CN101182507A - 一种载体和固定化脂肪酶的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种固定化载体的制备技术，特别是涉及一种高选择性固定化脂肪酶的载体和固定化酶的制备和应用，该载体为有机－无机复合物，其孔径为10－20nm，孔体积在0.6－1.2cm³/g，比表面积在300－700cm²/g。该载体的制备采用水热晶化先合成出多孔氧化硅材料，利用氨基硅烷表面改性后进行醛基活化，形成共价结合酶的载体。本发明的载体在有机溶剂中能够获得高活和高选择性的固定脂肪酶，在温和的反应条件下催化拆分(R，S)－1－苯乙醇等外消旋化合物，获得单一对映体的高光学纯度高，在手性医药、农药和重要有机中间体的合成领域有重要的应用价值。

Description

一种载体和固定化脂肪酶的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种固定化载体的制备技术，特别是涉及一种高选择性固定化脂肪酶的载体和固定化酶的制备和应用。

背景技术

对映体的存在是自然界中的一种普遍现象，药物的药理和生理作用多与体内相应靶分子之间的手性匹配和分子识别能力有关，当手性药物分子作用于生物体时，构型不同的药物分子产生的对映相互作用往往是不同的，甚至是截然相反的，因此，手性是许多药物发挥有效作用的一个关键性因素。由于手性分子与生物体之间的这种特异性手性识别特征，不同对映体显示了不同的药理作用，单一对映异构体的生产技术在医药工业中显得尤其重要。

光学活性的醇与酯是手性化合物中非常重要的一类，其作为精细有机化学品合成的重要中间体，在医药、农药和化工等领域有着广泛的应用。如1-苯乙醇作为一种有机合成原料，可用于香料工业、制药工业；苯乙氰醇可以用来生成胺类化合物、羟基化合物、羧基化合物等数十种重要的精细化学品，被称为万能手性中间体；2-辛醇是合成铁电性液晶材料和有机非线性材料，可作为金属配合物手性催化剂的手性配体等，这些中间体的单一对映异构体是设计和制备新的手性药物的手性源。

获得手性化合物的方法主要有非生物法和生物转化法，前者包括物理拆分法、化学不对称合成法、手性源合成法和直接提取法等；后者包括利用氧化还原酶的直接转化和水解酶类的不对称拆分。由于酶自身的催化活性中心具有不对称环境，活性中心的手性特征使其对底物构型不同的对映体有相当的识别能力，即与酶的活性中心匹配的对映体反应速度高于不匹配的对映体从而实现对消旋物的拆分。与一般的化学方法相比，酶法拆分专一性强、拆分效率高、操作简单、成本低、环境污染小。据统计，大约有65％的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆分得到的，因此酶法拆分是拆分外消旋体得到手性化合物最重要最有效的途径之一。随着近年来生物技术和酶工程的发展，利用生物酶高度的立体选择性，在有机溶剂中进行手性拆分制备单一对映体倍受人们的关注，酶在手性技术中正发挥着越来越重要的作用

用于手性拆分最常用的酶是水解酶，包括酯酶、脂肪酶、酰胺酶、酰化酶、磷酯酶等，其中30％以上的拆分过程涉及到脂肪酶。脂肪酶(EC3.1.1.3)具有多样的催化性能，特别是在有机溶剂中仍具有相当的催化活性和对映选择性，在手性化合物的制备方面有着十分诱人的应用前景。目前大多数研究报道都是通过游离酶催化拆分获得单一对映体，在文献1：Tetrahedron：Asymmetry，2004，15(18)：2893-2899中用荧光假单胞菌脂肪酶连续拆分1-O-烷基甘油醇制备1-O-烷基甘油二酯，其对映体过量值达到95％；在文献2：Enzyme Microb Technol，2004，34(2)：523-528中用非离子表面活性剂双十二烷基N-D-葡糖酸-L-谷氨酸酯(DGG)修饰假单胞菌脂肪酶在无溶剂系统中制备光学活性(S)-4-羟基-3-甲基-2-(2-丙烯基)-2-环戊烯-1-酮(简写(s)-HMPC)，其活性比游离酶提高了160倍，底物转化率达到40％，(R)-HMPC进行反应转化为相应乙酸酯的ee值接近100％；文献3：Biotech Bioeng，2001，74(3)：256-263利用脂肪酶对3-羟基丁酸乙酯(HEB)进行了两步拆分，最后得到的2个单一手性HEB的光学纯度均超过96％。在这些研究中利用游离脂肪酶选择性催化获得了很好的拆分结果。然而，在有机溶剂中游离酶分子极易聚集成簇，这时酶的对映选择性变化不大，但催化活性急剧下降，结果产物的收率很低。另外，游离使用后，酶与介质不易分离，酶难以回收和重复使用。解决上述问题的思路是酶的固定化技术，依据脂肪酶自身的特性，设计制备适宜的载体材料，固定化酶既能保持其高催化活性和对映选择性，又能提高在有机溶剂中的分散性和催化活性，还有利于分离和回收，这无疑是实现脂肪酶工业化制备手性化合物的有效途径。

目前用于制备手性化合物的脂肪酶主要有假丝酵母脂肪酶(CCL)、皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)、猪胰脂肪酶(PPL)，假单胞菌脂肪酶(PSL)、南极假丝酵母脂肪酶(CAL)、荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)和根霉脂肪酶(RSL)，其中PSL和CAL在手性化合物合成中被应用得最为广泛，尤其PSL在有机相拆分芳香族仲醇的反应中显示了非常高的催化活性及对映选择性。文献4：Tetrahedron：Asymmetry，2003，14(17)：2547-2555中用溶胶-凝胶法固定化β-环糊精预处理过的PSL进行拆分1-苯乙醇，1-苯乙醇的转化率达到52％，底物和产物的ee值分别为99％和91％，但是溶胶-凝胶法所用前驱体试剂非常昂贵，且制备过程繁琐、时间长，批次质量稳定性差，难以在工业中得到应用。2007年10月3日授权公告的名为“高稳定性固定化酶的制备方法”，申请号200510060838.0，该专利的技术方案是通过紫外光等方式引发自由基聚合，实现酶在高度交联聚合物载体中的包埋固定化。但是高分子网格或薄膜不利于底物与产物分子的扩散，在有机溶剂中，固定化酶往往表现出低的催化活性，而专利中对所发明的固定化脂肪酶在有机溶剂的比活性和对映选择性未作进一步实例说明。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种具有良好的重复使用性、生产成本较低的、质量稳定的酶的载体和该载体的生产方法；该载体属有机-无机复合物，具有多孔结构，孔径分布窄，孔道内表面存在大量的醛基基团，酶分子进入载体孔内，并与孔壁上的醛基充分接触，固定化酶结合酶量高，载酶量在100-200mg/g范围；

本发明的目的之二是提供一种利用上述载体制备固定化酶的方法；利用该方法制备的固定化酶具有酶分子能够保持其特有的活性中心的手性特征，固定化酶兼备高活力和高对映选择性，其催化拆分外消1-苯乙醇产物对映体对量值达到99％，且固定化酶在有机溶剂中具有良好的分散性，与底物分子亲和作用强，在反应中底物分子容易向固定化酶的孔内扩散，固定化酶的催化效率高。

本发明的目的之三是上述固定化酶的使用；该固定化酶专用于有机溶剂高对映选择性催化拆分手性醇酯等外消旋体。

本发明固定化脂肪酶的制备和应用技术，包括如下步骤：

一种载体，其特征在于该载体为有机-无机复合物，其孔径为10-20nm，孔体积在0.6-1.2cm³/g，比表面积在300-700cm²/g。

上述载体的孔道内表面有醛基基团。

制备上述载体的方法，其制备步骤为：

a、多孔无机材料的制备：采用水热晶化法。在H⁺浓度为2-4mol/L酸性溶液中加入硅酸酯、聚氧乙烯醚-聚丙烯醚聚合物(简称P₁₂₃)和芳香烃，混合溶液搅拌2-10h，在90-150℃进行30-80h晶化后，冷却至室温后滤出固体；

b、多孔无机材料氨基化修饰：上述固体分散在质量分数为30-60％的硫酸溶液中，在70-100℃下搅拌10-40h后过滤出固体并用水洗涤至中性，然后再用无水乙醇进行洗涤，将洗净的固体分散于有机溶剂中，搅拌下加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(简称APTS)并在80-110℃氮气气氛中反应5-15h，反应结束后滤出固体，用甲苯洗1-4次后用无水乙醇洗涤，得到氨基多孔无机材料；

c、戊二醛活化：制得的氨基多孔无机材料固体转移至质量分数为1-4％戊二醛-磷酸盐缓冲溶液中，室温下反应1-3h后滤出固体，并用去离子水洗涤至洗涤液检测不出戊二醛为止；

d、将步骤c所获得的物质经50-70℃干燥得到醛基多孔有机-无机复合物载体。

上述酸性溶液为HCl或H₃PO₄水溶液。

上述硅酸酯为正硅酸乙酯和正硅酸丙酯。

上述芳香烃为甲苯、二甲苯、三甲苯或它们的混合物。

上述混合溶液中硅酸酯∶聚氧乙烯醚-聚丙烯醚聚合物∶芳香烃的质量比为1∶0.2∶1至1∶1∶4，优选的为1∶0.4∶2。

上述多孔无机材料氨基化修饰时，待活化的固体和氨基化试剂APTS的质量比为1∶0.2至1∶1.5。

利用上述载体制备固定化脂肪酶的方法，其制备步骤为：

将载体分散在的中性磷酸盐缓冲溶液或中性磷酸盐缓冲溶液-有机溶剂混合液中，然后加入一定质量的脂肪酶，在15-45℃下，置摇床中振荡4-10h以上，使酶与载体充分接触进行固定化，然后分离出固定化酶，于真空干燥箱中干燥后冷冻储藏备用。

上述载体与脂肪酶的质量比1∶0.05-0.4，固定化溶剂为磷酸盐缓冲溶液-有机溶剂混合溶液时，磷酸盐缓冲溶液与有机溶剂的体积比为0.2-2∶1，其中的有机剂可用异辛烷、正庚烷、正己烷、环己烷、甲苯、乙苯等，也可以用上述二者的混合溶剂。

固定化脂肪酶的应用，其特征在于该固定化脂肪酶是拆分外消旋化合物制备单一手性对映体的优良催化剂。

1、多孔复合物载体的制备

44g正硅酸乙酯中加入20g聚氧乙烯醚-聚丙烯醚聚合物(简称P₁₂₃)、50mL三甲苯和300mL 2mol/L HCl溶液，混合溶液经机械搅拌24h后转入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜，在100℃静止进行50h晶化后，冷却至室温后滤出固体。固体分散在质量分数为30-60％的硫酸溶液中，在95℃下搅拌24h以洗脱有机物。过滤，固体用水洗涤至中性，在索氏提取器用无水乙醇进行抽提洗涤。得到的固体分散于200ml甲苯中，搅拌下加入10mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(简称APTS)并在110℃氮气气氛中反应10h，以使固体表面嫁接氨基基团。反应结束后滤出固体，用甲苯洗3次后用无水乙醇洗涤。得到的固体转移至戊二醛(质量分数为2.5％)-磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)中，室温下反应1-3h后滤出固体，并用去离子水洗涤至洗涤液检测不出戊二醛为止。经70℃干燥得到多孔有机-无机复合物产品。

载体制备方法中正硅酸乙酯、P₁₂₃与三甲苯的质量比为1∶0.2∶1至1∶1∶4，优选的为1∶0.4∶2；HCl的浓度为1.5-5mol/L，优选的为2-4mol/L，晶化温度90-150℃，优选的为100-130℃；晶化时间30-80h，优选的为40-72h。载体表面醛基活化时，待活化的固体和氨基化试剂APTS的质量比为1∶0.2至1∶1.5，优选的为1∶0.4至1∶1；戊二醛溶液的质量分数为1％-4％，优选的为1.5％-2.5％。

2、固定化脂肪酶的制备

上述有机-无机复合物载体分散在的中性磷酸盐缓冲溶液或中性磷酸盐缓冲溶液-有机溶剂混合液中，然后加入一定质量的脂肪酶，置摇床中至少振荡4h使酶与载体充分接触进行反应。分离出固定化酶，于真空干燥箱中干燥后冷冻储藏备用。

固定化脂肪酶制备方法中，载体与脂肪酶的质量比1∶0.05至1∶0.4，优选的为1∶0.1至1∶0.2；固定化溶剂若采用磷酸盐缓冲溶液-有机溶剂混合溶液，磷酸盐缓冲溶液与有机溶剂体积为0.2∶1至2∶1，优选的为0.4∶1至1∶1，其中的有机剂可用异辛烷，正庚烷，正己烷，环己烷，甲苯，乙苯等，也可以用上述二者的混合溶剂；固定化温度为15-45℃，优选的为20-30℃；固定化时间为4-10h，优选的为5-8h。

3、固定化脂肪酶的应用

以制备的固定化酶在有机溶剂中催化拆分外消旋1-苯乙醇制备单一手性醇和酯为例。乙酸乙烯酯为酰化剂，底物(R，S)-1-苯乙醇和酰化剂的质量比为1∶1至1∶5，优选的为1∶2至1∶4。底物(R，S)-1-苯乙醇与有机溶剂(如异辛烷、庚烷等)的质量比为为1∶100至1∶400，优选的为1∶200至1∶300。底物、酰化剂和有机溶剂混合后加入制备的固定化酶，(R，S)-1-苯乙醇与固定化酶的质量比为1∶0.05至1∶1，优选的为1∶0.1至1∶0.4。振荡反应器使酶与反应物充分接触，温度控制为20-60℃，优选的为30-40℃；反应时间为20-90h，优选的为48-72h。反应结束后，回收固定化酶。转酯化拆分反应式如下：

(R，S)-1-苯乙醇                              (s)-1-苯乙醇                  (R)-1-乙酸苯乙酯

反应液中生成物和剩余底物的含量可用装有手性毛细管柱的气相色谱仪测定。采用文献[J.Mol.Catal.B：Enzym.2000，11：45-53]所公开的方法，对映体过量值和外消旋底物的转化率计算如下：

生成物(R)-1-乙酸苯乙酯的对映体过量值(ee_p，％)： ${\mathrm{ee}}_S(\%)=\frac{{\left[S\right]}_S-{\left[R\right]}_S}{{\left[S\right]}_S+{\left[R\right]}_S}$

底物(S)-1-苯乙醇的对映体过量值(ee_s，％)： ${\mathrm{ee}}_p(\%)=\frac{{\left[R\right]}_p-{\left[S\right]}_p}{{\left[R\right]}_p+{\left[S\right]}_p}$

外消旋底物(R，S)-1-苯乙醇的转化率(C，％)： $C(\%)=\frac{{\mathrm{ee}}_S}{{\mathrm{ee}}_S+{\mathrm{ee}}_P}$

本发明固定化脂肪酶在常温下可用于水解、酯化、酯交换等催化反应，尤其适应于在有机溶剂中催化拆分外消旋体。产品固定化酶在机溶剂中对外消旋1-苯乙醇的转酯化拆分反应显示出极高的对映选择性，获得的(R)-1-乙酸苯乙酯的对映体过量值ee_p≥99％，(S)-1-苯乙醇的对映体过量值ee_s接近99％，转化率C(％)接近理论最大转化率(50％)。

附图说明

图1本发明固定化酶的载体扫描电子显微镜照片。

图2本发明醛基多孔有机-无机载体载体的孔径分布图。

从图可见，该载体孔体积较大，孔径分布很窄，主要集中在17nm。载体具有较大的比表面积和孔道，有利于制备载酶量高的固定化酶。

具体实施方式：

实施例1

1、多孔有机-无机复合物载体的制备：

44g正硅酸乙酯中加入20g的P₁₂₃、20mL三甲苯和150mL 2mol/LHCl溶液，混合溶液机械搅拌24h后转入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜，100℃静止晶化50h，冷却至室温后滤出固体。固体中加入质量分数为60％的硫酸溶液，加热至100℃下搅拌24h后滤出固体。固体经去离子水洗涤，用无水乙醇在索氏提取装置中抽提。得到的固体分散于200mL甲苯中，搅拌下加入1.0g氨基化试剂APTS，然后在110℃下氮气气氛中反应10h，反应结束后滤出固体，用甲苯洗3次后用无水乙醇洗涤。得到的固体转移至2.5％的戊二醛-磷酸盐缓冲溶液，该溶液的pH＝8.0，室温下反应1.5h后滤出固体，用去离子水洗涤至洗涤液检测不出戊二醛为止。固体经70℃干燥得到醛基多孔有机-无机复合物载体。如图1、2所示，该载体孔体积较大，孔径分布很窄，主要集中在17nm。载体具有较大的比表面积和孔道，有利于制备载酶量高的固定化酶。

2、固定化酶的制备

反应器中装有10mL中性磷酸盐缓冲溶液-异辛烷的混合溶液，二者的体积比为0.2∶1。将0.1g载体放入混合液中分散均匀后，加入10mg假单胞菌脂肪酶，反应器置30℃摇床中振荡8h。滤出固定化酶，在真空干燥箱中干燥后冷冻储藏。

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇

在250mL的反应器中装入100mL异辛烷和10g底物(R，S)-1-苯乙醇及20g乙酸乙烯酯，三者混合均匀后加入1g固定化酶，振荡反应器使酶与反应物充分接触，控制反应温度为40℃，反应时间为50h，反应结束后过滤回收固定化酶，产物用装有手性毛细管柱的气相色谱仪分析。

实施例2

1、多孔有机-无机复合物载体的制备：

44g正硅酸乙酯中加入20g的P₁₂₃、50mL三甲苯和250mL 2mol/LHCl溶液，机械搅拌24h后转入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜，100℃静止晶化50h，冷却至室温后滤出固体。固体洗涤操作过程同实施例1。得到的固体分散于200mL甲苯中，搅拌下加入1.5g APTS，然后在110℃下氮气气氛中反应10h，反应结束后滤出固体，用甲苯洗3次后用无水乙醇洗涤。用质量分数为1.5％的戊二醛-磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)在室温下活化1.5h后滤出固体，用去离子水洗涤至洗涤液检测不出戊二醛为止。醛基有机-无机复合物载体在真空干燥箱中70℃下干燥。

2、固定化酶的制备：

反应器中装有10mL中性磷酸盐缓冲溶液-正庚烷的混合溶液，二者的体积比为0.2∶1。将0.1g载体放入混合液中分散均匀后，加入15mg假单胞菌脂肪酶，反应器置30℃摇床中振荡8h。滤出固定化酶，在真空干燥箱中干燥后冷冻储藏。

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇的操作方法同实施例1。

实施例3

1、多孔有机-无机复合物载体的制备：

在实施例1的基础上，正硅酸乙酯与P₁₂₃和三甲苯及HCl溶液转入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，将晶化温度由100℃调为120℃，晶化时间调为36h；搅拌状态氮气气氛中固体与APTS反应温度和时间由110℃、10h，分别调为100℃、20h；戊二醛-磷酸盐缓冲溶液的中戊二醛的质量分数由2.5％调至1.5％，其它条件不变，同样能制备出醛基多孔有机-无机复合物载体。

2、固定化酶的制备同实施例1

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇的操作方法同实施例1。

实施例4

1、多孔有机-无机复合物载体的制备：

在实施例1中，以正硅酸丙酯代替正硅酸乙酯，H₃PO₄溶液代替HCl溶液，同样能够得到复合物载体。

2、固定化酶的制备同实施例1。

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇的操作方法同实施例1。

实施例5

1、多孔有机-无机复合物载体的制备：

在实施例1中，以甲苯和二甲苯代替三甲苯，或用它们的混合物，也可以制备复合物载体。

2、固定化酶的制备同实施例1。

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇的操作方法同实施例1。

实施例6

1、多孔有机-无机复合物载体的制备同实施例1。

2、固定化酶的制备：

在反应器中先将15mg假单胞菌脂肪酶溶于10mL中性磷酸盐缓冲溶液中，然后加入0.1g载体，反应器置20℃摇床中振荡4h。滤出固定化酶，在真空干燥箱中干燥后冷冻储藏。

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇的操作方法同实施例1。

实施例7

1、多孔有机-无机复合物载体的制备同实施例2。

2、固定化酶的制备同实施例2

3、固定化酶催化拆分外消旋(R，S)-1-苯乙醇：

在250mL的反应器中装入100mL甲苯和10g底物(R，S)-1-苯乙醇及30g乙酸乙烯酯，三者混合均匀后加入1.5g固定化酶，振荡反应器使酶与反应物充分接触，控制反应温度为45℃，反应时间为40h，反应结束后过滤回收固定化酶，产物进行气相色谱分析。

实施例1至实施例7制备固定化脂肪酶，用于拆分外消旋1-苯乙醇，转化率和对映体过量值数据列于表1。

表1固定化脂肪酶拆分1-苯乙醇转化率和对映体过量值

样品	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	实施例7
								转化率C(％)	50	42	39	50	48	45	50
eep(％)	99	99	99	99	99	99	99
								ees(％)	99	72	64	99	90	80	99

Claims (11)

1.一种载体，其特征在于该载体为有机-无机复合物，其孔径为10-20nm，孔体积在0.6-1.2cm³/g，比表面积在300-700cm²/g。

2.根据权利要求1所述载体，其特征在于在上述载体的孔道内表面有醛基基团。

3.制备权利要求1所述载体的方法，其制备步骤为：

a、多孔无机材料的制备：采用水热晶化法。在H⁺浓度为2-4mol/L酸性溶液中加入硅酸酯、聚氧乙烯醚-聚丙烯醚聚合物(简称P₁₂₃)和芳香烃，混合溶液搅拌2-10h，在90-150℃进行30-80h晶化后，冷却至室温后滤出固体；

b、多孔无机材料氨基化修饰：上述固体分散在质量分数为30-60％的硫酸溶液中，在70-100℃下搅拌10-40h后过滤出固体并用水洗涤至中性，然后再用无水乙醇进行洗涤，将洗净的固体分散于有机溶剂中，搅拌下加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(简称APTS)并在80-110℃氮气气氛中反应5-15h，反应结束后滤出固体，用甲苯洗1-4次后用无水乙醇洗涤，得到氨基多孔无机材料；

c、戊二醛活化：制得的氨基多孔无机材料固体转移至质量分数为1-4％戊二醛-磷酸盐缓冲溶液中，室温下反应1-3h后滤出固体，并用去离子水洗涤至洗涤液检测不出戊二醛为止；

d、将步骤c所获得的物质经50-70℃干燥得到醛基多孔有机-无机复合物载体。

4.根据权利要求3所述的制备载体的方法，其特征在于上述酸性溶液为HCl或H₃PO₄水溶液。

5.根据权利要求4所述的制备载体的方法，其特征在于上述硅酸酯为正硅酸乙酯和正硅酸丙酯。

6.根据权利要求5所述的制备载体的方法，其特征在于上述芳香烃为甲苯、二甲苯、三甲苯或它们的混合物。

7.根据权利要求3所述的制备载体的方法，其特征在于上述混合溶液中硅酸酯∶聚氧乙烯醚-聚丙烯醚聚合物∶芳香烃的质量比为1∶0.2∶1至1∶1∶4，优选的为1∶0.4∶2。

8.根据权利要求3所述的制备载体的方法，其特征在于上述多孔无机材料氨基化修饰时，待活化的固体和氨基化试剂APTS的质量比为1∶0.2至1∶1.5。

9.利用权利要求1所述的载体制备固定化脂肪酶的方法，其制备步骤为：

将载体分散在的中性磷酸盐缓冲溶液或中性磷酸盐缓冲溶液-有机溶剂混合液中，然后加入一定质量的脂肪酶，在15-45℃下，置摇床中振荡4-10h以上，使酶与载体充分接触进行固定化，然后分离出固定化酶，于真空干燥箱中干燥后冷冻储藏备用。

10.根据权利要求9所述的制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于上述载体与脂肪酶的质量比1∶0.05-0.4，固定化溶剂为磷酸盐缓冲溶液-有机溶剂混合溶液时，磷酸盐缓冲溶液与有机溶剂的体积比为0.2-2∶1，其中的有机剂可用异辛烷、正庚烷、正己烷、环己烷、甲苯、乙苯等，也可以用上述二者的混合溶剂。

11.固定化脂肪酶的应用，其特征在于该固定化脂肪酶是拆分外消旋化合物制备单一手性对映体的优良催化剂。

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