CN102676493A - 一种含猪胰脂肪酶的介孔生物材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含猪胰脂肪酶的介孔生物材料及其制备方法。该方法是首先通过将表面活性剂溶解在盐酸的水溶液中，加入无机硅源和有机硅烷化试剂，水浴条件下充分水解，经老化、冷却、过滤、洗涤、干燥和表面活性剂抽提得到含有活性基团的介孔氧化硅，然后将上述所得到的材料投入到猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，离心，过滤，干燥得到猪胰脂肪酶功能化的介孔生物材料。本发明方法简便，环境友好。合成的含有猪胰脂肪酶的介孔生物材料具有较大孔径、高比表面积以及其保持酶活性高，酶活提高比例大的特征，可以作为生物催化材料直接使用。本发明不仅在生物反应器，而且在纳米生物传感器件、生物分子输送等方面有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种含猪胰脂肪酶的介孔生物材料及其制备方法，具体地说是一种孔内猪胰脂肪酶功能化的介孔氧化硅材料及其制备方法。
背景技术
近年来，国际上引人注目的研究热点是无机材料与生命科学的交叉学科，各种生物分子通过特定的物理或化学的方法被囊入具有多孔性的无机材料的空腔，导致了一类令人惊异的生物无机杂化新材料的问世，以无机材料为载体囊入脂肪酶、DNA、胰岛素、氨基酸、细胞色素C等广泛地被人们所研究。其中有效固定酶所得到的复合功能材料在不同的领域比如生物分析、生物催化、蛋白质输送体系等担当着重要的环节，因此作为固定酶的新型材料的研究越来越受到人们的关注。
就猪胰脂肪酶而言，它是脂肪酶的一种，具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点，广泛的应用于大规模的生化工业生产、食品工业、油化学、清洁剂以及精细化工产品制备等很多领域。因此选择其固定于适当的载体材料构建新型的复合功能材料，对于生物技术的发展以及拓展生物应用领域有着重要的意义。随着纳米技术发展，许多具有理想的酶固定环境的多孔材料被创造出来，其中介孔硅材料成为此类研究的代表。许多研究者将其作为固定酶的材料中结果表明：氧化硅的介孔孔道提供了一个很好的生物空间，对于这些生物分子的活性和热稳定性具有很好的保护作用，同时在有机溶剂中具有更好的抗流失性能。为了能够提高酶固定的稳定性和牢固性，以有机功能化介孔材料成为了研究的对象，通过介孔有机功能化能够有效地提高孔道内有机基团的含量，而且这些有机基团好似活性位点可以共价或者物理吸附绑定生物酶分子，提高它的固定效率增加其抗流失性能。以不同的硅烷化试剂和硅前躯体共水解-聚合在介孔孔壁上引入活性基团如-NH2、-SH、-Cl基团，继而以这些基团作为活性中心，共价绑定猪胰脂肪酶搭建新型的生物功能复合材料。这种复合的猪胰脂肪酶功能化的介孔材料的研究还未见报道，可以预期这样的复合功能材料由于本身的特征使其不仅在生物催化领域，而且在纳米生物荧光传感器件、生物分子载体等方面有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供了一种含猪胰脂肪酶的介孔生物材料，本发明的另一目的是提供上述材料的制备方法。
本发明的技术方案为：首先通过将表面活性剂溶解在盐酸的水溶液中，加入无机硅源和有机硅烷化试剂，水浴条件下充分水解，经老化、冷却、过滤、洗涤、干燥和表面活性剂抽提得到含有活性基团的介孔氧化硅，然后将上述所得到的材料投入到猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，离心，过滤，干燥得到猪胰脂肪酶功能化的介孔生物材料。
本发明的具体技术方案为：一种含猪胰脂肪酶的介孔生物材料，其特征在于所述的含猪胰脂肪酶的介孔生物材料为在有机改性的二氧化硅介孔材料的孔道内固定猪胰脂肪酶的介孔生物材料；猪胰脂肪酶功能化的介孔生物材料的孔径为3-8nm，比表面积为130-290m2/g，猪胰脂肪酶的酶活为130-510u/g，酶活提高比率为1.5-6.0。
本发明还提供了上述的含猪胰脂肪酶的介孔生物材料的方法，具体步骤如下：
A)将非离子表面活性剂溶于盐酸的水溶液中，控制溶液的pH为0.1～1，水浴搅拌至澄清，获得澄清溶液，保持温度在35～50℃；
B)在上述步骤A)所得溶液中加入与非离子表面活性剂摩尔比为25～60∶1无机硅源，并且继续搅拌1～3小时；
C)向步骤B)所得溶液体系中逐滴加入有机硅烷化试剂，水浴下保持温度35～50℃，搅拌22～24小时，将无机硅源和有机硅源充分水解；
D)将步骤C)所得到的溶液转入到带有聚四氟乙烯衬套的不锈钢反应釜中，100～120℃下老化22～24h，然后经冷却、过滤、洗涤、干燥，再经过抽提去除表面活性剂得到含有活性基团的介孔氧化硅；
E)将步骤D)得到的具有活性基团的介孔氧化硅材料，加入到猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，在离心条件下反应10～20分钟；
F)将步骤E)所得到混合溶液，在温度为5～15℃条件下，离心5～15分钟，滤去清液，自然干燥得到脂肪酶功能化的介孔生物材料。
优选步骤A中所述的非离子表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(P123)；优选步骤B中所述的无机硅源为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；优选步骤C中有机硅烷化试剂为分子式为RCnH2n-Si(OCmH2m+1)3，其中R为氯基、氨基、巯基、乙烯基或环氧基，n为1～4、m为1～4；有机硅烷化试剂的加入量为控制有机硅烷化试剂与无机硅源的摩尔比为1∶1～20。
优选步骤D中表面活性剂抽提去除采用的溶剂为乙醇的盐酸溶液或者乙醇的醋酸溶液。
优选步骤E中猪胰脂肪酶的缓冲溶液是为pH范围为5～9的猪胰脂肪酶水溶液；其中猪胰脂肪酶的浓度范围为0.5～5mg/mL。
有益效果：
本发明制备的含胰脂肪酶的介孔生物材料具有规整的一维孔道结构，比表面积大，具有较大的孔径，实现生物无机功能材料的孔内自组装。由于首先采用在溶胶/凝胶体系中利用有机硅烷化试剂和正硅酸乙酯原位共缩合进行合成，孔表面的活性基团量是可控的，因而实现了猪胰脂肪酶固载量的可控性。
本发明方法简便，环境友好。合成的含有猪胰脂肪酶的介孔生物材料具有较大孔径、高比表面积以及其保持酶活性高，酶活提高比例大的特征，可以作为生物催化材料直接使用。
本发明不仅在生物反应器，而且在纳米生物传感器件、生物分子输送等方面有着广阔的应用前景。
具体实施方式
氮气吸附/脱附等温线测定中，对于比表面积的分析一般采用BET方法，孔径分布通常采用BJH模型。
样品中酶活分析采用裂解三乙酸甘油酯作为特征反应，以记录体系中pH值的变化推算酶活。
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
将2克非离子表面活性剂P123溶于15克水和60克浓度为2M的盐酸溶液中，室温下搅拌30分钟至澄清，将其放置于40℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯3.83克，预水解2小时后，加入氯丙基-三乙氧基硅烷化试剂0.49克，40℃下搅拌24小时后转入到带有聚四氟乙烯衬套的反应釜中，放入100℃烘箱中，老化24小时，经过过滤、洗涤、在空气中自然干燥，最后在乙醇的盐酸溶液中抽提24小时去除表面活性剂，在室温下干燥，得到含有氯基在总硅中比例为10％的介孔氧化硅(SBA-Cl-10％)。将上述材料加入到20ml浓度为2mg/mL的猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，其混合液在25℃，215rmp的条件下混合3小时。然后，将其置于10℃，6000rmp条件下离心10分钟，滤去清液后剩余固体室温下干燥后获得猪胰脂肪酶功能化介孔生物材料。所得功能化材料经氮气吸附/脱附等温线测定孔径为3.5nm，比表面积为231m2/g；采用三乙酸甘油酯裂解为探针反应测得的酶活为509.5u/g，酶活提高比率为5.7。
实施例2
将4克非离子表面活性剂P123溶于125克浓度为1M盐酸溶液中，室温下搅拌35分钟至澄清，将其放置于35℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯4.04克，预水解1.5小时后，加入巯丙基-三乙氧基硅烷化试剂0.25克，35℃下搅拌24小时后转入到带有聚四氟乙烯衬套的反应釜中，放入100℃烘箱中，老化24小时，经过过滤、洗涤、在空气中自然干燥，最后在乙醇的盐酸溶液中抽提24小时去除表面活性剂，在室温下干燥，得到含有巯基在总硅中比例为5％的介孔氧化硅(SBA-SH-5％)。将上述材料加入到20ml浓度为2mg/mL的猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，其混合液在25℃，215rmp的条件下混合1小时。然后，将其置于10℃，6000rmp条件下离心10分钟，滤去清液后剩余固体室温下干燥后获得猪胰脂肪酶功能化介孔生物材料。所得功能化材料经氮气吸附/脱附等温线测定孔径为5.3nm，比表面积为205m2/g；采用三乙酸甘油酯裂解为探针反应测得的酶活为342.7u/g，酶活提高比率为3.8。
实施例3
将1克非离子表面活性剂P123溶于7.5克水和30克浓度为4M的盐酸溶液中，室温下搅拌40分钟至澄清，将其放置于45℃水浴条件下，加入正硅酸甲酯1.4克，预水解1小时后，加入乙烯基-三乙氧基硅烷化试剂0.20克，45℃下搅拌24小时后转入到带有聚四氟乙烯衬套的反应釜中，放入100℃烘箱中，老化24小时，经过过滤、洗涤、在空气中自然干燥，最后在乙醇的盐酸溶液中抽提24小时去除表面活性剂，在室温下干燥，得到含有乙烯基在总硅中比例为10％的介孔氧化硅(SBA-YX-10％)。将上述材料加入到20ml浓度为2mg/mL的猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，其混合液在25℃，215rmp的条件下混合9小时。然后，将其置于10℃，6000rmp条件下离心10分钟，滤去清液后剩余固体室温下干燥后获得猪胰脂肪酶功能化介孔生物材料。所得功能化材料经氮气吸附/脱附等温线测定孔径为7.6nm，比表面积为285m2/g；采用三乙酸甘油酯裂解为探针反应测得的酶活为307.2u/g，酶活提高比率为3.4。
实施例4
将2克非离子表面活性剂P123溶于15克水和60克浓度为2M的盐酸溶液中，室温下搅拌35分钟至澄清，将其放置于40℃水浴条件下，加入正硅酸甲酯2,95克，预水解2小时后，加入γ-缩水甘油醚氧丙基-三甲氧基硅烷化试剂0.24克，40℃下搅拌24小时后转入到带有聚四氟乙烯衬套的反应釜中，放入100℃烘箱中，老化24小时，经过过滤、洗涤、在空气中自然干燥，最后在乙醇的盐酸溶液中抽提24小时去除表面活性剂，在室温下干燥，得到含有γ-缩水甘油醚氧基在总硅中比例为5％的介孔氧化硅(SBA-HY-5％)。将上述材料加入到20ml浓度为2mg/mL的猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，其混合液在25℃，215rmp的条件下混合4小时。然后，将其置于10℃，6000rmp条件下离心10分钟，滤去清液后剩余固体室温下干燥后获得猪胰脂肪酶功能化介孔生物材料。所得功能化材料经氮气吸附/脱附等温线测定孔径为6.5nm，比表面积为245m2/g；采用三乙酸甘油酯裂解为探针反应测得的酶活为208.4u/g，酶活提高比率为2.3。
实施例5
将1.5克非离子表面活性剂P123溶于11.25克水和45克浓度为2M的盐酸溶液中，室温下搅拌40分钟至澄清，将其放置于50℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯2.71克，预水解3小时后，加入氨丙基-三甲氧基硅烷化试剂1.30克，50℃下搅拌24小时后转入到带有聚四氟乙烯衬套的反应釜中，放入100℃烘箱中，老化24小时，经过过滤、洗涤、在空气中自然干燥，最后在乙醇的盐酸溶液中抽提24小时去除表面活性剂，在室温下干燥，得到含有氨基在总硅中比例为15％的介孔氧化硅(SBA-NH2-15％)。将上述材料加入到20ml浓度为2mg/mL的猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，其混合液在25℃，215rmp的条件下混合1小时。然后，将其置于10℃，6000rmp条件下离心10分钟，滤去清液后剩余固体室温下干燥后获得猪胰脂肪酶功能化介孔生物材料。所得功能化材料经氮气吸附/脱附等温线测定孔径为3.8nm，比表面积为132m2/g；采用三乙酸甘油酯裂解为探针反应测得的酶活为139.8u/g，酶活提高比率为1.6。
Claims (6)
1.一种含猪胰脂肪酶的介孔生物材料，其特征在于所述的介孔生物材料为在有机改性的二氧化硅介孔材料的孔道内固定猪胰脂肪酶的介孔生物材料；所述的含猪胰脂肪酶的介孔生物材料的孔径为3-8nm，比表面积为130-290m2/g，猪胰脂肪酶的酶活为130-510u/g，酶活提高比率为1.5-6.0。
2.一种制备如权利要求1所述的含猪胰脂肪酶的介孔生物材料的方法，具体步骤如下：
A)将非离子表面活性剂溶于盐酸的水溶液中，控制溶液的pH为0.1～1，水浴搅拌至澄清，获得澄清溶液，保持温度在35～50℃；
B)在上述步骤A)所得溶液中加入与非离子表面活性剂摩尔比为25～60∶1无机硅源，并且继续搅拌1～3小时；
C)向步骤B)所得溶液体系中逐滴加入有机硅烷化试剂，水浴下保持温度35～50℃，搅拌22～24小时，将无机硅源和有机硅源充分水解；
D)将步骤C)所得到的溶液转入到带有聚四氟乙烯衬套的不锈钢反应釜中，100～120℃下老化22～24h，然后经冷却、过滤、洗涤、干燥，再经过抽提去除表面活性剂得到含有活性基团的介孔氧化硅；
E)将步骤D)得到的具有活性基团的介孔氧化硅材料，加入到猪胰脂肪酶的缓冲溶液中，在离心条件下反应10～20分钟；
F)将步骤E)所得到混合溶液，在温度为5～15℃条件下，离心5～15分钟，滤去清液，自然干燥得到脂肪酶功能化的介孔生物材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A中所述的非离子表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤B中所述的无机硅源为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C中有机硅烷化试剂为分子式为RCnH2n-Si(OCmH2m+1)3，其中R为氯基、氨基、巯基、乙烯基或环氧基，n为1～4、m为1～4；有机硅烷化试剂的加入量为控制有机硅烷化试剂与无机硅源的摩尔比为1∶1～20。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤E中猪胰脂肪酶的缓冲溶液是为pH范围为5～9的猪胰脂肪酶水溶液；其中猪胰脂肪酶的浓度范围为0.5～5mg/mL。
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