CN117229529A - 一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶及其制备方法，涉及酶载水凝胶技术领域。本发明用于解决通过化学反应共价结合固定活性酶的水凝胶，需要对其成分结构、添加剂进行改进，使得活性酶得到良好负载固定的同时提高韧性和力学性能，拓宽极端环境下的使用范围的技术问题。活性酶与凝胶前驱体溶液内的两亲不饱和分子在引发剂的引发作用下，交联形成酰胺共价结合的凝胶网络结构，以化学反应结合的形式进行活性酶载体固定化；烷胺化后的氧化石墨烯实现水凝胶由脆性向韧性的转变，提高了韧性和力学性能；使得活性酶得到良好的负载固定，抵抗微生物分解和蛋白吸附，拓宽极端环境下的使用范围。
Description
技术领域
本发明属于酶载水凝胶技术领域，具体涉及一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶及其制备方法。
背景技术
酶是一类重要的生物催化剂，能够参与生物体内多种代谢反应，具有作用条件温和、高效性、专一性、来源广泛等优点。但是，蛋白质类酶的高级结构对于环境十分敏感，多种因素如物理、化学、生物等都易使酶失活变性，并且酶在反应结束后混入产品中，难以分离纯化，不能重复利用。
现有技术中用于活性酶固定化的载体，通常要具有以下特性：具有能和酶反应的官能团，较好的渗透性和较大的比表面积；水和有机溶剂不溶性；热稳定性及化学稳定性；对微生物的抵抗性；可重复使用性；良好的生物相容性。授权公告号为CN107746841B的发明专利公开了一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法；固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶；具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。该发明提供的酶固定化方法继承了传统共价结合法固定化酶的优点，酶活力回收率较高，具有较高的应用价值。但是研究发现，通过化学反应共价结合固定活性酶的水凝胶，需要对其成分结构、添加剂进行改进，使得活性酶得到良好负载固定的同时提高韧性和力学性能，拓宽极端环境下的使用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶及其制备方法，用于解决现有技术中通过化学反应共价结合固定活性酶的水凝胶，需要对其成分结构、添加剂进行改进，使得活性酶得到良好负载固定的同时提高韧性和力学性能，拓宽极端环境下的使用范围的技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶，通过将亚油酸与仲丁胺发生酰化反应合成两亲不饱和分子粉末，氧化石墨烯通过烷胺化得到掺杂增韧石墨烯粉末，两亲不饱和分子粉末与引发剂、交联剂混合得到凝胶前驱体溶液；活性酶在水中分散后与凝胶前驱体溶液、掺杂增韧石墨烯粉末发生交联得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。
作为本发明进一步改进的方案，所述氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；引发剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，交联剂为过氧化苯甲酰；活性酶选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶中的一种或多种的组合。
本发明还提供了上述作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将亚油酸、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入N,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在50～60℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；
两亲不饱和分子的合成反应式如下：
两亲不饱和分子的质谱检测结果如下：m/z:335.32(100.0％)，336.32(24.2％)，337.33(2.8％)；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取氧化石墨烯，分散于N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入十六胺，40～50℃机械搅拌2小时，加入多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将两亲不饱和分子粉末、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将活性酶分散于去离子水中，得到浓度20～30U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联30～40min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。
作为本发明进一步改进的方案，步骤S1所述亚油酸与1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N,N-二甲基甲酰胺、仲丁胺的用量比为0.1mol：0.15mol：0.15mol：500～600mL：0.1mol，甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的1～2倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的3～5倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可。
作为本发明进一步改进的方案，步骤S2所述氧化石墨烯与N,N-二甲基甲酰胺、十六胺、多肽缩合试剂DEPBT的用量比为100mg：30mL：120～160mg：18～30mg。
作为本发明进一步改进的方案，步骤S3所述两亲不饱和分子粉末与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化苯甲酰、蒸馏水的质量比为25～30：0.5：0.03：50～60。
作为本发明进一步改进的方案，步骤S4活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为8～10：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的1～3％。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的生物水凝胶，通过合成具有碳碳双键、酰胺键的长链两亲不饱和分子，再与引发剂、交联剂混合得到凝胶前驱体溶液；活性酶与凝胶前驱体溶液内的两亲不饱和分子在引发剂的引发作用下，交联形成酰胺共价结合的凝胶网络结构，以化学反应结合的形式进行活性酶载体固定化；烷胺化后的氧化石墨烯一方面能够与生物酶共价结合，一方面在受到外力拉伸时，由于柔性烷基链的释放可以使水凝胶层滑移，导致层级界面脱粘，实现水凝胶由脆性向韧性的转变，提高了韧性和力学性能；使得活性酶得到良好的负载固定，抵抗微生物分解和蛋白吸附，拓宽极端环境下的使用范围。
2、本发明的两亲不饱和分子，通过小疏水性的长碳链亚油酸与亲水性的伯胺仲丁胺反应得到，避免使用高水溶性天然多肽带来的凝胶效果不佳，酶载体固定的过程中能够形成更加稳定、结合率更高的凝胶网络。
3、本发明的掺杂增韧石墨烯，利用氧化石墨烯高强度、高模量以及表面含有大量活性羧基的特点，在多肽缩合试剂的作用下，与十六胺发生酰胺化反应得到表面连接长碳链胺基的石墨烯，应用至水凝胶中能够实现拉伸时的载荷转移，保持水凝胶良好的物理形态和活性酶的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法流程图；
图2示出了本发明实施例1固定化活性酶载体的生物水凝胶的电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参阅图1所示，本实施例作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将28g亚油酸、20.3g 1-羟基苯并三唑、28.8g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入560mLN,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加7.3g仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在56℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的1.6倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的4倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取100mg氧化石墨烯，分散于30mLN,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入160mg十六胺，47℃机械搅拌2小时，加入30mg多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将28g两亲不饱和分子粉末、0.5g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.03g过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入52g蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将蛋白酶分散于去离子水中，得到浓度25U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联30min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为8.5：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的1.8％。
从图2的电镜图可以看出，本实施例制备的生物水凝胶具有良好的三维网状结构且孔径大，对活性酶的固定化效果好。
实施例2
参阅图1所示，本实施例作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将28g亚油酸、20.3g 1-羟基苯并三唑、28.8g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入500～600mL N,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加7.3g仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在58℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的2倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的4.5倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取100mg氧化石墨烯，分散于30mLN,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入135mg十六胺，48℃机械搅拌2小时，加入25mg多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将28g两亲不饱和分子粉末、0.5g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.03g过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入55g蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将淀粉酶分散于去离子水中，得到浓度30U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联36min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为9：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的2.2％。
实施例3
参阅图1所示，本实施例作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将28g亚油酸、20.3g 1-羟基苯并三唑、28.8g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入600mLN,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加7.3g仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在60℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的1.2倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的3.8倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取100mg氧化石墨烯，分散于30mLN,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入140mg十六胺，50℃机械搅拌2小时，加入26mg多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将30g两亲不饱和分子粉末、0.5g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.03g过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入60g蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将纤维素酶分散于去离子水中，得到浓度26U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联40min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为10：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的2.8％。
实施例4
参阅图1所示，本实施例作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将28g亚油酸、20.3g 1-羟基苯并三唑、28.8g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入500～600mL N,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加7.3g仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在53℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的1.8倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的4.5倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取100mg氧化石墨烯，分散于30mLN,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入150mg十六胺，50℃机械搅拌2小时，加入30mg多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将27g两亲不饱和分子粉末、0.5g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.03g过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入57g蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将脂肪酶分散于去离子水中，得到浓度24U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联36min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为9.5：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的3％。
实施例5
参阅图1所示，本实施例作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将28g亚油酸、20.3g 1-羟基苯并三唑、28.8g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入500～600mL N,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加7.3g仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在53℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的2倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的4.5倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取100mg氧化石墨烯，分散于30mLN,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入152mg十六胺，45℃机械搅拌2小时，加入23mg多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将30g两亲不饱和分子粉末、0.5g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.03g过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入60g蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将纤维素酶分散于去离子水中，得到浓度27U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联32min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为10：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的2.5％。
对比例1
本对比例的生物水凝胶的制备方法，与实施例5的区别在于，步骤S4酶载体固定时未加入掺杂增韧石墨烯粉末。
对比例2
本对比例的生物水凝胶的制备方法，与实施例5的区别在于，步骤S3两亲不饱和分子粉末的添加量为20g。
对比例3
本对比例的生物水凝胶的制备方法，与实施例5的区别在于，步骤S4活性酶液的浓度为18U/mL。
实验例
对于实施例1-5、对比例1-3制备的生物水凝胶，进行了活性酶的最适pH、最适温度、温度稳定性、力学稳定性的测试，各项测试方法具体如下：
1)最适pH：取等量的200mg生物水凝胶，在不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)条件下测定酶活力，酶活力最高时的pH定为最适pH；
2)最适温度：取等量的200mg生物水凝胶，在不同温度(25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃)条件下测定酶活力，酶活力最高时的温度定为最适温度；
3)温度稳定性：将200mg的生物水凝胶放置于60℃的烘箱中，测定初始酶活力以及每隔30min后的酶活力，计算150min后的酶活力相对于初始酶活力的比例；
4)力学稳定性：对200mg的生物水凝胶施加向下的20MPa压力，然后测定pH＝7、温度25℃条件下60min后的酶活力相对于初始酶活力的比例。
具体测试结果见下表：
观察上表的实验结果能够发现：1)本发明实施例的生物水凝胶作为固定化活性酶载体，活性酶的最适pH、最适温度稳定一致；且温度稳定性和力学稳定性的数值均高于对比例，说明耐热稳定性、力学抗压性能良好；2)对比例1由于未加入掺杂增韧石墨烯粉末，无法实现拉伸时的载荷转移，使得水凝胶的物理形态改变，活性酶的稳定性降低；3)对比例2由于两亲不饱和分子粉末的添加量少量降低，使得对活性酶的结合固定效果变差，温度稳定性和力学稳定性有所降低；4)对比例3由于活性酶液的添加量降低，使得能够释放的活性酶总量降低，温度稳定性和力学稳定性也有所降低。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可做很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (7)
1.一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶，其特征在于，通过将亚油酸与仲丁胺发生酰化反应合成两亲不饱和分子粉末，氧化石墨烯通过烷胺化得到掺杂增韧石墨烯粉末，两亲不饱和分子粉末与引发剂、交联剂混合得到凝胶前驱体溶液；活性酶在水中分散后与凝胶前驱体溶液、掺杂增韧石墨烯粉末发生交联得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶，其特征在于，所述氧化石墨烯的含量大于98％，层数小于5层；引发剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，交联剂为过氧化苯甲酰；活性酶选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶中的一种或多种的组合。
3.一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、两亲不饱和分子合成：将亚油酸、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入三口烧瓶内，再加入N,N-二甲基甲酰胺，超声搅拌混匀，氮气气氛保护下通过恒压滴液漏斗滴加仲丁胺，滴加完毕后室温避光搅拌反应24小时，减压抽滤，甲醇淋洗，滤液在50～60℃下旋转蒸发，浓缩液重结晶得到两亲不饱和分子粉末；
S2、掺杂增韧石墨烯制备：称取氧化石墨烯，分散于N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散5min得到分散液，向分散液中加入十六胺，40～50℃机械搅拌2小时，加入多肽缩合试剂DEPBT，60℃搅拌反应8小时，离心分离，除去上清液后依次经过乙醇洗、去离子水洗，减压抽滤，滤饼90℃真空干燥18小时得到掺杂增韧石墨烯粉末；
S3、凝胶前驱体溶液制备：将两亲不饱和分子粉末、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化苯甲酰添加至烧瓶内，并加入蒸馏水，混合均匀后得到凝胶前驱体溶液；
S4、酶载体固定：将活性酶分散于去离子水中，得到浓度20～30U/mL的活性酶液，将活性酶液加入凝胶前驱体溶液内，再加入掺杂增韧石墨烯粉末，振荡均匀，37℃加热交联30～40min，得到固定化活性酶载体的生物水凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1所述亚油酸与1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N,N-二甲基甲酰胺、仲丁胺的用量比为0.1mol：0.15mol：0.15mol：500～600mL：0.1mol，甲醇的用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的1～2倍且分三次淋洗；重结晶的具体过程为：向浓缩液中加入由甲醇与石油醚按照体积比1：5组成的混合溶剂，混合溶剂的用量为浓缩液质量的3～5倍，-10℃冰乙醇浴结晶24小时，过滤，滤饼60℃干燥至恒重即可。
5.根据权利要求3所述的一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2所述氧化石墨烯与N,N-二甲基甲酰胺、十六胺、多肽缩合试剂DEPBT的用量比为100mg：30mL：120～160mg：18～30mg。
6.根据权利要求3所述的一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S3所述两亲不饱和分子粉末与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化苯甲酰、蒸馏水的质量比为25～30：0.5：0.03：50～60。
7.根据权利要求3所述的一种作为固定化活性酶载体的生物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S4活性酶液与凝胶前驱体溶液的质量比为8～10：1，掺杂增韧石墨烯粉末的用量为活性酶液质量的1～3％。
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