CN107937387B - 一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法 - Google Patents

一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：(1)采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；(2)将脂肪酶和界面激活剂溶解于缓冲溶液中得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应；所述界面激活剂包括吐温、蔗糖酯、正己醇、正己烷、曲拉通X‑100和十二烷基硫酸钠中的至少一种；(3)固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。本发明制备的固定化脂肪酶具有高效、稳定、分散性好和容易回收等优点。

Description

一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域，尤其涉及一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法。
背景技术
脂肪酶(三酰甘油酰基水解酶，E.C.3.1.1.3)是自然界普遍存在的水解三酰基甘油酯键的酶。脂肪酶是一种广泛应用于食品、医药等化工行业的生物催化剂。脂肪酶具有“盖子”结构，其构象变化与脂肪酶的活化密切相关。在酶的封闭构象异构体中，活性位点完全埋在α螺旋的“盖子”下。脂肪酶“盖子”的打开，导致其活性中心的暴露，表现出催化活力，称为“界面活化”。
近年来脂肪酶在生物催化工业中的使用显著增长，特别是食品工业。但是，商业化脂肪酶的高成本以及低的操作稳定性被认为是推广脂肪酶大规模使用的主要制约因素。酶的固定化是规避上述缺点的一种相对较简单的方法。脂肪酶以及其他酶可以通过合理的固定获得更高的活力，更好的稳定性，选择性以及其他性能的改进。然而，酶的固定并不能很好的改善酶的性能。据报道，许多不适当的固定化过程导致了酶的性能的削弱，如活性损失(
Figure BDA0001510444600000011
C.，et al.Immobilized heterologous Rhizopus oryzae lipase：A feasiblebiocatalyst for the production of human milk fat substitutes.BiochemicalEngineering Journal，2012，67：104-110；RedekerS.E.，et al.Protein engineering fordirected immobilization.Bioconjug Chem，2013，24(11)：1761-77.)。固定化过程中酶活力的降低可能是由于固定化过程中酶的构象发生了变化或者固定化酶的在催化反应中存在传质限制。对于脂肪酶，不适当的固定化过程时常导致固定化酶活力的损失，因为大多数固定是随机的，导致脂肪酶的“盖子”被掩盖。为了解决这个问题，提出了通过修饰蛋白进行定向固定以实现位点定向固定化(Blank K.，Morfill J.andGaub H.E.，Site-specificimmobilization of genetically engineered variants of Candida antarcticalipase B.Chembiochem，2006，7(9)：1349-51；Redeker S.E.，et al.，Proteinengineering for directed immobilization.Bioconjug Chem，2013，24(11)：1761-77.)。表面活性剂的添加可以打开脂肪酶的“盖子”并保持其打开的状态。脂肪酶可以以这种“盖子”打开的状态被固定化，使固定化酶的活性增加，这种方法被称为“分子印迹”。
目前纳米颗粒(碳纳米管，纳米尺寸二氧化硅，磁性纳米粒子等)在酶工程中的应用引起了人们的极大关注，它们为酶固定化提供了许多独特和有利的物理化学能力。其中，磁性纳米粒子(Fe3O4)由于其生物相容性好、稳定性好、比表面积大和超顺磁性而引起了人们极大兴趣。
发明内容
本发明提供了一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，制备的固定化脂肪酶具有高效、稳定、分散性好和容易回收等优点。
本发明提供了如下技术方案：
一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；
(2)将脂肪酶和界面激活剂溶解于缓冲溶液中得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应；
所述界面激活剂包括吐温、蔗糖酯、正己醇、正己烷、曲拉通X-100和十二烷基硫酸钠中的至少一种；
(3)固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。
本发明的脂肪酶固定化方法以纳米四氧化三铁为载体，通过添加界面激活剂实现对脂肪酶的定向固定化，提高脂肪酶的水解活力。
优选的，步骤(1)包括：
(1-1)将二价铁盐和三价铁盐溶解于去离子水中并加热至60～100℃，在惰性气体保护下加入氨水使铁盐水溶液的pH至10～11，保温反应，得到纳米四氧化三铁；
(1-2)将纳米四氧化三铁加入到乙醇水溶液中，再向乙醇水溶液中加入硅烷偶联剂对纳米四氧化三铁进行修饰，得到氨基化的纳米四氧化三铁；
所述的硅烷偶联剂为3-氨丙基-三乙氧基硅烷，纳米四氧化三铁与3-氨丙基-三乙氧基硅烷的质量比为1∶1～4；
修饰温度为20～30℃；
(1-3)采用戊二醛水溶液对氨基化的纳米四氧化三铁进行修饰，得到表面带有醛基纳米四氧化三铁；
所述戊二醛水溶液中，戊二醛的体积百分比浓度为1～5％。
步骤(2)中：
优选的，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶的浓度为1～12mg/ml。
进一步优选的，脂肪酶的浓度为3～8mg/ml；再优选的，脂肪酶的浓度为5～6mg/ml。
固定化脂肪酶的相对活力随酶浓度的增加先升高后降低，酶浓度为3～8mg/ml时，酶相对活力较高，酶浓度为6mg/ml时酶相对活力达到最高。而蛋白回收率则随酶浓度的增加而逐渐降低。
界面激活剂可以打开脂肪酶的“盖子”并保持其打开的状态，脂肪酶可以以这种“盖子”打开的状态被固定化，使固定化脂肪酶的活性增加。
优选的，固定化溶液中，界面激活剂的浓度为0.5～10％。
固定化脂肪酶的活力随着界面激活剂浓度的增大而升高，但是当界面激活剂的添加量过大时，界面激活剂在固定化溶液中不能完全溶解，严重影响固定化过程，且固定化脂肪酶的活力随着界面激活剂添加量的增加而趋于平稳，因此，进一步优选的，界面激活剂的浓度为2～5％；最优选的，界面激活剂的浓度为3％。
当界面激活剂为固态时，界面激活剂的浓度是指质量体积分数；当界面激活剂为液态时，界面激活剂的浓度是指体积分数。
优选的，所述的界面激活剂为吐温和/或蔗糖酯；
所述的吐温为吐温20、吐温60和吐温80中的至少一种；所述的蔗糖酯为蔗糖酯SE-11和/或蔗糖酯SE-15。
进一步优选的，所述的界面激活剂为蔗糖酯SE-11。蔗糖酯SE-11对固定化脂肪酶活力的提升最大。
优选的，所述的缓冲溶液的pH为4～8.5。
固定化脂肪酶的活性随着固定化过程中固定化溶液的pH值的增加而增加，pH达到一定值后，固定化脂肪酶的活性反而随着固定化溶液的pH值的增加而降低，因此，进一步优选的，缓冲溶液的pH为5～7；最优选的，缓冲溶液的pH为6.5。
优选的，固定化时间为1～12h。
在固定化过程中，脂肪酶蛋白与载体共价结合的速度很快，随着固化时间的增加，载体上交联的脂肪酶蛋白越来越多。
进一步优选的，固定化时间为1～6h。固定化1h后，载体上脂肪酶的交联速率下降，固定化6h时，载体上的脂肪酶基本饱和。
在固定化时，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶与载体的质量比为1∶10～50。
脂肪酶的筛选目标是获得对甘油1，3位羟基酯化的高选择性，具体为筛选各种商业化脂肪酶催化油酸与甘油的酯化反应，获得1，3位选择性最高的脂肪酶。
所述的脂肪酶为米根霉脂肪酶(脂肪酶ROL)、米赫根毛霉脂肪酶、Lipozyme CALB、Palatase 20000L脂肪酶和Xhlip-O脂肪酶中的至少一种。
米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶购自于sigma-aldrich公司，Lipozyme CALB、Palatase 20000L脂肪酶购自于Novozyme公司，Xhlip-O脂肪酶购自于杭州馨海生物科技有限公司。
优选的，所述的脂肪酶为米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶或Lipase RM-IM脂肪酶；最优选的，所述的脂肪酶为米根霉脂肪酶。
步骤(3)中，固定化溶液中，戊二醛的体积百分比浓度为1～5％。
一种优选的技术方案为：
一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；
(2)将脂肪酶和界面激活剂溶解于pH值为5～7的缓冲溶液中，得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应1～6h；
脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶的浓度为5～6mg/ml；脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶与载体的质量比为1∶10～50；
所述界面激活剂为吐温和/或蔗糖酯；所述的吐温为吐温20、吐温60和吐温80中的至少一种；所述的蔗糖酯为蔗糖酯SE-11和/或蔗糖酯SE-15；
界面激活剂的浓度为2～5％；
所述的脂肪酶为米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶或Lipozyme CALB脂肪酶；
(3)固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。
该优选方案的固定化方法固定化效率较高，制备的固定化脂肪酶的水解活力较好。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的固定化方法显著提高了脂肪酶的水解活力，与游离脂肪酶相比，在最佳工艺参数条件下制备的固定化脂肪酶的对对硝基苯酚丁酸酯的水解活力提高了16.6倍；
(2)固定化脂肪酶的载体为四氧化三铁，由于氧化三铁的磁性，使固定化酶的回收更佳简便容易。
附图说明
图1为纳米四氧化三铁的扫描电镜图，其中：(a)为修饰前的四氧化三铁的扫描电镜图，(b)为修饰后的四氧化三铁的扫描电镜图；
图2为固定化pH对固定化脂肪酶性能的影响，其中：(a)为不同pH时的蛋白结合量和蛋白回收率，(b)为不同固定化pH时得到固定化脂肪酶的相对活力；
图3为脂肪酶浓度对固定化脂肪酶性能的影响，其中：(a)为不同脂肪酶浓度时的蛋白结合量和蛋白回收率，(b)为不同脂肪酶浓度时得到固定化脂肪酶的相对活力；
图4为蔗糖酯SE-11浓度对固定化脂肪酶性能的影响，其中：(a)为不同蔗糖酯SE-11浓度时的蛋白结合量和蛋白回收率，(b)为不同蔗糖酯SE-11浓度时得到固定化脂肪酶的相对活力；
图5为不同固定化时间时的蛋白结合量和蛋白回收率；
图6为不同pH时固定化脂肪酶和游离脂肪酶比活力的对比；
图7为固定化脂肪酶和游离脂肪酶对不同碳链长度的对硝基苯脂肪酸的水解活力对比；
图8为固定化脂肪酶和游离脂肪酶的热稳定性对比，其中，(a)为游离脂肪酶的热稳定性图，(b)为固定化脂肪酶的热稳定性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1纳米Fe3O4的合成
将11.75g FeCl3·6H2O、5.97g FeSO4·7H2O溶解在250ml去离子水中，加热至80℃，在快速搅拌下迅速加入14ml氨水，在氮气保护下保持2h。将沉淀用去离子水清洗至水溶液至中性，得到Fe3O4。其透射电镜如图1(a)所示。
将得到的Fe3O4加入500ml 80％的乙醇，在30℃下缓慢加入20ml APTES(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)，室温下反应12h，分别用去离子水和乙醇清洗三次得到氨基化的Fe3O4。将氨基化的Fe3O4加入到100ml 2％的戊二醛溶液中，在30℃下反应2h，清洗并冻干可得到约5g表面带有醛基的Fe3O4。其透射电镜如图1(b)所示。
由图1(a)和图1(b)可知，四氧化三铁磁性颗粒在经过APTES包覆后，粒径并没有明显增大，但是呈现出了更好的分散性，这是由于粒子表面形成了一层很薄的SiO2薄层。
实施例2～10不同界面激活剂的添加对固定化脂肪酶活力的影响
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量为10.5％)溶于25ml pH6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入终浓度为1％(界面激活剂为固体时，该百分数为w/v％；界面激活剂为液体时，该百分数为v/v％)不同的界面激活剂，搅拌使酶粉溶解，再加入2g实施例1制备的活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h后，加入终浓度为1％(v/v)的戊二醛，继续反应2h。用强磁铁分离得到的固定化脂肪酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及界面激活剂，得到四氧化三铁固定化脂肪酶。
脂肪酶的活力采用对P-NPB(对硝基苯酚丁酸酯)的水解活力来表示。一个酶活力单位定义为每分钟水解释放1μmol P-NP(对硝基苯酚)的酶量。
固定化过程中添加的界面激活剂对固定化脂肪酶活力的影响见表1。
表1固定化过程中界面激活剂对固定化脂肪酶活力的影响
Figure BDA0001510444600000071
根据表1结果可知，在固定化过程中添加界面激活剂可以大大提高固定化脂肪酶的活力；在固定化过程中添加蔗糖酯SE-11对固定化酶的活力提高影响最大，制备的固定化脂肪酶的比活力是对照组的5.6倍。
实施例11～18不同pH值对固定化脂肪酶活力的影响
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量为10.5％)溶于25ml pH分别为4、5、6、6.5、7、7.5、8和8.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入终浓度为1％(w/v)的蔗糖酯SE-11，搅拌使酶粉溶解，再加入2g实施例1制备的活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h后，加入终浓度为1％(v/v)的戊二醛，继续反应2h。用强磁铁分离得到的固定化脂肪酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及界面激活剂，得到四氧化三铁固定化脂肪酶。
测定各个实施例中蛋白回收率、蛋白结合量以及四氧化三铁固定化脂肪酶的相对活力(定义各组条件优化过程中得到的固定化酶比活力最高的相对活力为100％，其他条件下得到的固定化酶相对活力为与最高值比较的百分比)，结果见图2(a)和图2(b)。根据图2(a)和图2(b)可知，固定化pH为6.5时制备得到的四氧化三铁固定化脂肪酶活力较好。
在考虑固定化酶相对活力的时候，同时参考蛋白结合量和蛋白回收率，优化的条件需保证一定的蛋白回收率。
实施例19～26不同酶蛋白浓度对固定化脂肪酶活力的影响
取不同质量的米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量为10.5％)溶于25ml pH分别为6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，使溶液中蛋白浓度分别为1.1、2.2、3.2、4.2、5.3、6、8.4、10.5mg/ml，加入终浓度为1％(w/v)的蔗糖酯SE-11，搅拌使酶粉溶解，再加入2g实施例1制备的活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h后，加入终浓度为1％(v/v)的戊二醛，继续反应2h。用强磁铁分离得到的固定化脂肪酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及界面激活剂，得到四氧化三铁固定化脂肪酶。
测定各个实施例中蛋白回收率、蛋白结合量以及四氧化三铁固定化脂肪酶的相对活力，结果见图3(a)和图3(b)。根据图3(a)和图3(b)可知，蛋白浓度为6mg/ml时制备得到的四氧化三铁固定化脂肪酶活力较好。
实施例27～34不界面激活剂浓度对固定化脂肪酶活力的影响
取米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量为10.5％)溶于25ml pH分别为6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，使溶液中酶蛋白浓度为6mg/ml，加入不同质量的蔗糖酯SE-11，使溶液中蔗糖酯SE-11的终浓度分别为1、1.5、2、3、5、6、8、10％(w/v)的蔗糖酯SE-11，搅拌使酶粉溶解，再加入2g实施例1制备的活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h后，加入终浓度为1％(v/v)的戊二醛，继续反应2h。用强磁铁分离得到的固定化脂肪酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及界面激活剂，得到四氧化三铁固定化脂肪酶。
测定各个实施例中蛋白回收率、蛋白结合量以及四氧化三铁固定化脂肪酶的相对活力，结果见图4(a)和图4(b)。根据图4(a)和图4(b)可知，固定化酶的相对活力随着蔗糖酯SE-11的增加而升高，但是当蔗糖酯SE-11的添加量大于3％(w/v)后，蔗糖酯SE-11的在体系中不能完全溶解，严重影响固定化过程，且固定化酶相对活力随蔗糖酯SE-11的加入量增加而趋于平稳。
实施例35～40
取米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量为10.5％)溶于25ml pH分别为6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，使溶液中酶蛋白浓度为6mg/ml，加入终浓度为1％(w/v)的蔗糖酯SE-11，搅拌使酶粉溶解，再加入2g实施例1制备的活化的四氧化三铁，在20℃下分别搅拌反应1、2、4、6、10、12h后，加入终浓度为1％(v/v)的戊二醛，继续反应2h。用强磁铁分离得到的固定化脂肪酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及界面激活剂，得到四氧化三铁固定化脂肪酶。
测定各个实施例中蛋白回收率、蛋白结合量，结果见图5。根据图5可知，固定化过程中，酶蛋白与载体共价结合的速度很快，当固定化时间为4h时，载体共价交联的蛋白已经基本饱和。
测试例
分别在pH为5、6、6.5、7、7.5、8、8.5下，测试实施例37制备的四氧化三铁固定化脂肪酶与游离酶的比活力，结果如图6所示。
由图6可以看出，在pH为5～8.5的范围内，固定化脂肪酶的比活力远远高于游离酶的比活力。pH为6.5时，固定化脂肪酶的比活力最好。
固定化脂肪酶与游离酶对不同碳链长度的对硝基苯酚脂肪酸酯的水解活力如图7所示。
由图7可以看出，游离酶和固定化酶对短链脂肪酸的催化能力更高，且固定化酶的催化能力比游离酶高。与游离酶相比，固定化脂肪酶对对硝基苯酚丁酸酯的水解活力提高了16.6倍。
在30、40、45、50、55℃下，分别测定固定化脂肪酶与游离酶的残留活力，结果如图8(a)和图8(b)所示。
由图8(a)和图8(b)可知，与游离酶相比，固定化脂肪酶具有较好的热稳定性。
综上，通过本发明的固定化方法定向固定的脂肪酶活力得到很大的提升，并且酶的热稳定性以及操作稳定性也得到了较大的提升。同时，固定化酶具有稳定的磁性，可以使用磁铁快速分离，省去了过滤以及离心分离等步骤，提高了生产效率，降低了生产成本。

Claims (6)

1.一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；
（2）将脂肪酶和界面激活剂溶解于缓冲溶液中得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应；
所述界面激活剂为蔗糖酯SE-11；界面激活剂的浓度为2~5%；缓冲溶液的pH为5~7；
（3）固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：
（1-1）将二价铁盐和三价铁盐溶解于去离子水中并加热至60~100℃，在惰性气体保护下加入氨水使铁盐水溶液的pH至10~11，保温反应，得到纳米四氧化三铁；
（1-2）将纳米四氧化三铁加入到乙醇水溶液中，再向乙醇水溶液中加入硅烷偶联剂对纳米四氧化三铁进行修饰，得到氨基化的纳米四氧化三铁；
（1-3）采用戊二醛水溶液对氨基化的纳米四氧化三铁进行修饰，得到表面带有醛基纳米四氧化三铁。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1-2）中，所述的硅烷偶联剂为3-氨丙基-三乙氧基硅烷，纳米四氧化三铁与3-氨丙基-三乙氧基硅烷的质量比为1:1~4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶的浓度为1~12mg/ml。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶与载体的质量比为1:10~50。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化时间为1~12h。
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