CN105950603B - 一种固定酶载体材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种固定酶载体材料及其制备方法，具体涉及一种硅胶表面经过两亲性物质修饰的载体材料，包括硅胶材料和修饰形成于所述硅胶材料表面的两亲性物质；其制备方法为将硅胶粉末加入甲基磺酸水溶液中进行活化，然后加入乙醇水溶液和3‑(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷制备成MPS‑硅胶，最后加入可聚合溶剂水溶液制成表面形成两亲性物质的固定酶载体材料。本发明的固定化酶载体提高了酶的操作稳定性、提高载体材料、酶与底物的相适应性，且其制备工艺较简单、成本低容易实现工业化。

Description

一种固定酶载体材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及催化材料与化学合成技术，具体涉及一种固定酶载体材料及其制备方法。
背景技术
酶作为具有特殊催化功能的生物催化剂，由于其催化高效性、高专一性及反应条件温和等性质被广泛用于生物工程、食品工业、医药、精细化学工业等领域。脂肪酶是各种生物酶反应包括：对映选择性水解和酯化、手性拆分、对映体单体制备及大分子聚合反应等，普遍存在的酶。但是游离酶在水溶液中很不稳定，重复使用性差，同时对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，容易降低甚至丧失其催化能力。另外，酶促反应后酶与底物和产物不易分离，产物中或多或少有酶的残留，导致产品纯度不高及酶回收重复使用性变差。游离酶的这些不足极大制约了其实际生产中的应用。为了解决酶存在的问题，人们将酶固定于载体材料中。目前固定酶的方法主要有物理法(吸附和包埋)和化学法(交联和共价结合)。共价结合主要是通过载体的活性官能团与酶分子中的部分官能团形成共价键，由于这种共价结合力度强，从而大大提高了酶的稳定性，但这种共价结合的有可能会对造成酶变形而导致酶活性降低。包埋主要是将酶捕获到聚合物内部空隙中，但这种孔内部结构易使传质受到限制；吸附主要是通过氢键、静电吸附、范德华力等微弱的分子间作用力将酶吸附到载体表面，但吸附力弱，酶与载体易脱落，污染产物，不利于回收。然而吸附法固定酶操作简单且成本低，易于产业化生产，是目前使用较多的一种固定酶方法。
目前，吸附法固定酶的载体材料主要是采用无机材料如：介孔碳材料、磁性Fe2O3/Fe3O4、水滑石、TiO2、介孔二氧化硅及硅胶、聚合物材料、多糖、苯乙烯树脂、聚羟基丁酸戊酯等来固定酶。其中多孔结构材料包括介孔碳材料和介孔硅氧化物微球，但介孔材料如氧化石墨烯、碳纳米管、有序介孔碳CMK-3等价格高昂，不利于产业化。目前研究硅胶及其相关的报道有很多，介孔硅材料由于其如具有较高的比表面积、孔隙率、表面具有较活波官能团而被广泛研究。但是介孔硅材料制备工艺复杂繁琐，且制备成本较高，不利于固定酶的大规模生产及商业化。相比之下，硅胶材料廉价易得，表面的多羟基官能团能够对酶进行吸附且易进行相关的改性修饰使其功能化，为酶的固定提供了很好的条件，同时制备工艺简单，容易大规模产业化。但是，现有的硅胶材料的吸附固定的稳定性较低，且不利于提高酶的活性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提出一种固定酶载体材料，本发明的固定酶载体材料利用硅胶表面的多羟基部分吸附酶，同时采用两亲性物质对表面进行修饰改性静电吸附酶，提高酶的操作稳定性；同时使得硅胶表面具有两亲性，能够促使固定酶对底物环境相适应，提供酶促反应所需要的界面环境，从而提高酶的催化效率。而且，本发明还提供一种固定酶载体材料的制备方法。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案一方面提供一种固定酶载体材料，包括硅胶材料和修饰形成于所述硅胶材料表面的两亲性物质。
优选的，所述两亲性物质为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯或聚乙烯醇。
本发明另一方面还提供一种固定酶载体材料的制备方法，包括如下步骤，
a、将硅胶粉末置于质量百分比为5%的甲基磺酸水溶液中，在102℃下搅拌4小时后过滤，将过滤得到的固体通过去离子水进行多次清洗后真空干燥24小时，即得活化的硅胶；
b、在活化后的硅胶中加入乙醇水溶液和3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷，并在氮气气氛、50℃的条件下反应24小时后过滤，过滤后的固体颗粒通过乙醇清洗多次，真空干燥即得表面活化的MPS-硅胶；
c、将步骤b所得的MPS-硅胶中加入可聚合溶剂水溶液，并在氮气条件下充分反应，过滤、干燥即得表面形成两亲性物质的固定酶载体材料。
优选的，所述两亲性物质为PVP，所述可聚合溶剂水溶液由N-乙烯基吡咯烷酮、过硫酸铵、三乙胺加入去离子水中形成。
优选的，所述步骤C还包括在氮气条件下搅拌1小时后，升高温度至70℃继续搅拌8小时，过滤、干燥即得硅胶表面接枝聚合有PVP的固定化酶载体。
优选的，所述步骤C包括将MPS-硅胶分散于乙二醇和氢氧化钠的混合溶液中，在氮气条件下升温至120℃，滴加环氧乙烷反应30分钟，冷却、过滤、洗涤、干燥即得硅胶表面聚合有PEO的固定化酶载体。
优选的，所述两亲性物质为聚乙烯醇。
优选的，所述可聚合溶剂水溶液中N-乙烯基吡咯烷酮、过硫酸铵、三乙胺的质量百分比分别为15%、2%、3%。
优选的，所述步骤B中活化后的硅胶中加入的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为6:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
1、该固定酶载体材料，具有较大比表面积，与酶结合率较高且能够将酶牢固的固定在载体表面，提高了酶的操作稳定性；
2、该固定酶载体材料，其两亲性能够为酶促反应提供良好的催化界面环境，提高载体材料、酶与底物的相适应性。
3、该固体酶载体材料，制备工艺较简单，成本低容易实现工业化。
附图说明
图1是本发明的硅胶-PVP载体固定CRL酶与游离CRL酶的热稳定性曲线对比图；
图2是本发明的硅胶-PVP载体固定CRL酶的重复实用性曲线；
图3是本发明的硅胶-PVP载体固定CRL酶的扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
取7.5ml的甲基磺酸配成质量百分比为5%的水溶液，将30g的硅胶粉末分散在甲基磺酸水溶液中，在102℃下搅拌4h，过滤后用去离子水洗涤多次，然后再真空干燥24h，得到活化后的硅胶。
将上述活化后的硅胶中加入140ml乙醇水溶液，然后再加入15.01g3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷，氮气气氛下，50℃反应24h；反应结束后过滤，并用乙醇反复洗涤去除多余MPS，真空干燥得到表面活化的MPS-硅胶；其中，本实施例中采用的MPS为3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷的简称。
将21mgN-乙烯基吡咯烷酮、2.8mg过硫酸铵、4.2mg三乙胺分散于140ml去离子水中，将上述制备的MPS-硅胶颗粒分散其中，反复充放氮气后，在氮气气氛下搅拌1h。然后将温度升至70℃搅拌8h，使得N-乙烯基吡咯烷酮在MPS-硅胶表面进行接枝聚合，并形成表面具有聚乙烯吡咯烷酮的固定化酶载体；为了便于后续描述，实施例中N-乙烯基吡咯烷酮和聚乙烯吡咯烷酮分别采用简称，具体为N-乙烯基吡咯烷酮的简称是NVP、聚乙烯吡咯烷酮的简称为PVP，相对应的，上述制备的固定酶载体为硅胶-PVP载体。
将1.17g CRL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS缓冲溶液中，然后加入0.5g上述制备的硅胶-PVP载体材料充分分散，将硅胶-PVP载体与酶的混合物置于37℃的摇床中，在160rpm的摇速下反应3小时，过滤，并采用去离子水洗涤5次后，离心冻干干燥后即得固定化酶，具体为硅胶-PVP载体固定CRL，将上述固定化酶保存在4℃环境下。其中，本实施例中的CRL为皱褶假丝酵母脂肪酶的简称。
固定化酶的热稳定性、重复使用率结果如附图1、图2所示。将制备的固定化酶通过PNPP显色法测定催化活力，结果显示：在固定化酶重复多次使用后，固定化酶催化活性保持稳定；在50℃下，随反应时间的增加，固定化酶的相对活性较游离酶稳定，这说明酶固定在本发明的载体材料上，其热稳定性有所提高。
实施例2
取7.5ml的甲基磺酸配成质量百分比为5%的水溶液，将30g的硅胶粉末分散在甲基磺酸水溶液中，在102℃下搅拌4h，过滤后用去离子水洗涤多次，然后再真空干燥24h，得到活化后的硅胶。
将上述活化后的硅胶中加入140ml乙醇水溶液，然后再加入15.01gMPS，氮气气氛下，50℃反应24h；反应结束后过滤，并用乙醇反复洗涤去除多余MPS，真空干燥得到表面活化的MPS-硅胶；其中，本实施例中采用的MPS为3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷的简称。
称取起始剂乙二醇和NaOH放入500ml反应釜内，将上述MPS-硅胶颗粒分散其中，然后用氮气置换3次后，升温至115℃，抽真空脱水1min，然后向反应釜内充氮气，当温度升至120℃时，缓慢滴加适量还氧乙烷，并保证温度不能超过140℃。反应30min后，通入冷却水使之冷却，过滤、洗涤、干燥，制得硅胶-PEO材料。其中，本实施例中PEO为聚氧乙烯的简称。
将1.17g CRL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS缓冲溶液中，然后加入0.5g上述制备的硅胶-PEO载体材料充分分散，将硅胶-PEO载体与酶的混合物置于37℃的摇床中，在160rpm的摇速下反应3小时，过滤，并采用去离子水洗涤5次后，离心冻干干燥后即得固定化酶，具体为硅胶-PEO载体固定CRL，将上述固定化酶保存在4℃环境下。其中，本实施例中的CRL为皱褶假丝酵母脂肪酶的简称。
实施例3
根据实施例1制备硅胶-PVP载体。
将1.0gPPL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS缓冲溶液中，然后加入0.5g上述制备的硅胶-PVP载体材料充分分散，将硅胶-PVP载体与酶的混合物置于37℃的摇床中，在160rpm的摇速下反应3小时，过滤，并采用去离子水洗涤5次后，离心冻干干燥后即得固定化酶，具体为硅胶-PVP载体固定PPL，将上述固定化酶保存在4℃环境下。其中，本实施例中的PPL为猪胰脂肪酶的简称。
测定实施例1~3所得的固定化酶的催化活性、热稳定性和重复使用率，同时测定相对应的CRL和PPL的游离酶的催化活性、热稳定性和重复使用率，具体如表1所示：
表1
从表1可见，在温度为50℃，反应时间为240min时，将游离酶与其相对应的固定化酶比较，固定化酶的活性得到明显提升，且对应固定酶热稳定性值均大于游离酶，这说明固定化酶的热稳定性得到了很大的提升。
从图2可见，随着重复使用次数的增加，固定化酶的活性趋于稳定。
由图3可知，从固定化酶硅胶-PVP@CRL固定酶的电镜图可以看出，CRL成功吸附在载体材料表面。
本发明所提出的利用两亲性物质修饰硅胶表面，一方面通过硅胶表面的羟基物理吸附酶；另一方面通过表面的两亲性物质静电吸附酶；进一步，表面两亲性物质能与底物良好接触，从而为酶的催化提供了合适的反应界面环境。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种固定酶载体材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
a、将硅胶粉末置于质量百分比为5％的甲基磺酸水溶液中，在102℃下搅拌4小时后过滤，将过滤得到的固体通过去离子水进行多次清洗后真空干燥24小时，即得活化的硅胶；
b、在活化后的硅胶中加入乙醇水溶液和3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷，并在氮气气氛、50℃的条件下反应24小时后过滤，过滤后的固体颗粒通过乙醇清洗多次，真空干燥即得表面活化的MPS-硅胶；
c、将步骤b所得的MPS-硅胶中加入可聚合溶剂水溶液，在氮气条件下搅拌1小时后，升高温度至70℃继续搅拌8小时，过滤、干燥即得硅胶表面接枝聚合有PVP的固定化酶载体；
所述可聚合溶剂水溶液由N-乙烯基吡咯烷酮、过硫酸铵、三乙胺加入去离子水中形成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可聚合溶剂水溶液中N-乙烯基吡咯烷酮、过硫酸铵、三乙胺的质量百分比分别为15％、2％、3％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b中活化后的硅胶中加入的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为6:1。
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