CN113637666B - 一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，通过碳纳米管的活化、碳纳米管的复合、磁性碳纳米管的制备三个步骤制备得到固定化载体，载体比表面积大。将上述制备得到的材料用于漆酶的固定化，得到的固定化漆酶具有良好的耐热、耐酸碱稳定性，良好的重复利用性，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于漆酶固定化技术领域，具体涉及一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法。
背景技术
漆酶是一种广泛应用于环境保护、生物电化学、食品工业、生物漂白等技术领域的酶物质。但是，在如过酸、过碱等环境下，游离酶的活性变差、稳定性变差，极大地影响了其使用。通过固定化酶技术，能够克服上述不足。
固定化酶技术中，载体的使用十分重要。可以说，固定化酶的酶活和酶学性质与载体的结构及性能有着紧密的关联。通常，比表面积、功能、稳定性好的载体是潜在的优良的酶固定载体。碳纳米管是一种常用的固定化酶载体，如专利文献CN105647902A通过金属离子鳌和亲和修饰的碳纳米管与脱除铜离子的漆酶活性中心结合，克服了漆酶蛋白质外壳对电子由活性中心到碳纳米管的直接传递过程产生的屏蔽作用，但存在着对漆酶的处理复杂的不足；专利文献CN107988196A用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管固定化漆酶能够充分发挥碳纳米管的自身比表面积的优势，但存在着不能重复的不足。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，制备得到的载体的比表面积大，固定化漆酶的负载量高、对含酚废水的吸附降解率高、稳定性好，且能够循环使用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化；
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化；
S2、碳纳米管的复合：将步骤S1得到的活化碳纳米管分散到去离子水中，随后加入果糖，混合均匀后再加入磷酸，接着开始加热反应，反应完成后经过滤、洗涤处理，即得复合碳纳米管；
S3、磁性碳纳米管的制备：将步骤S2得到的复合碳纳米管分散到去离子水中，随后加入硫酸铁和氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下调节pH值至10.5；接着，加入吐温80，随后开始搅拌反应，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料。
优选的，步骤S1中碳纳米管活化的方法包括如下步骤：将碳纳米管和氢氧化钾分散到去离子水中，搅拌均匀，随后在120~140℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、820~860℃的条件下反应1~2h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化。
优选的，氢氧化钾、碳纳米管的质量比为4~6.5：1。
优选的，步骤S2中活化碳纳米管、果糖、去离子水的质量比为1~5：4~8：100。
优选的，步骤S2中磷酸质量分数为85%，所述磷酸的用量为1~5mL。
优选的，步骤S2中加热反应温度为120~150℃，加热时间为2~6h。
优选的，步骤S3中去离子水的用量为15~30mL，硫酸铁的用量为0.9~1.5g，氯化亚铁的用量为0.1~0.2g，复合碳纳米管的用量为40~70mg，吐温80的用量为450~650mg。
优选的，步骤S3中使用30 wt%的氨水调节pH值。
优选的，步骤S3中搅拌反应温度为70~110℃，反应时间为1.5~3h。
优选的，步骤（2）中漆酶的固定化包括如下步骤：取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g磁性碳纳米管复合材料和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆酶。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明首先对碳纳米管进行预改性，接着在加热、酸催化作用下进行二次改性，最后在表面活性剂的作用下制得磁性碳纳米管复合材料。采用上述方法制备得到的材料得到的固定化漆酶，具有良好的耐热、耐酸碱稳定性，良好的重复利用性。
（2）本发明中利用氢氧化钾为改性剂，通过高温作用，使得钾原子能够进入到纳米管内部，与碳发生反应，丰富孔结构，增加新的孔穴，使得碳纳米管的比表面积增大。
（3）本发明中在磷酸、加热的作用下，通过果糖的反应使得在碳纳米管的表面生成粗糙碳层，丰富碳纳米管的活性基团，可以进一步提高碳纳米管材料的比表面积，为后续漆酶的负载提供更多的活性点位。
（4）本发明中通过使用吐温80，能够降低漆酶与碳纳米管载体之间的阻力，实现漆酶的高负载；同时，吐温80的长尾亲水性基团，能够使得碳纳米管载体表现出更强的亲水性，从而提高酶的催化活性和酶的稳定性。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和发明优势更加清楚阐述，以下将结合说明书实施例对本发明做进一步详细讲解。
特别需要强调的是，漆酶购买自Aldrich公司；碳纳米管购自深圳纳米港有限公司。如无特殊说明，本发明中的其他原料或试剂也通过商业渠道购买。
实施例1
一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g漆酶固定化载体和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆。
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化：将1g多壁碳纳米管和4.2g氢氧化钾分散到80mL去离子水中，搅拌均匀，随后在125℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、830℃的条件下反应1h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化；
S2、碳纳米管的复合：将步骤S1得到的活化碳纳米管（2g）分散到100mL去离子水中，随后加入4g果糖，混合均匀后再加入2mL 85%的磷酸，接着于130℃下加热反应3h，反应完成后经过滤、洗涤处理，即得复合碳纳米管；
S3、磁性碳纳米管的制备：将步骤S2得到的复合碳纳米管（45mg）分散到20mL去离子水中，随后加入1g硫酸铁和0.1g氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下用30 wt%的氨水调节pH值至10.5；接着，加入450mg吐温80，随后于85℃下搅拌反应1.5h，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料。
实施例2
一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g漆酶固定化载体和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆。
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化：将1g多壁碳纳米管和4.8g氢氧化钾分散到80mL去离子水中，搅拌均匀，随后在130℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、840℃的条件下反应1.5h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化；
S2、碳纳米管的复合：将步骤S1得到的活化碳纳米管（2.5g）分散到100mL去离子水中，随后加入5g果糖，混合均匀后再加入3mL 85%的磷酸，接着于135℃下加热反应4h，反应完成后经过滤、洗涤处理，即得复合碳纳米管；
S3、磁性碳纳米管的制备：将步骤S2得到的复合碳纳米管（50mg）分散到25mL去离子水中，随后加入1.2g硫酸铁和0.15g氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下用30wt%的氨水调节pH值至10.5；接着，加入480mg吐温80，随后于90℃下搅拌反应2h，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料。
实施例3
一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g漆酶固定化载体和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆。
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化：将1g多壁碳纳米管和5.5g氢氧化钾分散到80mL去离子水中，搅拌均匀，随后在135℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、850℃的条件下反应1.5h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化；
S2、碳纳米管的复合：将步骤S1得到的活化碳纳米管（3g）分散到100mL去离子水中，随后加入6g果糖，混合均匀后再加入3.5mL 85%的磷酸，接着于140℃下加热反应4h，反应完成后经过滤、洗涤处理，即得复合碳纳米管；
S3、磁性碳纳米管的制备：将步骤S2得到的复合碳纳米管（55mg）分散到25mL去离子水中，随后加入1.4g硫酸铁和0.2g氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下用30 wt%的氨水调节pH值至10.5；接着，加入550mg吐温80，随后于100℃下搅拌反应2h，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料。
对比例1
一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g漆酶固定化载体和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆。
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化：将1g多壁碳纳米管和4.8g氢氧化钾分散到80mL去离子水中，搅拌均匀，随后在130℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、840℃的条件下反应1.5h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化；
S2、磁性碳纳米管的制备：将步骤S1得到的活化碳纳米管（50mg）分散到25mL去离子水中，随后加入1.2g硫酸铁和0.15g氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下用30wt%的氨水调节pH值至10.5；接着，加入480mg吐温80，随后于90℃下搅拌反应2h，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料。
对比例2
一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化：取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g漆酶固定化载体和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆。
其中，所述漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化：将1g多壁碳纳米管和4.8g氢氧化钾分散到80mL去离子水中，搅拌均匀，随后在130℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、840℃的条件下反应1.5h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化；
S2、碳纳米管的复合：将步骤S1得到的活化碳纳米管（2.5g）分散到100mL去离子水中，随后加入5g果糖，混合均匀后再加入3mL 85%的磷酸，接着于135℃下加热反应4h，反应完成后经过滤、洗涤处理，即得复合碳纳米管；
S3、磁性碳纳米管的制备：将步骤S2得到的复合碳纳米管（50mg）分散到25mL去离子水中，随后加入1.2g硫酸铁和0.15g氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下用30wt%的氨水调节pH值至10.5；随后于90℃下搅拌反应2h，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料。
对实施例1~3及对比例1、对比例2制得的复合碳纳米管进行比表面积测试，其中实施例1~3及对比例2中为步骤S2得到的材料，对比例1中为步骤S1得到的材料。测试结果如下：
表1复合碳纳米管比表面积测试结果
| 比表面积/（m2/g） | |
| 实施例1 | 683 |
| 实施例2 | 691 |
| 实施例3 | 687 |
| 对比例1 | 592 |
| 对比例2 | 680 |
从上表中可以看到，本申请制备得到的复合碳纳米管材料的比表面积大，可以为后续的磁性物质的负载及漆酶的负载提供更多的活性点位。
对实施例1~3及对比例1、对比例2制备得到的固定化漆酶进行酶活力测试、固定化漆酶量测试、降解吸附性能测试、热稳定性测试、重复性利用测试。具体测试方法如下：
1）酶活性测试
将2mL 1mg/mL的游离漆酶或者2 mg 得到的固定化漆酶加入到1mmol/L的ABTS溶液中，于25℃下振荡反应15min后，置于冰浴中终止反应，离心分离，使用紫外-可见分光光度计测定上清液在420nm处的吸光度变化，即可计算出相应的酶活力。
本发明中，紫外-可见分光光度计型号为新世纪T6。
2）固定化漆酶量测试
a）蛋白质标准曲线的绘制：按照不同量分别加入1000 µg/mL 标准蛋白质溶液和蒸馏水，随后再分别依次加入5mL考马斯亮蓝 G-250 试剂，染色 5 min 后测其吸光度，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。
b）固定化漆酶量的测定：采用考马斯亮蓝法进行漆酶量的测试；其中，酶量计算公式如下：
Q=（W1- W2）/W；
上式中，Q为酶吸附量，W1为固定化前漆酶的质量；W2固定化后漆酶的质量，W为载体的质量。具体到本案，W1=0.08g，W=0.5g。具体的测试、计算结果见表2。
表2固定化漆酶量测试结果
| 固定化漆酶量/（mg/g） | |
| 实施例1 | 156.3 |
| 实施例2 | 155.5 |
| 实施例3 | 156.7 |
| 对比例1 | 118.4 |
| 对比例2 | 136.5 |
从表1中可以看到，本发明中各实施例对漆酶的固定化量超过150 mg/g，固定化效率高。
（3）2,4-二氯苯酚的降解吸附
取0.1g固定化漆酶与15mL、10mg/L的2,4-二氯苯酚进行混合，室温条件下反应5h，离心分离，取10mL上清液稀释，随后依次加入1.25mL、0.5mol/L 的 NH3·H2O，0.5ml、2%的4-氨基安替比林，0.5mL、80g/L 的铁氰化钾溶液，搅拌反应 15min，通过紫外分光光度计测量在波长 510nm 处的吸光度变化，即可计算得到固定化漆酶对 2,4-二氯苯酚的吸附降解率。
本发明中，HPLC为日本岛津LC-20A。
表3 2,4-二氯苯酚降解吸附测试结果
| 降解吸附率/% | |
| 实施例1 | 98.2 |
| 实施例2 | 99.1 |
| 实施例3 | 98.9 |
| 对比例1 | 89.6 |
| 对比例2 | 91.3 |
从上表中，可以看到，本申请各实施例中制备得到的固定化漆酶对2,4-二氯苯酚均具有较好的吸附降解率。
（4）稳定性测试
热稳定性测试：将实施例1~3和对比例1、对比例2中制备得到的固定化漆酶（100mg）与游离酶（100mg）在不同温度下保存1.5h，按前述酶活测试方法，计算得到酶的剩余活性。
测试结果表明，实施例1~实施例3得到的固定化酶在60℃下保存2 h后酶的剩余活性仍保持有80%以上；对比例1中酶的剩余活性为57.2%；对比例2中酶的剩余活性仅为62.1%。
酸碱稳定性测试：将实施例1~3和对比例1、对比例2中制备得到的固定化漆酶（100mg）与游离酶（100mg）在20mL pH值3~8的PBS缓冲液中室温下保存12h，随后加入2mL1.00mmol/L的ABTS溶液混合，室温下搅拌1h，冰浴终止反应，取上清液，按前述酶活测试方法，计算得到酶的剩余活性。实施例1~3所得固定化漆酶在pH值3~8的范围内酶剩余活性相较于对比例1、对比例2均更高，且实施例1~3所得固定化漆酶在pH值3~6的范围内的酶剩余活性均在82%以上。
（5）重复性利用测试
反应完成后，马上用磁铁将固定化漆酶与底物溶液分离，并测试固定化酶的活性，以初始化固定化酶的活力为100%；同时，每次反应结束后用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗涤，随后进行下一次反应。测试结果见表4。
表4 循环使用5次后酶的活力保持情况
| 酶活力保持值/% | |
| 实施例1 | 70.2 |
| 实施例2 | 71.1 |
| 实施例3 | 69.3 |
| 对比例1 | 43.2 |
| 对比例2 | 51.5 |
从上表中可以看到，本申请的固定化漆酶的循环利用性能好。
以上说明描述本发明中的一个较佳的实施方式，不应将其看作为是对本发明权利要求保护范围的限制。在不脱离本发明原理和精神的情况下，任何修改、等效替换及改进，都应视为在本发明权利要求保护范围之内。
Claims (2)
1.一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）漆酶固定化载体的制备；
（2）漆酶的固定化；取25mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，加入0.5g磁性碳纳米管复合材料和30mL去离子水，随后加入0.08g漆酶，在25℃下混合均匀，经抽滤处理，即得固定化漆酶；
其中，步骤（1）漆酶固定化载体的制备包括如下步骤：
S1、碳纳米管的活化；将碳纳米管和氢氧化钾分散到去离子水中，搅拌均匀，随后在120~140℃下干燥，干燥完成后在氮气氛围、820~860℃的条件下反应1~2h，反应完成后冷却，经洗涤、干燥处理，即完成碳纳米管的活化；
S2、碳纳米管的复合：将步骤S1得到的活化碳纳米管2~3g分散到去离子水中，随后加入果糖，混合均匀后再加入磷酸，接着开始加热反应，反应完成后经过滤、洗涤处理，即得复合碳纳米管；
S3、磁性碳纳米管的制备：将步骤S2得到的复合碳纳米管分散到去离子水中，随后加入硫酸铁和氯化亚铁，超声分散均匀，随后在搅拌条件下调节pH值至10.5；接着，加入吐温80，随后开始搅拌反应，搅拌反应温度为70~110℃，反应时间为1.5~3h，反应完成后分离得到固体，并反复洗涤多次，即得磁性碳纳米管复合材料；
其中，步骤S1中氢氧化钾、碳纳米管的质量比为4~6.5：1；
其中，步骤S2中活化碳纳米管、果糖、去离子水的质量比为1~5：4~8：100；
其中，步骤S2中磷酸质量分数为85%，所述磷酸的用量为1~5mL；
其中，步骤S2中加热反应温度为120~150℃，加热时间为2~6h；
其中，步骤S3中去离子水的用量为15~30mL，氯化亚铁的用量为0.1~0.2g，硫酸铁的用量为0.9~1.5g，复合碳纳米管的用量为45~55mg，吐温80的用量为450~650mg。
2.根据权利要求1所述的一种磁性碳纳米管复合材料固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤S3中使用30 wt%的氨水调节pH值。
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| CN105639717A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-06-08 | 华南理工大学 | 一种弱碱、漆酶与表面活性剂协同脱除烟梗中木质素的方法 |
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