CN105969758B - 固定化酶、磁性碳材料及其制备方法 - Google Patents

固定化酶、磁性碳材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化酶、磁性碳材料及其制备方法和在固定化酶载体上的应用，磁性碳材料包括介孔碳材料、分装于所述介孔碳材料的孔洞内的磁性颗粒、与所述介孔碳材料的孔洞口通过化学键合连接的修饰剂，制备方法包括：准备介孔碳材料；将介孔碳材料处理为磁性碳材料复合物；对磁性碳材料复合物进行修饰。本发明的磁性碳材料作为固定化酶载体，重复操作性及稳定性好，克服了酶难回收的困难，同时修饰剂封口降低了磁性颗粒脱落材料对底物的污染；能够将酶牢固的固定在载体表面，不易从固定载体表面脱落；该固体化酶载体，具有较大比表面积，与酶结合率较高；且酶在材料表面易与底物接触，消除了底物的空间阻碍，从而提高了酶的催化效率。

Description

固定化酶、磁性碳材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及酶的固定技术，具体涉及一种固定化酶、磁性碳材料及其制备方法。
背景技术
酶作为具有特殊催化功能的生物催化剂，由于其催化高效性、高专一性及反应条件温和等性质被广泛用于生物工程、食品工业、医药、精细化学工业等领域。脂肪酶是各种生物酶反应包括：对映选择性水解和酯化、手性拆分、对映体单体制备及大分子聚合反应等，普遍存在的酶。但是游离酶在水溶液中很不稳定，重复使用性差，同时对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，容易降低甚至丧失其催化能力。另外，酶促反应后酶与底物和产物不易分离，产物中或多或少有酶的残留，导致产品纯度不高及酶回收重复使用性变差。游离酶的这些不足极大制约了其实际生产中的应用。为了解决酶存在的问题，人们将酶固定于载体材料中。目前固定酶的方法主要有物理法(吸附和包埋)和化学法(交联和共价结合)。吸附主要是通过氢键、静电吸附、范德华力等微弱的分子间作用力将酶吸附到载体表面，但吸附力弱，酶与载体易脱落，污染产物，不利于回收；包埋主要是将酶捕获到聚合物内部空隙中，但这种孔内部结构易使传质受到限制；共价结合主要是通过载体的活性官能团与酶分子中的部分官能团形成共价键，由于这种共价结合力度强，从而大大提高了酶的稳定性，但这种共价结合有可能会造成酶变形而导致酶活性降低。通过调整载体材料的结构及活性官能团，能够在一定程度上抑制由于共价结合导致酶活性的降低。综合而言，共价结合的方法是固定方法中较稳定且用途较广的方法。与纯介孔硅材料相比，介孔碳材料表现出特殊的性质，如具有高的比表面积，高孔隙率，机械强度大，稳定性好；孔径尺寸在一定范围内可调；介孔形状多样，孔壁组成、结构和性质可调；合成简单、易操作、无生理毒性。其在分子筛，吸附，催化反应，电化学等领域有着潜在的应用价值。近年来，介孔碳材料科学已经成为国际上跨化学、物理、材料、生物等学科交叉的热点研究领域之一。多壁碳纳米管(CNT)具有优良的导电性、机械稳定性、热稳定性，对CNT表面进行修饰或者功能化，使得其表面具有特殊功能团，如：-OH、-COOH、-NH2等；另外CNT是空心管状，具有毛细凝聚作用而起到吸附的效果；同时对CNT进行处理，使其表面形成孔洞的结构，利用其孔结构能够进行吸附及固定的相关应用。
为了解决游离酶存在的问题，人们提出了许多解决方法。主要是从载体材料固定酶、酶分子修饰等方面着手。针对载体材料固定酶，中国专利CN102443579A公开了一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法，主要是将酵母碳化后得到双亲性中空碳微球，利用吸附法将不同的酶包埋在中空碳微球的空腔里，实现酶的固定化。这种包埋酶的方法虽然能够提高酶的负载量，但对传质过程有很大影响，因此对底物的选择性比较苛刻。中国专利CN1975429B公开了一种氨基化纳米磁性微球固定蛋白酶；中国专利CN102250869B公开了一种用于生产植物甾醇酯的磁性固定化酶，主要是用乙烯基磷酸对磁性基体进行化学改性，然后在其表面包裹含有环氧或磺酸根基团的聚合物得到磁性聚合物微球，通过环氧开环或者静电吸附的方法实现酶在磁性聚合物微球表面的固定。但表面的共价键结合酶分子，易导致酶分子结构形变，降低酶表观活性。专利CN104531888A公开了一种磁性碳纳米管，使用亲水性溶胶-凝胶化合物包裹碳纳米管一端形成富羟基壳，然后将其包覆磁性纳米颗粒固定酶。
针对载体材料固定酶的专利及文献，其载体材料主要是采用无机材料如：SiO2、磁性Fe2O3/Fe3O4、水滑石、TiO2等，其中多孔结构材料如：介孔硅氧化物微球、石墨烯、碳纳米管等包埋；聚合物材料：多糖，苯乙烯树脂，聚羟基丁酸戊酯等来固定酶。本发明提出了一类新型载体材料，利用壁管表面多孔结构的碳管分装磁性颗粒，并用修饰剂将孔洞封闭，酶与碳管表面的官能团相互作用而固定，利用磁性颗粒易分离的特点可以有效的提高酶的重复使用性及回收率；另外磁性颗粒分布在碳管内部有利于降低多次分离后的磁损失，保护整个固定酶材料的完整性，减少磁物质对底物的污染；同时，磁颗粒分布在管内部，使碳管表面能提供更多酶固定位点；进一步酶与碳管表面的基团相互作用，能有效的提高酶的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化酶、磁性碳材料及其制备方法。本发明将碳管进行处理形成表面多孔的结构，磁性颗粒分装到碳管内部并用修饰剂封闭孔洞，碳管表面的官能团与酶分子相互作用形成稳定的C/M/D-L构型，这种固定酶的重复使用性、回收率、稳定性等均有很大提高。
本发明一方面提供一种磁性碳材料，其用于固定化酶的载体，包括介孔碳材料、分装于所述介孔碳材料的孔洞内的磁性颗粒、与所述介孔碳材料的孔洞口通过化学键合连接的修饰剂。
优选的，所述磁性碳材料内修饰剂的质量百分比为0.05-0.15％。
优选的，所述介孔碳材料表面具有亲水性官能团，所述亲水性官能团为羟基或羧基中的至少一种。
本发明另一方面还提供一种上述磁性碳材料的制备方法，包括如下步骤，
a、准备介孔碳材料；
b、将Fe(NO3)3·9H2O溶于乙醇溶液中形成饱和溶液，并缓慢分批少量加入处理后的介孔碳材料中，且每批次加入后进行抽真空处理，直至形成的铁氧化物的质量比达到15-30wt％，然后在室温下真空干燥；
c、将干燥后得到的混合物置于管式炉中，以N2为保护气体，于400-700℃温度下煅烧2h，得到磁性碳材料复合物；
d、将磁性碳材料复合物均匀分散于修饰剂溶液中，然后将分散液转移至水热反应釜中，于70-100℃反应4-12h，反应后过滤分离得到封口的磁性碳纳米管材料。
优选的，所述介孔碳材料由碳纳米管制备而成，制备方法为：将固态的KOH与碳纳米管均匀混合后，置于管式炉中，以N2为保护气体，于700-850℃煅烧1.5-2h，然后将煅烧后的物质用稀盐酸和去离子水洗至中性，干燥得到表面多孔的介孔碳材料。
优选的，所述介孔碳材料为碳纤维、膨胀石墨、土状石墨、CMK-3或碳纳米球的其中一种。
优选的，所述介孔碳材料表面具有亲水性官能团，所述亲水性官能团为羟基或羧基中的至少一种。
优选的，所述修饰剂为氧化锆、β-环糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮的其中一种。碳管开口处的官能团，由于处于缺陷状态，使得此缺陷处的官能团较活波从而有利于修饰剂的结合，因此修饰剂能够较好的封住孔洞结构。修饰剂的添加量极少，这是为了其能够修饰在孔洞周围而并不是覆盖在碳管表面，不影响碳管表面的固定酶位点。
同时，本发明还提供一种上述磁性碳材料在固定化酶载体上的应用。
而且，本发明还提供一种固定化酶，包括上述磁性碳材料，及与所述磁性碳材料的亲水性官能团连接的酶分子，所述酶分子为动物的猪胰腺酶、微生物发酵的褶皱假丝酵母酶、南极假丝酵母酶或米黑根毛霉脂肪酶的其中一种。
其中，磁性颗粒分装于介孔碳材料内部的方式包含但不限于：磁性颗粒可以通过边合成边进入材料孔洞中方式分装复合，即先处理碳材料使其表面形成多孔结构，磁性颗粒前驱体溶液与其混合后进入孔洞内再生成磁性颗粒，从而形成磁性颗粒处于孔洞结构内部的构型；也可以采用先制备磁性颗粒再组装碳材料分装磁颗粒的方式复合，即先制备磁性颗粒，再采用碳前驱体溶液与其混合后形成碳前驱体包覆碳颗粒的方式分装；也可以采用边制备磁性颗粒边组装碳材料的方式分装磁颗粒的方式复合，即磁性颗粒前驱体与碳前驱体以一定比例混合，利用碳前驱体与磁性颗粒前驱体间的静电或者螯合作用相互结合形成碳包覆分装磁性颗粒。这三种复合的方式均能将磁性颗粒分装在碳材料内部，与此同时，用修饰剂将孔洞口封住以减少磁颗粒的外漏，从而在一定程度上提高了材料的重复使用性、回收率并降低了磁性颗粒脱落后材料对底物的污染。
本发明的有益效果是：
1)该固定化酶载体，重复操作性及稳定性好，采用介孔碳材料分装磁性颗粒并通过修饰剂封口，通过磁性分离回收酶，克服了酶难回收的困难，同时修饰剂封口降低了磁性颗粒脱落材料对底物的污染。
2)该固定化酶载体，能够将酶牢固的固定在载体表面，不易从固定载体表面脱落。
3)该固体化酶载体，具有较大比表面积，与酶结合率较高；且酶在材料表面易与底物接触，消除了底物的空间阻碍，从而提高了酶的催化效率。
附图说明
图1为本发明的固定化酶的复合构型示意图；
图2为本发明的实施例1的固定化酶的热稳定性曲线；
图3为本发明的实施例1的固定化酶的重复使用性曲线；
其中，M为磁性颗粒，C为介孔碳材料，D为修饰剂，L为酶分子。
具体实施方式
下面的实施例描述了本发明的几种实施方式，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
制备h-CNT/Fe2O3/ZrO2复合磁性负载材料。选择多壁碳纳米管(CNT)为碳材料，铁氧化合物为磁性物质，ZrO2为修饰剂制备固定化酶载体材料。碳纳米管的处理：5g KOH与1gCNT研磨均匀后置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至850℃下煅烧90min。煅烧后的产物用稀盐酸洗涤至中性后，真空干燥得到表面腐蚀多孔的碳管h-CNT。
取0.75g Fe(NO3)3·9H2O的乙醇饱和溶液分批缓慢浸润0.5g处理后的碳管h-CNT，且每次浸润后抽真空处理5min，如此反复多次。加入乙二醇浸润此混合材料后，置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至450℃下煅烧120min。煅烧后即得到h-CNT/Fe2O3复合材料。
取10mg ZrOCl2·8H2O溶于20ml去离子水中，超声5min。取上述0.5g h-CNT/Fe2O3磁性复合材料分散于配置好的锆的水溶液中，超声15min后于60℃烘箱中烘干。10ml氨水(28％)倒入反应釜中，将烘干后的混合物平铺于滤纸上悬挂于反应釜中(不与氨水接触)。反应釜置于70℃烘箱内保温4h。反应结束后，取出材料于60℃下干燥12h得到h-CNT/Fe2O3/ZrO2复合磁性负载材料。
取5ml戊二醛溶于20ml磷酸缓冲液(PBS，PH＝5.0,0.1M)中超声2min。将0.5g上述h-CNT/Fe2O3/ZrO2复合磁性负载材料分散于戊二醛溶液中，超声1min，置于65℃摇床中反应12h。反应结束后过滤，用去离子水洗涤至中性后室温真空干燥得到磁性负载材料。
取100mg上述磁性负载材料分散于皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)的磷酸缓冲液中，置于37℃摇床中，在160rpm速率下反应6h。反应结束后将混合物磁分离，过滤，磷酸缓冲溶液洗涤后冻干干燥得到固定化酶。
将所获得的固定化酶测定其催化活性及其热稳定性、重复使用率。固定酶的热稳定性、重复使用率结果如附图2、3所示。将制备的固定化酶通过PNPP显色法测定催化活力，结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为75.36％。在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简单，分离彻底。在固定化酶重复多次使用后，磁分离效果仍较好，固定化酶催化活性保持稳定；在50℃下，随反应时间的增加，固定化酶的相对活性较游离酶稳定，这说明酶固定在本发明的载体材料上，其热稳定性有所提高。
实施例2
制备h-CNT/Fe2O3/PVP复合磁性负载材料。选择多壁碳纳米管(CNT)为碳材料，铁氧化合物为磁性物质，PVP为修饰剂制备固定化酶载体材料。碳纳米管的处理：5g KOH与1gCNT研磨均匀后置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至850℃下煅烧90min。煅烧后的产物用稀盐酸洗涤至中性后，真空干燥得到表面腐蚀多孔的碳管h-CNT。
取0.75g Fe(NO3)3·9H2O的乙醇饱和溶液分批缓慢浸润0.5g处理后的碳管h-CNT，且每次浸润后抽真空处理5min，如此反复多次。加入乙二醇浸润此混合材料后，置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至450℃下煅烧120min。煅烧后即得到h-CNT/Fe2O3复合材料。
取10mg PVP溶于20ml去离子水中，超声5min。取上述0.5g h-CNT/Fe2O3磁性复合材料分散于配置好的PVP水溶液中，超声15min后于60℃烘箱中烘干。
取5ml戊二醛溶于20ml磷酸缓冲液(PBS，PH＝5.0,0.1M)中超声2min。将0.5g上述h-CNT/Fe2O3/PVP复合磁性负载材料分散于戊二醛溶液中，超声1min，置于65℃摇床中反应12h。反应结束后，过滤，用去离子水洗涤至中性后室温真空干燥得到磁性负载材料。
取100mg上述磁性负载材料分散于CRL酶的磷酸缓冲液中，置于37℃摇床中，在160rpm速率下反应6h。反应结束后将混合物磁分离，过滤，磷酸缓冲液洗涤后冻干干燥得到固定化酶。
将所获得的固定化酶测定其催化活性及其热稳定性、重复使用率。
实施例3
制备h-CNT/Fe2O3/β-CD复合磁性负载材料。选择多壁碳纳米管(CNT)为碳材料，铁氧化合物为磁性物质，β-环糊精为修饰剂制备固定化酶载体材料。碳纳米管的处理：5g KOH与1g CNT研磨均匀后置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至850℃下煅烧90min。煅烧后的产物用稀盐酸洗涤至中性后，真空干燥得到表面腐蚀多孔的碳管h-CNT。
取0.75g Fe(NO3)3·9H2O的乙醇饱和溶液分批缓慢浸润0.5g处理后的碳管h-CNT，且每次浸润后抽真空处理5min，如此反复多次。加入乙二醇浸润此混合材料后，置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至450℃下煅烧120min。煅烧后即得到h-CNT/Fe2O3复合材料。
取10mgβ-CD溶于20ml乙二醇中，超声5min。取上述0.5g h-CNT/Fe2O3磁性复合材料分散于配置好的β-CD乙二醇溶液中，超声15min后于60℃烘箱中烘干。
取5ml戊二醛溶于20ml磷酸缓冲液(PBS，PH＝5.0,0.1M)中超声2min。将0.5g上述h-CNT/Fe2O3/β-CD复合磁性负载材料分散于戊二醛溶液中，超声1min，置于65℃摇床中反应12h。反应结束后，过滤，用去离子水洗涤至中性后室温真空干燥得到磁性负载材料。
取100mg上述磁性负载材料分散于CRL酶的磷酸缓冲液中，置于37℃摇床中，在160rpm速率下反应6h。反应结束后将混合物磁分离，过滤，磷酸缓冲液洗涤后冻干干燥得到固定化酶。
将所获得的固定化酶测定其催化活性及其热稳定性、重复使用率。
实施例4
制备CMK-3/Fe2O3/PVP复合磁性负载材料。选择有序介孔碳CMK-3为碳材料，铁氧化合物为磁性物质，PVP为修饰剂制备固定化酶载体材料。
取0.75g Fe(NO3)3·9H2O的乙醇饱和溶液分批缓慢浸润0.5g CMK-3介孔碳材料，且每次浸润后抽真空处理5min，如此反复多次。加入乙二醇浸润此混合材料后，置于管式炉中，在N2气氛下，以10℃/min的升温速率从室温升至450℃下煅烧120min。煅烧后即得到CMK-3/Fe2O3复合材料。
取5mg PVP溶于20ml去离子水中，超声5min。取上述0.5g CMK-3/Fe2O3磁性复合材料分散于配置好的PVP水溶液中，超声15min后于60℃烘箱中烘干。
取5ml戊二醛溶于20ml磷酸缓冲液(PBS，PH＝5.0,0.1M)中超声2min。将0.5g上述CMK-3/Fe2O3/PVP复合磁性负载材料分散于戊二醛溶液中，超声1min，置于65℃摇床中反应12h。反应结束后，过滤，用去离子水洗涤至中性后室温真空干燥得到磁性负载材料。
取100mg上述磁性负载材料分散于CRL酶的磷酸缓冲液中，置于37℃摇床中，在160rpm速率下反应6h。反应结束后将混合物磁分离，过滤，磷酸缓冲液洗涤后冻干干燥得到固定化酶。
将所获得的固定化酶测定其催化活性及其热稳定性、重复使用率。
实施例5
制备h-CNT/Fe2O3/ZrO2磁性负载材料，制备方法如实施例1所示。
取100mg上述磁性负载材料分别分散于皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)、猪胰脂肪酶(PPL)、米黑根毛霉脂肪酶(RML)的磷酸缓冲液中，置于37℃摇床中，在160rpm速率下反应6h。反应结束后将混合物磁分离，过滤，磷酸缓冲液洗涤后冻干干燥得到固定化酶。
分别测定实施例5所获得的三种固定化酶的催化活性及其热稳定性、重复使用率。结果如表1所示。
分别测定实施例1～5获得的固定化酶的热稳定性、重复使用率，并将测定结果进行对比，具体对比结果如表2所示。
表2
对于游离酶而言，在温度为50℃，反应时间为250min时，酶相对活性(此条件下的酶与初始酶的百分比)为56％。从表2可见，磁性碳管材料为载体固定酶的各实施例，固定酶热稳定性值均大于游离酶，这说明固定化酶的热稳定性得到了很大的提升。从图3可见，随着重复使用次数的增加，固定化酶的活性在前四次循环中损失的比较大，但是在之后的循环使用中酶活性较稳定。这可能是由于在前四次循环中，部分通过物理吸附在碳管表面的酶，由于吸附力较弱容易脱离，导致了活性的降低，当固定酶体系稳定后，酶活性稳定。将磁性颗粒M分装于表面多孔的介孔碳材料C内部，并将孔洞用修饰剂D封闭构成载体材料，酶分子L与载体材料表面官能团相互作用制得磁性固定化酶(C/M/D-L)。该固定化酶具有如下优良的效果：1)利用磁性颗粒易分离的特点可以有效的提高酶的重复使用性及回收率；2)磁性颗粒分布在碳管内部降低了磁性颗粒脱落后材料对底物的污染，保护整个固定酶材料的完整性；4)磁性颗粒分布在碳管内，使碳管表面提供更多固定酶的位点；3)酶与碳管表面的基团相互作用，能有效的提高酶的稳定性。如在温度为50℃，反应时间为250min时，游离酶CRL相对活性为56％，h-CNT/Fe2O3/ZrO2为载体的固定化酶CRL相对活性为73％；另外，h-CNT/Fe2O3/ZrO2为载体的固定化酶CRL重复8次后的酶相对活性为65％。
本发明所提出的将磁性颗粒分装于表面多孔结构的碳材料中，采用修饰剂将孔洞封口形成的载体材料，利用酶分子中的官能团与碳材料表面的活性官能团相互作用形成的磁性碳管固定化酶，一方面利用磁性颗粒易分离的特点，使得固定酶易回收；另一方面磁性颗粒分布在碳管内部有利于降低多次分离后的磁损失后材料对底物的污染，保护整个固定酶材料的完整性；同时，磁性颗粒分布在管内有利于使碳管表面能提供更多的固定酶位点；进一步，酶与碳管表面的基团相互作用，能有效的提高酶的稳定性。

Claims (5)

1.一种固定化酶，其特征在于，包括磁性碳材料及与所述磁性碳材料的亲水性官能团连接的酶分子，所述酶分子为动物的猪胰腺酶、微生物发酵的褶皱假丝酵母酶、南极假丝酵母酶或米黑根毛霉脂肪酶的其中一种，并将制得的磁性碳材料分散于戊二醛磷酸缓冲溶液中反应；
所述磁性碳材料包括介孔碳材料、分装于所述介孔碳材料的孔洞内的磁性颗粒、与所述介孔碳材料的孔洞口通过化学键合连接的修饰剂，所述修饰剂为氧化锆、β-环糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮的其中一种；
所述磁性碳材料的制备方法包括如下步骤：
a、准备介孔碳材料；
b、将Fe(NO3)3·9H2O溶于乙醇溶液中形成饱和溶液，并缓慢分批少量加入处理后的介孔碳材料中，且每批次加入后进行抽真空处理，直至形成的铁氧化物的质量比达到15-30wt％，然后在室温下真空干燥；
c、将干燥后得到的混合物置于管式炉中，以N2为保护气体，于400-700℃温度下煅烧2h，得到磁性碳材料复合物；
d、将磁性碳材料复合物均匀分散于修饰剂溶液中，然后将分散液转移至水热反应釜中，于70-100℃反应4-12h，反应后过滤分离得到封口的磁性碳纳米管材料。
2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述介孔碳材料为碳纤维、膨胀石墨、土状石墨、CMK-3或碳纳米球的其中一种。
3.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述介孔碳材料由碳纳米管制备而成，制备方法为：将固态的KOH与碳纳米管均匀混合后，置于管式炉中，以N2为保护气体，于700-850℃煅烧1.5-2h，然后将煅烧后的物质用稀盐酸和去离子水洗至中性，干燥得到表面多孔的介孔碳材料。
4.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述磁性碳材料内修饰剂的质量百分比为0.05-0.15％。
5.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述亲水性官能团为羟基或羧基中的至少一种。
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