JPH1169974A - 固定化酵素担体および固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い反応活性を有し、且つ、耐久性に優れた
固定化酵素と、このような固定化酵素に好適な固定化酵
素担体を提供する。 【解決方法】 ｘＭｇＯ・Ａｌ₂ Ｏ₃ （但し、ｘ＝１〜
２００）で表される化合物を２００〜１０００℃で焼成
し、アルミニウムとマグネシウムとの複合酸化物を主成
分とする多孔性無機材料からなる固定化酵素担体を得
た。酵素としてリパーゼ等の脂質分解酵素を使用し、シ
クロヘキサノン等の有機溶媒中で前記酵素を含む水溶液
と前記固定化酵素担体とを接触させながら水分を留去す
ることにより酵素を固定化し、固定化酵素を得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素を触媒とする
生化学反応の工業的な実施に有用な固定化酵素および固
定化酵素担体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】現在、食品や医薬品製造等の分野で酵素
を利用した生化学反応が工業的に実施されている。その
ような生化学反応の一例としては、リパーゼ等の脂質分
解酵素を利用したエステルの合成および交換反応が挙げ
られる。エステル合成反応は、アルコールと脂肪酸から
のアルコール脂肪酸エステルの合成や、モノグリセリ
ド、糖エステルのような多価アルコール脂肪酸エステル
の合成等に利用され、また、エステル交換反応は大豆
油、オリーブ油、パーム油等の植物油脂や、牛脂、魚油
等の動物油脂等の食品用加工油脂の改質等に利用され、
共に重要な反応である。

【０００３】しかし、酵素水溶液を、上記エステル合成
および交換反応等のような水分の制限された系でのみ進
行する反応に利用する場合、酵素を溶媒中に均一に混合
・分散させることが困難であるうえに、水に依存する副
反応が併発するという問題があった。この問題を解決す
るため、酵素を水不溶性担体に固定化して使用する方法
が採用されている。この固定化酵素によれば、有機溶媒
中の酵素反応が可能であるだけでなく、酵素の回収・再
利用による触媒コストの低減、酵素の安定性の向上、反
応時間の短縮、反応器の小型化等が図れるという利点が
ある。

【０００４】固定化酵素担体としては、多孔性陰イオン
交換樹脂およびマクロポーラス樹脂（特開昭６０−９８
９８４号公報、特開平１−５０１１２０号公報）、フェ
ノール樹脂（特開昭６１−２０２６８号公報）、陽イオ
ン交換樹脂（特開平３−６４１８５号公報）、キレート
樹脂（特開平１−２６２７９５号公報）等の有機材料、
または、多孔性ガラス、ムライト質やコーディライト質
等の多孔性セラミックスや、ケイ酸マグネシウム質のセ
ピオライト（特開昭６３−９１０８３号公報）等の無機
材料が用いられている。

【０００５】また、酵素の固定化方法としては、担体を
酵素水溶液中に一定時間浸漬して酵素を吸着させた後、
担体を濾別し、洗浄、乾燥する方法が一般的であり（特
表平４−５０１６６４号公報）、その他には、担体を分
散させた有機溶媒中に酵素水溶液を滴下し、水分の共存
下で一定時間攪拌して酵素を固定化した後、担体を濾別
し、洗浄、乾燥する方法（特公平７−１２３１０号公
報）が提案されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】反応活性が高く、耐久
性に優れた固定化酵素を得るために、固定化酵素担体に
できるだけ多くの酵素が確実に吸着することが求められ
る。

【０００７】このような観点から、担体には、できるだ
け大きな比表面積が要求される。多孔性ガラスビーズ
は、比表面積が７０〜８０ｍ² ／ｇと比較的大きく、担
体として好適ではあるが、製造工程が複雑で高価なもの
となるため工業的使用には適当ではない。

【０００８】また、前述のような従来の固定化方法で
は、酵素の固定化率および得られる固定化酵素の耐久性
の向上に限界があり、また、水分の乾燥操作中に酵素が
失活するおそれがあった。よって、高い耐久性および反
応活性を有する固定化酵素を確実に得ることは困難であ
った。

【０００９】本発明は、優れた耐久性と高い反応活性と
を有する固定化酵素、および、このような固定化酵素に
好適な固定化酵素担体を得ることを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明の固定化酵素担体は、アルミニウムとマグネ
シウムとの複合酸化物を主成分とする多孔性無機材料か
らなることを特徴とする。この固定化酵素担体は、前記
複合酸化物がモル％で表示して下記組成を有することが
好ましい。

【００１１】 ＭｇＯ ： ５０〜９９．５ ％ Ａｌ₂ Ｏ₃ ： ０．５〜５０ ％ 但し、ＭｇＯは、好ましくは５０〜９０％であり、Ａｌ
₂ Ｏ₃ は好ましくは１０〜５０％である。

【００１２】また、本発明の固定化酵素担体の別の側面
は、下記式（１）もしくは下記式（２）で示される化合
物、または前記化合物の水和物を主成分とする多孔性無
機材料を焼成して得られることを特徴とする。

【００１３】 ｘＭｇＯ・Ａｌ₂ Ｏ₃ （１） Ｍｇ_1-y ・Ａｌ_y （ＯＨ）₂ （Ｑ）_y/2 （２） 但し、ｘ＝１〜２００、好ましくは１〜１００、更に好
ましくは１〜８であり、ｙ＝０．０１〜０．６、好まし
くは０．０２〜０．６、更に好ましくは０．２〜０．６
であり、ＱはＣＯ₃ 、ＳＯ₄ 、２ＮＯ₃ または２ＣＨ₃
ＣＯＯである。

【００１４】なお、前記式（１）または前記式（２）に
より示される化合物の水和物は、例えば、下記式により
示される化合物である。

【００１５】 ｘＭｇＯ・Ａｌ₂ Ｏ₃ ・ｎＨ₂ Ｏ （３） Ｍｇ_1-y ・Ａｌ_t （ＯＨ）₂ （Ｑ）_y/2 ・ｍＨ₂ Ｏ （４） 但し、ｘ、ｙおよびＱは前記と同様であり、ｍ、ｎは、
化合物に含まれる水分子を結晶水として示したときの配
位数に相当し、前記化合物に化学的、構造的に含まれる
水分子を示す妥当な範囲であれば特に制限されない。

【００１６】本発明の固定化酵素担体は、比表面積が大
きく、酵素の固定化に適当な大きさの細孔を多数有す
る。また、機械的強度、耐熱性、耐溶媒性および耐久性
に優れるという利点を有する。

【００１７】また、前記固定化酵素担体においては、前
記焼成を２００〜１０００℃の温度範囲で行うことが好
ましく、このような構成にしたことにより担体として好
適な細孔孔径および比表面積を得ることができる。

【００１８】前記目的を達成するため、本発明の固定化
酵素の第一の構成は、前記式（１）〜（４）（但し、
ｘ、ｙおよびＱは前記と同様である。）のいずれかで示
される化合物を主成分とする多孔性無機材料を焼成して
得られる固定化酵素担体に、酵素を固定化したことを特
徴とする。このような構成にしたことにより、耐久性に
優れ、酵素吸着量が多く、反応活性の高い固定化酵素と
することができる。

【００１９】また、前記目的を達成するため、本発明の
固定化酵素の第二の構成は、固定化酵素担体と酵素を含
む水溶液とを有機溶媒中で接触させながら水分を留去す
ることにより、前記固定化酵素担体に前記酵素を固定化
したことを特徴とする。このような構成にしたことによ
り、酵素と固定化担体との結合の強化と酵素の固定化率
の向上が実現し、耐久性および反応活性に優れた固定化
酵素とすることができる。更に、特公平７−１２３１０
号公報に記載の方法のように、水分を共存させたままの
状態で固定化を行い、その後濾別、洗浄等をするのでは
ないので、酵素活性低下のおそれも小さい。また、乾燥
工程等を省略でき、生産効率を向上できる。

【００２０】また、前記第二の固定化酵素における固定
化酵素担体としては、前記本発明の第一の固定化酵素に
含まれるものと同様の固定化酵素担体、マクロポーラス
型吸着樹脂もしくはマクロポーラス型イオン交換樹脂、
または、活性アルミナ、炭酸カルシウム、炭酸マグネシ
ウム、酸化マグネシウム、珪藻土およびゼオライトから
選ばれる少なくとも１種の無機材料を使用することが好
ましい。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明の第一の固定化酵素は、好
ましくは、上記（１）式もしくは（２）式で示される化
合物、または上記（３）式もしくは上記（４）式で表さ
れるような前記化合物の水和物を主成分とする多孔性無
機材料を焼成して得られるアルミニウム・マグネシウム
複合酸化物を固定化酵素担体として用いて酵素を固定化
したものである。

【００２２】この固定化酵素担体の材料である上記無機
材料は、不定形またはＭｇＯの岩塩型結晶構造を保持し
た構造等をとる。本発明の固定化担体の材料としては、
特に限定されるわけではないが、結晶構造が不定形であ
るものほど焼成物の比表面積を大きくできるため好まし
い。組成は結晶構造に大きく影響し、アルミニウムの含
有率の高いものが結晶構造を不定形とするために好まし
く、ｘは１〜８、ｙは０．２〜０．６とすることが最も
好ましい。

【００２３】上記無機材料は、固体触媒の調製法として
一般に知られる含浸法、共沈法、沈着法等によって得ら
れる分散粒子を必要に応じて洗浄した後、噴霧乾燥等の
方法で乾燥・造粒することにより製造できる。また、合
成吸着剤として市販されているものでもよく、そのよう
な市販品としてはキョーワード３００、同３００ＡＳ
（２．５ＭｇＯ・Ａｌ₂ Ｏ₃ ・ｍＨ₂ Ｏ）、同５００
（Ｍｇ_0.75 ・Ａｌ_0.25 （ＯＨ）₂ （ＣＯ₃ ）_0.125 ・
０．５Ｈ₂ Ｏ）、同１０００（Ｍｇ_0.7 ・Ａｌ_0.3（Ｏ
Ｈ）₂ （ＣＯ₃ ）_0.15 ・０．５４Ｈ₂ Ｏ）、および同
２０００（Ｍｇ_0.7Ａｌ_0.3 Ｏ_1.15 ）（以上、協和化学
工業株式会社製：「キョーワード」は登録商標）等や、
合成ハイドロタルサイト（協和化学工業株式会社製、富
田製薬株式会社製）等が挙げられる。また、上記材料に
は粉末状、顆粒状、塊状等の種々の形態のものがある
が、必要に応じて粒径調節のための粉化または造粒、粒
度調整のための篩分等を行えばいずれの外観でも使用可
能であり、必要ならば含水率調整のための乾燥等を行っ
てから使用してもよい。

【００２４】上記無機材料は、好ましくは焼成炉で回分
あるいは連続方式で焼成される。焼成の過程において上
記無機材料は、３００〜４００℃で物理吸着または化学
吸着されている水分子が脱離し、比表面積の増大を伴っ
て酸化物へ転移する。比表面積は４００℃付近で極大
（キョーワード３００ＡＳ焼成物の場合は３３０ｍ² ／
ｇ前後）を示す。更に温度が高くなると酸化物の結晶化
が進行し、７００℃以上では比表面積はやや低減（同３
００ＡＳ焼成物の場合は２５０ｍ² ／ｇ前後）するもの
の、粒子の焼結により強度が著しく向上する。

【００２５】担体の強度向上のため焼成は重要な工程で
あるが、その焼成温度によっては酵素の固定化に必要な
細孔を損なうおそれがある。したがって焼成温度は、本
担体を用いた固定化酵素の使用目的・条件等にもよる
が、２００〜１０００℃、好ましくは５００〜１０００
℃、より好ましくは７５０〜９５０℃とする。１０００
℃を超える温度では焼結収縮が進行して細孔が閉塞し、
また、２００℃未満の温度では上記無機材料に吸着して
いる水分の脱離が不十分であり、いずれの場合において
も焼成物の比表面積が小さくなるため好ましくない。な
お、焼成時間は１〜５時間程度が適当である。

【００２６】焼成後、担体粒子径を調整するため、粉砕
工程を行ってもよい。粒子径が小さいほど反応の際に基
質溶液との接触面積が広くなり、酵素の活性発現率が高
くなるが、粒子径があまりに小さいと酵素の回収・再利
用が困難になるため、粒子径は一般に、数十〜千μｍ程
度が適当である。更に、固定化酵素の使用目的や条件等
を考慮して、例えば攪拌槽で反応を行う場合、液相中で
の固定化酵素の分散を重視する時は粒子径を５０μｍ前
後から５００μｍ前後、反応後の固定化酵素の分離操作
を重視する時は粒子の沈降性をよくするため、より大き
い粒子径とすることが好ましい。

【００２７】このようにして得られたアルミニウム・マ
グネシウム複合酸化物は、優れた機械的強度、耐熱性、
耐溶媒性を有し、更に、酵素を固定化するのに適した孔
径２０ｎｍ以上の細孔を十分に備え、極めて大きな比表
面積を有するため、固定化できる酵素量が多い。一般
に、酵素吸着量が多い程優れた反応活性を示すことが多
く、よって本発明の担体は反応活性の高い固定化酵素を
得るのに好適な担体である。また、この担体は固定化酵
素の使用目的に応じて容易に表面状態を調整することが
可能である。細孔の孔径および比表面積は焼成条件によ
り調整でき、孔径１０〜６０ｎｍ、比表面積８０〜３５
０ｍ² ／ｇとすることが好ましい。

【００２８】上記の本発明の固定化酵素担体は、従来の
有機材料からなる担体が有していた機械的強度、耐熱
性、耐溶媒性における欠点を解消するものである。ま
た、本発明の固定化酵素担体は８０ｍ² ／ｇ以上の比表
面積を得ることが可能であり、この点においても、ムラ
イト質やコーディライト質の多孔性セラミックスの比表
面積が１ｍ² ／ｇ前後であることや、セピオライトにお
いては、焼成時に原石が含有する不純物によって細孔の
閉塞が生じて比表面積の減少を招くことを考えれば、こ
れら従来使用されていた担体に比べ、反応活性の高い固
定化酵素を作製するうえで非常に好適な担体であるとい
える。

【００２９】上記の固定化酵素担体に酵素水溶液を接触
させて酵素を固定化することにより本発明の第一の固定
化酵素が得られる。酵素の固定化は、上記担体を酵素水
溶液中に浸漬する従来の方法で行ってもよいが、後述す
る本発明の第二の固定化酵素の製造における固定化方法
を採用すれば、より確実に酵素の固定化率および耐久性
を向上させることができて好ましい。

【００３０】本発明の第二の固定化酵素は、有機溶媒中
で酵素の固定化を行うことにより得られるものである。
その固定化は、まず固定化酵素担体を有機溶媒中に懸濁
させ、そこへ酵素水溶液を添加し、混合しながら減圧す
ること等により水分を留去する方法で行う。この減圧脱
水は酵素水溶液の添加と同時に行っても、添加終了後に
行っても構わないが、液相中の水分濃度の調整が容易で
あることから前者がより好ましい。

【００３１】固定化酵素担体としては、特に限定される
ものではなく、マクロポーラス樹脂や各種の多孔性無機
材料を使用することができ、特に、担体の有する細孔の
孔径が数十〜数百ｎｍの範囲であるものが、酵素の固定
化時の拡散および反応時の基質との接触が有効に起こる
ため好ましい。粒子径については、前述の本発明の第一
の固定化酵素と同様に数十〜千μｍ程度が適当であり、
好ましくは２００〜１０００μｍである。また、比表面
積は、より多くの酵素を固定化できるよう、５０ｍ² ／
ｇ以上であることが好ましい。

【００３２】担体として用いるマクロポーラス樹脂とし
ては、吸着樹脂またはイオン交換樹脂として市販されて
いるものを使用することができる。そのような市販品と
しては、吸着樹脂としては、レバチットＯＣ１０６２
（バイエルジャパン株式会社製：「レバチット」は登録
商標）、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨＰ２Ｍ
Ｇ、セパビーズＳＰ２０７（以上、三菱化学株式会社
製：「ダイヤイオン」および「セパビーズ」は登録商
標）、デュオライトＳ−８７６（ローム・アンド・ハー
ス・カンパニー製：「デュオライト」は登録商標）等が
挙げられる。また、イオン交換樹脂としては、ダウエッ
クスＭＷＡ−１、ダウエックス８８（以上、ザ・ダウ・
ケミカル・カンパニー製：「ダウエックス」は登録商
標）、アンバーライトＩＲＡ−９０４、アンバーライト
２００Ｃ（以上、ローム・アンド・ハース・カンパニー
製：「アンバーライト」は登録商標）、ダイヤイオンＨ
ＰＡ２５、ダイヤイオンＨＰＫ２５（以上、三菱化学株
式会社製：「ダイヤイオン」は登録商標）等が挙げられ
る。

【００３３】また、担体として使用できる無機材料とし
ては、前述した本発明のアルミニウム・マグネシウム複
合酸化物の固定化酵素担体を使用することが好ましい。
その他にも活性アルミナ、炭酸カルシウム、炭酸マグネ
シウム、酸化マグネシウム、珪藻土またはゼオライトが
担体として好適である。

【００３４】有機溶媒としては、脂肪族炭化水素、芳香
族炭化水素、ケトン類、アルコール類、エーテル類、含
窒素化合物、エステル類を用いることが好ましい。溶媒
は酵素を失活させにくいものが好ましく、具体的には、
脂肪族炭化水素としてはデカン、芳香族炭化水素として
はエチルベンゼン、ケトン類としてはシクロヘキサノ
ン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、ジイソブチル
ケトン、イソプロピルケトン、γ−ブチロラクトン、ア
ルコール類ではｔ−ブタノール、エーテル類ではジオキ
サン、含窒素化合物ではβ−ピコリン、エステル類では
脂肪酸メチルエステルが好ましい。

【００３５】脱水操作は酵素の活性に悪影響を及ぼさな
いよう、酵素の種類にもよるが、０〜８０℃、好ましく
は０〜５０℃で行う。また、減圧脱水時の圧力は、水分
を蒸発できる程度であれば特に限定されるものではな
く、温度によっても変わるが、例えば３０℃では１０Ｔ
ｏｒｒ以下が適当である。吸着時間は水分の蒸発に要す
る時間で換言され、特に限定されるものではないが、５
分〜２時間程度が適当である。

【００３６】また、この固定化酵素を反応に使用する
際、有機溶媒中から固定化酵素を一旦濾別回収し、必要
に応じて溶媒を真空蒸発させてから使用してもよいが、
固定化に用いる有機溶媒に適当なものを選択すれば、固
定化酵素を有機溶媒中に懸濁させた状態で溶媒ごと使用
することもできる。この後者の方法によれば、濾過、乾
燥等の諸工程を省略することができる。

【００３７】水分が少ない有機溶媒中で固定化した固定
化酵素は、酵素タンパクのコンホメーションが剛直であ
るため熱安定性が高く、また酵素と担体との結合も強い
ため、耐久性に優れ、酵素の固定化率も高い。また、酵
素固定化時に同時に脱水を行うことにより、従来の水溶
液中での固定化方法における複雑で長時間を要する乾燥
工程等を省略することができ、生産効率が向上すると共
に、乾燥工程における酵素の失活も回避できる。

【００３８】本発明の第一および第二のいずれの固定化
酵素においても、酵素と固定化担体の使用割合（重量
比）は固定化担体１部に対して酵素０．０５〜０．５部
が好ましいが、特にこれに限定されるものではない。ま
た、固定化酵素に含まれる水分量は、担体重量に対し５
％以下が好ましい。固定化する酵素は固定化酵素を使用
する反応に応じて適宜選択でき、特に限定されるもので
はないが、例えばエステルの合成および交換反応には、
脂質分解酵素であるリパーゼ、ホスホリパーゼ、コレス
テロールエステラーゼ等の各種エステラーゼが使用でき
る。リパーゼとしては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ）
属、リゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ジオトリ
カム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属等の微生物や、動物の
臓器や植物の種子から得られたもの等が挙げられ、水溶
液状のノボザイム５２５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社
製）や、粉末状のリパーゼＡＬ、ＰＬ、ＱＬ（名糖産業
製）、リパーゼＰＳ、Ａ、Ｍ（天野製薬製）、Ｌｉｐｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ（東洋紡製）等の市販品
を純水または緩衝液に溶解して使用できる。ホスホリパ
ーゼとしてはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃ
ｅｓ）属由来のホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣや
酵母由来のホスホリパーゼＡ等が挙げられ、コレステロ
ールエステラーゼとしてはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属由来のもの等が挙げられる。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００４０】（実施例１−１）キョーワード３００ＡＳ
（協和化学工業株式会社製）を９５０℃で２時間焼成
し、比表面積１０７ｍ² ／ｇ、細孔径２０〜４０ｎｍの
多孔構造を有するアルミニウム・マグネシウム複合酸化
物を得た。攪拌器、温度計、酵素水溶液滴下ロートおよ
び真空排気管を備えた３００ｍｌの４つ口フラスコに、
溶媒としてシクロヘキサノン１００ｇを仕込んだ後、担
体として上記アルミニウム・マグネシウム複合酸化物４
ｇを攪拌しながら仕込み、２５℃で１０分間、懸濁状態
を保持した。次いで、系内を３０Ｔｏｒｒの減圧状態に
保ちながら、リパーゼを２％含む酵素水溶液（Ｎｏｖｏ
Ｎｏｒｄｉｓｋ社製、Ｎｏｖｏｚｙｍ−５２５）４ｇ
を１０分間で滴下し、攪拌しながら、水分が留出しなく
なるまで酵素を担体に固定化した。

【００４１】この固定化酵素の活性を測定するため、固
定化時に水分と共に留出したシクロヘキサノンの一部
（１２ｇ相当）を上記フラスコへ補充した後、カプリン
酸メチルエステル９６ｇとメチルグルコシド２０ｇを仕
込み、７０℃、２５Ｔｏｒｒでエステル交換反応を行
い、反応開始から２時間経過後に基質メチルグルコシド
のメチルグルコシドエステルへの転化率を測定したとこ
ろ、８５％であった。

【００４２】（実施例１−２）担体の原料として、キョ
ーワード５００（協和化学工業株式会社製）を用いた以
外は実施例１−１と同様に焼成、固定化およびエステル
交換反応を行ったところ、反応開始から２時間経過後の
転化率は７６％であった。

【００４３】（実施例１−３）溶媒を、表１に示すよう
に変化させた以外は実施例１−１と同様の操作によりリ
パーゼを固定化した後、固定化酵素と溶媒を濾別して、
湿り状態で得られた固定化酵素沈殿物を真空乾燥器で室
温乾燥し、乾燥粉末４．４ｇを得た。この固定化酵素の
活性を測定するため、上記乾燥粉末全量を用いて実施例
１−１と同様のエステル交換反応を行い、反応開始から
２時間経過後の転化率を測定した結果を表１に示す。

【００４４】

【表１】溶媒種類 転化率(%) γ−ブチロラクトン ７５ デカン ６０ エチルベンゼン ６５ １，４−ジオキサン ７８ ２-ヘプタノン ８３ t-ブタノール ７２ β-ピコリン ７０カプリン酸メチル ６５ （実施例１−４）担体原料の焼成温度を種々変化させた
以外は、実施例１−１と同様に酵素の固定化およびエス
テル交換反応を行い、反応開始から２時間経過後の転化
率を測定した。結果を表２に示す。

【００４５】

【表２】担体焼成温度（℃） 転化率（％） ７５０ ８５ ５００ ７７２００ ７２ （実施例１−５）担体の使用量を２ｇにした以外は実施
例１−１と同様に酵素の固定化およびエステル交換反応
を行ったところ、反応開始から２時間後の転化率は８４
％であった。

【００４６】（実施例１−６）本発明による固定化酵素
の耐久性を評価するため、実施例１−１と同様に酵素の
固定化およびエステル交換反応を行い、転化率が９５％
になるまで反応を続けた後、３０℃まで冷却して撹拌を
停止し固定化酵素を沈降させ、上澄の反応液を抜き出し
た。沈降分離した固定化酵素（反応液の一部を含む）を
再度使用して、同様のエステル交換反応および沈降分離
操作を繰り返し、固定化酵素の耐久性を評価した。な
お、固定化酵素の耐久性は基質メチルグルコシドのメチ
ルグルコシドエステルへの転化率が９５％に到達するま
での所要時間で判定した。結果を表３に示す。

【００４７】

【表３】

【００４８】１回目の反応においては、反応溶液中に固
定化されていない酵素が残留していることが考えられる
ため、２回目以降の反応について比較すると、反応所要
時間の増加は殆ど無く、この固定化酵素が優れた耐久性
を有することが示された。

【００４９】（実施例１−７）担体として、天然粘土の
一種であるスメクタイト（主成分；シリカ、マグネシ
ア）粉末を６００℃で２時間焼成したものを用いた以外
は実施例１−１と同様に固定化酵素を調製し、エステル
交換反応を行ったところ、反応開始から２時間経過後の
転化率は４５％であった。

【００５０】（比較例１−１）担体として珪藻土（セラ
イト社製、Ｃｅｌｉｔｅ ５４５）を用い、リパーゼ水
溶液中で固定化を行った。操作手順は、５０ｍｌ三角フ
ラスコに、２％リパーゼ水溶液Ｎｏｖｏｚｙｍ−５２５
を１０ｇ仕込み、イオン交換水１０ｇで希釈した後、Ｃ
ｅｌｉｔｅ ５４５を４ｇ添加し、室温で３時間マグネ
チックスターラー撹拌条件下で担体への固定化を行っ
た。次いで、濾紙濾過を行い、真空乾燥器中で室温乾燥
し、固定化酵素４.５ｇを得た。濾液中に移行した酵素
タンパク量を測定したところ、固定化に使用した全酵素
量のほぼ６０％であり、リパーゼの固定化率は約４０％
であった。

【００５１】上記固定化酵素の活性を測定するため、シ
クロヘキサノン１００ｇにカプリン酸メチルエステル９
６ｇ、メチルグルコシド２０ｇおよび上記固定化酵素全
量を仕込み、７０℃、２５Ｔｏｒｒでエステル交換反応
を行い、反応開始から２時間経過後に生成したメチルグ
ルコシドエステルを測定したところ、転化率は２５％で
あった。

【００５２】（比較例１−２）多孔性樹脂にリパーゼを
固定化した市販の固定化酵素Ｎｏｖｏｚｙｍ−４３５
（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社製）３ｇを使用して実施
例１−６と同様に繰り返し反応における耐久性を評価し
た。結果を表４に示す。

【００５３】

【表４】

【００５４】表４に示すように、反応の繰り返しに伴う
所要時間の増加が著しく、活性の大幅な低下が認められ
た。

【００５５】（実施例２−１）攪拌器、温度計、酵素水
溶液滴下ロートおよび真空排気管を備えた５００ｍｌ４
つ口フラスコに、溶媒としてシクロヘキサノン３００ｇ
を仕込んだ後、担体としてマクロポーラス型吸着樹脂で
あるレバチットＯＣ１０６２（バイエルジャパン株式会
社製）７．５ｇ（乾燥重量）を攪拌しながら仕込んだ。
次いで、系内を３０℃、１５Ｔｏｒｒに保ちながら、リ
パーゼを２％含む酵素水溶液（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ
社製、Ｎｏｖｏｚｙｍ ５２５）１５ｇを１０分間で滴
下し、圧力を１０Ｔｏｒｒに下げ、水分が留出しなくな
るまで攪拌しながら酵素を担体に固定化した。次に固定
化酵素と溶媒を濾別して、湿り状態で得られた固定化酵
素沈殿物を真空乾燥器で室温乾燥し、乾燥状態の固定化
酵素８．３ｇを得た。

【００５６】この固定化酵素に対し、０．１５９Ｍのト
リブチリン乳化液２０ｍｌに所定量のリパーゼ溶液を加
えて、ｐＨ７．０、３０℃の条件下で加水分解反応を５
分間行い、生成した酪酸の量を測定して固定化酵素の活
性を評価したところ、１１ＫＬＵ／ｇであった。ここ
で、酵素活性を評価するために使用する単位ＫＬＵ（Ｋ
ｉｌｏ Ｌｉｐａｓｅ Ｕｎｉｔ）は、上記と同様の反
応条件において１分間に１ｍｍｏｌの酪酸を生成させる
ことのできる酵素量を１ＫＬＵとして定義するものであ
る。

【００５７】（実施例２−２）担体として塩基性炭酸マ
グネシウム（和光純薬社製）を使用した以外は、実施例
２−１と同様にして固定化酵素を調製し、活性を測定し
たところ、１５ＫＬＵ／ｇであった。

【００５８】（実施例２−３）２％リパーゼ水溶液とし
て、粉末状のリパーゼＱＬ（名糖産業株式会社製）を純
水に溶解させたものを使用した以外は実施例２−１と同
様に、レバチットＯＣ１０６２に酵素を固定化し、得ら
れた固定化酵素の活性を測定したところ、７ＫＬＵ／ｇ
であった。

【００５９】（実施例２−４）担体として塩基性炭酸マ
グネシウム（和光純薬社製）を使用した以外は、実施例
２−３と同様にして固定化酵素を調製し、活性を測定し
たところ、９ＫＬＵ／ｇであった。

【００６０】（実施例２−５）攪拌器、温度計、酵素水
溶液滴下ロートおよび真空排気管を備えた５００ｍｌ４
つ口フラスコに、溶媒としてシクロヘキサノン３００ｇ
を仕込んだ後、担体としてマクロポーラス型吸着樹脂で
あるレバチットＯＣ１０６２を７．５ｇ（乾燥重量）攪
拌しながら仕込んだ。次いで、系内を３０℃、１５Ｔｏ
ｒｒに保ちながら、リパーゼを２％含む酵素水溶液Ｎｏ
ｖｏｚｙｍ ５２５を１５ｇ、１０分間で滴下し、水分
が留出しなくなるまで攪拌しながら酵素を担体に固定化
した。上記フラスコからシクロヘキサノン２４０ｇを抜
き出した後、カプリン酸メチルエステル７９ｇとメチル
グルコシド３０ｇを仕込み、７０℃、２５Ｔｏｒｒでエ
ステル交換反応を行い、反応開始から２時間経過後に基
質メチルグルコシドのメチルグルコシドエステルへの転
化率を測定し、酵素活性を評価したところ、転化率は７
５％であった。

【００６１】（実施例２−６）担体としてマクロポーラ
ス型イオン交換樹脂であるダウエックスＭＷＡ−１（ザ
・ダウ・ケミカル・カンパニー製）を使用した以外は、
実施例２−５と同様に固定化酵素の調製およびエステル
交換反応を行い、反応開始から２時間経過後の転化率を
測定したところ、転化率は７２％であった。

【００６２】（実施例２−７）担体として塩基性炭酸マ
グネシウム（和光純薬社製）を使用した以外は、実施例
２−５と同様に固定化酵素の調製およびエステル交換反
応を行い、反応開始から２時間経過後の転化率を測定し
たところ、転化率は８０％であった。

【００６３】（実施例２−８）担体として、表５に示す
各種の無機材料を使用した以外は実施例２−５と同様に
固定化酵素の調製およびエステル交換反応を行った。反
応開始から２時間経過後の転化率を測定した結果を表５
に示す。

【００６４】

【表５】 担体種類 転化率（％） 活性アルミナ （水澤化学工業社製 ＤＮ−１Ａ） ７３ 炭酸カルシウム （和光純薬工業社製） ６７ 酸化マグネシウム（富田製薬社製 トミタ−ＡＤ５００） ８０ 珪藻土 （セライト社製 Celite 545） ６５ ゼオライト （東ソー社製 ゼオラムＦ−９） ５０ （実施例２−９）溶媒を種々変化させた以外は実施例２
−１と同様に、レバチットＯＣ１０６２に酵素を固定化
し、乾燥状態で８．３ｇの固定化酵素を得た。固定化酵
素の活性を測定するため、上記固定化酵素の全量を、攪
拌器、温度計、酵素水溶液滴下ロートおよび真空排気管
を備えた５００ｍｌ４つ口フラスコに、シクロヘキサノ
ン６０ｇ、カプリン酸メチルエステル７９ｇ、メチルグ
ルコシド３０ｇとともに仕込み、７０℃、２５Ｔｏｒｒ
でエステル交換反応を行い、反応開始から２時間経過後
の転化率を測定した。結果を表６に示す。

【００６５】

【表６】溶媒種類 転化率(%) γ-ブチロラクトン ７０ デカン ６２ エチルベンゼン ７６ １，４-ジオキサン ７３ ２-ヘプタノン ７６ t-ブタノール ７５ β-ピコリン ６８カプリン酸メチル ６５ （実施例２−１０）担体として塩基性炭酸マグネシウム
を使用した以外は、実施例２−９と同様に固定化酵素の
調製およびエステル交換反応を行い、反応開始から２時
間経過後の転化率を測定した。結果を表７に示す。

【００６６】

【表７】溶媒種類 転化率(%) γ-ブチロラクトン ８２ デカン ６５ エチルベンゼン ７５ １，４-ジオキサン ７７ ２-ヘプタノン ８０ t-ブタノール ７５ β-ピコリン ７０カプリン酸メチル ６０ （実施例２−１１）担体の使用量を３．７ｇにした以外
は実施例２−５と同様に、レバチットＯＣ１０６２への
酵素の固定化およびエステル交換反応を行ったところ、
反応開始から２時間後の転化率は６９％であった。

【００６７】（実施例２−１２）担体として塩基性炭酸
マグネシウムを使用した以外は、実施例２−１１と同様
に固定化酵素の調製およびエステル交換反応を行ったと
ころ、反応開始から２時間後の転化率は７４％であっ
た。

【００６８】（実施例２−１３）本発明による固定化酵
素の耐久性を評価するため、実施例２−５と同様に、レ
バチットＯＣ１０６２への酵素の固定化およびエステル
交換反応を行い、転化率が９５％になるまで反応を続け
た後、３０℃まで冷却して撹拌を停止し固定化酵素を沈
降させ、上澄の反応液を抜き出した。沈降分離した固定
化酵素（反応液の一部を含む）を再度使用して、同様の
エステル交換反応および沈降分離操作を繰り返し、固定
化酵素の耐久性を評価した。なお、固定化酵素の耐久性
は基質メチルグルコシドのメチルグルコシドエステルへ
の転化率が９５％に到達するまでの所要時間で判定する
こととし、その結果を表８にまとめた。

【００６９】

【表８】

【００７０】１回目は溶媒中に固定化されていない酵素
が残存しているものと考えられるため２回目以降の反応
について比較すると、反応所要時間の増加は殆ど無く、
優れた耐久性を示した。

【００７１】（実施例２−１４）担体として塩基性炭酸
マグネシウムを使用した以外は、実施例２−１３と同様
に固定化酵素の調製および繰り返しエステル交換反応を
行い、固定化酵素の耐久性を評価した。結果を表９に示
す。

【００７２】

【表９】

【００７３】（比較例２−１）５０ｍｌ三角フラスコ
に、２％リパーゼ水溶液Ｎｏｖｏｚｙｍ ５２５を１５
ｇ仕込み、イオン交換水１５ｇで希釈した後、レバチッ
トＯＣ１０６２を７．５ｇ（乾燥重量）添加し、室温で
３時間マグネチックスターラー撹拌条件下で担体への固
定化を行った。次いで、濾紙濾過を行い、真空乾燥器中
で室温乾燥し、乾燥状態の固定化酵素８．０ｇを得た。

【００７４】この固定化酵素の活性を、実施例２−１と
同様の方法で測定したところ、６ＫＬＵ／ｇであった。

【００７５】（比較例２−２）担体として塩基性炭酸マ
グネシウムを用いた以外は、比較例２−１と同様に固定
化酵素の調製および活性評価を行ったところ、この固定
化酵素の活性は７ＫＬＵ／ｇであった。

【００７６】（比較例２−３）５０ｍｌ三角フラスコ
に、０．３ｇの粉末状のリパーゼＱＬと７．５ｇのレバ
チットＯＣ１０６２とを仕込み、シクロヘキサノン３０
ｇを加え、室温で３時間マグネチックスターラー撹拌条
件下で担体への固定化を行った。次いで、濾紙濾過を行
い、真空乾燥器中で室温乾燥し、乾燥状態の固定化酵素
７．８ｇを得た。この固定化酵素の活性を実施例２−１
と同様の方法で測定したところ、０．１ＫＬＵ／ｇであ
った。

【００７７】（比較例２−４）担体として塩基性炭酸マ
グネシウムを用いた以外は、比較例２−３と同様に固定
化酵素の調製および活性評価を行ったところ、この固定
化酵素の活性は０．１ＫＬＵ／ｇであった。

【００７８】（比較例２−５）比較例２−１と同様の操
作によってレバチットＯＣ１０６２に酵素を固定化して
固定化酵素を調製した。固定化酵素の活性を測定するた
め、得られた固定化酵素を、攪拌器、温度計、酵素水溶
液滴下ロートおよび真空排気管を備えた５００ｍｌ４つ
口フラスコに、シクロヘキサノン６０ｇ、カプリン酸メ
チルエステル７９ｇ、メチルグルコシド３０ｇとともに
仕込み、７０℃、２５Ｔｏｒｒでエステル交換反応を行
ったところ、反応開始から２時間経過後の転化率は４５
％であった。

【００７９】（比較例２−６）担体としてダウエックス
ＭＷＡ−１を用いた以外は比較例２−５と同様に固定化
およびエステル交換反応を行った。反応開始から２時間
経過後の転化率を測定したところ、４０％であった。

【００８０】（比較例２−７）担体として塩基性炭酸マ
グネシウムを使用した以外は、比較例２−５と同様に固
定化酵素の調製およびエステル交換反応を行った。反応
開始から２時間経過後の転化率を測定したところ５２％
であった。

【００８１】（比較例２−８）担体として活性アルミナ
ＤＮ−１Ａ（水澤化学工業株式会社製）を用いた以外は
比較例２−５と同様に固定化酵素の調製およびエステル
交換反応を行ったところ、反応開始２時間後の転化率は
４３％であった。

【００８２】（比較例２−９）比較例２−５と同様に、
レバチットＯＣ１０６２に酵素を固定化して調製した固
定化酵素を使用した以外は実施例２−１３と同様にし
て、繰り返し反応における耐久性を評価した。結果を表
１０に示す。

【００８３】

【表１０】

【００８４】（比較例２−１０）比較例２−５と同様
に、塩基性炭酸マグネシウムに酵素を固定化して調製し
た固定化酵素を使用した以外は実施例２−１３と同様に
して、繰り返し反応での耐久性を評価した。結果を表１
１に示す。

【００８５】

【表１１】

【００８６】表１０および１１に示すように、水溶液中
で固定化した固定化酵素は、反応の繰り返しに伴う所要
時間の増加が著しく、活性の大幅な低下が認められた。

【００８７】

【発明の効果】本発明の固定化酵素担体は、比表面積が
大きく、酵素の固定化に適当な大きさの細孔を多数有
し、且つ、機械的強度、耐熱性、耐溶媒性に優れるた
め、反応活性が高く、耐久性に優れた固定化酵素を作製
するうえで好適な担体である。また、本発明によれば、
酵素水溶液と担体とを有機溶媒中で接触させながら水分
を留去して酵素を固定化することにより、酵素と担体と
の結合が強化でき、固定化酵素の耐久性および固定化率
を向上させることができる。また、固定化後の濾過およ
び乾燥操作等を省略できるため酵素活性低下のおそれが
少なく、工業的に極めて合理的なプロセスの構築が可能
になるという利点がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小柳津 敬久 東京都墨田区本所一丁目３番７号ライオン 株式会社内 (72)発明者 伊藤 裕 東京都墨田区本所一丁目３番７号ライオン 株式会社内 (72)発明者 宇野 彰記 東京都墨田区本所一丁目３番７号ライオン 株式会社内 (72)発明者 森 信博 東京都墨田区本所一丁目３番７号ライオン 株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルミニウムとマグネシウムとの複合酸
   化物を主成分とする多孔性無機材料からなることを特徴
   とする固定化酵素担体。
2. 【請求項２】 前記複合酸化物がモル％で表示して下記
   組成を有する請求項１に記載の固定化酵素担体。 ＭｇＯ ： ５０〜９９．５ ％ Ａｌ₂ Ｏ₃ ： ０．５〜５０ ％
3. 【請求項３】 下記式（１）もしくは下記式（２）で示
   される化合物、または前記化合物の水和物を主成分とす
   る多孔性無機材料を焼成して得られることを特徴とする
   固定化酵素担体。 ｘＭｇＯ・Ａｌ₂ Ｏ₃ （１） Ｍｇ_1-y ・Ａｌ_y （ＯＨ）₂ （Ｑ）_y/2 （２） 但し、ｘ＝１〜２００、ｙ＝０．０１〜０．６であり、
   ＱはＣＯ₃ 、ＳＯ₄ 、２ＮＯ₃ または２ＣＨ₃ ＣＯＯで
   ある。
4. 【請求項４】 前記多孔性無機材料を２００〜１０００
   ℃の温度範囲で焼成して得られる請求項３に記載の固定
   化酵素担体。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の固定化
   酵素担体に酵素を固定化した固定化酵素。
6. 【請求項６】 固定化酵素担体と酵素を含む水溶液とを
   有機溶媒中で接触させながら水分を留去することによ
   り、前記固定化酵素担体に前記酵素を固定化した請求項
   ５に記載の固定化酵素。
7. 【請求項７】 固定化酵素担体と酵素を含む水溶液とを
   有機溶媒中で接触させながら水分を留去することによ
   り、前記固定化酵素担体に前記酵素を固定化したことを
   特徴とする固定化酵素。
8. 【請求項８】 前記固定化酵素担体が、マクロポーラス
   型吸着樹脂またはマクロポーラス型イオン交換樹脂であ
   る請求項７に記載の固定化酵素。
9. 【請求項９】 前記固定化酵素担体が、活性アルミナ、
   炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウ
   ム、珪藻土およびゼオライトからなる群より選ばれる少
   なくとも１つの無機材料である請求項７に記載の固定化
   酵素。
10. 【請求項１０】 前記酵素が、脂質分解酵素である請求
    項５〜９のいずれかに記載の固定化酵素。