CN113174384B - 一种固定化酶及其制备方法与在opo制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化酶及其制备方法与在制备OPO中的应用。本发明所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：将磁性载体和脂肪酶分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在20～60℃下反应1～6h，得到所述固定化酶；所述磁性载体为多巴胺修饰的铁酸锌。本发明将铁酸锌磁性颗粒作为磁性核心，利用多巴胺对铁酸锌表面进行修饰得到所述磁性载体，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性载体表面，得到固定化酶，并将其用于催化合成OPO中，OPO的转化率可高达38％。本发明所述固定化酶，具有优异的稳定性，良好的催化能力，改善了脂肪酶的热稳定性，对婴儿配方奶粉中添加剂的合成起到重要作用。

Description

一种固定化酶及其制备方法与在OPO制备中的应用
技术领域
本发明属于酶固定化技术领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法与在制备OPO中的应用。
背景技术
酶是催化生物和化学反应的一种蛋白质，具有催化活性高、选择性强、专一性好、成本低、反应条件温和以及可被生物降解等优点。因此酶在精细化学、药物化学、食品或能源等各个领域都有很高的应用。生物催化过程作为一种合理、高效的转化方法受到了广泛的关注。酶促工艺在支持可持续绿色化工中的发挥了重要作用。然而，天然酶在实际应用中普遍操作和储存稳定性较差、酶的回收和重复利用困难、成本高，而且还会受到反应液的影响。因此，固定化在酶催化中是常用的改善方法。
在实际应用中，固定化酶在稳定性、生物催化剂负载、可回收性等方面具有优势。固定化是成功实现以酶为基础的工业过程的关键技术，特别是用于生产绿色和可持续能源或生物衍生的催化转化化学品(工业化)。酶的固定化可以改变酶的活性、特异性或选择性，这为增加酶在底物上的可用性提供了一个良好的基础。如今，多巴胺仿生修饰磁性纳米材料已经被开发为制备酶固定化载体的便捷方法了。
磁性纳米材料主要是因为其具有比表面积，而且能通过外加磁场轻易地回收重复使用，从而优化了操作成本，提高了产品的纯度。磁性纳米材料通常不会直接用作酶的固定化载体，会与其他一些材料，如高分子聚合物、介孔硅、氧化石墨烯等材料，形成不同的磁性复合材料，以此作为固定化载体。Mosayebi等以辛基官能化的磁性氧化石墨烯纳米复合材料(GO-Fe3O4)为载体，对VII型念珠菌脂肪酶(CRL7)进行固定化。实验结果表明相对于游离酶(34.5U·mg-1脂肪酶)，固定在此载体上的脂肪酶具有94.7％的酶活保留率，酯交换反应的转化率为89％，在10个循环后保留的活性为63％。Zhou等研究合成一种简单的核壳磁性COF复合材料(Fe3O4@COF-OME)，以其为载体对RML(根茎脂肪酶)进行固载，应用在生物柴油生产中。结果表明，该方法合成载体材料具有外在的磁性，能很好地分散在水介质中，并能促进脂肪酶的附着。Fe3O4@COF-OME磁性核壳结构不仅很大程度上保持了脂肪酶的活性，而且具有较高的固定化效果和回收利用效果。在优化条件下以麻疯树油为原料，生物柴油的转化率约为70％。
多巴胺(DA)是一种典型的儿茶酚胺类有机化合物，其结构与贻贝蛋白的基本粘附成分相似，可以作为材料表面改性剂。DA可以在碱性条件下(pH>7.5)以氧气为氧化剂自聚成聚多巴胺(PDA)，从而在几乎所有有机和无机材料表面上形成具有可控制的厚度和良好粘合性能的纳米级PDA膜，使其成为一种多功能的涂料。而且，PDA的化学结构中存在许多官能团(例如胺，亚胺和邻苯二酚)，使其很容易通过与官能团的共价键合而将生物大分子固载在其表面。多巴胺几乎可以充当所有有机、无机材料的表面改性剂，因而在修饰功能化酶载体方面具有广泛的应用。多巴胺修饰载体材料后可以通过温和的条件、简单步骤将酶固定起来。Ariaeenejad等用磁铁矿纳米颗粒和多巴胺对纤维素纳米晶(CNCs)进行功能化，制备出用于共价结合固定化水解酶混合物(三种纤维素酶，两种半纤维素酶及其组合)的纳米载体(DA/Fe3O4 NPs@CNCs)。实验结果显示该固定化酶具有更高的最佳温度
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更高的热稳定性，以及最佳pH向碱性的转变。共价结合可以成功抑制酶的浸出，并提供多达10个循环后仍能轻松回收再利用，初始活性可达50％以上。
多巴胺仿生修饰磁性纳米材料在固定化酶中的应用，不仅对固定化酶的活性影响较小，而且可以提升酶的热稳定性、耐酸碱性等性能，说明该方法具有良好的生物相容性，且绿色环保，固定化方法简便可行性较高。磁性纳米材料具有良好的磁学性能，同时多巴胺具有很大的生物相容性，在食品工业和生物医药行业有很好的应用前景。
在婴儿配方奶粉中，OPO是理想的结构甘油三酯，它的结构与人乳脂肪相似，具有多种有益的对婴儿的影响，如防止便秘，优化钙和脂肪酸的吸收，促进骨骼发育。然而，常用的乳脂替代品，如植物油和牛奶等，通常缺乏OPO结构脂这一重要成分。因此研究合成这种具有特定脂肪酸组成的OPO结构脂的有效方法，是非常必要的。目前合成OPO广泛使用的特异性固定化脂肪酶有商用的Novozym TL IM和Novozym RM IM等。基于这些固定化脂肪酶产品成本高、易磨损、重用性差等缺点。多巴胺仿生修饰磁性纳米载体固定化酶催化合成OPO不仅可以通过外加磁场达到回收再用的效果，而且催化效果良好，不会引入有害的化学物质。
发明内容
针对上述现有技术的缺点，本发明提供一种固定化酶及其制备方法与在制备OPO中的应用。本发明利用多巴胺对铁酸锌表面进行修饰得到所述磁性载体，将磁性载体对脂肪酶进行固定化，提高脂肪酶的重用性和稳定性，改善脂肪酶催化位置的选择性，进而提高目标产物OPO的含量。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
将磁性载体和脂肪酶分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在20～60℃下反应1～6h，得到所述固定化酶；所述磁性载体为多巴胺修饰的铁酸锌。
本发明利用与生物更相容的多巴胺修饰磁性铁酸锌，得到磁性纳米复合载体，在温和条件下将磁性载体对脂肪酶进行固定化反应，并对固定化条件进行改善，提高脂肪酶的重用性和稳定性，改善脂肪酶催化位置的选择性，进而提高目标产物OPO的含量。固定化酶在20～60℃水浴18h，残留酶活保留率均在60％以上，游离脂肪酶的酶活保留率低于40％。固定化酶在pH＝6～10的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率均在70％以上。而且，本发明制得的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。本发明所制备的固定化酶在催化合成OPO反应中充当催化剂的作用，OPO产物的转化率达到38％。
作为本发明的优选实施方式，所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶。
本发明经过大量实验探索，脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶时，所制备的固定化酶应用于催化合成OPO中，提高OPO产物的转化率，使OPO产物的转化率达到38％。
作为本发明的优选实施方式，所述反应液中磁性载体的浓度为0.050～0.150g/mL；所述反应液中脂肪酶的浓度为0.2～1.5mg/mL；所述磷酸缓冲液的pH值为6～10。
作为本发明的优选实施方式，所述磁性载体的制备方法，包括如下步骤：向Tris-HCl缓冲液中添加多巴胺和铁酸锌得到混合溶液，将混合溶液在25～50℃下反应12～24h，得到所述磁性载体。
多巴胺生物相容性好，表面具有丰富的基团，通过表面修饰铁酸锌使铁酸锌表面基团丰富，很容易通过与官能团的共价键合而将生物大分子固载在磁性载体表面。本发明磁性载体与脂肪酶以共价结合的方法固定，避免出现酶脱落和酶固载量较低的现象，提高OPO的转化率。
作为本发明的优选实施方式，所述多巴胺和铁酸锌质量比为1∶0.5～5；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7～9；所述混合溶液中多巴胺的浓度为0.01～0.04g/mL。
本发明经过大量实验探索，多巴胺和铁酸锌的添加量在上述比例下，提高OPO的转化率的效果最佳。
作为本发明的优选实施方式，所述铁酸锌的制备方法，包括如下步骤：
将铁盐和锌盐加入乙二醇中，再加入聚乙二醇和乙酸钠得到混合液，将混合液于100～220℃水热反应12～24h，得到所述铁酸锌。
本发明所述铁酸锌为空心球状结构。
作为本发明的优选实施方式，所述铁盐为三氯化铁或硝酸铁；所述锌盐为氯化锌或硝酸锌；所述乙酸钠、铁盐和锌盐的摩尔比为6～10∶2∶1；所述聚乙二醇的质量与乙二醇的体积配比为0.02～0.5g/mL。
所述铁盐的物质的量与乙二醇的体积配比为0.04～0.1mmol/mL；所述锌盐的物质的量与乙二醇的体积配比为0.02～0.05mmol/mL。
本发明要求保护采用所述固定化酶的制备方法制备的固定化酶。
本发明还要求保护所述固定化酶在制备OPO中的应用。
所述OPO为1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯。
本发明将所述固定化酶应用于催化合成OPO的反应中，一方面，所述固定化酶可以提高OPO的转化率；另一方面，固定化酶具有磁性，可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。
另外，本发明还保护了所述固定化酶催化合成OPO的方法，包括如下步骤：
将底物、固定化酶和正己烷混合均匀，在20-60℃下反应3-18h，得到所述OPO；所述底物为三棕榈酸甘油酯和油酸的混合物。
作为本发明的优选实施方式，所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：2～10；所述底物和固定化酶的质量比为1：0.04～0.12。
所述底物的质量和正己烷的体积配比为0.1g/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明将铁酸锌磁性颗粒作为磁性核心，利用多巴胺对铁酸锌表面进行修饰得到所述磁性载体，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性载体表面，得到固定化酶，并将其用于催化合成OPO中，OPO的转化率可高达38％。本发明制备得到固定化酶，具有优异的稳定性，良好的催化能力，改善了RML脂肪酶的热稳定性，将对婴儿配方奶粉中添加剂的合成起到重要作用。
附图说明
图1为所述固定化酶及应用于催化合成OPO的流程图；
图2为实施例1制备的铁酸锌的扫描电镜图；
图3为实施例1制备的固定化酶的扫描电镜图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为所述固定化酶及应用于催化合成OPO的流程图。从图中清晰得知，所述固定化酶的制备方法以及应用于催化合成OPO的过程，本发明利用多巴胺修饰铁酸锌(ZnFe2O4)生成磁性载体(ZnFe2O4@PDA)，再将磁性载体与RML酶共价结合得到所述固定化酶(ZnFe2O4@PDA@RML)，将固定化酶应用于OPO催化合成中，促进三棕榈酸甘油酯(PPP)和油酸(OA)合成产物OPO。
实施例1
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的实施例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入35mL乙二醇中，再加入8g聚乙二醇和8mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于160℃水热反应18h，得到所述铁酸锌；
(2)向25mL的Tris-HCl缓冲液中添加1g多巴胺和3g铁酸锌，在25℃下反应18h，得到所述磁性载体；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8；
(3)将磁性载体和脂肪酶酶液分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在40℃下固定化反应3.5h，得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为8；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶；所述反应液中磁性载体浓度为0.1g·mL-1；所述反应液中脂肪酶浓度为1mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL。
实施例1制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为81％，游离脂肪酶的酶活保留率为20％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为96％；实施例1中OPO的转化率为38％。
图2和图3分别为实施例1制备的铁酸锌和固定化酶的扫描电镜图。从图中可以看出，ZnFe2O4呈现空心球状，所述固定化酶也呈现球状。
实施例2
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的实施例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入20mL乙二醇中，再加入10g聚乙二醇和6mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于140℃水热反应24h，得到所述铁酸锌；
(2)向100mL的Tris-HCl缓冲液中添加1g多巴胺和0.5g铁酸锌，在50℃下反应12h，得到所述磁性载体；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7；
(3)将磁性载体和脂肪酶酶液分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在20℃下固定化反应6h，得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为6；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶；所述反应液中磁性载体浓度为0.05g·mL-1；所述反应液中脂肪酶浓度为0.5mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在50℃下反应18h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：2；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.04g：10mL。
实施例2制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为74％，游离脂肪酶的酶活保留率为20％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为90％；实施例2中OPO的转化率为36％。
实施例3
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的实施例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入50mL乙二醇中，再加入1g聚乙二醇和10mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于220℃水热反应12h，得到所述铁酸锌；
(2)向75mLTris-HCl缓冲液中添加1g多巴胺和5g铁酸锌，在40℃下反应24h，得到所述磁性载体；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为9；
(3)将磁性载体和脂肪酶酶液分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在50℃下固定化反应1h，得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为10；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶；所述反应液中磁性载体浓度为0.15g·mL-1；所述反应液中脂肪酶浓度为1.5mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在60℃下反应3h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：10；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.12g：10mL。
实施例3制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为83％，游离脂肪酶的酶活保留率为20％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为95％；实施例3中OPO的转化率为37％。
对比例1
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL；对比例1所述固定化酶购买于诺维信公司，型号为Lipozyme TL IM的商用固定化酶。
对比例1的固定化酶无磁性，与产物分离困难，需要通过离心、洗涤等方法才能回收再利用，且产物催化效果低于实施例1制备的固定化酶。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为72％，游离脂肪酶的酶活保留率为42％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为62％；对比例1中OPO的转化率为32％。
对比例2
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL；对比例1所述固定化酶购买于诺维信公司，型号为Lipozyme RM IM的商用固定化酶。
对比例2的固定化酶无磁性，与产物分离困难，需要通过离心、洗涤等方法才能回收再利用，且产物催化效果低于实施例1制备的固定化酶。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为50％，游离脂肪酶的酶活保留率为15％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为60％；对比例2中OPO的转化率为36％。
对比例3
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入35mL乙二醇中，再加入8g聚乙二醇和8mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于160℃水热反应18h，得到所述铁酸锌；
(2)将铁酸锌和脂肪酶酶液分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在40℃下固定化反应3.5h，得到所述固定化酶；得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为8；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶；所述反应液中磁性载体浓度为0.1g·mL-1；所述反应液中脂肪酶浓度为1mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：4mL。
对比例3制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为60％，游离脂肪酶的酶活保留率为20％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为65％；对比例3中OPO的转化率为10％。物理吸附法固定化酶可以通过外加磁场进行回收再利用，但是物理吸附法固定化酶容易出现酶脱现象，而且固载量较低，导致OPO转化率较低。
对比例4
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入35mL乙二醇中，再加入8g聚乙二醇和8mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于160℃水热反应18h，得到所述铁酸锌；
(2)向25mL的Tris-HCl缓冲液中添加1g戊二醛和3g铁酸锌，在25℃下反应18h，得到所述磁性载体；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8；
(3)将磁性载体和脂肪酶酶液分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在40℃下固定化反应3.5h，得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为8；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶；所述反应液中磁性载体浓度为0.1g·mL-1；所述反应液中脂肪酶浓度为1mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在50℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL。
对比例4制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为60％，游离脂肪酶的酶活保留率为20％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为63％；交联法固定化酶中交联剂戊二醛容易导致脂肪酶分子之间发生交联，导致大量酶结构发生改变、变性失活，导致OPO转化率较低。对比例4中OPO的转化率为20％。
对比例5
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、游离脂肪酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、游离脂肪酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶。
对比例5的游离脂肪酶无磁性，与产物分离困难，需要通过溶剂溶解、分液等方法才能回收再利用。所述游离脂肪酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为20％。所述游离脂肪酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为19％；对比例5中OPO的转化率为10％，原因是游离酶容易受溶剂、温度等环境的影响，且酶液中存在大量的水分会影响脂肪酶催化底物的选择性。
对比例6
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入35mL乙二醇中，再加入8g聚乙二醇和8mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于160℃水热反应18h，得到所述铁酸锌；
(2)向25mL的Tris-HCl缓冲液中添加1g多巴胺和3g铁酸锌，在25℃下反应18h，得到所述磁性载体；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8；
(3)将磁性载体和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在40℃下固定化反应3.5h，得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为8；所述反应液中磁性载体浓度为0.1g·mL-1；所述反应液中疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶浓度为1mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL。
对比例6制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为70％，游离脂肪酶的酶活保留率为20％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为70％；对比例6中OPO的转化率为30％。
对比例7
本发明一种固定化酶的制备方法及应用于催化合成OPO的对比例。
所述固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将2mmol三氯化铁和1mmol氯化锌加入35mL乙二醇中，再加入8g聚乙二醇和8mmol乙酸钠得到混合液，将混合液于160℃水热反应18h，得到所述铁酸锌；
(2)向Tris-HCl缓冲液中添加1g多巴胺和3g铁酸锌，在25℃下反应18h，得到所述磁性载体；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8；
(3)将磁性载体和南极假丝酵母B脂肪酶分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在40℃下固定化反应3.5h，得到所述固定化酶；所述磷酸缓冲液的pH值为8；所述反应液中磁性载体浓度为0.1g·mL-1；所述反应液中南极假丝酵母B脂肪酶浓度为1mg·mL-1。
所述固定化酶应用于催化合成OPO的制备方法，具体步骤如下：
将三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化酶和正己烷混合均匀，在40℃下反应10h，得到所述OPO；所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：6；所述底物、固定化酶和正己烷的配比为1g：0.08g：10mL。
对比例7制备的固定化酶可以通过外加磁场到达回收、重复再用的效果显著。所述固定化酶在50℃水浴18h，残留酶活保留率为75％，游离脂肪酶的酶活保留率为25％。固定化酶在pH＝8的缓冲溶液保存18h，残留酶活保留率为76％；对比例7中OPO的转化率为20％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将磁性载体和脂肪酶分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在20～60℃下反应1～6h，得到所述固定化酶；所述磁性载体为多巴胺修饰的铁酸锌；所述脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶；所述反应液中磁性载体的浓度为0.050～0.150g/mL；所述反应液中脂肪酶的浓度为0.2～1.5mg/mL。
2.如权利要求1所述固定化酶的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH值为6～10。
3.如权利要求1所述固定化酶的制备方法，其特征在于，所述磁性载体的制备方法如下：
向Tris-HCl缓冲液中添加多巴胺和铁酸锌得到混合溶液，将混合溶液在25～50℃下反应12～24h，得到所述磁性载体。
4.如权利要求3所述固定化酶的制备方法，其特征在于，所述多巴胺和铁酸锌质量比为1∶0.5～5；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7～9；所述混合溶液中多巴胺的浓度为0.01～0.04g/mL。
5.如权利要求1所述固定化酶的制备方法，其特征在于，所述铁酸锌的制备方法如下：
将铁盐和锌盐加入乙二醇中，再加入聚乙二醇和乙酸钠得到混合液，将混合液于100～220℃水热反应12～24h，得到所述铁酸锌。
6.如权利要求5所述固定化酶的制备方法，其特征在于，所述铁盐为三氯化铁或硝酸铁；所述锌盐为氯化锌或硝酸锌；所述乙酸钠、铁盐和锌盐的摩尔比为6～10∶2∶1；所述聚乙二醇的质量与乙二醇的体积配比为0.02～0.5g/mL。
7.采用权利要求1-6任一项所述固定化酶的制备方法制备的固定化酶。
8.如权利要求7所述的固定化酶的催化合成OPO方法，其特征在于，包括如下步骤：
将底物、固定化酶和正己烷混合均匀，在20-60℃下反应3-18h，得到所述OPO；所述底物为三棕榈酸甘油酯和油酸的混合物。
9.如权利要求8所述固定化酶催化合成OPO的方法，其特征在于，所述三棕榈酸甘油酯和油酸的摩尔比为1：2～10；所述底物和固定化酶的质量比为1：0.04～0.12。
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