CN111979212A - 一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法 - Google Patents
一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111979212A CN111979212A CN202010902189.9A CN202010902189A CN111979212A CN 111979212 A CN111979212 A CN 111979212A CN 202010902189 A CN202010902189 A CN 202010902189A CN 111979212 A CN111979212 A CN 111979212A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- substance
- methylimidazole
- acid
- immobilized enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法,通过水相溶液法,以柠檬酸或柠檬酸钠修饰2‑甲基咪唑,再向其中掺杂纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶,离心,所得沉淀即为固定化酶。本发明方法采用水相溶液混合法制备耐酸改性有机金属框架,其操作简单、反应条件温和、原料成本低廉、稳定性高、绿色。且本发明采用掺杂纳米SiO2得到耐酸性的复合纳米材料作为固定化脂肪酶的载体,使得固定化脂肪酶的催化活性、pH耐受性、重复利用率均有显著的提升。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶、纳米材料领域,具体涉及一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法。
背景技术
脂肪酶,具有催化酯交换反应、脂水解反应、转酯反应等能力。脂肪酶的作用温度、pH范围广,耐有机溶剂,催化效率高及对环境友好,使得其在食品加工、医药生产、生物质能及环境治理等领域具有广泛应用。和绝大多数酶在实际工业生产中一样,游离脂肪酶较难分离回收再利用,严重影响了它的大规模生产应用。因此在实际投入工业化生产应用前,都必须按照使用环境被定向设计及固定化改造,改善酶的稳定性和重复使用率。
金属有机框架材料ZIF-8作为酶的固定化载体,由于其极高的比表面积和多孔结构,在生物大分子的固载上有广泛的应用。然而,依靠配位键作用力的ZIF-8材料在酸性环境中耐受性不足;其次直接掺杂其它耐酸材料的策略往往会阻碍晶体的有序生长,限制了ZIF-8材料在酸性催化环境中的进一步拓展。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法。
发明思路:本研究通过使用金属络合剂柠檬酸或柠檬酸钠修饰ZIF-8共沉淀掺杂纳米SiO2的方法,成功构建了具有耐酸层支撑的金属有机框架固定化酶材料。正十二面体结构的ZIF-8材料通过金属络合剂柠檬酸或柠檬酸钠修饰后形成多棱角状的结构,在空间结构上更有利于结合纳米SiO2。得到的复合改性材料在耐酸性上有显著的提升,并能很好保持脂肪酶的在不同催化环境下的催化活性,提高了固定化酶制剂的使用性能。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法,其特征在于,通过水相溶液法,以柠檬酸或柠檬酸钠修饰2-甲基咪唑,再向其中掺杂纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶,离心,所得沉淀即为固定化酶;其中,纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶的添加顺序没有具体的要求。
其中,所述的耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法具体包括如下步骤:
S1:向2-甲基咪唑水溶液中加入柠檬酸或柠檬酸钠,混匀,得到第一溶液;
S2:向第一溶液中加入第一物质,混匀,得到第二溶液;向第二溶液中加入第二物质,混匀,得到第三溶液;再向第三溶液中加入第三物质,混匀,离心,将沉淀物冻干,即得固定化酶;其中,所述的蛋白酶为诺维信公司Lipozyme CALB,酶蛋白浓度为6g/L。
步骤S2中,所述的第一物质、第二物质和第三物质为纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶中的任意一种,且第一物质、第二物质和第三物质均不相同。
步骤S1中,所述的2-甲基咪唑水溶液中2-甲基咪唑的浓度为1~500mmol/L,优选为20mmol/L。
步骤S1中,所述的柠檬酸或柠檬酸钠的终浓度为0.001~0.05mmol/L,优选为0.0175mmol/L。
步骤S2中,所述的纳米二氧化硅的粒径为15~200nm,优选为15nm。
步骤S2中,所述的纳米二氧化硅的终浓度为0.1~10mg/mL,优选为1.5mg/mL。
步骤S2中,所述的锌离子水溶液中锌离子的浓度为5~100mmol/L,优选为40mmol/L。
步骤S2中,所述的第一溶液与锌离子水溶液的体积比为1:1。
步骤S2中,所述的第一溶液与蛋白酶的体积比为1:1~10:1,优选为10:1;其中,所述的蛋白酶为诺维信公司Lipozyme CALB。
步骤S2中,所述的混匀为为室温下在100~1000rpm转速下搅拌5~60min。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优势:
1、本发明方法采用水相溶液混合法制备耐酸改性有机金属框架,其操作简单、反应条件温和、原料成本低廉、稳定性高、绿色。
2、相比传统的ZIF-8合成材料后固定化酶,本发明制备的耐酸改性有机金属框架耐酸性能提升,兼备生物和物理催化活性,明显提高酶的蛋白固载量和酶活收率。
3、掺杂纳米SiO2得到耐酸性的复合纳米材料作为固定化脂肪酶的载体,使得固定化脂肪酶的催化活性、pH耐受性、重复利用率均有显著的提升。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为柠檬酸钠修饰有机金属框架固定化酶的扫描电镜图。
图2为耐酸改性有机金属框架固定化酶的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1柠檬酸钠修饰有机金属框架固定化酶的合成
首先配制20mmol/L浓度的2-甲基咪唑水溶液,再向20mmol/L浓度的2-甲基咪唑溶液加入终浓度为0.0175mg/mL的柠檬酸,得到溶液A。
取50mL的锥形瓶,加入10mL的溶液A与1mL的CALB(酶蛋白浓度为6g/L,诺维信公司Lipozyme CALB),室温下以500rpm的转速搅拌混合15min,然后加入10mL浓度为40mmol/L的ZnSO4水溶液。混合液在室温下以500rpm的转速搅拌30min,通过3次离心洗涤(8000rpm,15min),收集上清测定其中剩余的蛋白浓度。其中材料对于脂肪酶蛋白固载率为87%。最后在真空冷冻干燥机进行干燥处理,得到的固定化脂肪酶SC-CALB。SEM图见图1。
实施例2耐酸改性有机金属框架固定化酶的合成
首先配制20mmol/L浓度的2-甲基咪唑水溶液,再向20mmol/L浓度的2-甲基咪唑溶液加入终浓度为0.0175mg/mL的柠檬酸,得到溶液A。
在溶液A中投入终浓度为1.5mg/mL SiO2固体(麦克林亲水型纳米二氧化硅,粒径:15nm)1000rpm搅拌5min混匀,得到混合溶液B。
取50mL的锥形瓶,加入10mL的溶液B与1mL的CALB(酶蛋白浓度为6g/L,诺维信公司Lipozyme CALB),室温下以500rpm的转速搅拌混合15min,然后加入10mL浓度为40mmol/L的ZnSO4水溶液。混合液在室温下以500rpm的转速搅拌30min,通过3次离心洗涤(8000rpm,15min),收集上清测定其中剩余的蛋白浓度。其中材料对于脂肪酶蛋白固载率为99%。最后在真空冷冻干燥机进行干燥处理,得到的固定化脂肪酶SC-SiO2-CALB。SEM图见图2。
对比例1 ZIF-8固定化脂肪酶的合成
取50mL的锥形瓶,加入10mL 20mmol/L浓度的2-甲基咪唑水溶液与1mL的CALB(酶蛋白浓度为6g/L,诺维信公司Lipozyme CALB),室温下以500rpm的转速搅拌混合15min,然后加入10mL浓度为40mmol/L的ZnSO4水溶液。混合液在室温下以500rpm的转速搅拌30min,通过3次离心洗涤(8000rpm,15min),收集上清测定其中剩余的蛋白浓度。其中材料对于脂肪酶蛋白固载率为90%。最后在真空冷冻干燥机进行干燥处理,得到的固定化脂肪酶ZIF-8-CALB。
对比例2 SiO2固定化脂肪酶的合成
取50mL的锥形瓶,加入10mL 1.5mg/mL SiO2固体(麦克林亲水型纳米二氧化硅,粒径:15nm)水溶液与1mL的CALB(酶蛋白浓度为6g/L,诺维信公司Lipozyme CALB),室温下以500rpm的转速搅拌混合15min。混合液在室温下以500rpm的转速搅拌30min,通过3次离心洗涤(8000rpm,15min),收集上清测定其中剩余的蛋白浓度。其中材料对于脂肪酶蛋白固载率为12%。最后在真空冷冻干燥机进行干燥处理,得到的固定化脂肪酶SiO2-CALB。SiO2固体只能依靠吸附作用实现脂肪酶的固定化,导致酶的大量浪费,不足以作为一款固定化材料去使用。
实施例3固定化酶催化活性分析
由于三乙酸甘油脂是一种结构较为简单的酯类,因此被用来测试游离酶的水解活力。在100mL的锥形瓶中加入50mL去离子水、2g三乙酸甘油脂和10mL的磷酸缓冲液(50mmol/L,pH=7.0),磁力搅拌器强力搅拌10min使其成为乳浊液。通过pH仪测定乳浊液的pH值,稳定后,记录为初始pH值。加入200μL脂肪酶或者脂肪酶制剂(其中脂肪酶蛋白浓度控制为1mg/L),环境温度为40℃。平稳搅拌反应30min后立即加入20mL丙酮-乙醇混合液(v:v=1:1)终止反应。再次测定溶液pH值,然后用0.02mol/L的NaOH溶液缓慢将溶液终了pH值滴定回归pH初始值,记录消耗的NaOH量。
相对活力通过以下公式进行计算:
R(%)=(A/A0)×100%
其中R代表相对活力,A代表由不同固定化脂肪酶CALB每分钟催化三乙酸甘油酯产生的乙酸的摩尔质量,A0代表游离脂肪酶CALB催化三乙酸甘油酯每分钟产生的乙酸的摩尔质量。
经换算,游离的脂肪酶CALB催化活性为100%;SC-CALB催化活性为242%;SC-SiO2-CALB催化活性为206%;ZIF-8-CALB催化活性为83%。
实施例4 pH值对于酶的催化活力的影响
调节反应体系缓冲溶液的pH为4.0(柠檬酸缓冲液,10mM)、5.0(柠檬酸缓冲液,10mM)、6.0(磷酸缓冲液,10mM)、7.0(磷酸缓冲液,10mM)在40℃下测定酶活,根据消耗的NaOH溶液的体积来计算相对酶活。其中,将各种脂肪酶在pH 7.0下的水解活力定义为100%。
经换算,在pH 4时,游离的脂肪酶CALB催化活性为5%;SC-CALB催化活性为22%;SC-SiO2-CALB催化活性为56%;ZIF-8-CALB催化活性为27%。
经换算,在pH 5时,游离的脂肪酶CALB催化活性为21%;SC-CALB催化活性为54%;SC-SiO2-CALB催化活性为71%;ZIF-8-CALB催化活性为63%。
经换算,在pH 6时,游离的脂肪酶CALB催化活性为74%;SC-CALB催化活性为81%;SC-SiO2-CALB催化活性为97%;ZIF-8-CALB催化活性为85%。
这种酸性pH下保持稳定性的能力是由于载体结构中合理引用了耐酸SiO2层,使得在催化反应过程中时载体结构对脂肪酶的起到了很好的保护作用。
实施例5固定化酶重复使用性能
实例3的中的反应进行5个循环,以各种脂肪酶第一次催化活性记为100%。经换算,5个循环后,SC-CALB催化活性为72%;SC-SiO2-CALB催化活性为95%;ZIF-8-CALB催化活性为83%。
综上所述,本发明种一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法,基于金属络合剂柠檬酸钠影响金属有机框架的自组装过程,改变金属有机框架空间上排布,其次利用耐酸SiO2层增强的金属有机框架耐酸性。这种合成策略提升了固定化脂肪酶的催化活性,并且在不同pH的酸性环境中,固定化脂肪酶的耐酸性能得到了增强,此外还提升了固定化脂肪酶的重复利用率。
本发明提供了一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法,其特征在于,通过水相溶液法,以柠檬酸或柠檬酸钠修饰2-甲基咪唑,再向其中掺杂纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶,离心,所得沉淀即为固定化酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:向2-甲基咪唑水溶液中加入柠檬酸或柠檬酸钠,混匀,得到第一溶液;
S2:向第一溶液中加入第一物质,混匀,得到第二溶液;向第二溶液中加入第二物质,混匀,得到第三溶液;再向第三溶液中加入第三物质,混匀,离心,将沉淀物冻干,即得固定化酶;
步骤S2中,所述的第一物质、第二物质和第三物质为纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶中的任意一种,且第一物质、第二物质和第三物质均不相同。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S1中,所述的2-甲基咪唑水溶液中2-甲基咪唑的浓度为1~500mmol/L。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S1中,所述的柠檬酸或柠檬酸钠的终浓度为0.001~0.05mmol/L。
5.据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S2中,所述的纳米二氧化硅的粒径为15~200nm。
6.据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S2中,所述的纳米二氧化硅的终浓度为0.1~10mg/mL。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S2中,所述的锌离子水溶液中锌离子的浓度为5~100mmol/L。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S2中,所述的第一溶液与锌离子水溶液的体积比为1:1。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S2中,所述的第一溶液与蛋白酶的体积比为1:1~10:1。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤S2中,所述的混匀为室温下在100~1000rpm转速下搅拌5~60min。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010902189.9A CN111979212A (zh) | 2020-09-01 | 2020-09-01 | 一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010902189.9A CN111979212A (zh) | 2020-09-01 | 2020-09-01 | 一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111979212A true CN111979212A (zh) | 2020-11-24 |
Family
ID=73447027
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010902189.9A Withdrawn CN111979212A (zh) | 2020-09-01 | 2020-09-01 | 一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111979212A (zh) |
-
2020
- 2020-09-01 CN CN202010902189.9A patent/CN111979212A/zh not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Xie et al. | Immobilized lipase on magnetic chitosan microspheres for transesterification of soybean oil | |
Lin et al. | Magnetic enzyme nanogel (MENG): a universal synthetic route for biocatalysts | |
CN108396023B (zh) | 用研磨法制备磁性mof材料并用于酶的固定 | |
Liu et al. | Immobilization of thermophilic lipase in inorganic hybrid nanoflower through biomimetic mineralization | |
Say et al. | A novel nanoprotein particle synthesis: Nanolipase | |
CN109810969B (zh) | 一种基于镧系核苷酸配合物和dna定向固定技术构建人造多酶系统的方法 | |
CN109576256B (zh) | 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 | |
CN112029756A (zh) | 一种磁性固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯类化合物的方法 | |
CN106582810A (zh) | 一种石墨烯固定酶催化剂的制备方法 | |
CN110862981A (zh) | 一种纳米材料固定化脂肪酶的方法 | |
CN109897846A (zh) | 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用 | |
JP2678341B2 (ja) | 固定化リパーゼ | |
CN104404023A (zh) | 一种磁性载体固定化脂肪酶的制备及其催化制备生物柴油 | |
Gu et al. | Immobilization of Papain onto graphene oxide nanosheets | |
CN108642040B (zh) | 一种可溶-不溶性UCST型PMAAc载体、其固定化酶及应用 | |
CN106939305A (zh) | 一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 | |
WO2024002326A1 (zh) | 双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用 | |
Ma et al. | Fabrication of immobilized bromelain using cobalt phosphate material prepared in deep eutectic solvent as carrier | |
CN111979212A (zh) | 一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法 | |
CN105039299B (zh) | 一种固定化辣根过氧化物酶载体及其制备、应用方法 | |
CN107034206B (zh) | 一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法 | |
CN113403298B (zh) | 一种游离酶的固定化方法 | |
CN113174384B (zh) | 一种固定化酶及其制备方法与在opo制备中的应用 | |
Liu et al. | Novel magnetic cross‐linked lipase aggregates for improving the resolution of (R, S)‐2‐octanol | |
CN1904043A (zh) | 一种纳米磁性壳聚糖固定化酶的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20201124 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |