CN111349681A - 一种应用固定化脂肪酶催化酯水解动力学拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法 - Google Patents

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Abstract

本专利介绍了一种应用固定化脂肪酶催化酯水解动力学拆分2‑(4‑甲基苯基)丙酸对映体的方法。利用双官能团化合物戊二醛，同时与载体UIO‑66‑NH2以及皱褶假丝酵母脂肪酶（Lipase AYS）上氨基反应形成席夫碱，实现酶与载体共价连接，获得固定化酶，并用于2‑(4‑甲基苯基)丙酸对映体动力学拆分。光学纯2‑(4‑甲基苯基)丙酸是一种重要的医药中间体，本专利提供的制备方法具有明显的技术优势。共价连接固定化结合力更强，可减少酶流失，保持了酶的活性和选择性。与游离酶相比，固定化酶热稳定性高，对pH耐受度高，便于循环使用，容易与产物分离，显著降低了技术成本，而且操作简便，绿色环保。

Description

一种应用固定化脂肪酶催化酯水解动力学拆分2-(4-甲基苯 基)丙酸对映体的方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，通过金属有机框架化合物（MOFs）UIO-66-NH2固定一种皱褶假丝酵母脂肪酶(Lipase AYS)，应用于立体选择性催化酯水解拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体。
背景技术
2-(4-甲基苯基)丙酸(2-(4-MP)PPA)是一种重要的医药中间体，主要用于芳基丙酸类抗炎药物（如洛索洛芬）的合成。酶的立体选择性催化反应可直接将化学合成的外消旋体转化成单一对映体。而且酶作为一种天然的高分子催化剂，具有立体选择性高、反应条件温和、无污染等诸多优点，使其在食品、医药、精细化工等工业领域有着极为广阔的应用前景。但游离酶从反应体系中分离难度大，难以循环利用等缺点增加了其作为催化剂的成本；游离酶使用过程中容易变性，并且对温度、pH等反应条件要求较为苛刻，上述不足使游离酶难以在工业中得到更为广泛的应用。因此，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。
酶的固定化，即通过化学或物理的处理方法使原来水溶性的酶与固态的水不溶性载体相结合或被载体包埋。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响，近年来，常用载体按组成可分为高分子载体、无机载体、复合载体以及新型载体等。高分子材料具有使用寿命较短，传质性能较差等不足；无机载体具有稳定性好，成本低，寿命长等优点，但使用无机材料制备的固定化酶的负载率一般而言较低。相较于上述固定化材料，金属有机框架化合物（MOFs）作为一类新型固定化载体日益受到重视。MOFs是一类由金属离子为节点，多齿有机配体作为连接体合成的多孔晶体材料。MOFs结构可针对具体的应用进行设计和调节，具有高比表面积、孔体积、易调节的孔道尺寸，以及良好的热稳定性且合成条件较温和等优点。因此MOFs固定化酶已经成为当前的热点研究方向。常采用的固定化方法主要分为表面吸附、共价连接、孔内包埋以及共沉淀法等。
本发明利用共价连接法，通过酶与载体形成共价键而实现固定化，并将固定化酶应用于催化酯的水解反应。本发明利用双官能团化合物戊二醛在脂肪酶Lipase AYS与UIO-66-NH2载体间进行交联反应，形成网格结构的固定化酶。戊二醛与含氨基的载体UIO-66-NH2反应的同时，也可以与皱褶假丝酵母脂肪酶（Lipase AYS）上的氨基发生反应生成席夫碱，实现酶与载体的共价连接。通过此方法固定化酶结合力较强，可在一定程度上减少酶的流失，同时与游离酶对比，此固定化酶AYS@UIO-66-NH2不仅可以实现与反应体系迅速分离，而且具有较高的热稳定性，以及对pH的耐受度。更重要的是，该技术提高了酶的循环使用性能，显著降低了技术成本，具有操作简便，污染少等优点，符合绿色化学理念。
发明内容
本发明提出了一种通过共价连接法将Lipase AYS固定于MOFs材料UIO-66-NH2表面的方法，并将固定化酶AYS@UIO-66-NH2应用于立体选择性催化酯水解拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体，通过固定化提高了酶的热稳定性、对pH的耐受性，以及底物酯的转化率。
本发明的技术方案：本发明将Lipase AYS通过沉淀交联的方法固定于UIO-66-NH2材料上并作为催化剂，以外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸酯为反应底物，将其进行拆分。以磷酸缓冲溶液为反应介质，调节其pH为4.5-8.5，每毫升反应介质投入2-(4-甲基苯基)丙酸酯5~35mmol，每毫升反应介质投入AYS@UIO-66-NH2量为10~150mg，控制温度范围30-70℃，在密闭反应容器中搅拌加热反应一定时间，反应结束后，取一定量样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测，计算产率和对映体过剩量。
本发明相比现有技术有如下优势：
本发明利用酶的立体选择性催化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体，具有绿色、高效、反应条件温和等优点；制备固定化酶作为催化剂，可强化酶的稳定性和操作范围，降低条件控制的苛刻程度，使该技术工业应用更便利；也能很好地解决酶的回收和循环利用问题，降低催化剂使用成本。而MOFs作为非常有潜力的一类酶固定化载体，其具有丰富多样的可设计和调节的结构，不仅具有高比表面积和孔体积，而且制备条件温和，能较好地保持酶的活性和选择性。本方法实施操作简便，绿色环保，产物和酶易于分离，酶催化剂的重复使用性能好。入发明内容描述段落。
具体实施方案
在此本发明具体的方法步骤如下：本发明所述实施例中AYS@UIO-66-NH2的典型合成步骤如下：Lipase AYS 100mg溶于2mL的磷酸缓冲溶液中(0.1mmol/L，pH=7.5)，再加入饱和硫酸铵溶液3.7mL，同时加入50mg的UIO-66-NH2，于4℃下搅拌30分钟后，加入245.6μL戊二醛和54.4μL水，继续于4℃下搅拌4小时，用水洗3次后冷冻干燥过夜得到微黄色固体。
产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析，Inertsil ODS-3色谱柱（150×4.6mm i.d.，5μm），柱温保持在35℃。流动相由甲醇和HP-β-CD水溶液（26mmol/L，pH=3.50，用三乙胺和冰醋酸调节）组成，二者体积比为15:85。检测波长230nm；流动相的流速设定为0.8mL/min；(R)-2-(4-MP)PPA的保留时间少于(S)-2-(4-MP)PPA。
实施例：
实施例1
将0.01mmol外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯和50mg固定化酶AYS@UIO-66-NH2加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液（pH=6.60，0.1mmoL/L）作为反应液，在转速500rpm、39℃下加热反应24h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(R)-2-(4-甲基苯基)丙酸的产率为72.567%，对映体过剩量为93.202%。
实施例2
将0.01mmol的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯和50mg固定化酶AYS@UIO-66-NH2加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液（pH=6.60，0.1mmoL/L）作为反应液，在转速500rpm、在反应温度60℃下催化反应24h，反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(R)-2-(4-甲基苯基)丙酸的产率仍保持在70.458%，对映体过剩量为91.789%。
实施例3
将0.01mmol的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯和50mg固定化酶AYS@UIO-66-NH2加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液（0.1mmoL/L），pH值为8.5，作为反应液，在转速500rpm、反应温度39℃下催化反应24h，反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明： (R)-2-(4-甲基苯基)丙酸产率仍保持在70.023%，对映体过剩量为90.924%。
实施例4
将0.01mmol的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯和50mg固定化酶AYS@UIO-66-NH2加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液（pH=6.60，0.1mmoL/L）作为反应液，在转速500rpm、温度39℃下反应24h，反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。再将反应体系固液分离，固体部分冷冻干燥后回收固定化酶AYS@UIO-66-NH2，再在相同条件下进行催化反应。分析结果表明：反应重复四次后，(R)-2-(4-甲基苯基)丙酸产率为66.306%，对映体过剩量为92.789%；反应重复六次后，(R)-2-(4-甲基苯基)丙酸产率为40.257%，对映体过剩量为92.234%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种应用具有高耐热性和耐pH的固定化脂肪酶催化酯水解动力学拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法，其特征在于所述的方法是以共价交联中的沉淀交联法制备固定化脂肪酶，再通过固定化酶立体选择性催化2-(4-甲基苯基)丙酸酯水解反应得到(R)-2-(4-甲基苯基)丙酸和(S)-2-(4-甲基苯基)丙酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化脂肪酶制备步骤：先合成MOFs材料UIO-66-NH2作为固定化载体，然后在反应容器内加入一定量皱褶假丝酵母脂肪酶（lipaseAYS）并溶于磷酸缓冲溶液，再加入一定量饱和硫酸铵溶液，随后在反应容器中加入一定量经研磨粉碎的固定化载体并搅拌使载体分散，搅拌一定时间后，加入一定量戊二醛溶液，控制反应体系温度并继续搅拌一定时间，反应结束后，过滤并收集固体部分，将所得固体产品冷冻干燥后，得到固定化酶AYS@UIO-66-NH2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化脂肪酶催化2-(4-甲基苯基)丙酸酯水解步骤：在反应容器内加入合适pH值的磷酸缓冲溶液和一定量的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸酯，再加入一定量的固定化脂肪酶，在一定温度下搅拌反应一定时间，反应结束后，取样进行检测。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MOFs材料UIO-66-NH2以ZrCl4和2-氨基对苯二甲酸为前驱体，在DMF溶剂中通过自组装反应合成。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用共价交联法固定皱褶假丝酵母脂肪酶，每毫升反应溶液含固定化载体量为2~40mg，每毫升反应溶液含酶量为2~60mg，每毫升反应溶液含硫酸铵的量为100~780mg，每毫升反应溶液含戊二醛的量为2~120mg。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应溶液pH控制在4.5~9.5，反应温度控制在0~25℃，反应时间控制在2~24小时。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，作为反应介质的磷酸缓冲溶液的pH值为4.5~9.5。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，底物外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸酯是从2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯、2-(4-甲基苯基)丙酸乙酯、2-(4-甲基苯基)丙酸丙酯、2-(4-甲基苯基)丙酸异丙酯、2-(4-甲基苯基)丙酸正丁酯、2-(4-甲基苯基)丙酸异丁酯、2-(4-甲基苯基)丙酸叔丁酯、2-(4-甲基苯基)丙酸戊酯中选择的，每毫升反应介质投入2-(4-甲基苯基)丙酸酯的量为5~35mmol。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每毫升反应介质投入固定化酶量为10~150mg，反应温度为30℃~70℃，反应时间为1~48h。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，固定化酶可重复利用，操作步骤为：水解反应结束后，过滤将固定化酶从反应介质中分离，固定化酶经冷冻干燥后重复使用。
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