CN106939305A - 一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 - Google Patents
一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106939305A CN106939305A CN201710234386.6A CN201710234386A CN106939305A CN 106939305 A CN106939305 A CN 106939305A CN 201710234386 A CN201710234386 A CN 201710234386A CN 106939305 A CN106939305 A CN 106939305A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- surfactant
- composite catalyst
- nano
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 83
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 25
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 25
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 16
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 15
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 11
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 claims description 11
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N glycodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 108010031797 Candida antarctica lipase B Proteins 0.000 claims description 2
- 241000321538 Candidia Species 0.000 claims description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 101710098556 Lipase A Proteins 0.000 claims description 2
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229940045946 sodium taurodeoxycholate Drugs 0.000 claims description 2
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 claims description 2
- 101001134452 Sus scrofa Pancreatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 claims 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 abstract description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 abstract description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 abstract 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 5
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 5
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 2
- BXRRQHBNBXJZBQ-UHFFFAOYSA-L dichloromanganese;hydrate Chemical compound O.Cl[Mn]Cl BXRRQHBNBXJZBQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 1
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- PWHCIQQGOQTFAE-UHFFFAOYSA-L barium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ba+2] PWHCIQQGOQTFAE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L cobalt chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Co+2] GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/63—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Catalysts (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用。该方法包括:配制0.01‑1mmol/mL表面活性剂水溶液,室温下,边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清,得混合液;将混合液边搅拌边滴加至0.01‑1 mmol金属离子盐溶液,室温下搅拌反应30‑60 min后得表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂水溶液;将表面活性剂‑酶的纳米复合催化剂水溶液离心,并用去离子水冲洗1‑3次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。本发明采用水相溶液混合法制备,操作简单、周期短、条件温和、成本低廉、酶稳定性高、酶活收率高、载体酶分子结合强度高,尤其适合在水油两相生物催化中的应用。
Description
技术领域
本发明属于酶的固定化技术领域,具体涉及一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用。
背景技术
酶是一类高效专一的生物催化剂,因其具有专一性强、反应条件温和、低污染、催化效率高等优点,在医药、食品、轻工、化工、环保、能源、生物工程等领域有越来越重要的地位。但游离酶由于蛋白结构的不稳定性,极易受外界环境条件的影响而失去催化活性,且回收难、分散性差、难以连续使用,致使其在实际应用中受到很大限制,固定化酶技术的出现克服了上述游离酶的缺点,而且在实际应用中保留了酶原有的催化特性,甚至对酶的稳定性、分散性及酶的催化活性有显著提高。因此,通过设计和制备高效稳定的固定化酶催化剂,提高酶在实际应用过程中的活性、稳定性和可操作性,是生物技术领域重要的研究内容之一,受到学术界和工业界的广泛关注。传统固定化酶一般将酶分子固定化在常规载体材料上,但由于常规载体材料对酶的底物存在较大的传质阻力,传统固定化的表现活性较低。纳米技术为酶固定化这一生物技术传统领域注入了新的活力。高比表面积、较小的传质阻力和丰富的功能性可使得纳米固定化酶催化剂具有高活性和稳定性。
申请号201610236689.7的中国专利公开了一种酶-金属离子纳米复合物及其制备方法,该方法通过控制水溶液中金属离子和酶的浓度形成水溶液中可溶的500 nm~1200 nm的纳米复合物,经干燥即得酶-金属离子纳米复合物。本发明方法操作简单,成本低廉,纳米复合物中酶的稳定性得到显著提高,但酶活基本没有变化,且固定化周期长。
申请号201210390877.7的中国专利公开了一种纳米介质材料的制备方法,以及以该纳米介质材料为载体的固定化酶,该制备方法是常温下,以可进行溶胶-凝胶反应的金属氧化物前驱体为原料与盐酸、水发生缩聚反应的预水解凝胶,通过加碱调pH后加模板剂,室温干燥至恒重即得纳米介质材料,然后以该纳米介质材料为载体实现酶的固定化。
上述及现有的纳米固定化酶催化剂的主要形式是在纳米载体表面或者内部结合酶分子,所制备的纳米固定化酶仍然会给酶催化过程带来一定的底物传质阻力,影响酶的表观活性。采用常温水相表面活性剂-酶-金属离子快速共沉淀固定化酶,相比有机相共沉淀固定化制备的纳米复合体而言,水相体系减少对酶的伤害,使得酶保留更高的催化活性,相比传统的合成材料后固定化酶,共沉淀明显提高酶的蛋白固载量,该表面活性剂-酶纳米复合催化剂兼具酶的生物催化活性和表面活性剂的物理催化活性。因此,采用简便、低成本、绿色、条件温和的方法制备纳米固定化酶的研究十分重要。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用,该方法采用水相溶液混合法制备,操作简单、周期短、条件温和、成本低廉、酶稳定性高、酶活收率高、载体酶分子结合强度高,兼备生物和物理催化活性。
为解决现有技术问题,本发明采取的技术方案为:
一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,表面活性剂改性游离酶
配制0.01-1 mmol/mL表面活性剂水溶液,室温下,边搅拌边以1 mL/s的滴加速率滴加游离酶水溶液至澄清,得混合液;
步骤2,制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂
将混合液边搅拌边滴加速率加至0.01-1 mmol金属离子盐溶液,室温下搅拌反应30-60min后得表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液;
步骤3,将表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液离心,并用去离子水冲洗1-3次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。
作为改进的是,所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸纳和鹅脱氧胆酸钠中任一种。
作为改进的是,所述金属离子为Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Cu2+、Ni2+、Sn2+、Mg2+中任一种。
作为改进的是,所述游离酶为南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种组合,所述游离酶水溶液中游离酶与水的质量比为0.1~1:50。
作为改进的是,步骤1和步骤2中搅拌速度为100~150 rpm。
作为改进的是,步骤1中所述游离酶水溶液的添加量为0.005~1 mL/mL。
作为改进的是,步骤3中离心5~15min,离心时转速为4000~8000 rpm,真空冷冻干燥的真空度为1.3~13 Pa,温度为(-85)~(-10)℃。
基于上述所得表面活性剂-酶纳米复合催化剂在水油两相生物催化中的应用。
与现有技术相比,本发明制备方法操作简单、周期短、成本低廉、反应条件温和、载体酶分子结合强度高。本发明中表面活性剂-酶纳米复合催化剂以沉淀的形式生成,提高了纳米复合催化剂中酶的稳定性和活性,同时兼具生物和物理催化活性,尤其适合用于水相催化、有机相催化、两相催化反应领域。
附图说明
图1为实施例1中脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂的扫描电镜图;
图2为实施例4甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂的扫描电镜图;
图3为实施例1脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂与天然游离酶的相对酶活对比图;
图4位实施例1中脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂与假丝酵母脂肪酶水解葵花籽油生成的脂肪酸含量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,另外,蛋白酶活性的测定方法:以2%(w/v)酪蛋白(0.05 mol/LTris-HCl 缓冲液,pH8.0)为底物,将酶和底物分别于反应前都置于40℃保温10 min,取0.2 mL底物加入到0.2 mL适度稀释的酶液上清中,置于40℃水浴中反应10 min 后,加入0.4 mL终止反应液(三氯乙酸18 g/L),室温下静置15 min,12000 rpm 离心20 min,取上清置于紫外分光光度计中测定280 nm 处吸光值,以反应零时加入终止反应液的样品为空白对照。每单位(U)蛋白酶活定义为,在40℃条件下,1 mg酶蛋白每分钟催化2%(w/v)酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为一个酶活单位(U/mg)。
实施例1
一种脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,表面活性剂改性游离酶
配制0.1 mmol/mL脱氧胆酸水溶液10 mL,室温下,以120 rpm速度边搅拌边以1 mL/s的滴加速率滴加20 mg/mL假丝酵母脂肪酶水溶液2 mL,搅拌至澄清,得混合液;
步骤2,制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂
将混合液边搅拌边以1 mL/s的滴加速率加至0.2 mmol六水合氯化钴水溶液,室温下以120 rpm的速度搅拌反应30 min后得脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂水溶液;
步骤3,将脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂水溶液用8000 rpm的速度离心,并用去离子水冲洗2次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。
本实施例制备的脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂在电镜下的扫描图如图1所示,从图中可以看出,该催化剂为500 nm左右的球状体。通过Bardford法测离心后的上清液中的剩余蛋白浓度的方式,测得该催化剂的酶蛋白负载量为1.6%,另外,本实施例纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高3.8倍,比表面积为29.78 m2/g,平均孔径为18.16 nm。
实施例2
一种脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,表面活性剂改性游离酶
配制0.1 mmol/mL脱氧胆酸水溶液10 mL,室温下,以120 rpm速度边搅拌边以1 mL/s的滴加速率加20 mg/mL木瓜蛋白酶水溶液2 mL,搅拌至澄清,得混合液;
步骤2,制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂
将混合液边搅拌边滴加至0.2 mmol四水合氯化锰水溶液,室温下以120 rpm的速度搅拌反应30 min后得脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂水溶液;
步骤3,将脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂水溶液用8000rpm的速度离心,并用去离子水冲洗2次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。
本实施例制备的脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂,通过Bardford法测离心后上清液中剩余蛋白浓度的方式,测的该催化剂的酶蛋白负载量为0.15%,另外,本实施例纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高1.6倍,比表面积为32.56 m2/g,平均孔径为8.64 nm。
实施例3
一种脱氧胆酸-木瓜蛋白酶- Ba2+纳米复合催化剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,表面活性剂改性游离酶
配制0.1 mmol/mL脱氧胆酸水溶液10 mL,室温下,以120 rpm速度边搅拌边以1 mL/s的滴加速率滴加20 mg/mL木瓜蛋白酶水溶液2 mL,搅拌至澄清,得混合液;
步骤2,制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂
将混合液边搅拌边滴加至0.2 mmol二水合氯化钡水溶液,室温下以120 rpm的速度搅拌反应30 min后得脱氧胆酸-木瓜蛋白酶- Ba2+纳米复合催化剂水溶液;
步骤3,将脱氧胆酸-木瓜蛋白酶- Ba2+纳米复合催化剂水溶液用8000 rpm的速度离心,并用去离子水冲洗2次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。
本实施例制备的脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Ba2+纳米复合催化剂,通过Bardford法测上清液中的剩余蛋白浓度的方式,测的该催化剂的酶蛋白负载量为0.8%,另外,本实施例纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高1.5倍,比表面积为31.21 m2/g,平均孔径为9.89 nm。
实施例4
一种甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,表面活性剂改性游离酶
配制0.1 mmol/mL甘氨脱氧胆酸钠水溶液10 mL,室温下,以120 rpm速度边搅拌边以1mL/s的滴加速率滴加20 mg/mL木瓜蛋白酶水溶液2 mL,搅拌至澄清,得混合液;
步骤2,制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂
将混合液边搅拌边滴加至0.2 mmol四水合氯化锰水溶液,室温下以120 rpm的速度搅拌反应30 min后得脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂水溶液;
步骤3,将脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂水溶液用8000 rpm的速度离心,并用去离子水冲洗2次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。
本实施例制备的甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂,通过Bardford法测离心后上清液中剩余蛋白浓度的方式,测的该催化剂的酶蛋白负载量为0.13%,另外,本实施例纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高1.8倍,比表面积为29.78 m2/g,,平均孔径为8.16 nm。
实施例5
用实施例1所得脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂与假丝酵母脂肪酶在油水两相中水解葵花籽油的催化应用,包括以下步骤:
第一步,取100 mL的锥形瓶,加入40 mLpH7.0的磷酸缓冲液、2 mL的葵花籽油、100 μL的游离CRL或者含有相等蛋白含量的CRL-MSNC;
第二步,将步骤1中得到的混合物,水浴45°C,以120 rpm的速率搅拌反应;
第三步,搅拌反应180 min后,用0.02 mol/L的NaOH溶液滴定反应生成的脂肪酸,其中使用酚酞作为指示剂。
通过滴定消耗的NaOH溶液的含量来计算出葵花籽油水解生成的脂肪酸总量,测得脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂可以催化水解葵花籽油生成0.88 mmol的脂肪酸,是假丝酵母脂肪酶催化生成脂肪酸量的4倍,验证了本发明制备得到的表面活性剂-酶纳米复合催化剂在油水两相中有更优越的催化效率。
通过实施例1-4可以看出,本发明的制备方法条件温和,绿色环保,简单快速,固定化酶的酶活较高,载体与酶分子结合强度高,不同的表面活性剂-金属离子对不同的酶有不同的作用效果,脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-Co2+纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高3.8倍,脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高1.6倍,脱氧胆酸-木瓜蛋白酶- Ba2+纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高1.5倍,甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-Mn2+纳米复合催化剂中酶的相对活力较游离酶提高1.8倍,通过实施例5可以看出,本发明制备得到的表面活性剂-酶纳米复合催化剂在油水两相生物催化中有更优越的催化效率,有着广泛的应用前景。
Claims (8)
1.一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,表面活性剂改性游离酶
配制0.01-1 mmol/mL表面活性剂水溶液,室温下,边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清,得混合液;
步骤2,制备表面活性剂-酶的纳米复合催化剂
将混合液边搅拌边滴加至0.01-1 mmol金属离子盐溶液,室温下搅拌反应30-60 min后得表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液;
步骤3,将表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液离心,并用去离子水冲洗1-3次,洗去未吸附的游离酶,真空冷冻干燥至恒重即可。
2.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸纳、鹅脱氧胆酸钠中任一种。
3.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,所述金属离子为Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Cu2+、Ni2+、Sn2+、Mg2+中任一种。
4.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,所述游离酶为南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种组合,所述游离酶水溶液中游离酶与水的质量比为0.1~1:50。
5.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,步骤1和步骤2中搅拌速度为100~150 rpm。
6.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,步骤1中所述游离酶水溶液的添加量为0.005~1 mL/mL。
7.根据权利要求1所述的一种表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法,其特征在于,步骤3中离心5~15 min,离心时转速为4000~8000 rpm,真空冷冻干燥的真空度为1.3~13Pa,温度为(-85)~(-10)℃。
8.基于权利要求1所得的表面活性剂-酶纳米复合催化剂在水油两相生物催化中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710234386.6A CN106939305A (zh) | 2017-04-12 | 2017-04-12 | 一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710234386.6A CN106939305A (zh) | 2017-04-12 | 2017-04-12 | 一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106939305A true CN106939305A (zh) | 2017-07-11 |
Family
ID=59464201
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710234386.6A Pending CN106939305A (zh) | 2017-04-12 | 2017-04-12 | 一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106939305A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107299096A (zh) * | 2017-06-21 | 2017-10-27 | 南京工业大学 | 一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
CN110257362A (zh) * | 2019-06-04 | 2019-09-20 | 开平牵牛生化制药有限公司 | 一种胆酸及其衍生物表面活性剂修饰金属有机骨架纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
CN110643592A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-03 | 南京工业大学 | 一种胆酸盐-金属离子复合修饰全细胞的方法及其应用 |
CN110862981A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-03-06 | 南京工业大学 | 一种纳米材料固定化脂肪酶的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105734038A (zh) * | 2016-01-22 | 2016-07-06 | 南京工业大学 | 一种酶-GO-MOFs纳米复合催化剂及其制备方法 |
CN105754985A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-07-13 | 清华大学 | 一种酶-金属离子纳米复合物及其制备方法 |
-
2017
- 2017-04-12 CN CN201710234386.6A patent/CN106939305A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105734038A (zh) * | 2016-01-22 | 2016-07-06 | 南京工业大学 | 一种酶-GO-MOFs纳米复合催化剂及其制备方法 |
CN105754985A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-07-13 | 清华大学 | 一种酶-金属离子纳米复合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
XUN CAO ET AL.,: "Encapsulation of enzymes in metal ion–surfactant nanocomposites for catalysis in highly polar solvents", 《CHEMCOMM》 * |
XUN CAO ET AL.,: "Increasing the hydrolytic activity of lipase in oil/water two-phase system using surfactant–enzyme nanocomposite", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
李盛贤: "《生物化学 第2版》", 31 July 2006, 哈尔滨工业大学出版社 * |
章亭洲 等: "脂肪酶改性对其在有机相中催化特性的影响", 《浙江大学学报》 * |
陈明雄: "《生物化学 供护理及相关医学专业用》", 31 August 2009, 中国医药科技出版社 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107299096A (zh) * | 2017-06-21 | 2017-10-27 | 南京工业大学 | 一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
CN107299096B (zh) * | 2017-06-21 | 2020-05-12 | 南京工业大学 | 一种咪唑及其衍生物修饰表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
CN110257362A (zh) * | 2019-06-04 | 2019-09-20 | 开平牵牛生化制药有限公司 | 一种胆酸及其衍生物表面活性剂修饰金属有机骨架纳米复合催化剂的制备方法与应用 |
CN110643592A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-03 | 南京工业大学 | 一种胆酸盐-金属离子复合修饰全细胞的方法及其应用 |
CN110862981A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-03-06 | 南京工业大学 | 一种纳米材料固定化脂肪酶的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106939305A (zh) | 一种表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法与应用 | |
Poorakbar et al. | Synthesis of magnetic gold mesoporous silica nanoparticles core shell for cellulase enzyme immobilization: improvement of enzymatic activity and thermal stability | |
Seenuvasan et al. | Magnetic nanoparticles: a versatile carrier for enzymes in bio‐processing sectors | |
Talekar et al. | Porous cross linked enzyme aggregates (p-CLEAs) of Saccharomyces cerevisiae invertase | |
Mohammadi et al. | Rapid and high-density covalent immobilization of Rhizomucor miehei lipase using a multi component reaction: application in biodiesel production | |
Wu et al. | Preparation and characterization of tannase immobilized onto carboxyl-functionalized superparamagnetic ferroferric oxide nanoparticles | |
WO2007112679A1 (fr) | Nanoparticules de fibroïne de soie fixées par enzyme et procédé de production correspondant | |
CN110468120A (zh) | 一种含漆酶的铜纳米花及其制备方法 | |
CN107164358A (zh) | 一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法及其应用 | |
CN104894094A (zh) | 一种酶固定化方法及酶制剂 | |
CN106582810A (zh) | 一种石墨烯固定酶催化剂的制备方法 | |
Torabizadeh et al. | Inulin hydrolysis by inulinase immobilized covalently on magnetic nanoparticles prepared with wheat gluten hydrolysates | |
Zhuang et al. | Immobilization of lipase onto dopamine functionalized magnetic nanoparticles | |
CN104164414A (zh) | 酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物及其制备方法 | |
Gu et al. | Immobilization of Papain onto graphene oxide nanosheets | |
CN106542568B (zh) | 一种固定化酶、固定化酶载体及其制备方法 | |
Anwar et al. | Smart chemistry and applied perceptions of enzyme-coupled nano-engineered assemblies to meet future biocatalytic challenges | |
Hojnik Podrepšek et al. | The synthesis of (magnetic) crosslinked enzyme aggregates with laccase, cellulase, β-galactosidase and transglutaminase | |
CN107522239A (zh) | 一种基于没食子酸‑金属离子配位化学调控纳米四氧化三铁分散度及粒径的方法 | |
Adalberto et al. | Immobilization of pectinase from Leucoagaricus gongylophorus on magnetic particles | |
CN107511151B (zh) | 一种蛋白质水解催化剂碳量子点/氧化亚铜复合物(CQDs/Cu2O)及其应用 | |
CN105039299B (zh) | 一种固定化辣根过氧化物酶载体及其制备、应用方法 | |
CN107034206A (zh) | 一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法 | |
CN107937387B (zh) | 一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法 | |
Graebin et al. | Preparation and characterization of cross-linked enzyme aggregates of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides B-512F |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170711 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |