CN105792926B - 用于磁性分离的新工艺和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于大规模地分离分子的工艺，其包括以下步骤：提供磁性多孔颗粒，其对所述待分离分子具有亲和性；将所述磁性多孔颗粒与含有所述分子的溶液混合在一起；使所述混合物与包括流动通道和至少一个磁性元件的磁性分离装置接触；除去所述至少一个磁性元件并收集携带所述分子的磁性多孔颗粒；使所述分子与所述磁性多孔颗粒分离；获得所述分子的浓缩级分；以及使所述磁性多孔颗粒再循环。提供了一种用于执行这种工艺的系统。

Description

用于磁性分离的新工艺和系统
技术领域
本发明说明书大致地涉及用于分离分子与细胞的新型工艺、装置和系统，其中磁性过滤器和对所述分子具有高容量和/或亲和性的磁性颗粒是主要组件。这种工艺及相应装置和系统可用于其中一种或多种反应物，例如催化剂或酶结合至固体介质的化学和生物化学过程中，如可用于化学和生物化学合成中以及可用于各种纯化步骤中。
所述工艺、装置和系统还适用于除去和/或富集期望或不想要的组分，例如但不限于从饮用水中除去药物残留物、重金属或其他不想要的污染物，以及富集化学和生物化学合成、生产和回收中的中间产物及最终产物。
背景技术
用于分离低或高分子量化合物、生物分子和细胞的技术在诸如但不限于生物制药和生物技术，包括食品技术和水净化的许多技术应用中都至关重要。大量层析介质及层析装置和系统是可用的。例如，基于生物亲和性的层析工艺已使用超过50年。一种重要的生物亲和性系统是固定化蛋白A，免疫球蛋白将通过它相互作用，表现出生物特异性相互作用。这使得以非常高效的方式分离单克隆抗体成为可能。
现今最频繁使用的分离技术是层析技术，其中分离介质装填在圆柱体中并且连接至使得分离感兴趣的分子成为可能的层析系统。这种技术存在的数个缺陷之一是处理时间。不但分离本身需要相当长的时间，而且搭建层析系统也费时。在待分离材料可被施加到柱子中之前，诸如过滤、离心和除杂工艺的额外步骤经常是必须的。仪器和设备价格昂贵而且需要时间搭建。此外，还需要有专业知识和经验才能够操纵该系统和评价结果。
存在可替代方案，磁性颗粒的使用是其中的一种。
美国专利序列号6,623,655公开了制备金属螯合化合物的方法。
Zhao等人在Lab Chip,2009,9,2981-2986中描述了一种制造具有用于细胞的隔室和带有磁性纳米颗粒的隔室的颗粒的技术。
美国专利序列号4,438,179描述了一种具有结合至其表面的磁性颗粒的聚合物颗粒。所述磁性材料与一层结合聚合物结合，所述结合聚合物包含这样的官能团，所述官能团是离子的或能够形成金属螯合物或络合物。替代地，磁性材料与聚乙二醇和/或聚丙二醇结合。
国际公布WO 2012/015891公开了一种颗粒，所述颗粒可能是多孔的，具有位于其表面上的较小无机颗粒。所述颗粒以供打印机用的调色剂颗粒形式来提供。
GB 1577930公开了包埋在多孔聚合物基体中的吸附颗粒和磁性颗粒。所述基体的孔隙率是这样的，其仅允许至多某特定分子量的分子能够穿透到基体的间隙中，以便所述产品选择性地吸附溶液中溶解的物质。复合材料，尤其珍珠形式的复合材料，在食品工业中尤其有用，例如，用来从各种食物产品中分离出不想要的微量风味剂或者从各种产品中回收诸如维他命之类的有用材料。具体应用包括从浓缩的酵母提取物中除去苦味的异葎草酮(isohumulone)及从乳清中回收核黄素。含有被选择性吸附的物质的颗粒，因为它们的磁性特性而容易与介质分离，因而克服了现有技术领域中这种类型的吸附材料遇到的分离问题。所述吸附颗粒可以是例如碳、Al2O3、硅胶、活性硅酸镁、粘土等的颗粒。所述磁性颗粒可以是例如磁铁矿、γ-Fe2O3、铁氧体等的颗粒。多孔基体可以是例如PVC、聚丙烯酰胺(任选地与表氯醇交联)酚醛树脂、与HCHO交联的尼龙-6,6等。
美国专利序列号8,518,265涉及功能性粉末，其包含磁性颗粒及提供在磁性颗粒表面上的疏水基团和亲水基团；其中疏水基团的数目(M)与亲水基团的数目(N)满足M/N为0.2-0.8的条件。包括了针对水处理方法(例如，对废水诸如工业废水的处理)的独立权利要求，所述方法涉及将功能性粉末分散在含有杂质的水中，以便粉末通过利用磁力吸附水中的杂质。
大多数市售磁性颗粒都是固体颗粒，其具有有限容量，这使得它们主要可用于小规模的分子分离。对于大规模分离，该容量太小而不能引起商业兴趣。然而，具有大内表面积的多孔磁性颗粒(5m2/ml颗粒，参见例如Protein Purification,Principles,Highresolution Methods and Applications，J.C.Janson和L.Ryden,VCH Publicerslnc.1989,40页)使得开发传统层析技术的替代物成为可能。
鉴于上述，将层析技术应用在大规模应用中仍然是一个问题，并且需要改进的颗粒以及用于在大规模应用中操纵层析颗粒的工艺、装置和单元操作。
本文描述了一种新型工艺、装置和系统，其中磁性过滤器与高容量磁性颗粒组合在一起，使得或多或少自动化的分子与细胞的分离工艺能够被开发和优化。
发明内容
本文陈述的一般概念和实施方案的目的在于减少现有技术的至少某些缺陷，并提供基于磁性颗粒的使用的改进的新型分子分离工艺，优选地用于大规模工艺，最优选地用于大规模连续或半连续工艺。
第一方面是用于大规模地分离分子的工艺，其包括以下步骤：提供颗粒，优选对所述待分离分子具有亲和性的磁性多孔颗粒；将所述磁性多孔颗粒与含有所述分子的溶液混合在一起；使所述混合物与包括流动通道和至少一个磁性元件的磁性分离装置接触；除去所述至少一个磁性元件并收集携带所述分子的磁性多孔颗粒；使所述分子与所述磁性多孔颗粒分离；获得所述分子的浓缩级分；以及使磁性多孔颗粒再循环。
所述颗粒可以选自市售颗粒，前提是这些颗粒具有所需的磁性特性和足够大的比表面积，或者优选为按本文所公开的方法生产的磁性颗粒。
根据所述第一方面的实施方案，磁性颗粒，优选多孔磁性颗粒包含选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、右旋糖酐、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的材料。
根据可与上述实施方案自由组合的所述第一方面的另一个实施方案，磁性颗粒，优选多孔磁性颗粒携带包括选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、环氧基、S-Au、酰胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季铵基乙基、羧基甲基、磷酸基和磺基丙基组成的组中的至少一者的官能团。这些官能团适合于制造磁性颗粒，因为它们使得磁性离子，诸如Fe和Ni容易偶联至颗粒。这些官能团也可以用在不同的分离工艺，例如离子交换中。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述官能团包括至少一种选自由IDA(亚氨基二乙酸)及其衍生物、TED(三(羧甲基)乙二胺)及其衍生物、CM-Asp(羧基甲基化天冬氨酸)及其衍生物、NTA(次氮基三乙酸)及其衍生物、TREN(三(2–氨基乙基)胺)及其衍生物、DPA(二甲基吡啶胺)及其衍生物、C6–S凝胶(己基硫基基团)及其衍生物、EDTA(乙二胺四乙酸)及其衍生物组成的组中的基团。这些官能团可用在例如涉及疏水相互作用和固定化金属亲合层析(IMAC)的应用中。
根据可与上述实施方案自由组合的又一个进一步实施方案，所述官能团包含至少一种选自由CnHm(1≤n≤20 4≤m≤42)、苯酚及其衍生物、硫代苯酚及其衍生物以及巯基吡啶及其衍生物组成的组中的基团。这些基团可用在涉及例如疏水分离和混合模式分离的应用中。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，适合于分子相互作用的分子是选自由有机分子、蛋白质、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、维他命、糖缀合物、核酸、凝集素以及碳水化合物组成的组中的至少一者。这些基团可用在涉及例如基于生物亲和性的分离的应用中。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，磁性多孔颗粒包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包括所述官能团。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述磁性分离装置包括流动通道或容器，并且其中将所述磁性元件施加到所述通道或容器的外面。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述磁性分离装置包括容器，并且其中将中空物体被引入到所述容器中的混合物中，其中所述中空形状具有与混合物接触的外表面，以及磁性元件可移动地插入在其中的内部容积
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述磁性分离装置包括流动通道，并且其中将所述磁性元件施加到流动通道的外面。
第二方面是用于大规模地分离分子的系统，其至少包括：用于储存磁性颗粒，优选对所述待分离分子具有亲和性的多孔磁性颗粒的储存罐；用于将所述颗粒与含有所述分子的溶液混合在一起的反应器；包括流动通道和至少一个磁性元件的磁性分离装置；以及用于输送所述颗粒与含有所述分子的溶液的混合物的泵。
根据第二方面的实施方案，系统进一步包括洗涤罐。
根据可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案，系统进一步包括用于光密度监测的光密度感测器。
根据可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案，系统进一步包括用于利用惰性气体对系统加压的气体进口。
根据所述工艺和/或所述系统这两个方面中任一个的实施方案，磁性颗粒，优选多孔磁性颗粒是这样的颗粒，其具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的连接的内表面，所述颗粒包括至少一种聚合物、位于所述外表面和内表面上的官能团以及共价结合至所述颗粒的内表面和/或外表面的磁性颗粒。
在进一步的实施方案中，磁性颗粒，，优选多孔磁性颗粒包括选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、右旋糖酐、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的材料。
在另一个实施方案中，磁性多孔颗粒具有比不带有共价结合的磁性颗粒的多孔颗粒的密度更高的密度。
在可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案中，位于磁性多孔颗粒的外表面和/或内表面上的官能团选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、环氧基、S-Au、酰胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季铵基乙基、羧基甲基、磷酸基和磺基丙基组成的组。
在可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案中，位于所述颗粒，优选磁性多孔颗粒的外表面和/或内表面上的官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
在可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案中，位于多孔磁性颗粒的表面上的官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
在可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案中，在所述颗粒，优选磁性多孔颗粒上引入适合于分子相互作用的分子。
在可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案中，适合于分子相互作用的分子是选自由有机分子、蛋白质、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、维他命、糖缀合物、核酸、凝集素以及碳水化合物组成的组中的至少一者。
在可与上述实施方案自由组合的另一个实施方案中，多孔磁性颗粒包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包含所述官能团。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述颗粒，优选磁性多孔颗粒是分离介质。
根据本文所描述的方面和实施方案的颗粒与已知的磁性颗粒相比较具有增大的结合容量。所述结合容量因为颗粒的形成而得以维持和/或甚至提高，该颗粒使得多孔颗粒的内容积的主要部分不受影响并且可供与待分离组分发生吸附和结合反应之用。
再一个优势是所述工艺可以非常少的步骤执行。所述工艺与根据现有技术的工艺相比较容易执行。进一步的特征和优势在详细的说明书和实施例中将变得明显。
附图说明
将在说明书和实施例中参考以下各图更详细地描述各个方面和实施方案，其中磁性多孔颗粒概况地举例说明磁性多孔颗粒，而不局限于说明书和实施例中给出的多孔磁性颗粒的那些实例：
图1示意性地示出包括多孔非磁性颗粒(Pp)和分布在其整个表面上并共价结合至其上的多个磁性颗粒(Mp)的颗粒(P)的横断面。
图2示意性地示出包括非磁性多孔颗粒(Pp)与磁性颗粒(Mp)的相似颗粒(P)的横断面，所述磁性颗粒(Mp)根据它们的尺寸与多孔颗粒中的孔隙直径的关系已或多或少地穿透到所述颗粒中，与内表面和外表面接触并共价结合至其上。
图3示出作为多孔颗粒的琼脂糖珠的光学显微镜图像，所述琼脂糖珠具有结合至其表面的较小磁性颗粒，所述琼脂糖珠是由环氧化物活化的琼脂糖与具有10μm、5μm和2μm尺寸的M NH2颗粒反应而产生的。
图4示出磁性琼脂糖颗粒的光学显微镜图像，所述磁性琼脂糖颗粒是由环氧化物活化的琼脂糖与2μmM NH2颗粒(来自德国罗斯托克micromodPartikeltechnologie GmbH)反应而产生的。
图5示意性地示出工艺方案，其包括以下组件：细胞培养物罐/再循环罐(1)、具有可缩回的磁体(8)的磁性过滤器单元(2)、排放阀(3)、用于洗涤和洗脱的罐(4)、供回收的和任选新的磁性颗粒用的器皿(5)、光密度感测器或窥视孔(6)、泵(7)例如蠕动泵、用于洗脱物的最终纯化的过滤器(9)例如0.22μm过滤器、用于维持无氧环境的例如N2的气体进口(10)、用于冲洗磁性过滤器单元的冲洗水进口(11)、用于排放洗脱物的阀门(12)、细胞培养物罐(13)，以及用于除去细胞的过滤器(14)。
具体实施方式
在详细描述各个方面和实施方案之前，应理解本说明书不局限于本文公开的具体化合物、构造、方法步骤、基质和材料，因为此类化合物、构造、方法步骤、基质和材料可以有些变化。还应理解，本文采用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而无意于限制，因为本发明实施方案的范围仅由所附权利要求书及其等价物限定。
必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。
而且，术语“大约”用于指示在适当的时候，偏离数值±10％，最优选±5％。
如果没有其他定义，包括本文使用的任何术语在内的科学术语意在具有本公开所属领域技术人员通常理解的含义。
本发明人已进行广泛的研究并且发现多孔磁性颗粒可应用到生物分子分离工艺中，特别是大规模应用中。与固定化分子和/或细胞在一起的所述颗粒容易使用一个或多个外磁体分离。因为磁性颗粒给颗粒带来附加密度，所以所述分离可以通过离心或者利用重力通过静态沉降来辅助。基于密度的分离可以用作预分离步骤和/或作为磁性分离的一部分。
本发明人已测试不同的磁性颗粒，发现不是所有颗粒都适合于本文公开的分离工艺和系统。许多市售颗粒具有太弱的磁性特性而不能用在本发明的工艺和系统中。目前被认为最适合的颗粒是本发明人使用本文概述的工艺生产的颗粒。这种工艺也是要求2013年9月9日提交的SE 1351038-3的优先权的共同待审的申请的主题。
磁性颗粒的实例包括来自GE Healthcare Life Sciences的Mag Sepharose磁珠。另一个实例是来自Biovision,Inc的磁珠。被发现非常适合于当前工艺和系统的再一个实例是来自瑞士苏黎世的Turbobeads LLC的产品系列，其有生物医学级和化学级形式可供选择。所有这些珠都以不同的质量供应并且具有不同的功能。
合适的磁性颗粒可以粗略地划分为三组：
-固体磁性微颗粒。这些颗粒经常具有低磁力和低容量。它们目前不太适合用于本文公开的工艺和系统中。实例包括(Dynal/Invitrogen Co.)和M(来自德国罗斯托克Micromod Partikeltechnologie GmbH的磁性聚苯乙烯颗粒)。
-多孔磁性颗粒。这些颗粒具有良好的磁性特性和高容量。它们适合用于本文所公开的工艺和系统中。实例包括来自GE Healthcare Life Sciences,Biovision,Inc的颗粒，以及按照本说明书和共同待审的申请中概述的方式生产的颗粒。
-具有高磁力的固体磁性颗粒，例如钴颗粒(来自瑞士苏黎世的Turbobeads LLC的产品系列)以及类似物。
根据一个实施方案，多孔颗粒基本上是球形的，然而也包括其他形状，并且磁性多孔颗粒不局限于任何特定形状。所有形状都包括在本文提供的实施方案的范围内。上述情况也适用于磁性颗粒。
优选所有磁性颗粒的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒的孔隙的至少95％的平均直径。根据一个实施方案，磁性颗粒的最小平均直径大于20nm。
根据一个实施方案，用于本发明工艺和系统中的磁性多孔颗粒包括选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的至少一者。
优选地，磁性颗粒包括至少一种选自磁性金属、磁性金属合金和磁性氧化物或它们的组合的磁性材料。非限制性实例包括铁、镍、钴、钆、钕和钐，以及它们的氧化物和合金。
优选地，磁性颗粒具有比非磁性颗粒的密度更高的密度。因而，磁性颗粒可用来增加整个颗粒的密度。当重力或离心用作分离步骤的一部分，例如用作磁性分离之前或之后的步骤时，这是有用的。
根据可与上述实施方案自由组合的所述第一方面的另一个实施方案，磁性颗粒，优选多孔磁性颗粒携带包括选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、环氧基、S-Au、酰胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季铵基乙基、羧基甲基、磷酸基和磺基丙基组成的组中的至少一者的官能团。这些官能团适合于制造磁性颗粒，因为它们使得磁性离子，诸如Fe和Ni容易偶联至颗粒。这些官能团也可以用在不同的分离工艺，例如离子交换中。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，所述官能团包括至少一种选自由IDA(亚氨基二乙酸)及其衍生物、TED(三(羧甲基)乙二胺)及其衍生物、CM-Asp(羧基甲基化天冬氨酸)及其衍生物、NTA(次氮基三乙酸)及其衍生物、TREN(三(2–氨基乙基)胺)及其衍生物、DPA(二甲基吡啶胺)及其衍生物、C6-S凝胶(己基硫基基团)及其衍生物、EDTA(乙二胺四乙酸)及其衍生物组成的组中的基团。这些官能团可用于例如涉及疏水相互作用和固定化金属亲合层析(IMAC)的应用中。
根据可与上述实施方案自由组合的又一个进一步实施方案，所述官能团包括至少一种选自由CnHm(1≤n≤20 4≤m≤42)、苯酚及其衍生物、硫代苯酚及其衍生物，以及巯基吡啶及其衍生物组成的组中的基团。这些基团可用在涉及例如疏水分离和混合模式分离的应用中。
根据可与上述实施方案自由组合的进一步实施方案，适合于分子相互作用的分子是选自由有机分子、蛋白质、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、维他命、糖缀合物、核酸、凝集素以及碳水化合物组成的组中的至少一者。这些基团可用在涉及例如基于生物亲和性的分离的应用中。
重要地，所述官能团可以存在于磁性固体颗粒上，所述磁性固体颗粒附接至多孔颗粒，从而一起构建具有足够大的表面的磁性颗粒；或者存在于多孔磁性颗粒上；或者存在于多孔的非磁性颗粒上，所述多孔的非磁性颗粒又携带结合至其上的磁性颗粒。
在一个实施方案中，磁性颗粒包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包含所述官能团。
在另一个实施方案中，多孔颗粒括选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、右旋糖酐、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的至少一者。
磁性颗粒包括至少一种磁性材料，例如但不限于，磁性金属、磁性金属合金、及磁性氧化物或它们的组合。在一个实施方案中，磁性颗粒具有比非磁性多孔颗粒的密度更高的密度。根据ISO 1183-1:2012测量密度。
在一个实施方案中，磁性多孔颗粒和至少一种磁性颗粒中的至少一者包括适合于分子相互作用的分子。适合于相互作用的分子是具有通过包括但不限于与另一种分子形成键的方式与另一种分子发生相互作用的能力的分子。
在一个实施方案中，所述多孔颗粒和/或所述至少一种磁性颗粒中的至少一者包括适合于检测的分子。
在一个实施方案中，适合于检测的分子是选自由有机分子、核酸、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、糖缀合物、凝集素，以及碳水化合物组成的组中的至少一者。适合于检测的分子是可通过任何方式检测的分子。实例包括发出具有至少一种特定波长的光的分子。
在一个实施方案中，磁性颗粒包括包埋在聚合物基体中的至少一种材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包含所述官能团。磁性颗粒(Mp)中的材料的实例包括但不限于，磁性金属、磁性金属合金及磁性氧化物，诸如铁、钴及它们的氧化物。
当使用磁性颗粒时，分离可通过磁场或通过利用密度差来进行。在一个实施方案中，磁性颗粒具有磁性并且具有高密度，使得可以使用基于磁场的分离和/或基于密度差的分离。基于密度的分离包括离心和/或暴露于重力中。暴露于重力中可能只是让样本静置以便密度较大的颗粒沉降。
本文所公开的工艺和系统具有许多优势。它可以补充或完全替代常规层析设备，并且提供更稳健且容易操作的连续或半连续系统。物料通过量(through-put)显著增大，因为本文所描述的工艺和系统可以在比常规层析设备高出很多的流速下操作，无需溶液预处理或需要极少的溶液预处理。如本文所公开的工艺和系统也不太易于中断并且需要较少的维护，例如因为色谱柱压紧、介质中形成通道、过滤器堵塞等问题可以被避免。
一般而言，所述工艺和系统的实现使得减少工艺步骤和单元操作的数目成为可能，从而使得以较低成本和较短时间处理较大的批量成为可能。所述工艺也容易按比例放大，要么通过增大磁性分离装置的尺寸，要么通过并联使用多个磁性分离装置来进行。也可以设计使磁性颗粒再循环的顺序系统。
所述工艺和系统可以用作平台，而没有将它的用途限制于捕获单克隆抗体。其他合适的用途是涉及疏水相互作用、离子交换或亲和层析的工艺。所述工艺和系统是非破坏性的，并且适合于操纵大生物分子以及甚至活细胞。此外，如本文所公开的系统易于清洗并且适合于需要消毒或甚至无菌环境的工艺。这使得它特别适合于制药、生物化学和微生物应用。
实施例
实施例1.流过式处理(Flow through processing)-利用磁性分离对IgG进行的分 离
通过利用磁性颗粒和包括在流动系统装备中的磁性分离器装置从较大的样本体积，例如，约1至10 000L中分离出免疫球蛋白G(IgG)。所述装备包括发酵罐，其中产生IgG并且其中添加了对IgG有亲和性的磁性颗粒以便捕获所产生的IgG，发酵罐后面是用于磁性颗粒的洗涤、洗脱和再生的各种容器。磁性分离器装置是例如磁性过滤器，在这里从大体积细胞培养基中捕获并集聚IgG负载的磁性颗粒。如本文所公开的磁性分离器装置可以1至1000L/min的流速处理细胞培养基和颗粒，这使得在短时间内操纵大体积细胞培养基成为可能。
所述磁性分离器装置也容易停用(deactivated)，例如通过将磁体从过滤器装置中移出或通过磁体的自动缩回来停用，从而使所捕获的携带IgG的颗粒可以释放出来。然后在后面的容器或器皿中对这些颗粒进行进一步处理，例如洗涤和洗脱，从而使IgG从磁性颗粒中释放出来。然后通过使颗粒与游离IgG的混合物再循环至启用(activated)的磁性分离装置中，来使IgG分子与磁性颗粒分离，在磁性分离装置中磁性颗粒再次被捕获。结果，IgG分子从磁性分离装置通过，并收集在单独容器中用于进一步处理。然后可以使磁性颗粒再循环至来自发酵罐的新一批含有IgG的细胞培养基中。
根据实施方案并且诸如被包括在流动系统装备中的上述磁性分离器装置的分离系统的实例在图5中示意性地示出。
实施例2.在流动系统装备中大规模分离磁性颗粒
利用包括在流动系统装备中的磁性分离器装置以3L/min的流速在35分钟内从10LPBS溶液中分离并集聚接近200ml沉降的磁性颗粒。
包括在流动系统装备中的磁性分离器装置，其包括基于商业装置(来自英国谢菲尔德的Eclipse Magnetics Ltd.的AutoMag Compact(AMC))的磁性分离器装置。在所述工艺中，AMC原始磁性过滤器经过改造在外壳底部具有两个额外出口，对应于排放阀，图5中的部件3，从而允许简化所述装置的排放并且导致磁性颗粒的高效回收和集聚，磁性颗粒然后被回收并进行再循环。
10L细胞培养物/进料罐1、废物容器和用于收集磁性颗粒的5L容器如图5所示的那样进行连接，包括必需的额外管道、阀门和连接器。在这个实验装备中，泵7是以至少3L/min的流通能力运转的蠕动泵。
磁性颗粒：200ml沉降的磁性颗粒如上面所描述的那样生产。所述工艺当然适用于其他颗粒，诸如市售颗粒，条件是它们表现出显著的磁力并且对待捕获分子具有必要的亲和性。
如本实验中使用的工艺包括以下步骤：磁性颗粒的捕获、所捕获磁性颗粒的洗涤以及磁性颗粒的释放和回收。下面进一步描述这些步骤。
磁性分离系统的准备/清洗：在磁性颗粒被捕获在磁性分离器装置和流动系统装备中的捕获单元中之前，通过以下方式利用去离子水洗涤所述装置：加入10L水并以3L/min流速再循环15分钟，然后排空系统。
磁性颗粒的捕获：将磁性颗粒悬浮在10L PBS溶液中并转移至10L细胞培养物/进料罐，图5中的部件1中。使所述带有磁性颗粒的溶液以3L/min流速再循环通过具有启用的磁体的磁性分离器装置，图5中的部件2。在再循环35分钟后，溶液变得澄清，在视觉上觉察到进料罐中的黑色磁性颗粒消失。因而，磁性颗粒被完全捕获在磁性分离器装置中的磁体上。然后将不带磁性颗粒的澄清溶液从磁性分离器装置排放到废物容器中。针对磁性颗粒损失量检查这个10L废物溶液。然后使溶液通过玻璃过滤漏斗，在这里磁性颗粒从溶液中被保留下来。接近100μl沉降的磁性颗粒可从废物溶液中分离出来。这相当于初始添加的磁性颗粒的0.05％。
所捕获磁性颗粒的洗涤：然后将5L PBS溶液加入到细胞培养物/进料罐中，并使其从磁性分离器装置涌出而进入出口废物容器中。流速为3L/min。磁性分离器装置中的磁体仍然是启用的以将颗粒保留在装置中。
磁性颗粒的释放和回收：然后在磁性分离器装置，图5中的部件2中装入体积接近2L的PBS溶液。此后，停用磁性分离器装置中的磁体，使其从过滤器，图5中的部件8中缩回，从而使颗粒释放出来。然后磁性颗粒沉降到过滤器的底部。
然后，打开位于磁性分离器装置外壳底部的排放阀，图5中的部件3，以便从磁性分离器装置中回收磁性颗粒。将所回收的磁性颗粒与2L PBS溶液一起收集在容器中。
检查所收集的级分以确定所收集的磁性颗粒的量。发现很大一部分，磁性颗粒的98％。
实施例3.免疫球蛋白与蛋白A的结合和洗脱
使用包括在流动系统装备中的磁性分离器装置，在大规模细胞培养物实验中测试磁性颗粒。规模适合1000克或10-1000升细胞培养物，将不进行特殊的过滤以将细胞从细胞培养物中除去。颗粒可以在处理细胞培养物批料后从系统中移出，或者磁性颗粒可在系统中储存在抑菌溶液中。
使用10升1M NaOH溶液彻底地清洗包括在流动系统装备中的磁性分离器装置。使该溶液在系统中循环，从而使它与所有管道、阀门和组件接触。接触时间为约30分钟以高效地清洗和消毒过滤器。
将流动系统装备中的磁性分离器装置，包括所有管道和蠕动泵，用去离子的无热源水冲洗，接着用PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)冲洗。
然后将清洗过的磁性分离器装置无菌地连接至细胞培养物罐。首先使磁性元件8从磁性分离器装置中缩回，以消除磁力并让磁性颗粒从所述装置通过。
通过GPC-HPLC或通过ELISA确定批料中抗体的含量和浓度。然后基于GPC-HPLC或ELISA的结果计算出待添加到磁性分离器装置中的细胞培养物的相应体积。
然后，将储存在抗菌溶液中且之后用PBS缓冲液平衡的干净的蛋白A磁性颗粒(允许以30mg/mL沉降颗粒结合的目标颗粒量)加入到细胞培养物罐/再循环罐中，并使其保持悬浮，同时使细胞培养物循环、环回(looping)通过磁性分离器装置并返回至细胞培养物/再循环罐。所述环回继续大约30分钟以实现抗体从细胞培养物中的完全提取以及抗体在磁性颗粒上的完全吸附。
接着，启用磁体从而使起始磁性颗粒在磁性分离器装置的磁体上的粘附。这是为了从细胞培养物中除去具有吸附到其上的抗体的磁性颗粒。
环回现在一直继续直到溶液澄清，即，所有颗粒都被捕获，包括所吸附的蛋白。细胞培养物溶液的澄清可通过窥视孔和OD 500-600nm感测器，图5中的部件6观察。光密度测量使得使该工艺自动化成为可能。光密度监测感测器和系统可从商业供应商例如德国DASGIP Information and Process Technology GmbH获得。
接着，经由排放阀，部件3，将溶液从磁性分离器装置排放出来，接着使体积为10升的冲洗缓冲液通过系统(PBS)到达废物，图中的出口废物中。这样做是为了从磁性分离器装置中高效地除去细胞培养肉汤和细胞。
接着，使磁体缩回以使得颗粒能够再悬浮。这通过使PBS缓冲液通过磁性分离器装置并使其再循环回到洗涤罐来实现。该PBS是从洗涤罐添加的，体积为大约10升。所述再循环、环回继续15分钟以使经由蛋白A配体非特异性地结合至磁性颗粒的杂质(宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、内毒素等)释放出来。然后启用磁体，并且维持循环直至根据OD感测器在溶液中观察不到颗粒为止。然后将溶液从系统排放出来。将这个步骤再重复两次。
现在当从洗涤罐，图5中的部件4添加洗脱缓冲液(柠檬酸60mM pH 3或100mM氨基酸缓冲液pH 3)时，磁体保持启用状态，缓冲液的体积为约2升。再循环经由洗涤罐，部件4开始，通过泵，部件7，并且返回至洗涤罐，部件4，停用磁体，使其缩回。所述循环继续大约15-20分钟以高效地洗脱，使抗体从磁性颗粒中释放出来。
接着，启用磁体以使得颗粒能够从含有洗脱的抗体的溶液中被除去。当基于视觉观察或使用OD感测器判断溶液澄清时，中断再循环、环回。
然后通过气体进口阀，图5中的部件10使用压力为0.5-1巴的氮气(N2)对磁性分离器装置进行加压。在此时关闭所有其他阀门。通过打开过滤阀，部件12，使含有抗体的洗脱物从外部0.22微米过滤器，部件9通过，进入合适的干净的外部容器中，以便高效地从含有抗体的溶液中除去颗粒和微生物。
当前面三个步骤总共已经执行约30-45分钟时，将1M Tris缓冲液(pH 7)以1:10的比例加入到洗脱物中，以中和溶液的pH。保持时间与低pH一起充当潜在的病毒灭活步骤。这充当第一病毒灭活步骤，这是在使用哺乳动物细胞时抗体纯化工艺所必需的。
回收和清洗磁性颗粒用于再使用：保持磁性颗粒粘附至过滤器的磁体，并使约10升由60mM柠檬酸组成的CIP缓冲液(pH 3)从洗涤罐再循环，经由磁性分离装置再循环回到洗涤罐，持续约15分钟，然后从过滤器，废物出口排放出来。
接着，使10升补充有0.5M NaCl和1％Tween的PBS缓冲液如步骤1中那样在过滤器上再循环、环回约15分钟，然后从系统排放出来。
重复步骤2，但是现在使磁体缩回15分钟以便颗粒返回到悬浮液中。然后启用磁体以便根据视觉观察或基于OD感测器信号将颗粒从溶液中除去。然后将溶液从系统中排放出来。
然后将体积大约10升由10％v/v乙醇或丙醇组成的抑菌溶液加入到洗涤罐中，同时移除磁力，如步骤1-2中那样环回，以便使颗粒再次返回至悬浮液中。约15分钟后，再次启用磁体并且将澄清溶液排干。
然后将体积为2升的额外的抑菌溶液加入到过滤器中，并停用磁体。释放的颗粒现在沉降到过滤器的底部圆锥体中。现在将0.5-1巴的低压氮气施加在过滤器上。缓慢打开排放阀以便将过滤器排空到储存器皿中。现在将颗粒于2-8℃储存在抑菌的20％乙醇溶液中直至进一步使用。
替代地，将磁性颗粒储存在过滤器中的抑菌溶液中直至进一步使用。当再使用磁性颗粒时，它们将经受可能的微生物污染的控制和内毒素缺乏的控制，例如使用LAL试验(鲎变形细胞溶解物试验，可从各种商业供应商，例如瑞士Lonza Group Ltd.获得)。
实施例4.免疫球蛋白与蛋白A的结合和洗脱
在磁性分离器装置中，以相当于约1000克产品或10-1000升细胞培养物的批量，处理来自大规模细胞培养物的磁性颗粒，接着进行过滤从而从细胞培养物中除去细胞。
过滤的细胞培养物从与图5中的部件13相对应的细胞培养物罐添加，经过0.22微米过滤器，部件14，到达细胞培养物/再循环罐，部件1。所有其他步骤都如实施例3中所描述的那样执行。
尽管为了理解清晰起见用说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明的教导将容易明了，可在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下对本发明作出某些改变和修改。

Claims (15)

1.一种用于大规模地分离分子的工艺，其包括以下步骤：
-提供磁性颗粒(P)，所述磁性颗粒(P)对待分离的所述分子具有亲和性，
-将所述磁性颗粒(P)与含有所述分子的溶液混合在一起，
-使所述混合物与包括流动通道和至少一个磁性元件的磁性分离装置接触，
-除去所述至少一个磁性元件并收集携带所述分子的所述磁性颗粒(P)，
-使所述分子与所述磁性颗粒(P)分离，
-获得所述分子的浓缩级分，以及
-使所述磁性颗粒(P)再循环，
其中所述磁性颗粒(P)是具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的连接的内表面的颗粒，所述颗粒(P)包括至少一种聚合物、位于所述外表面和内表面上的官能团以及共价结合至所述颗粒(P)的所述内表面和外表面的磁性颗粒(Mp)，其中所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于所述颗粒(P)的所述孔隙的至少95％的平均直径。
2.根据权利要求1所述的工艺，其中所述磁性颗粒(P)包括选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、丙烯酸酯、右旋糖酐以及它们的衍生物组成的组中的材料。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述磁性颗粒(P)携带包括选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、环氧基、S-Au、酰胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季铵基乙基、羧基甲基、磷酸基和磺基丙基组成的组中的至少一者的官能团。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述磁性颗粒(P)携带选自由IDA(亚氨基二乙酸)及其衍生物、TED(三(羧甲基)乙二胺)及其衍生物、CM-Asp(羧基甲基化天冬氨酸)及其衍生物、NTA(次氮基三乙酸)及其衍生物、TREN(三(2–氨基乙基)胺)及其衍生物、DPA(二甲基吡啶胺)及其衍生物、C6–S凝胶(己基硫基基团)及其衍生物、EDTA(乙二胺四乙酸)及其衍生物组成的组中的官能团。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述磁性颗粒(P)携带至少一种选自由CnHm(1≤n≤20 4≤m≤42)、苯酚及其衍生物、硫代苯酚及其衍生物以及巯基吡啶及其衍生物组成的组中的基团。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
7.根据权利要求1所述的工艺，其中所述亲和性是使用在磁性颗粒(P)上引入的适合于分子相互作用的分子来获得。
8.根据权利要求5所述的工艺，其中适合于分子相互作用的分子是选自由有机分子、蛋白质、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、维他命、糖缀合物、核酸、凝集素以及碳水化合物组成的组中的至少一者。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述磁性颗粒(P)包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包括官能团。
10.根据权利要求1所述的工艺，其中所述磁性分离装置包括流动通道或容器，并且其中将所述磁性元件施加到所述通道或容器的外面。
11.根据权利要求1所述的工艺，其中所述磁性分离装置包括容器，并且其中将中空物体引入到所述容器内的混合物中，其中所述中空形状具有与所述混合物接触的外表面，以及磁性元件可移动地插入在其中的内部容积。
12.根据权利要求1所述的工艺，其中所述磁性分离装置包括流动通道，并且其中将所述磁性元件被施加到所述流动通道的外面。
13.一种用于大规模地分离分子的系统，其至少包括：
-用于储存对待分离的所述分子具有亲和性的磁性颗粒(P)的储存罐，
-用于将所述磁性颗粒(P)与含有所述分子的溶液混合在一起的反应器，
-包括流动通道和至少一个磁性元件的磁性分离装置，以及
-用于输送磁性颗粒(P)与含有所述分子的溶液的混合物的泵，
其中所述磁性颗粒(P)是具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的连接的内表面的颗粒，所述颗粒(P)包括至少一种聚合物、位于所述外表面和内表面上的官能团以及共价结合至所述颗粒(P)的所述内表面和外表面的磁性颗粒(Mp)，其中所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于所述颗粒(P)的所述孔隙的至少95％的平均直径。
14.根据权利要求13所述的系统，其进一步包括用于光密度监测的光密度感测器。
15.根据权利要求13所述的系统，其进一步包括用于利用惰性气体对所述系统加压的气体进口。
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