CN102703411B - 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 - Google Patents
固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102703411B CN102703411B CN201210184719.6A CN201210184719A CN102703411B CN 102703411 B CN102703411 B CN 102703411B CN 201210184719 A CN201210184719 A CN 201210184719A CN 102703411 B CN102703411 B CN 102703411B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular sieve
- epoxy
- mesoporous molecular
- aramagnetic
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 title claims abstract description 104
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 104
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 title abstract description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 53
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 230000005408 paramagnetism Effects 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 10
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920002415 Pluronic P-123 Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010792 warming Methods 0.000 claims description 5
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- LDDQLRUQCUTJBB-UHFFFAOYSA-N ammonium fluoride Chemical compound [NH4+].[F-] LDDQLRUQCUTJBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 claims description 2
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 abstract description 23
- 239000011148 porous material Substances 0.000 abstract description 13
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 abstract description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 abstract description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 abstract description 2
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 abstract description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 abstract description 2
- -1 glucosylase Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract 2
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 abstract 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N trimethoxy-[3-(oxiran-2-ylmethoxy)propyl]silane Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCOCC1CO1 BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 4
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013335 mesoporous material Substances 0.000 description 4
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 description 3
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 3
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 2
- IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin potassium Chemical class [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- WNQJZQMIEZWFIN-UHFFFAOYSA-N 1-(benzenesulfonyl)-4-(2-chlorobenzoyl)piperazine Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(=O)N1CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC=CC=2)CC1 WNQJZQMIEZWFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWRWFPQBGSZWNV-UHFFFAOYSA-N Dinitrosopentamethylenetetramine Chemical compound C1N2CN(N=O)CN1CN(N=O)C2 MWRWFPQBGSZWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960004841 cefadroxil Drugs 0.000 description 1
- NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N cefadroxil monohydrate Chemical compound O.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004375 physisorption Methods 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- ASWVTGNCAZCNNR-UHFFFAOYSA-N sulfamethazine Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 ASWVTGNCAZCNNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法，属于生物技术领域。本发明先用γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷在介孔分子筛表面引入环氧基团，再以共价键分别将L-半胱氨酸表面修饰的粒径大于介孔分子筛孔径的顺磁性Fe3O4纳米粒子和生物酶固定到介孔分子筛的外表面和内表面，来制备特殊结构的顺磁性固定化酶，可以在外加磁场的作用下易于从液相体系中分离出来，从而提高固定化酶的性能和分离效率。上述顺磁性的环氧基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，制得的顺磁性固定化青霉素酰化酶的活性为8800U/g，经过10次循环使用后保留了94.5％的初始活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
青霉素酰化酶(EC 3.5.1.11，酶分子尺寸：
)是半合成β-内酰胺类抗生素生产中最关键的酶，它既能催化青霉素及其扩环酸水解去侧链，生产半合成β-内酰胺类抗生素的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-APA和7-ADCA与侧链缩合，生产多种半合成β-内酰胺类抗生素(如Ampicillin，Amoxicillin，Cephalexin和Cefadroxil等)。
将游离酶直接用于催化过程存在许多不足，如在高温、强酸、强碱和有机溶剂中不稳定，容易丧失催化活性；游离酶回收困难，经济上不合理，还造成产物难以分离提纯，严重影响产品质量；生产过程难以实现连续操作，只能一次性间歇操作等。固定化酶克服了游离酶的上述不足，不仅保持了游离酶特有的催化特性，还提高了操作稳定性，生产过程易于实现连续操作，反应完成后易于与产物分离且可以重复使用，所得的产品纯度高，生产成本低。因此，酶的固定化一直是催化化学、生物化学和材料化学等领域的研究热点。
生物酶固定化载体可分为两类：无机载体和有机载体。与广泛使用的有机载体相比较，无机载体具有更高的机械强度和较好的化学稳定性，其结构和表面性质容易控制，其突出优势是负载的酶经焙烧等简单处理就可以除去，载体可以重复使用，这就大大降低了固定化酶的成本，也避免了已失活的固定化酶的后处理问题，减轻了对环境的压力。新型介孔分子筛具有较大连续可调的孔径、高的比表面积、较大的吸附容量和孔道内富含弱酸性羟基，可以使体积较大的酶分子固定于分子筛介孔中和反应产物及时扩散出孔道，保持固定化酶适宜的微环境，因而制得的固定化酶具有较高的催化活性，同时固定化酶的使用温度较低，可以避免介孔分子筛普遍存在的水热稳定性差的问题，因此，介孔分子筛是一类很有发展前途的酶固定化新型无机载体。
我们研究发现(Micropor.Mesopor.Mater.，2008，114(1-3)：507-510；J Mol.Catal.B-Enzym.，2004，30(2)：75-81)，固定化青霉素酰化酶的性能与介孔分子筛的结构(晶相、孔径、孔容和比表面积)密切相关。介孔分子筛的孔径是影响固定化酶活性的关键因素，当介孔分子筛的孔径大于青霉素酰化酶的分子尺寸时，在酶的固定化过程中，酶分子就容易进入介孔分子筛孔道内与表面的功能性基团相结合，充分利用介孔分子筛的孔容，得到的固定化酶具有较高活性。介孔分子筛的晶相、孔容和比表面积对固定化酶活性都有较大影响。SBA-15介孔分子筛与MCM-41介孔分子筛(固定化酶活性为402U/g)类似，都是六方相p6mm的一维孔道结构，以它为载体制备的固定化酶性能较差(固定化酶活性为1343U/g)；而具有较大孔径的立方相Ia3d结构的KIT-6介孔分子筛具有与MCM-48介孔分子筛(固定化酶活性为1509U/g)类似的比表面积、孔容以及双连续的三维孔道结构，但是前者比后者具有更大的孔径，对酶、底物以及产物分子的扩散具有优异的传输性能，以前者为载体制备的固定化酶具有较高的活性(固定化酶活性为3522U/g)。泡沫状介孔分子筛(Mesostructured Cellular Foams，MCFs)(J.Am.Chem.Soc.，1999，121(1)：254-255)，是一种具有超大孔径和3D泡沫结构的介孔氧化硅，其球形孔室由均一的窗口连通成为三维孔道结构，孔径为16～42nm，孔容为1.0～2.4cm3/g，由于具有较大的窗口直径和球形孔室，使得更多的酶分子可以进入球形孔室内部以及底物和产物的传输更加容易。我们研究发现，以MCFs介孔分子筛为载体制备的固定化青霉素酰化酶的活性可以达到9104U/g。因此，MCFs介孔分子筛有望成为性能优异的酶固定化无机载体。
介孔分子筛粒径越小，越有利于青霉素酰化酶在介孔分子筛表面的固定化和提高固定化酶的活性，但造成固定化酶在重复使用过程中难以得到有效分离。由于青霉素酰化酶分子与介孔分子筛表面弱酸性羟基之间通常是以较弱的氢键作用力相结合，在使用过程中一部分酶会发生脱落，操作稳定性有待进一步提高。共价结合法是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和固定化载体的功能性基团进行偶联制备固定化酶的方法，因酶与载体之间以共价键相结合，呈现良好的操作稳定性，是目前工业上广泛使用的酶固定化方法。因此，本发明将通过表面嫁接环氧基官能团的MCFs介孔分子筛与顺磁性的Fe3O4纳米粒子有效结合来制备顺磁性的环氧基介孔分子筛固定化载体，使固定化酶能在外加磁场的作用下得到迅速分离，提高固定化酶的分离效率。
目前文献报道的磁性介孔分子筛都是以顺磁性的Fe3O4或Fe3O4SiO2为核，然后在碱性条件下合成核壳结构的磁性介孔分子筛(Adv.Funct.Mater.，2004，14(4)：345-351；J.Am.Chem.Soc.，2005，127(25)：8916-8917；J.Am.Chem.Soc.，2006，128(22)：7130-7131；J.Am.Chem.Soc.，2008，130(1)：28-29)。而MCFs介孔分子筛是在强酸性条件下以P123非离子表面活性剂为模板剂合成的，Fe3O4在强酸性条件下容易被酸蚀和P123难以吸附在Fe3O4SiO2表面，这样用常规的磁性介孔分子筛制备方法就无法制备顺磁性的MCFs介孔分子筛。陆安慧等人(J.Am.Chem.Soc.，2004，126(28)：8616-8617)以聚甲基丙烯酸甲酯为SBA-15介孔分子筛的堵孔剂，接着将包覆碳层的顺磁性Co纳米颗粒沉积在分子筛的外表面，然后用850℃高温焙烧去除堵孔剂，制备了顺磁性的SBA-15介孔分子筛，但该制备过程较为繁琐。
中国专利CN102286455A公开了一种固定化漆酶及其制备方法。该材料是以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道内嵌入磁性纳米颗粒，磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，酶活性回收率为60％～95％，材料孔径为4-18nm，饱和磁化值比较低(4.1emu/g)，磁分离能力比较弱，以致分离时间比较长。
中国专利CN101256864A公开了一种超顺磁性介孔二氧化硅复合微球及其制备方法。该复合微球的内核为磁性铁氧体纳米粒子团簇，外壳包覆介孔二氧化硅的球体，微粒中铁氧体纳米粒子的质量百分含量为40～80％。该材料具有较大的比表面积(300-1000m2/g)和较强的磁分离能力(20-80emu/g)，在水中分散性好，表面容易经修饰后进一步功能化，但是该材料的最大孔径只有3.8nm，很多大分子酶难以进入孔道，吸附量比较低。
中国专利CN101752048A公开了一种有序的短孔道磁性介孔材料。该介孔材料在传统的合成介孔材料的碱性体系中，加入表面包覆有二氧化硅的以Fe3O4为磁性内核的纳米磁性颗粒并通过调节反应溶液的pH值，制备了一种有序短孔道并且形貌清晰的磁性介孔材料，可应用到生物分离、药物载体和催化反应中，但是该材料的孔径比较小，约为3nm，很难吸附大分子的酶使其进入孔道中。
中国专利CN102389771A公开了一种铃铛型磁性介孔硅球吸附剂的制备方法。通过选择性刻蚀过程，利用介孔硅将大尺寸纳米γ-Fe2O3粒子包覆，获得中空磁性介孔硅微球复合材料，用作吸附剂快速分离水体系中四环素和磺胺二甲嘧啶2种抗生素，该合成的材料孔径约为3nm，同样不适用于大分子酶的吸附。
发明内容
本发明目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可提高固定化酶性能和分离效率的用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：先用γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷在介孔分子筛的内外表而引入环氧基官能团，不需要进一步活化就可以用共价结合方式将经过L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子(Fe3O4粒径大于介孔分子筛的孔径，难以进入介孔分子筛的孔道中)嫁接在介孔分子筛的外表面和生物酶固定在介孔分子筛的内表面，从而提高固定化酶的性能和分离效率。
所述的γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功能化修饰，是将介孔分子筛和γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷加入甲苯溶液中，在100～120℃加热回流6～18小时，然后将介孔分子筛过滤用乙醇洗涤后，在60～120℃真空烘箱中干燥6～18小时，得到环氧基介孔分子筛。
所述的γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷和介孔分子筛的质量比为0.5～2∶1。
所述的L-半胱氨酸对顺磁性Fe3O4纳米粒子的表面修饰，是将用共沉淀法合成的Fe3O4纳米粒子分散于水中，用稀盐酸调节溶液pH值为4.0～5.0，然后加入L-半胱氨酸溶液，超声反应15～45分钟，用磁铁磁分离除去水溶液，得到L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子。
所述的L-半胱氨酸和顺磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为0.03～0.35∶1。
所述的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备方法，是将L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子的悬浮水溶液滴加到环氧基介孔分子筛的悬浮水溶液中，常温反应1～5小时后用磁铁磁分离除去水溶液，然后在40～80℃真空烘箱中干燥6～18小时，得到顺磁性的环氧基介孔分子筛。
所述的L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子和环氧基介孔分子筛的质量比为0.2～0.7∶1。
用上述方法制备的顺磁性的环氧基介孔分子筛的平均孔径为15～30nm，比表面积为350～500m2/g，孔容在1.0～2.0cm3/g，饱和磁化强度为10～25emu/g，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。
与现有技术相比，本发明所述的顺磁性环氧基介孔分子筛的制备方法的显著优点在于，通过将经过表面修饰的粒径大于介孔分子筛孔径的顺磁性Fe3O4纳米粒子负载到环氧基介孔分子筛的外表面，尽量减少顺磁性纳米粒子对于介孔分子筛孔道的堵塞，降低对介孔分子筛的孔径、比表面积和孔容的影响，不需要进一步活化就可以直接使生物酶以共价结合方式固定在介孔分子筛的内表面，来制备特殊结构的顺磁性固定化酶，可以使固定化酶在外加磁场的作用下，易于从液相体系中分离出来，从而提高固定化酶的性能和分离效率。
本发明所述的顺磁性环氧基介孔分子筛的显著优点之一在于，该介孔分子筛的孔径比青霉素酰化酶的分子尺寸大得多，而且具有较大的比表面积和孔容，有利于酶分子的固定化以及底物和产物分子的扩散，从而提高固定化酶的活性。
本发明所述的顺磁性环氧基介孔分子筛的显著优点之二在于，该介孔分子筛通过表面的环氧基团，用共价结合方式将经过L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子嫁接在介孔分子筛的外表面和生物酶固定在介孔分子筛的内表面，从而提高固定化酶的操作稳定性。
本发明所述的顺磁性环氧基介孔分子筛的显著优点之三在于，该介孔分子筛具有顺磁性，可以在外加磁场的作用下，易于从液相体系中分离出来，当撤去外加磁场，固定化酶又可以重新均匀分散在液相体系中，操作简便，容易工业化。
附图说明
图1为特殊结构的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备过程及酶的固定化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
在以下实施例中，采用下述方法进行青霉素酰化酶的固定化，以及测定固定化酶的活性和操作稳定性：
青霉素酰化酶的固定化：称取0.020g载体与6.0mL经pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液稀释的青霉素酰化酶溶液(Vbuffer/Venzyme＝9∶1)混合，放入30℃的水浴摇床中固定化12小时后进行磁分离，所得固体用pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液多次洗涤后进行活性测定。
固定化酶的活性测定(青霉素G钾盐水解制备6-APA)：在37℃的温度下，将上述固定化酶与20mL 4wt％的青霉素G钾盐水溶液(用0.1mol/L pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液稀释)均匀混合，然后用浓度为0.1mol/L的NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH值保持在7.8，记录10分钟内NaOH的消耗量。然后用以下公式来计算固定化酶的活性：
A(U/g)＝VNaOH×CNaOH×103/(m×r)
其中A代表固定化酶的活性；VNaOH代表NaOH消耗量(ml)；CNaOH代表NaOH浓度(mol/L)；m代表载体干重(g)；t代表测试所用时间(min)。
固定化酶的操作稳定性测定：将已使用过的固定化酶溶液进行磁分离，然后将固定化酶转移到反应器中，采用上述活性测定方法测定使用过的固定化酶的活性。经过10次循环使用后，固定化酶的活性与初始活性的百分比越高，则说明固定化酶的操作稳定性越好。
对比例
在室温条件下，将2.0g Pluronic P123(EO20PO70EO20，May＝5800)溶于75mL 1.6mol/L的HCl溶液中；待P123完全溶解后加入0.023g氟化铵和3.0g 1，3，5-三甲苯，然后将溶液升温至37℃并持续搅拌1小时后，加入4.4g正硅酸乙酯，并在37℃下持续搅拌20小时；将溶液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，于100℃水热晶化24小时；待溶液冷却至室温后过滤得到白色固体，在100℃的烘箱中干燥过夜，然后在马弗炉中程序升温至500℃焙烧8小时得到介孔分子筛。将1.0g介孔分子筛和1.0g γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷加入到50mL甲苯溶液中，于110℃加热回流12小时后过滤用乙醇洗涤，然后在90℃真空烘箱中干燥12小时得到环氧基介孔分子筛。将上述介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为9360U/g，经过10次循环使用后(用离心机进行固定化酶的分离，操作过程较为复杂)，固定化酶保留了94.6％的初始活性。
实施例1
将0.365g FeCl3·6H2O和0.208g FeSO4·7H2O(Fe3+/Fe2+摩尔比为1.8∶1)溶于10mL水中并升温至80℃，用浓氨水调节pH值约为11，在此温度下陈化2小时，冷却至室温后用水洗涤至中性得到0.15g的Fe3O4纳米粒子，然后分散于20mL水中，用稀盐酸调节溶液pH值为4.0～5.0，然后加入浓度为5g/L的L-半胱氨酸溶液5mL，超声反应30分钟，最后在外加磁场下除去水溶液，得到L-半胱氨酸表面修饰的Fe3O4纳米粒子。
将0.60g对比例中制备的环氧基介孔分子筛和0.15g的L-半胱氨酸表面修饰的Fe3O4纳米粒子分别分散于25mL水中，然后混合均匀常温反应5小时，反应完成用磁铁磁分离除去水溶液，然后在60℃真空烘箱中干燥12小时，得到顺磁性的环氧基介孔分子筛。将上述顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8800U/g，经过10次循环使用后(用磁铁进行固定化酶的分离，操作简便)，固定化酶保留了94.5％的初始活性。
实施例2
将实施例1中环氧基介孔分子筛的重量改为0.70g和L-半胱氨酸表面修饰的Fe3O4纳米粒子的重量改为0.30g，其他制备过程与实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8514U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了92.8％的初始活性。
实施例3
将实施例1中环氧基介孔分子筛的重量改为0.45g和L-半胱氨酸表面修饰的Fe3O4纳米粒子的重量改为0.30g，其他制备过程与实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8489U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了89.8％的初始活性。
实施例4
将实施例1中环氧基介孔分子筛和L-半胱氨酸表面修饰的Fe3O4纳米粒子的常温反应时间改为1小时，其他制备过程与实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8950U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了89.6％的初始活性。
实施例5
将实施例1中环氧基介孔分子筛和L-半胱氨酸表面修饰的Fe3O4纳米粒子的常温反应时间改为3小时，其他制备过程与实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8902U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了92.8％的初始活性。
实施例6
将实施例1中L-半胱氨酸溶液的浓度改为1g/L，其他制备过程与实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8838U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了92.3％的初始活性。
实施例7
将实施例1中L-半胱氨酸溶液的浓度改为10g/L，其他制备过程与实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8893U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了91.8％的初始活性。
实施例8
将对比例中的γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷的重量改为0.5g，其他制备过程与对比例和实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为9354U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了89.1％的初始活性。
实施例9
将对比例中的γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷的重量改为2.0g，其他制备过程与对比例和实施例1相同，将制得的顺磁性的环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8821U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了92.2％的初始活性。
Claims (4)
1.一种用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，该方法先用γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷在介孔分子筛的内外表面引入环氧基官能团，然后用共价结合方式将经过L-半胱氨酸表面修饰的粒径大于介孔分子筛孔径的顺磁性Fe3O4纳米粒子嫁接在介孔分子筛的外表面和生物酶固定在介孔分子筛的内表面，来制备特殊结构的顺磁性固定化酶，具体操作步骤如下：
步骤一，在室温条件下，将2.0g Pluronic P123(EO20PO70EO20，Mav＝5800)溶于75mL1.6mol/L的HCl溶液中；待P123完全溶解后加入0.023g氟化铵和3.0g1，3，5-三甲苯，然后将溶液升温至37℃并持续搅拌1小时后，加入4.4g正硅酸乙酯，并在37℃下持续搅拌20小时；将溶液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，于100℃水热晶化24小时；待溶液冷却至室温后过滤得到白色固体，在100℃的烘箱中干燥过夜，然后在马弗炉中程序升温至500℃焙烧8小时得到介孔分子筛；
步骤二，将介孔分子筛和γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷加入甲苯溶液中，在100～120℃加热回流6～18小时，然后将介孔分子筛过滤用乙醇洗涤后，在60～120℃真空烘箱中干燥6～18小时，得到环氧基介孔分子筛；
步骤三，将用共沉淀法合成的Fe3O4纳米粒子分散于水中，用稀盐酸调节溶液pH值为4.0～5.0，然后加入L-半胱氨酸溶液，超声反应15～45分钟，用磁铁磁分离除去水溶液，得到L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子；
步骤四，将L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子的悬浮水溶液滴加到环氧基介孔分子筛的悬浮水溶液中，常温反应1～5小时后用磁铁磁分离除去水溶液，然后在40～80℃真空烘箱中干燥6～18小时，得到顺磁性的环氧基介孔分子筛。
2.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，所述的γ-[(2，3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷和介孔分子筛的质量比为0.5～2∶1。
3.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，所述的L-半胱氨酸和顺磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为0.03～0.35∶1。
4.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的顺磁性的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，所述的L-半胱氨酸表面修饰的顺磁性Fe3O4纳米粒子和环氧基介孔分子筛的质量比为0.2～0.7∶1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210184719.6A CN102703411B (zh) | 2012-06-06 | 2012-06-06 | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210184719.6A CN102703411B (zh) | 2012-06-06 | 2012-06-06 | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102703411A CN102703411A (zh) | 2012-10-03 |
| CN102703411B true CN102703411B (zh) | 2014-01-08 |
Family
ID=46896461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210184719.6A Expired - Fee Related CN102703411B (zh) | 2012-06-06 | 2012-06-06 | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102703411B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015034427A1 (en) * | 2013-09-09 | 2015-03-12 | Lab-On-A-Bead Ab | Manufacture of magnetic particles |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007846B (zh) * | 2012-12-14 | 2015-02-04 | 无锡百运纳米科技有限公司 | 一种载蛋白的磁性微球的制备方法 |
| CN103012673B (zh) * | 2013-01-21 | 2015-03-18 | 华东理工大学 | 固定生物酶的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法 |
| CN105792926B (zh) * | 2013-09-09 | 2018-06-22 | 微球实验公司 | 用于磁性分离的新工艺和系统 |
| CN104911224B (zh) * | 2015-06-26 | 2018-12-25 | 南京工业大学 | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 |
| CN106421813B (zh) * | 2016-10-21 | 2019-07-26 | 新乡医学院 | 具有双重靶向功能的载药纳米粒子及其制备方法和应用 |
| CN109502637A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-03-22 | 湖北天瓷电子材料有限公司 | 一种水解法制备高纯纳米级二氧化钛的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1935994B (zh) * | 2006-08-23 | 2011-09-07 | 宁夏大学 | 一种有机基团功能化介孔分子筛酶固定化载体及其制备方法 |
-
2012
- 2012-06-06 CN CN201210184719.6A patent/CN102703411B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015034427A1 (en) * | 2013-09-09 | 2015-03-12 | Lab-On-A-Bead Ab | Manufacture of magnetic particles |
| WO2015034429A1 (en) * | 2013-09-09 | 2015-03-12 | Lab-On-A-Bead Ab | New diagnostic assay using particles with magnetic properties |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102703411A (zh) | 2012-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102703411B (zh) | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 | |
| CN103012673B (zh) | 固定生物酶的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法 | |
| Poorakbar et al. | Synthesis of magnetic gold mesoporous silica nanoparticles core shell for cellulase enzyme immobilization: improvement of enzymatic activity and thermal stability | |
| CN101613694A (zh) | 一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法 | |
| CN109796019A (zh) | 一种空心二氧化硅纳米球及其制备方法和应用 | |
| CN104248990B (zh) | 球形凹凸棒石介孔复合载体和负载型催化剂及其制备方法和应用以及乙酸乙酯的制备方法 | |
| CN104445214A (zh) | 一种介孔二氧化硅纳米空心球及其制备方法 | |
| Yu et al. | Covalent immobilization and characterization of penicillin G acylase on amino and GO functionalized magnetic Ni0. 5Zn0. 5Fe2O4@ SiO2 nanocomposite prepared via a novel rapid-combustion process | |
| Li et al. | Molecular imprinting and immobilization of cellulase onto magnetic Fe3O4@ SiO2 nanoparticles | |
| CN102568728A (zh) | 低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法及其应用 | |
| CN102952792B (zh) | 凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法 | |
| CN109810969B (zh) | 一种基于镧系核苷酸配合物和dna定向固定技术构建人造多酶系统的方法 | |
| CN112980807B (zh) | 一种基于dna与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法 | |
| CN102703412A (zh) | 固定生物酶的顺磁性的醛基介孔分子筛及其制备方法 | |
| CN101250247A (zh) | 用于生物酶固定化的磁性聚合物微球及其制备方法 | |
| Cheng et al. | Preparation and characterization of PDA/SiO2 nanofilm constructed macroporous monolith and its application in lipase immobilization | |
| Malvi et al. | Encapsulation of enzyme in large mesoporous material with small mesoporous windows | |
| CN104531668B (zh) | 一种固定化酶载体及其制备方法和应用 | |
| CN108722374A (zh) | 一种固载型离子液体磁性功能材料及其制备方法 | |
| CN104689808A (zh) | 有机-无机杂化环糊精手性固定相的制备方法 | |
| Deng et al. | Magnetic nanoparticles prepared in natural deep eutectic solvent for enzyme immobilisation | |
| CN104911162B (zh) | 一种可控多孔无载体固定化脂肪酶及其制备方法 | |
| CN109422352B (zh) | 利用固定化漆酶处理抗生素废水的方法 | |
| CN105969758B (zh) | 固定化酶、磁性碳材料及其制备方法 | |
| CN101643725B (zh) | 一种磁性中空复合微结构固定化酶及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140108 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |