入混合溶液中，继续室温搅拌30min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到缺陷型ZIF-酶复合物。
实施例2、缺陷型ZIF-酶复合物及其制备
(1)将1.6mmol的1-甲基咪唑加入1.6mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑中，室温搅拌10min。
(2)将160μL 0.3mol/L的硝酸锌溶液与50μL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)同时加入混合溶液中，继续室温搅拌30min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到缺陷型ZIF-酶复合物。
实施例3、缺陷型ZIF-酶复合物及其制备
(1)将0.8mmol的吡咯加入1.6mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑中，室温搅拌10min。
(2)将160μL 0.3mol/L的硝酸锌溶液与50μL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)同时加入混合溶液中，继续室温搅拌30min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到缺陷型ZIF-酶复合物。
实施例4缺陷型ZIF-酶复合物批量制备
(1)将80mmol的1-甲基咪唑加入160mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑中，室温搅拌10min。
(2)将16mL 0.3mol/L的硝酸锌溶液与5mL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)同时加入混合溶液中，继续室温搅拌30min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min,并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
对比例1、
不添加有机配体类似物的ZIF-酶复合物及其制备
(1)配置1.6mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑溶液，室温搅拌10min。
(2)将160μL 0.3mol/L的硝酸锌溶液与50μL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)同时加入混合溶液中，继续室温搅拌30min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到ZIF-酶复合物。
对比例2、
先用有机配体类似物修饰酶的ZIF-酶复合物及其制备
(1)配置1.6mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑溶液，室温搅拌10min。
(2)将0.8mmol1-甲基咪唑加入到50μL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)搅拌10min,再和160μL 0.3mol/L的硝酸锌溶液同时加入2-甲基咪唑中，继续室温搅拌30min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到ZIF-酶复合物。
对比例3、
先沉淀再用有机配体类似物修饰的缺陷型ZIF-酶复合物及其制备
(1)配置1.6mL 0.8mol/L的2-甲基咪唑溶液，室温搅拌10min。
(2)将160μL 0.3mol/L的硝酸锌溶液与50μL的葡萄糖氧化酶(蛋白浓度为5mg/mL)同时加入2-甲基咪唑中，室温搅拌30min，然后再加入0.8mmol的1-甲基咪唑，继续室温搅拌10min。
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，并用水洗涤2次，将沉淀放置于冷冻干燥机。冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到ZIF-酶复合物。
实施例5、不同缺陷型ZIF-酶复合物的酶活测定
在50mL的锥形瓶中加入288mg葡萄糖、5.48mg ABTs、1mg辣根过氧化物酶与20mL的10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，配置成底物溶液。称取一定量的缺陷型ZIF-酶复合物均匀分散于蒸馏水中，并稀释一定的倍数得到缺陷型ZIF-酶溶液。在比色皿中加入980μL的底物溶液与20μL的缺陷型ZIF-酶溶液(含有酶蛋白3.2μg)，测定反应液在415nm处吸光值的变化。
酶活力单位1U定义为在环境温度为25℃时，每分钟内酶分子使底物吸光度上升0.001所需要的酶量。
表1不同缺陷型ZIF-酶复合物的酶活测定
组别 酶活(U)
实施例1 1450
实施例2 1213
实施例3 1093
实施例4 1386
对比例1 683
对比例2 546
对比列3 710
表1数据表明，通过添加有机配体类似物能大大提高缺陷型ZIF-酶复合物的催化活性，而不添加有机配体类似物制备的ZIF-酶复合物的催化活性较低。
实施例6、不同缺陷型ZIF-酶复合物的平均孔径研究
称取本发明100mg实施例1-4、对比例1-3制备的缺陷型ZIF-酶复合物，用氮气吸附脱附仪测定缺陷型ZIF-酶复合物的孔径大小。
表2不同缺陷型ZIF-酶复合物的平均孔径
组别 平均孔径(nm)
实施例1 4.2
实施例2 3.8
实施例3 3.6
实施例4 4.1
对比例1 1.8
对比例2 1.7
对比列3 1.8
由表2数据可知，本发明实施例提供的缺陷型ZIF-酶复合物的平均孔径大于3.5nm，具有部分介孔孔道，更利于底物分子与酶分子的接触。而对比例1-3采用不同制备方法制备得到的ZIF-酶复合物的平均孔径较小，限制了底物分子与酶分子的接触。
实施例7、缺陷型ZIF-酶复合物重复使用测定
在50mL的锥形瓶中加入288mg葡萄糖、5.48mg ABTs、1mg辣根过氧化物酶与20mL的10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，配置成底物溶液。称取一定量的缺陷型ZIF-酶复合物均匀分散于蒸馏水中，并稀释一定的倍数得到缺陷型ZIF-酶溶液。在比色皿中加入980μL的底物溶液与20μL的缺陷型ZIF-酶溶液(含有酶蛋白3.2μg)，测定反应液在415nm处吸光值的变化。
反应1min后，将反应液离心分离(10000rpm，5min)，洗涤2次得到缺陷型ZIF-酶复合物，加入20μL的蒸馏水重悬，重新与980μL的底物混合，测定反应液的吸光度值的变化。经过20次重复使用后，计算出每一次缺陷型ZIF-酶复合物的酶活并作出对比测定出其相对酶活。相对酶活的计算公式如下：
相对酶活＝A/A0
其中，A代表重复使用时样品的酶活，A0代表样品第一次测定的酶活。
表3不同缺陷型ZIF-酶复合物的重复使用率
由表3数据可知，本发明实施例提供的双酶-表面活性剂具有良好的重复使用率，经过20次重复使用后，酶活仍能保持90％以上，而对比例1-3采用不同制备方法得到的ZIF-酶复合物的活性会随着重复使用次数的次数增加呈现不断降低的趋势。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种缺陷型金属有机骨架-酶复合物，其特征在于：该复合物通过如下方式制得：有机配体添加有机配体类似物在水溶液中混合，然后加入金属离子溶液和酶蛋白混合，进行共沉淀反应。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述有机配体选自2-甲基咪唑、2-咪唑甲醛、咪唑和苯并咪唑中的至少一种；
所述有机配体类似物选自1-甲基咪唑、吡咯和2-巯基-1-甲基咪唑中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于：所述金属离子溶液金属离子选自锌离子、铜离子、亚铁离子和钴离子中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的复合物，其特征在于：所述酶蛋白选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶、细胞色素c、乙醇脱氢酶、漆酶、超氧化物歧化酶、蛋白酶、碳酸酐酶和蔗糖酶中的至少一种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合物，其特征在于：在所述水溶液中，所述有机配体的浓度为0.1～2mol/L，所述金属离子的浓度为0.01～1mol/L，所述酶蛋白的浓度为0.1～50mg/mL，所述有机配体类似物的浓度为0.1～2mol/L。
6.权利要求1-5中任一项所述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物在生物医药、食品、生物检测、精细化工品领域中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述有机配体类似物与所述有机配体溶液混合，搅拌混匀，得到混合液；
(2)将所述金属离子溶液与所述酶蛋白加入所述混合液中，搅拌进行共沉淀反应，即得到所述的缺陷型金属有机骨架-酶复合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述搅拌混匀的时间为1min～1h，温度为室温；
步骤(2)中，所述搅拌的时间为5min～4h，所述共沉淀反应的温度为20～30℃室温。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中还包括对所述共沉淀反应后的体系进行离心、洗涤、干燥的步骤。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述离心的转速为4000～15000rpm，离心时间为2～30min；
所述干燥方式选自真空干燥、冷冻干燥和自然风干中的至少一种。
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