CN112752847A - 磁性分离 - Google Patents

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K·米德尔顿
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Abstract

本文公开了用于自动磁性分离生物样品中磁化靶标的系统、装置和方法，其中它们包括磁场屏蔽/屏障，所述磁场屏蔽/屏障可控地操作以通过到达和吸引所述生物样品中的所述磁化靶标来控制磁场。

Description

磁性分离
技术领域
本发明涉及用于从生物样品中自动磁性分离靶标的装置、方法和系统。此类装置、方法和系统发现在各种临床和实验室环境中使用。
背景技术
磁性分离已经被用作通过应用各种不同的工艺从流体中分离磁性杂质的方法(U.S.3,985,646；U.S.4,054,513；和U.S.5,137,629)。磁性分离技术也已经被应用于使用磁珠分离生物材料的群体，所述磁珠已经用抗体或聚合物包被以与各种生物靶结合，包含病毒、细菌和细胞(U.S.3,970,518；U.S.4,219,411；U.S.4,795,698；和U.S.5,385,707)。然后可以使用例如在U.S.4,710,472；U.S.5,691,208；U.S.6,193,892和Zborowski等人,(Journal of Magnetism and Magnetic Materials,vol.194,pp.224-230,1999)中描述的先前开发的磁性分离装置之一从流体悬浮液中提取生物靶。在分离装置中产生的磁场对悬浮在其中的磁珠施加力，这可以将磁珠从流体悬浮液(如在Shevkoplyas等人,(Lab on aChip,vol.7,pp.1294-1302,2007)和Warnke(IEEE Transactions on Magnetics,vol.39,issue 3,pp.1771-1777,2003)中描述的)以及与磁珠结合的任何生物材料中吸出。这允许通过从流体悬浮液中去除所需的群体(被称为阳性选择)，或者通过从流体悬浮液中去除所有其他群体以仅留下非磁性结合的目标群体(被称为阴性选择)来分离所需的群体。从异质细胞群体中分离细胞(诸如T细胞和干细胞)对于开发用于治疗各种疾病的细胞疗法是必要的。
一个系统在周围的磁体中利用静力悬浮(STEMCELL
Figure BDA0002995936310000011
的EasySepTM)。其他自动化的并使用磁珠来分离靶群体的系统也是已知的(来自Milytenyi Biotec的
Figure BDA0002995936310000012
和来自STEMCELLTMTechnologies的RoboSepTM)。
对于生物样品中所选靶标的快速和可靠的磁性分离仍存在未满足的需求，其中磁场的施加可以是自动化的、定制的和受控的，以用于以期望的高产量和高纯度分离靶标。
发明内容
本发明提供了一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：a.将靶生物群体与磁性颗粒结合；b.使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；c.将与磁性颗粒结合的靶生物群体暴露于磁场梯度；d.重复步骤b-c一次或多次；和e.收集与磁性颗粒结合的靶生物群体。
本文还提供了一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：a.将靶生物群体与磁性颗粒结合；b.使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；c.将与磁性颗粒结合的靶生物群体暴露于磁场梯度，以捕获与磁性颗粒结合的靶生物群体；d.使生物样品的未结合组分循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；e.在与磁性颗粒结合的靶生物群体和磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以释放与磁性颗粒结合的靶生物群体；f.使与磁性颗粒结合的靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；g.重复步骤b-f一次或多次；以及h.收集与磁性颗粒结合的靶生物群体。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：a.将非靶生物群体与磁性颗粒结合；b.使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；c.将与磁性颗粒结合的非靶生物群体暴露于磁场梯度；d.重复步骤b-c一次或多次；和e.收集靶生物群体；
在仍另外的实施例中，本文提供了一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：a.将非靶生物群体与磁性颗粒结合；b.使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；c.将与磁性颗粒结合的非靶生物群体暴露于磁场梯度，以捕获与磁性颗粒结合的非靶生物群体；d.使生物样品的靶标循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；e.在与磁性颗粒结合的非靶生物群体和磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以释放与磁性颗粒结合的非靶生物群体；f.使与磁性颗粒结合的非靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学途径；g.重复步骤b-f一次或多次；和h.收集靶生物群体。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本文描述的典型方面的以下描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前典型的方面。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的方面的精确布置和设置。应当注意，相同的附图标记指代不同实施例中相同的要素，如附图所示和说明书中所提到的。
根据以下附图，将更全面地理解本文的描述：
图1示出了用于移动磁性颗粒的磁场梯度；
图2示出了用于细胞分离应用的不同大小的磁珠；
图3示出了磁珠大小对响应于磁场梯度作用在磁珠上的净磁力的影响；
图4示出了用于产生自动控制的磁场的不同概念方法；
图5示出了高磁导率和饱和度材料阻挡磁通量密度的能力的计算模型；
图6示出了在盒上磁性分离管的并入；
图7示出了与磁体阵列704对准的分离管701的计算机辅助设计(CAD)模型，该磁体阵列由具有交替磁极702和703的稀土磁体组成；
图8示出了处于“打开”位置的与磁体阵列704对准的分离管701的CAD模型组件，其被放置在磁场屏蔽801内，该磁场屏蔽可以使用马达802和齿轮系803旋转；
图9示出了处于“关闭”位置的与磁体阵列对准的分离管701的CAD组件，其中磁场屏蔽801位于管701和磁体阵列704之间；
图10示出了处于“打开”或“关闭”位置的组件的横截面视图；
图11示出了由分离管701组成的盒1101的完整组件，分离管与包含磁性分离组件(704和801)的细胞培养仪器1102对准；
图12展示了产生局部高磁场梯度的不同非限制性方法(部分1201-1208)；
图13示出了从工作实例1获得的结果，证明了在不同流速下细胞与磁珠的成功分离；
图14示出了从工作实例2获得的结果，证明了不同流速对阳性选择的细胞的捕获和释放的影响；
图15示出了来自工作实例3的结果，该工作实例在阳性选择的细胞的捕获和释放方面通过分离管701向磁性分离工艺添加多次通过；
图16示出了来自工作实例4的结果，该工作实例在阳性选择的细胞的捕获和释放方面通过增加等待时间来增加磁珠暴露于磁场；
图17示出了各种过程修改如何可以修改从工作实例4获得的假阳性的百分比；
图18示出了从工作实例5中获得的纯化流过分离管701经过磁体阵列704的混合细胞群体的结果；
图19示出了从工作实例6获得的结果，证明了修改磁体702和703的尺寸如何可以影响由磁体阵列704和细胞捕获产生的磁场性质；和
图20示出了从工作实例7中获得的关于向盒添加棒/间隔物1201的效果的结果。
图21示出了根据本发明实施例的再循环磁性分离方法的示意图。
图22A-22D示出了根据本发明实施例的纯化和废弃细胞的回收。
图23A-23B示出了根据本发明实施例的珠从细胞中释放的效率。
图24A-24C示出了与磁场接触的强度和多次循环的影响。
图24D-24E示出了如本文所述的分离管中细胞的捕获和去除。
图25A-25L示出了如本文所述的靶细胞的阳性和阴性选择的结果。
图26A-26D示出了在如本文所述的自动化细胞培养系统中细胞的回收。
图27A-27B示出了在如本文所述的自动化细胞培养系统中洗涤后磁性颗粒的回收。
具体实施方式
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入。本文所讨论的出版物和申请仅仅是提供其在本申请的申请日之前公开的内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明先于此类公开。此外，材料、方法和示例仅是说明性的，而不是限制性的。
在有冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以便有利于理解本发明。
如本文所使用的，元件或部件前面的冠词“一(a)”和“一个(an)”旨在对元件或部件的实例(即出现)的数量是非限制性的。因此，“一”或“一个”应理解为包含一个或至少一个，并且元件或部件的单数形式也包含复数，除非该数字明显是指单数。
如本文所使用的，术语“发明”或“本发明”是非限制性的术语，并且不旨在指特定发明的任何单个方面，而是包括如在说明书和权利要求书中所述的所有可能的方面。
如本文所使用的，术语“包括(comprises和comprising)”、“包含(includes和including)”、“具有”及其变形和缀合物表示“包含但不限于”。
如本文所使用的，修饰所采用的成分、组分或反应物的量的术语“约”是指数值量的变化，该变化可以例如通过用于制备浓缩物或溶液的典型测量和液体处理程序而发生。此外，变化可能由于测量程序中的意外错误、用于制备组合物或实施方法的成分的制造、来源或纯度的差异等而发生。在一个方面中，术语“约”是指在报告的数值的10％以内。在另一个方面中，术语“约”是指在报告的数值的5％以内。然而，在另一个方面中，术语“约”是指在报告的数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％以内。
如果列举了值的范围，这仅仅是为了方便或简洁，并且包含所有可能的子范围以及该范围内和该范围边界附近的单个数值。除非另有说明，否则任何数值都包含实际的接近值，并且整数值不排除小数值。子范围值和实际接近值应被视为具体公开的值。
应当理解，本文定义为包含的任何部件都可以通过限制性条款或负面限制的方式从所要求保护的发明中明确排除。
如本文可以使用的，术语“接近”、“近似”和“实际上”表示相对于所引用的术语或实施例或操作或本发明的范围没有不利后果或影响的相应关系或度量或量或定量。
如本文中可以使用的，涉及几何关系，诸如“竖直”、“水平”、“平行”、“相对”、“直的”、“横向”、“平行”、“垂直”和其他角度关系的任何术语也表示近似但功能性和/或实用性的相应关系。
如本文中可以使用的，术语“优选的”、“优选地”、“典型的”、“典型地”或“任选地”不限制本发明或其实施例的范围。
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如本文中可以使用的，术语“可忽略的”和“轻微的”(或其同义词)表示足够小的相应关系或度量或量或数量或程度，以相对于所引用的术语和本发明的范围不具有实际后果。
如本文所使用的，术语“可以”表示被包含或不被包含和/或被使用和/或被实施和/或发生的选项或效果，然而该选项构成本发明的一些实施例的至少一部分或其结果，而不限制本发明的范围。
如本文所使用的，“样品”可以是任何样品，并且可以是可以来自植物、人、动物或微生物来源的“生物样品”。样品通常是多相样品，从中选择靶标用于进行分离和收集。靶标可以是细胞、DNA、RNA、蛋白质、肽、微生物、病毒等。生物样品包含靶群体。
生物样品可以包括体液样品、身体细胞样品或生物组织样品。生物样品或体液样品的示例包含尿液、淋巴液、血液、血浆、血清、唾液、宫颈液、宫颈-阴道液、阴道液、乳腺液、母乳、滑液、精液、精液、粪便、痰、脑脊液、眼泪、粘液、间质液、滤泡液、羊水、房水、玻璃体液、腹膜液、腹水、汗液、淋巴液、肺痰和灌洗液或由其衍生的样品。生物组织样品是含有细胞聚集体(通常为特定种类)以及细胞间物质的样品，细胞间物质形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包含结缔组织、上皮组织、肌肉和神经组织。生物组织样品的示例还包含器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单独的细胞。例如，样品可以是怀疑为癌性的组织样品。可以首先处理生物组织样品以分离细胞聚集体。
在实施例中，生物样品是血细胞、白血细胞或血小板。白血细胞(白细胞)包含中性粒细胞、淋巴细胞(T细胞，包含T辅助细胞、细胞毒性T细胞、T-杀伤细胞、自然杀伤细胞和B淋巴细胞)、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。
如本文所使用的，“靶细胞”是通常用于与其他细胞分离或浓缩(诸如用于检查或诊断)、具有特定类型或相对于其他细胞具有不同特征(诸如与某些抗体或其他化合物或其他颗粒偶联的选择性相互亲和力)的细胞。在特定实施例中，独特的特征是与磁珠偶联或结合以形成磁性靶细胞的选择性亲和力。
如本文所使用的，术语“患者样品”被定义为取自预期对其进行诊断、筛选、监测或治疗的任何动物的生物样品。动物包含哺乳动物。患者是指受试者，诸如患有疾病病症或疾病病症待确定或治疗的哺乳动物、灵长类动物、人类或家畜受试者。患者样品可以是源生物群体的来源。
如本文所使用的，术语“抗体”旨在包含任何同种型(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)的多克隆和单克隆抗体或其抗原结合部分，包含但不限于F(ab)和Fv片段诸如sc Fv、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组工程改造的抗体和Fab表达文库。双特异性抗体也可以被固定在磁性颗粒上。
如本文所使用的，“标记部分”是可直接或间接检测的。标记部分可以是可检测的标记，并且可以与磁性颗粒结合使用。直接标记部分包含放射性同位素；其产物可检测的酶(例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶等)；荧光标记物(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、藻红蛋白、花青染料、层叠蓝(Cascade Blue)、PerCP、Cy5、Cy7、别藻蓝蛋白(APC)、PECy5或不同荧光染料的其他串联缀合物、德克萨斯红等)；荧光发射金属，例如152Eu或镧系元素系列的其他金属，其通过金属螯合基团诸如EDTA与蛋白质连接；化学发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等；生物发光化合物，例如荧光素、水母发光蛋白(绿色荧光蛋白)等；和金属化合物。间接标记部分包含与多肽结合的标记分子，例如对多肽具有特异性的抗体，其中标记的结合分子如上所述被标记；和特异性结合对的成员，例如生物素、(特异性结合对生物素-亲和素的成员)、洋地黄毒苷(特异性结合对洋地黄毒苷-针对洋地黄毒苷的抗体的成员)等。可替代地，标记部分可以是任何合适的标记，包含但不限于本文所述的那些。
用结合伴侣诸如抗体、蛋白质或核酸分子标记的磁性颗粒可从Miltenyi BiotecGmbH(Friedrich Ebert Str.68,D-51429Bergisch Gladbach,Germany)购得。用于磁性地标记生物分子的方法在本领域中是已知的；可以使用任何已知的方法。例如，美国专利第6,020,210号描述了用于制备磁性颗粒和将生物分子附着于其上的方法。特异性结合对的第一成员可以与磁性颗粒缔合，其中待修饰的生物分子包括与特异性结合对的成员结合的部分。可替代地，磁性颗粒通过接头或间隔物(诸如例如核酸接头)与例如抗体或其免疫反应性片段偶联。间隔物或接头的添加将允许生物分子以更灵活的方式呈现，并且精细的化学可以以特定的方向连接配体。存在多种用于这些偶联的化学物质，因为许多公司已经公布了方案，并将帮助本领域技术人员掌握化学物质。
可以与磁性颗粒连接的特异性结合对的成员的示例包含但不限于寡dT(用于与核酸分子结合，所述核酸分子包括例如3’端处的聚-A束)；具有特定核苷酸序列的寡核苷酸(用于与包括互补核苷酸序列的核酸分子结合)；亲和素(例如链霉亲和素)(用于与生物素化的生物分子结合)；抗原结合多肽，例如免疫球蛋白(Ig)或其表位结合片段(用于与包括由Ig识别的表位的生物分子结合)；多核苷酸结合蛋白(用于与多核苷酸结合)，例如转录因子、翻译因子等；Ni或Co螯合物(用于固定多聚组氨酸标记的蛋白质)；受体-配体系统或其他特异性蛋白质-蛋白质相互作用对；适体(例如，用于三维分子靶的核酸配体)；凝集素(用于结合糖蛋白)；脂质和磷脂类(与脂质结合蛋白结合)，例如磷脂酰丝氨酸和膜联蛋白V。本领域技术人员将认识到可以与磁性颗粒连接的特异性结合对的其他成员。
生物分子也可以通过直接化学缀合或通过物理缔合与磁性颗粒偶联(共价或非共价)。此类方法在本领域中是众所周知的。生化缀合描述在例如，"BioconjugateTechniques"Greg T.Hermanson,Academic Press中。非共价相互作用，诸如离子键、疏水相互作用、氢键和/或范德华引力也可以用于将生物分子与磁性颗粒偶联。例如，可以使用用于将生物分子与色谱基质结合的标准非共价相互作用。可以用于将生物分子与磁性颗粒结合的此类非共价相互作用的一个非限制性示例是在离液盐的存在下与二氧化硅结合的DNA。本领域技术人员知道其他此类非共价结合和用于实现此类非共价结合的条件。参见，例如，Molecular Cloning,Sambrook and Russell,Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
如本文所使用的，“磁性颗粒”用作生物样品(诸如但不限于抗体、DNA、多肽和细胞)中生物分子靶的标记，以帮助它们从样品的复杂混合物中分离。磁性颗粒可以根据大小分类：约<50nm的微珠；约100至约200nm的纳米珠；和约1-5μm的动态珠。此外，磁性颗粒可以适于选择性亲和(官能化)以与所需的生物分子靶诸如与荧光标记、抗体、核酸等偶联或结合。
不同的磁性颗粒可从多个来源获得，包含例如Dynal(Norway),AdvancedMagnetics(Cambridge,Mass.,U.S.A.),Immuncon(Philadelphia,U.S.A.),Immunotec(Marseilles,France),和Miltenyi Biotec GmbH(Germany)。优选的磁性标记方法包含尺寸范围为5至200nm，优选地尺寸为10至100nm的胶体超顺磁性颗粒。这些磁性颗粒允许对细胞进行定量磁性标记，因此偶联的磁性标记的量与结合产物的量成比例。例如，通过Miltenyi Biotec GmbH可获得具有各种特异性的胶体颗粒。
如本文所使用的，“分离”包含从周围的流体块中分离或收集积累的靶细胞，其中所述块是例如细胞乳液的流体混合物或悬浮液或其组合，还意味着靶细胞相对于周围块或所提供的细胞样品的浓缩或富集(类似于沉淀或离心获得沉淀)。
如本文所使用的，关于分离的“耗尽”是指从块中除去靶细胞(类似于沉淀或离心获得上清液)。
如本文所使用的，“高定性”(分离、耗尽)是指基本上排除其他细胞或包括可忽略量的其他细胞，诸如约10％至约1％或更少的分离细胞的靶细胞的高纯度分离，和相反的耗尽。
如本文所使用的，“高定量”(分离，耗尽)是指基本上所有靶细胞或来自样品的非常大量的靶细胞，诸如约80％至约99％或更多的分离细胞的高回收率分离，和相反的耗尽。
应注意，每当本文提及细胞附着或粘附或粘附到管的壁，或与此类似的术语，其不一定意味着细胞直接附着到壁，而是它们还间接连接或链接或吸引到壁，诸如通过细胞链或细胞组。
如本文所使用的，“磁屏蔽”通过用“磁场屏蔽”(在本文中也被称为磁场屏蔽/屏障，其中两个术语可互换)来阻挡磁场来减小和/或阻挡空间中的磁场。
如本文所使用的，“HMPSM”表示高磁导率和饱和度材料，其在其内部产生高度集中的磁场，有效地减小和/或消除磁场的影响。
如本文所使用的，“磁场屏蔽/屏障”是可以相对于磁场的使用来控制的结构。
如本文所使用的，“电磁体”是其中磁场由电流产生的磁体类型。当电流关闭时，磁场消失。电磁体通常由缠绕成线圈的导线组成。通过导线的电流产生磁场，该磁场集中在线圈中心的孔中。线匝通常围绕由铁磁性材料或亚铁磁性材料诸如铁制成的磁芯缠绕；磁芯集中了磁通量并且形成更强大的磁体。
如本文所使用的，“永磁体”是这样的磁体：其是永磁性的，与电磁体相反，电磁体仅在电流流过时才表现得像磁体。永磁体由如磁体矿(Fe3O4)(最具磁性的天然存在的矿物)或钕(一种强磁性合成物质)的物质制成。
如本文所使用的，“磁体阵列”是一个或多个磁体。一个或多个磁体可以是永磁体或电磁体。一个或多个永磁体可以是线性阵列，具有不同的尺寸、不同的强度，配置在垂直于线性阵列轴线的相反磁极方向上，或者配置为在垂直于线性阵列轴线的平面中彼此旋转90°。阵列中的任何数量的磁体可以物理地保持在一起或粘接地保持在一起。永磁体可以是选自铁、钕、钐钴或铝镍钴的材料。
下面给出了本发明和实施本发明的一般非限制性概述。该概述概述了本发明的实施例/方面的示例性实践，为变型和/或替代和/或不同的方面/实施例提供了构造基础，其中一些方面/实施例随后被描述。
本公开涉及用于通过阳性或阴性选择磁性地分离和收集生物样品中的所需生物分子靶的装置、方法和系统。如本文所述，产生基本上邻近包含所需的磁化生物分子靶的生物样品的磁场。磁场可以以自动方式切换“开”和“关”，从而提供所需强度、连续持续时间、间歇持续时间、脉冲持续时间及其组合的磁场。这通过引入磁场屏蔽(本文中也被称为磁场屏蔽/屏障)来实现，以在功能上控制遇到的/施加到生物样品的磁场的施加。磁场屏蔽/屏障位于磁场源与生物样品之间，并且由于其高磁导率和饱和度材料(HMPSM)，在其内部产生高度集中的磁场，这有效地减少和/或消除磁场对含有磁化的生物分子靶的生物样品的影响。
在本发明的一个方面中，在生物反应器容器中培养细胞生物材料，并且期望的细胞是用于磁性分离和收集的生物分子靶。
本文所述的装置、方法和系统通常采用一种方法，由此生物样品(异质生物群体)(其通常是但不限于细胞)具有与样品中的特定生物分子靶(特定细胞类型)结合的磁珠，从而产生“磁化的细胞”。典型的结合方法可以包含：i)与生物靶的抗体缀合的磁珠的直接结合；和ii)使用多步骤工艺，其中所述生物靶与抗体结合，所述抗体与另一抗原或结合对缀合。然后，该抗原/结合对与磁珠结合，磁珠与相应的抗体/结合对缀合。在磁性分离期间，作为附着在磁珠上的靶细胞的磁化的细胞(表达抗原；阳性选择的)被吸引到磁体附近的位置，而未附着于珠的细胞群体(阴性选择的)保留在生物样品的培养基中，并且容易从结合的群体中除去。磁性细胞选择的备选工艺是使用抗原呈递磁性微珠刺激靶标上的某些类型的生物过程(诸如用与磁性活化珠偶联的抗CD3和抗CD28激活T细胞)。在刺激后，必须在下游处理之前去除磁珠，这需要用有效的磁体处理细胞悬浮液。
在分离期间，磁性倾斜的颗粒受到来自外加磁场B的力矢量F的作用，该力矢量作用在顺磁颗粒上，如下式1所示(Pamme,2006)。
Figure BDA0002995936310000091
其中V是颗粒的体积，Δχ是颗粒和周围介质的磁化率(变得磁化的能力)之差，μ0是真空的磁导率，并且
Figure BDA0002995936310000095
是磁场与梯度算子之间的点积。从该等式中可以明显地看出，磁性分离系统的成功取决于多个参数。首先是颗粒大小，其中较大的颗粒会受到较强的磁力。存在3种典型的磁性颗粒的大小分类，i)<50nm(例如Miltenyi Biotec的
Figure BDA0002995936310000092
MicroBeads)，ii)100-200nm(例如
Figure BDA0002995936310000093
的Nanobeads)，或iii)1-5μm(例如，Invitrogen的
Figure BDA0002995936310000094
)，它们随着大小的增加更容易分离。接下来，增加磁珠相对于周围介质的磁化率。由于大多数珠通常由铁芯组成，并且周围介质实际上不可磁化，因此该值通常已经相对较大。最后，增加磁场梯度可以显著地增加施加到磁珠上的力。这是因为由于高梯度场的不均匀的空间质量，磁场梯度对磁性颗粒的北极和南极产生不均匀的力(图1A)。这种对颗粒的不均匀力导致颗粒运动。在完全均匀的磁场中，在磁性颗粒的两极上产生相等且相反的力，导致颗粒上的净力为零且没有净运动(图1B)。此外，对于较大尺寸的磁性颗粒，与较小的珠相比，在两个磁极之间由梯度施加的磁力差较大(图2和图3)。
存在诱导“可切换的”(可以打开和关闭)磁场的手段，该磁场可以产生梯度以吸引磁珠用于自动分离、隔离和收集。例如，电磁体通过将载流导线围绕一根易磁化材料(例如铁)棒缠绕而形成(图4A)。它们可以通过分别施加或移除通过导线的电流来打开或关闭。另一种方法是使用电永磁体，它由具有高磁矫顽力(切换磁极的高磁场)的硬磁体和具有低矫顽力的软磁体组成(图4B)。两个磁体通过顺磁性材料(诸如铁)相互连接成完整的磁路。软磁体包裹在载流导线中，并且通过在导线中脉动强电流，可以切换软磁体的磁极。当磁极错位时，磁性“电流”流过顺磁性材料，并且没有观察到外部磁场。然而，当磁极对齐时，磁性电流行进通过空气，并且产生外部磁场。最后一种方法是使用永磁体来产生磁场。通过使用具有高磁饱和度的材料，可以阻挡磁体的一侧上的磁场(图4C)。
在本发明的一个方面中，使用具有交替取向的强永磁体阵列(图4C)。这将从阵列径向产生强磁梯度，以及沿阵列的轴线线性地产生梯度。这种设计的改进是Halbach阵列，其中阵列中的磁体相对于彼此旋转90°(图4D)。这导致磁体一侧上的磁场显著增大，而另一侧上的磁场减小(Kang等人)。
可控磁场可以被设计成执行控制含有生物分子靶的靶生物部分的隔离的顺序活动(通过阳性选择或阴性选择)，同时使得非靶生物部分能够被去除和丢弃。
在使用磁性分离处理生物样品期间，打开和关闭磁场的能力(从而实现阳性和阴性细胞选择的自动化)是一项主要的操作要求。本文所述的装置和方法能够自动收集靶生物群体，从而降低整体工艺复杂性并降低操作成本。
本文所述的“开”和“关”可切换磁场是通过引入磁场屏蔽/屏障来控制用磁性颗粒(诸如磁珠)标记的生物样品所遇到的磁场。通过这种可控磁场，靶生物保留、随后的二次释放和捕获的顺序步骤使得能够生产非常紧凑和节能的磁性分离系统。
磁场屏蔽/屏障因HMPSM的固有特性而发挥作用。这种高磁导率和饱和度导致该材料中的磁场高度集中。将HMPSM部署作为磁场源与生物样品之间的磁场屏蔽/屏障，能够实际消除磁场对生物样品的影响。通过磁屏障的这种可控激活，可以以高再现性和相对低的成本实现靶群体与生物样品的磁性分离。
图1示出了磁性颗粒/磁珠(诸如用于细胞分离和活化的那些)如何响应于磁场梯度的理论。这在数学上以等式1为例。每个磁珠具有北极和南极。当暴露于磁场梯度时，作用在颗粒的每个磁极上的磁力(一个吸引，一个排斥)将会不同，从而产生可以移动颗粒的净力(图1A)。相比之下，当没有磁场梯度时，作用在每个磁极上的力将相等且相反(图1B)。因此，不会对磁性颗粒施加净力，并且不会诱发运动。被布置成使得磁极在北(N)与南(S)之间交替的磁体阵列可以用于产生这些必要的磁场梯度。此外，如图1C所示，通过使用多个强的小的磁体阵列，可以产生高磁场梯度，其中在阵列中的磁极为南北交替方向。
图2示出了通常用于细胞的磁性分离的磁珠大小。目前存在一系列珠大小，从Miltenyi的约50nm
Figure BDA0002995936310000111
MicroBeads到Invitrogen的约5μm
Figure BDA0002995936310000112
增加磁珠大小通常增加磁珠对磁场响应的敏感性，因为作用在磁珠的每个极上的力的差异增大。
图3概述了一种方法，通过该方法，响应于感应磁场，更大尺寸的磁珠被更有效地推出流体。在一些实施例中，珠同时暴露于来自每个珠相应的磁极上的磁场的吸引力和排斥力。远离磁场源移动时，磁场的量级和梯度减小。因此，珠受到的净力取决于距磁场源的距离和珠的直径。较大的珠在两极之间具有较大的距离，导致作用在两极上的磁力差异较大。类似地，更强的梯度(即更靠近磁体)缩放作用在珠的相应磁极上的力的差异。这种净力的增加导致珠更快地被吸引朝向磁体并离开流体。
图4示出了使用自动控制系统产生磁场的方法，该磁场可以相对于应用于生物样品而被打开/关闭。在图4A中，示出了电磁体，其中导线围绕诸如铁的铁磁性材料缠绕。通过向导线施加电流，可以快速且容易地打开以及相反地关闭磁场。然而，由此产生的磁场会很低。此外，电磁体产生大量的热量，这对于局部细胞培养环境来说是很成问题的。图4B示出了由不可切换的稀土磁体和磁极可切换的铝镍钴永磁体组成的电永磁体，两者都设置在形成磁路的铁磁性材料中。当永磁体的磁极对齐时，碳钢采用相同的方向，在磁体周围的空气中产生净磁通量(其可以用于将磁珠从流体悬浮液中拉出)。然而，当两个永磁体的磁极相反时，磁通量被限制在铁磁性材料中，从而阻止了磁珠的提取。铝镍钴磁体的方向通过经由其周围的导线线圈施加非常高量级和短持续时间的电流脉冲来切换，从而产生高量级的瞬态磁场。然而，与稀土磁体相比，由这种设置产生的磁梯度也相当低，并且这种方法还会产生电磁干扰，其可能对任何周围的电子设备产生未知的不利影响。图4C示出了具有相反的磁极方向的永磁体阵列，其中在一侧上带有HMPSM，诸如铁、钴铁和Hiperco 50。通过使用这种HMPSM，磁场的磁通量将在相反侧上被放大，而在具有HMPSM的一侧上被减小到可忽略的水平。通过驱动HMPSM，使得其位于永磁体与磁珠之间，作用在珠上的力可以被有效地减小到零。相反，将HMPSM移动到永磁体的相反侧，可以在珠上感应出很强的磁力。最后，在图4D中，展示了Halbach线性阵列，其中磁体的90°旋转允许在阵列的一侧上产生放大的磁场，而在阵列的相反侧上产生显著减小或消除的磁场。
图5示出了计算建模，展示了HMPSM(标记为x)在永磁体上的功能。磁通量主要通过磁场周围的空气传输。然而，磁通量不够强，无法通过HMPSM传输。这导致在HMPSM与磁体相对的一侧上没有显著的磁通量密度，而磁通量密度主要在永磁体的两极处被放大。
图6展示了通常用于自动化细胞培养系统中的示例性盒的布局，该系统具有用于使用沿盒面的长度延伸的磁珠进行磁性分离的分离管。该管与位于自动化细胞培养系统内的永磁体阵列对齐。分离管与盒内的各种管和袋连接，这些管和袋用于目标细胞的阳性或阴性结合。使用尽可能长的管增加了可以被装载到分离管中的体积，从而减少发生磁性分离的处理时间。
图7提供了图6中所示的分离过程的实施例。附着或未附着于细胞的磁性结合珠可以被装载到分离管701中(图7A)。在一些方面中，分离管701与永磁体阵列704对齐，如图7B所示。在其他方面中，分离管701与替代永磁体阵列704的电磁体对齐。永磁体阵列704由具有交替的北极(702)和南极(703)的永磁体组成，以产生尽可能高的磁通量梯度。分离管701中的磁珠被磁体阵列704吸引，从而成功地从流体悬浮液中分离出磁珠。
图8示出了磁场开启时的磁场屏蔽/屏障的实施例。分离管701沿着永磁体阵列704的长度延伸。围绕永磁体阵列704的一部分的是由HMSPM产生的磁场屏蔽801(示出为顺磁性护套801)。在一些方面中，磁场屏蔽801由纯铁制成。在一些方面中，磁场屏蔽801由软磁铁合金(诸如铁素体钢、硅铁、镍铁或钴铁)制成。在一些方面中，磁场屏蔽801由钴、钒和铁的软磁体合金(诸如约49％钴、约2％钒和余量铁的合金)制成。在一些方面中，护套801可以由Hiperco50或Hiperco 50A制成。在一些方面中，磁场屏蔽801的顺磁性质放大了由磁体阵列704施加到分离管701的磁场梯度。这实际上增加了作用在磁珠上的磁力，允许磁珠更有效地从流体悬浮液中去除，而非磁性物质将不受影响，并且将能够不受阻碍地通过分离管。永磁体阵列704和磁场屏蔽801还连接到伺服机构802和齿轮系803，允许整个组件完全旋转，并且根据需要关闭和打开。
图9示出了与图8中发现的相同的组件，但是磁体处于“关闭”位置。分离管701仍然沿着永磁体阵列704延伸。然而，在关闭位置，使用旋转伺服机构802和齿轮系803旋转磁体阵列704和磁场屏蔽801，使得磁场屏蔽801位于分离管701与永磁体704之间。如图4和图5所述，用于磁场屏蔽801的HMPSM材料阻止磁通量通过。因此，分离管701暴露于的磁通量梯度显著减小，从而失去对磁珠上的磁场的保持。向分离管701施加高流速的液体或气体可以用于冲洗磁珠和磁性结合的细胞。
图10是分离管701、磁场屏蔽801和永磁体阵列704之间的界面的横截面。当处于“打开”位置时，如图10A所示，存在作用在分离管701上的显著磁场，其可以吸引磁性颗粒。当处于“关闭”位置时，如图10B所示，作用在分离管701上的磁场可以忽略不计，并且可以有效地去除先前结合的细胞和珠。
图11是盒1101和自动化细胞培养仪器1102的接口的侧视图。分离管701被附接到盒1101，以允许磁性或非磁性部分从盒1101内的不同区域移动并朝向盒1101内的不同区域移动。相反，磁性分离组件(由704和801一起组成)被包含在自动化细胞培养仪器1102内。与仪器1102相关联的控制系统可以控制伺服机构802和齿轮系803以旋转磁体阵列704和磁场屏蔽801，从而当磁场属于分离管701时将磁场“打开”或“关闭”。当盒1101和仪器1102接口在一起时，分离管701和分离组件(704和801一起)对齐，以允许执行有效的磁性分离。此外，使用与仪器1102相关联的蠕动泵，流体(具有或不具有磁珠和细胞)可以被运输或从分离管701移除。
图12由位于盒1101的外壁与细胞培养仪器1102的外壁之间的分离管701的侧视图组成，具有增加分离管701内磁场梯度的数量和量级的各种装置。图12A示出了顺磁性/非磁性间隔物1201，其在盒1101的外表面上沿分离管701的长度延伸。该间隔物1201用于压缩管701，以最小化流过管701的磁化元件与磁体阵列704之间的距离。同样，来自磁体阵列704的间隔件1201(如果是顺磁性的)的磁化将导致在最靠近盒1101的一侧上的分离管701中形成另一磁场梯度。此外，沿着间隔物1201(未示出)的长度将间隔物1201切割成更小的子部分可以允许在每个间隔物子部分1201的末端的点处产生高梯度磁场。图12B示出了分离管701内的顺磁性丝网1202，当其暴露于由永磁体阵列704产生的磁场时，在丝网1202的线周围产生高磁场梯度。图12C示出了位于分离管701内的顺磁性颗粒1203，当暴露于来自永磁体阵列704的磁场时，该顺磁性颗粒产生局部磁场梯度。图12D示出了顺磁性棒1204，顺磁性棒沿着分离管701的长度延伸，并且被纵向分成较小的子部分(未示出)，并且当暴露于磁体阵列704时能够在每个棒1204的端部处产生高磁场梯度。图12E示出了沿分离管701的长度延伸的一系列顺磁性棒1205，其中当棒1205暴露于来自阵列704的磁场时，在棒之间形成高磁场梯度。图12F示出了顺磁性支架1206，顺磁性支架沿分离管701的长度延伸，其中当暴露于来自阵列704的磁场时，在孔内形成高磁场梯度。图12G示出了分离管701的顺磁性涂层1207，其由当暴露于来自阵列704的磁场时在它们之间产生高磁场梯度的小像差组成。图12H示出了放置在分离管701内的顺磁性过滤器1208，当暴露于来自阵列704的磁场时，顺磁性过滤器在过滤器孔内产生高磁场梯度。
任选地或附加地，在本发明的一些方面中，各种参数是可调节的，诸如磁场强度、生物分子靶的空间分布(浓度)和/或其他参数，诸如温度。例如，可以调节生物样品流体的流速和/或粘度和/或弹性，诸如以允许靶细胞的分离，但至少基本上防止非靶细胞的凝结。在一些实施例中，流体可以用于洗去分离的靶细胞。任选地调节洗涤流体的流动状态和速率，以促进靶细胞从管壁的移出(即，促进移除或释放)，这突然改变流动，由此诱发湍流或冲击，其有助于侵蚀或使管壁上的靶细胞不稳定。
在某些实施例中，通过多种方法和方法的组合(例如，消磁、鼓泡、振动、酶、声波及其组合)将分离的细胞从分离管中释放可以在将细胞从管中洗出之前和/或与之同时进行。可以进行这种外围处理，以在质量和/或质量方面改善分离和期望的靶群体的特性。例如，使用红细胞(RBC)裂解法可能有助于去除粘性RBC，提高纯度，并且从而使得更容易地从一般PBMC群体中分离T细胞。
诸如DNase等所述的酶可以用于帮助细胞释放。
此外，当想要高质量或高纯度耗尽(而不是收集靶细胞)时，可以施加比用于收集的磁场更强的足够强的磁场，代价是非靶细胞粘附在壁上和/或凝固。
所述装置、系统和方法可以体现在用于实施本发明的一种或多种方法的试剂盒及其用途中，所述试剂盒包括一种或多种试剂、一种或多种磁性颗粒、一种或多种结合伴侣、磁体阵列、磁场屏蔽和/或使用说明。
在没有进一步描述的情况下，可以认为，本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实例来制造和利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的典型方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。因此，这些实例仅用于说明的目的，而不应用于以任何方式限制本发明的范围。
实例：
实例1-从流体中分离珠
使用磁性分离系统(704和801)处理使用CD3/CD28 Activation
Figure BDA0002995936310000141
(由Invitrogen生产)激活和扩增的T细胞(衍生自来自Lonza的PBMC)，目的是从珠中分离T细胞。通过分离管701以不同的流速(5、10和20ml/min)加载31ml的珠-细胞(1.6×106个细胞/ml)流体悬浮液(T细胞培养基，94％X-Vivo 15,5％HS,1％P/S,10ng/ml IL-2)，其中磁性分离组件(704和801)被设置为“打开”位置。从分离管收集的流体被称为“细胞级分”，因为细胞(非磁性结合)不太可能从流体悬浮液中去除。磁体组件(704和801)被手动旋转(不使用802和803)到“关闭”位置，使得顺磁性材料801位于分离管701与磁体阵列704之间。在分离管701中进行三次冲洗循环(包括以40ml/min交替进行空气和流体冲洗，每次4ml)，以冲洗掉并收集
Figure BDA0002995936310000142
和附着在管701壁上的任何细胞。这被称为“磁性级分”，因为它由所有磁性吸引的细胞和珠组成。
使用来自两个级分的细胞计数，计算从
Figure BDA0002995936310000143
中成功分离的细胞百分比(即在“细胞级分”中获得的总细胞百分比)。在所有施加的流速下，从
Figure BDA0002995936310000144
中成功分离出的细胞百分比为约95％(图13A)。还使用血细胞计数器对两种液体级分进行计数，以测量各相应的级分中的
Figure BDA0002995936310000145
数。在所有流速下，从细胞中移除的
Figure BDA0002995936310000146
百分比为至少95％(图13B)。
实例2-珠结合细胞通过分离管的连续流动
使用磁性分离组件(704和801)，将链霉亲和素纳米珠(来自
Figure BDA0002995936310000147
)结合到盒1101外部的传代Jurkats，用于阳性选择。首先通过添加阻断剂(5μl/107个细胞，HumanTruStain FcXTM,
Figure BDA0002995936310000151
)阻断细胞(107个细胞/ml)进行非特异性结合，该阻断剂通过在室温下将细胞和试剂一起孵育10分钟与细胞上的Fc受体结合。添加与目标细胞结合的生物素缀合一抗混合物(10μl/107个细胞，人CD14+单核细胞隔离,
Figure BDA0002995936310000152
)，并将混合物在2-8℃下培养15分钟。类似地将链霉亲和素包被的纳米珠(10μl/107个细胞)在2-8℃下加入到细胞悬液中持续另外的15分钟。纳米珠上的链霉亲和素与目标细胞的抗体上的生物素结合，从而磁性地结合细胞。为了确保磁性结合的细胞群体的纯度，通过将结合的细胞装入EasySepTM(STEMCELL
Figure BDA0002995936310000153
)磁体中5分钟对结合的细胞进行预分选，并且然后倒掉充满未结合细胞的上清液。
为了使用磁体阵列704分离Jurkats，使Jurkats(1.5-2ml/min，3ml)以不同流速(1-5ml/min)通过分离管701，同时使磁性分离组件(704和801)通过。将磁吸引的细胞从流动悬浮液中拉出并粘附到最靠近磁体阵列704的管701的壁上。在打开磁体的情况下，所有未从流动中移除的细胞均被捕获为“阴性级分”(以9-12ml的体积收集)。手动将磁体组件(704和801)旋转至“关闭”位置，并进行三次冲洗循环(如实例1所述)以捕获“阳性级分”。使用隔离缓冲液(98％DPBS，2％FBS)进行所有上述步骤。
使用阴性级分和阳性级分的细胞计数，可以确定未能被捕获的细胞的百分比(与装载的细胞数量相比，“阴性级分”中的所有细胞)，以及阳性捕获的细胞的释放效率(随后在“阳性级分”中成功获得的被捕获的细胞)。增加分离管701中的捕获流速导致系统未能捕获的细胞数量增加(图14A和C)，这归因于结合的细胞暴露于磁场的时间减少。然而，将捕获流速提高至5ml/min大大提高了结合的细胞的释放速率，最大几乎100％(图14B和D)。这可能是由于在较高流速下离开悬浮液的细胞较少，并变得被截留在管道回路中的各个接头处。改变分离管的内径(粗管-1/8”ID，细管-3/32”ID)导致捕获失败略有增加(图14A和C)，但细胞释放略有改善(图14B和D)。这些结果可能是由于细管中增加的流速和壁剪切应力造成的。
实例3-珠结合的细胞多次通过分离管
如实例2所述，对Jurkats进行磁性结合和预选。类似于实例2，使Jurkats(2×106个细胞/ml，3ml)在隔离缓冲液中以5ml/min的流速通过分离管701，同时打开磁性分离组件(704和801)。未被磁体阵列704捕获的细胞作为第一次通过的阴性级分(12ml的收集体积)收集在隔离缓冲液中。再次以5ml/min的捕获流速将细胞装载到分离管701中，并且收集仍未捕获的细胞作为第二次通过的阴性级分(再次收集为12ml)。在第二次通过后，分离组件(704和801)被转到“关闭”位置，并且分离管701中捕获的细胞被暴露于3次冲洗循环(如实例1所述)以获得阳性级分。所有以上步骤均用隔离缓冲液进行。
与实例2一样，对来自每个级分的细胞进行计数，并根据捕获失败(对于两次通过，作为装载到管701中的总细胞的百分比)和释放效率进行定量。增加细胞通过分离管701的附加通道确实成功地降低了未能被捕获的细胞的百分比(图15A)，并且与单个通道相比没有导致释放的任何负面减少(图15B)。
实例4-分离管中的“等待时间”
如实例2所述，对Jurkats进行磁性结合和预选。为了有效地增加结合的细胞暴露于磁场的持续时间，在装载到分离管701中之后，在磁性组件(704和801)转到“打开”位置的情况下，使Jurkats(1.5×106，3ml)在不同的持续时间(1-5分钟)内保持静止。以5ml/min的速度轻轻冲洗试管701持续12ml，并收集作为阴性级分的流出液。在等待持续时间之后，分离组件(704和801)被转到“关闭”位置，并且应用三次冲洗循环(在实例1中描述)以收集阳性级分。以上步骤均使用隔离缓冲液进行。
再次对收集的阴性和阳性级分进行计数，并根据捕获失败和释放速率进行定量。观察到等待时间增加导致捕获失败减少的显著趋势(图16A)，这可能是由于磁性颗粒可以响应磁场的额外时间所造成的。此外，尽管等待时间增加，但每个等待持续时间的释放速率接近100％(图16B)，表明捕获速率的提高不仅仅是由于在管道回路中的连接处细胞损失的增加。
随着对该过程增加等待持续时间，阴性细胞更可能被该过程捕获(以下称为“假阳性”)。为了定量假阳性的百分比，以不同的捕获流速(5ml/min或10ml/min)将未经历与磁珠结合的Jurkats(3×106个细胞/ml，3ml)加载到分离管701中。同样，细胞等待不同的持续时间(1min或3min)，并暴露于不同的“阴性级分”冲洗，包括高流速空气或流体冲洗，其中磁性组件(704和801)仍处于“打开”位置。由于装载的细胞是未结合的，所有细胞都期望出现在“阴性级分”中，并且任何未出现的细胞都被视为“假阳性”。虽然使用更常规的捕获序列(5ml/min的捕获流速，3min的等待时间)会导致较差的假阳性率(30％)，但提高捕获流速和缩短等待时间均将其降低至约20％(图17)。此外，结合等待时间的显著缩短和捕获流速(条件5)的提高以及增加40ml/min空气冲洗(条件7)均可以将假阳性率降低至<3％(图17)。
实例5-混合细胞群体的分离和纯化
解冻的人外周血单核细胞(PBMC)与
Figure BDA0002995936310000161
结合，用于通过阳性选择(来自ThermoFisher Scientific)从异源细胞群体中选择CD3+细胞。首先将PBMC(107个细胞/ml)与CD3抗体(5μl/107个细胞，FlowCompTM人CD3抗体，Invitrogen)在2-8℃下孵育10分钟。然后，在室温下，将PBMC与FlowCompTMDynabeads(15μl/107个细胞，Invitrogen)在摇晃和倾斜下结合15分钟。使用不同的工艺参数(流速、等待时间、通过次数，如图18中所述)，通过分离管701将珠结合的细胞(5-10×106个细胞/ml，1.5ml)装载经过磁体阵列704。所有未被磁体捕获的细胞(CD3阴性细胞)均被送至废物处理场，且未对其进行表征。将磁体阵列704转到“关闭”位置，并且管701经历三次冲洗循环以获得“阳性级分”，其将由珠结合的CD3+细胞组成。所有上述步骤均在补充有2mM EDTA的隔离缓冲液中进行。
对分离前级分和分离后级分(对于每个孔300k细胞)进行了生存力(0.031μl/100μl,Live/DeadTMGreen,Invitrogen)、CD3(5μl/100μl，PE小鼠抗人CD3，BD Biosciences)荧光染色，并且在一些实验中还对CD14(0.625μl/100μl,CD14单克隆抗体-太平洋蓝(PacificBlue),Invitrogen)进行了荧光染色，并使用流式辅助细胞分选(FACS)进行了分析，以评估获得的级分的表型。发现初始装载的群体是异质性的，但主要是CD3+(图18-黑线)。为了比较，使用磁体阵列704测试了各种工艺参数。观察到使用
Figure BDA0002995936310000171
结合细胞将等待时间从0更改为2min对输出细胞的纯度具有有限的影响(图18A、B和图18F、G)。然而，将等待时间进一步增加至5min显著地降低了细胞的纯度(图18C、D)。在3ml/min至10ml/min之间，流速对细胞纯度也具有有限的影响(图18G、H)。细胞纯度的最大实质性改善来自于对该过程增加了第二次通过，这将纯度提高至97.5％CD3+细胞(图18E)。
实例6-用于捕获磁珠的不同大小的磁体
不同大小(1/8”和1”长)的永磁体(702和703)用于组装磁体阵列704。使用高斯计(AlphaLab Inc.)在距磁体不同特定距离处测量磁场的量级(图19A)。根据量级测量值，计算出磁场梯度的估计值(图19B)。经确定，为了产生最强的梯度，较小长度的磁体是更期望的。然而，这种更强的梯度比更长的磁体退化更快，从而减小了磁体的有效范围。这证明了在磁体阵列704中使用不同磁体大小以实现不同分离目标的潜力，诸如弱结合的靶的短程分离和强结合的靶的长程分离。
为了测试磁体702和703大小对细胞分离的影响，如实例2所述，用
Figure BDA0002995936310000172
Nanobeads结合Jurkat细胞。珠结合的细胞(2.5×106个细胞/ml，1.5ml)以5ml/min的流速和以5min的等待时间流过分离管701内的磁体阵列704。用12ml的隔离缓冲液(98％PBS，2％FBS，2mM EDTA)以5ml/min将未结合的细胞从管701中冲洗出来。由阵列704产生的磁场被从管701中移除，并且执行三次冲洗循环(在实例1中描述)以从管中移除阳性级分。将结果与从典型磁体组件(704和801)获得的结果进行比较。观察到，与1”长的磁体702和703相比，1/8”长的磁体702和703减少了捕获失败(图19C)。所有上述步骤均使用隔离缓冲液进行。
实例7-促进捕获弱结合的生物靶的附加组件(add-ons)
改变或改善弱结合的靶标/小珠的捕获的容易性的一种方法是减小磁体阵列704与分离管701之间的距离，从而增加管701内经历的平均磁场量级和梯度，如由实例6所证明的。为此，在分离管701与盒1101之间放置3/32”厚的间隔物1201。如实例2所述，将与
Figure BDA0002995936310000181
Nanobeads结合的Jurkat细胞(2.5-5×106细胞/ml，1.5ml)以5ml/min的流速流入分离管701中，并允许其等待3或5分钟。然后以5ml/min(11-13ml)使未捕获的细胞流出，并进行三次冲洗循环(如实例1所述)以收集捕获的细胞级分。将间隔物1201添加到设置中获得的结果表明，在使用间隔物捕获失败和3分钟等待时间方面有所改善，达到了使用5分钟等待时间获得的水平(图20A)。使用隔离缓冲液进行上述步骤。
减小生物靶与磁场之间的距离的另一种方法是在分离管701内包含可磁化物体(1202-1208)。由磁体阵列704产生的磁场可以被这些物体(1202-1208)放大，产生与物体(1202-1208)的大小成反比的磁场梯度，并且具有与物体(1202-1208)的大小成比例的有效范围。为了证明这一点，将顺磁性网1202添加到分离管701。通过在4-8℃下将细胞和预缀合的珠一起孵育15分钟，使Jurkat细胞(1.25×107个细胞/ml)与
Figure BDA0002995936310000182
MicroBeads(20μl/107个细胞，CD3微珠-人,Miltenyi Biotec)结合。在结合后，使细胞以5ml/min流入含有顺磁性网1202(9×106个细胞/ml，1.5ml)的分离管701中，并允许等待5分钟。用12ml的隔离缓冲液以5ml/min从管701冲洗未捕获的细胞。将磁体阵列704转到关闭位置，并且应用三次冲洗循环(在实例1中描述)以从管701中移除阳性捕获的细胞。为了说明通过网1202的非特异性捕获，将结果归一化为从无珠对照(未被MicroBeads结合的Jurkats)获得的结果，其中所有捕获都是由于来自网1202的物理阻滞。使用顺磁性网导致与不使用珠相比，使用珠捕获的细胞相对增加10％(图20B)。使用补充有2mM EDTA的隔离缓冲液进行上述步骤。
利用再循环和磁场的方法
如本文所述，在示例性的实施例中，用于生物样品内的靶标的磁性分离的方法适当地利用样品再循环通过多次(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10次等)磁性分离循环。通过这种再循环，期望的靶标的产量显著增加。
本文所述的方法适当地在自动化细胞培养系统中进行，并且在实施例中可以在自动化细胞培养系统内的盒中进行。图6示出了示例性的盒，并且图21示出了该盒在自动化细胞培养系统的流程图中的位置。如图21所示，自动化细胞培养系统适当地包含细胞增殖室2102和几个流体学路径2104以及磁场源2106，以及试剂2108的输入位置。
图21示出了示例性的实施例，其中示出了再循环路径/管线，其中含有靶生物群体的生物样品通过再循环路径/管线(粗线)循环多次。合适地，在每次通过期间，通过磁场源2106(例如，永磁体或电磁体)将样品暴露于磁场梯度。
本文所述的利用生物样品的再循环来去除靶生物群体的方法可以依赖于阳性或阴性选择方法，或两者的组合。
阳性选择方法
在利用阳性选择方法来分离和捕获靶生物群体的实施例中，本文提供了用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：将靶生物群体与磁性颗粒结合；使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；将与磁性颗粒结合的靶生物群体暴露于磁场梯度；重复循环和暴露步骤一次或多次；以及收集与磁性颗粒结合的靶生物群体。在另外的实施例中，所述方法可以进一步包含从结合的磁性颗粒中除去靶生物群体。
此类阳性选择方法依赖于直接从生物样品中去除靶生物群体，利用磁场从样品中阳性选择所需的靶群体。
如本文所述，合适地，靶生物群体与磁性颗粒结合。本文描述了用于将磁性颗粒与靶生物群体结合的方法，并且适当地使用抗体、蛋白质或核酸。如本文所述，靶生物群体合适地包含一种或多种细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和/或RNA。在示例性的实施例中，靶生物群体是T细胞的群体，合适地是已经产生以包含所需受体的T细胞。从中去除靶群体的生物样品也可以包括不期望的其他细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA、RNA等(即，非靶群体)。
可以包含在本文所述的阳性选择方法中的其他步骤包含洗涤生物样品(例如，细胞群体)、洗涤磁性颗粒、将靶生物群体转移到细胞培养区域(例如，增殖室)和将非靶生物群体转移到废弃室，以及最终从自动化细胞培养系统中移除。
生物样品通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径循环，例如如图21所示。在实施例中，生物样品可以在系统的输入定位点2108中或在实施例中在细胞增殖室2102中作为细胞培养物样品开始，之后其被转移到其中提供含有抗体或其他药剂的磁性颗粒的区域，使得磁性颗粒与所需的靶群体(例如细胞)结合。这种与磁性颗粒的结合也可以发生在增殖室2102或系统内的任何输入位置2108或室中。
然后，使生物样品通过自动化细胞培养系统的包含磁场源2106的区段，使得与磁性颗粒结合的靶生物群体暴露于磁场梯度。作为这种暴露的结果，靶生物群体(例如，期望细胞的群体)变成与磁场源结合(例如，靠着分离管701或其他类似装置的侧面聚集)，其邻近产生磁场的磁场源。这种分离将靶生物群体(或至少一部分靶生物群体)从样品中拉出。然后适当地收集与磁性颗粒结合的靶生物群体。收集靶生物群体的示例性方法包含在暴露于磁场之后移除和洗涤靶生物群体。在实施例中，通过使气相流体随后是液相流体循环通过系统一次或多次来收集靶生物群体。合适地，气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。在进一步的实施例中，液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
如本文所述，已经确定样品再循环通过多次(即2、3、4、5、6、7、8、9、10次等)磁性分离循环增加了从样品中除去的靶群体的量。因此，在合适的实施例中，阳性选择方法的步骤被适当地重复两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10次等或更多次)，在所述阳性选择方法中，生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，并且与磁性颗粒结合的靶生物群体被暴露于磁场梯度。如图21所示，这种再循环适当地发生在整个再循环周期中，其中样品邻近磁场源2106通过以结合靶群体，并且然后样品被再循环并再次邻近磁场源通过以去除甚至更多的可能在先前通过中未被捕获的靶群体，之后最终收集最终的靶样品。该循环可以根据需要重复多次，直到达到靶群体的目标，或者通过统计学或通过其他手段确定额外的循环不会显著地增加靶群体的产量和/或纯度。在收集靶生物群体之后，所述方法适当地包含从结合的磁性颗粒中去除靶生物群体，使得靶群体可以在各种程序等中进一步处理或利用，如本文所述。
在另外的实施例中，本文所述的再循环方法可以包含冲洗与磁源(例如，在基于磁的方法中使用的分离管)结合的靶群体，随后将洗涤的靶群体转移到增殖室以用于进一步的处理和/或扩增。然后，这些捕获、冲洗和转移的要素可以用另一种包含磁性结合的靶群体的生物样品进行。
在实施例中，靶群体暴露于的磁场梯度由一个或多个永磁体提供。本文描述了可以用于永磁体中的示例性材料，并且适当地包含磁铁矿、钕、钐钴和/或铝镍钴。如本文所述，在实施例中，永磁体被适当地配置成线性阵列，诸如图7B中的磁体阵列704。
在另外的实施例中，磁场梯度由一个或多个电磁体提供，如本文所述。
在另外的实施例中，本文提供了一种阳性选择方法，其包含在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体，所述方法包括将靶生物群体与磁性颗粒结合，使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，将与磁性颗粒结合的靶生物群体暴露于磁场梯度以捕获与磁性颗粒结合的靶生物群体，使生物样品的未结合组分循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，在与磁性颗粒结合的靶生物群体和磁场之间插入磁场屏蔽/屏障以释放与磁性颗粒结合的靶生物群体，使与磁性颗粒结合的靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，重复循环生物样品至循环靶生物群体的步骤一次或多次；以及收集与磁性颗粒结合的靶生物群体。在另外的实施例中，阳性选择方法可以进一步包含从结合的磁性颗粒中除去靶生物群体。
如本文所述，此类阳性选择方法利用其中生物样品例如通过分离管701(诸如图7A所示)的设计。在生物样品中，靶生物群体与磁性颗粒结合。该方法适当地包含在分离管701和磁源之前或包含分离管和磁源的情况下，使生物样品循环通过一个或多个流体学路径。与磁性颗粒结合的靶生物群体被适当地暴露于磁场梯度以捕获与磁性颗粒结合的靶生物群体(并且被适当地再循环通过该磁场一次或多次)。例如，如图8所示，生物样品通过分离管701，并且具有结合的磁性颗粒的靶样品被磁场捕获在管的侧面(也参见图24D-24E)。
生物样品中未结合的组分(即，不需要的细胞、蛋白质、DNA或其他结构)然后循环通过一个或多个流体学路径以将它们从分离管701移除。
然后将磁场屏蔽/屏障适当地插入到与磁性颗粒结合的靶生物群体和磁场之间，以从磁体中释放与磁性颗粒结合的靶生物群体。然后，使与磁性颗粒结合的靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，并收集在例如自动化细胞工程改造系统的单独区域中。本文描述了用于收集靶生物群体的各种方法。
合适地，重复循环生物样品、暴露样品(和与磁性颗粒结合的靶生物群体)、在靶群体和磁场之间插入磁屏蔽/屏障以及收集靶生物群体的步骤一次或多次(适合地2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次等)。每次通过该循环增加靶生物制剂的产量。如本文所述，然后合适地从结合的磁性颗粒中除去靶生物群体。
如本文所述，合适地，靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和/或RNA中的一种或多种，并且在实施例中包括T细胞。本文描述了用于将磁性颗粒与靶生物群体结合的方法和化合物，并且适当地包含抗体、蛋白质或核酸的使用。
本文描述了示例性的磁场，并且合适地由永磁体或电磁体产生。本文描述了用于制备永磁体的材料，并且包含例如磁铁矿、钕、钐钴和/或铝镍钴。在实施例中，永磁体被配置成线性阵列。在其中使用电磁体的实施例中，磁场屏蔽/屏障的插入可以通过关闭电磁体来代替，例如通过简单地从电磁体移除电流以停止磁场。
如全文所述，在实施例中，磁场屏蔽/屏障适当地包括高磁导率和饱和度材料。如本文所述，在实施例中，磁场屏蔽/屏障旋转以将磁场屏蔽/屏障插入到与磁性颗粒结合的靶生物群体和磁场之间。此类实施例在图8、9和10A-10B中示出，并且在本文中详细地描述。
阴性选择方法
在利用针对靶生物群体的阴性选择方法的实施例中，本文提供了用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括将非靶生物群体与磁性颗粒结合；使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；将与磁性颗粒结合的非靶生物群体暴露于磁场梯度；重复循环至暴露步骤一次或多次；以及收集靶生物群体。所述方法还可以进一步包含收集非靶生物群体，适合地用于作为废弃物消除。
如本文所使用的，阴性选择方法利用将磁性颗粒与“非靶生物样品”(其是指一种或多种细胞、蛋白质、DNA、RNA等)结合，它们不包含在“靶生物群体”中，并且因此寻求从生物样品中除去，留下靶生物群体。在此类阴性选择方法中，使用磁性分离来分离出非靶生物群体，从而允许从样品中收集剩余的靶生物群体。
如本文所述，合适地，非靶生物群体与磁性颗粒结合。本文描述了用于将磁性颗粒与非靶生物群体结合的方法，并且适当地使用抗体、蛋白质或核酸。如本文所述，非靶生物群体合适地包含一种或多种细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和/或RNA。在示例性的实施例中，靶生物群体是T细胞的群体，合适地是已经产生以包含所需受体的T细胞，而非靶生物群体在需要移除的样品中包含任何其他细胞、蛋白质等，留下靶群体。从中去除靶群体的生物样品也可以包含不期望的其他细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA、RNA等。
生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，例如如图21所示。在实施例中，生物样品可以在输入位置2108、或细胞增殖室2102、或在系统内的其他位置作为细胞培养物样品开始，之后其被转移到其中提供含有抗体或其他药剂的磁性颗粒的区域，使得磁性颗粒与不需要的非靶群体(例如，不需要的细胞、蛋白质、DNA等)结合。这种与磁性颗粒的结合也可以发生在增殖室内、输入位置2108处或系统内的其他室中。
生物样品然后通过包含磁场源2106的自动化细胞培养系统的区段，使得与磁性颗粒结合的非靶生物群体被暴露于磁场梯度(靶生物群体也被暴露于磁场，但不与磁场反应)。由于该暴露，非靶生物群体(例如，不需要的细胞、蛋白质等的群体)变成与邻近磁场的磁场源结合(例如，聚集在分离管701或其他类似装置的侧面)。该分离将非靶生物群体(或至少一部分非靶生物群体)拉出样品。然后适当地收集未与磁性颗粒结合的靶生物群体。收集靶生物群体的示例性方法包含在暴露于磁场之后从样品中过滤、去除和洗涤靶生物群体(并且从而去除非靶生物群体)。
在实施例中，通过使气相流体随后是液相流体循环通过系统一次或多次来收集靶生物群体。合适地，气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。在进一步的实施例中，液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
如本文所述，已经确定样品再循环通过多次(即2、3、4、5、6、7、8、9、10次等)磁性分离循环增加了从样品中除去的靶群体的量和/或纯度。因此，在合适的实施例中，阴性选择方法的步骤被适当地重复两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10次等或更多次)，在所述阴性选择方法中，生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径，并且与磁性颗粒结合的非靶生物群体被暴露于磁场梯度，并且收集靶生物群体。如图21所示，这种再循环适当地发生在整个再循环周期中，其中样品邻近磁场源2106通过以结合非靶群体，收集靶群体，并且然后样品被再循环并再次邻近磁场源通过以去除甚至更多的可能在先前通过中未被捕获的非靶群体。该循环可以根据需要重复多次，直到达到靶群体的目标，或者通过统计学或通过其他手段确定额外的循环不会显著地增加靶群体的产量和/或纯度。在收集靶生物群体之后，所述方法适当地包含在各种程序等中进一步处理、过滤或利用靶生物群体，如本文所述。
在实施例中，非靶群体暴露于的磁场梯度由一个或多个永磁体提供。本文描述了可以用于永磁体中的示例性材料，并且适当地包含磁铁矿、钕、钐钴和/或铝镍钴。如本文所述，在实施例中，永磁体被适当地配置成线性阵列，诸如图7B中的磁体阵列704。
在另外的实施例中，磁场梯度由一个或多个电磁体提供，如本文所述。
在进一步的实施例中，本文提供了一种阴性选择方法，其包含在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体，所述方法包括将非靶生物群体与磁性颗粒结合；使生物样品循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；将与磁性颗粒结合的非靶生物群体暴露于磁场梯度以捕获与磁性颗粒结合的非靶生物群体；使生物样品的靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；在与磁性颗粒结合的非靶生物群体和磁场之间插入磁场屏蔽/屏障以释放与磁性颗粒结合的非靶生物群体；使与磁性颗粒结合的非靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；重复使生物样品循环至收集靶生物群体的步骤一次或多次；以及收集靶生物群体。
如本文所述，此类阴性选择方法利用了这样的设计：其中收集靶生物群体；使生物样品例如通过分离管701(诸如图7A所示)。在生物样品中，使非靶生物群体与磁性颗粒结合。该方法适当地包含在分离管701之前或包含分离管701，使生物样品循环通过一个或多个流体学路径。与磁性颗粒结合的非靶生物群体被适当地暴露于磁场梯度，以捕获与磁性颗粒结合的非靶生物群体。例如，如图8所示，生物样品通过分离管701，并且具有结合的磁性颗粒的非靶样品被磁场捕获在管的侧面(也参见图24D-24E)。
生物样品中的未结合的组分(即，靶生物群体，包含细胞、蛋白质、DNA或所需的其他结构，包含T细胞)然后循环通过一个或多个流体学路径，并且通过过滤或其他机制被适当地收集，例如，在自动化细胞工程改造系统的单独区域中。
然后将磁场屏蔽/屏障适当地插入到与磁性颗粒结合的非靶生物群体和磁场之间，以从磁体中释放与磁性颗粒结合的非靶生物群体。然后使与磁性颗粒结合的非靶生物群体循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径。
合适地，重复循环生物样品、暴露样品(和与磁性颗粒结合的非靶生物群体)、在非靶群体和磁场之间插入磁性屏蔽/屏障以及收集靶生物群体的步骤一次或多次(合适地2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次等)。每次通过这种再循环增加靶生物制剂的产量和/或纯度，以允许去除越来越多的非靶生物群体，并且分离和收集更多的所需靶生物制剂。
可以包含在本文所述的阴性选择方法中的其他步骤包含洗涤生物样品(例如，细胞群体)、洗涤磁性颗粒、将靶生物群体转移到细胞培养区域(例如，增殖室)和将非靶生物群体转移到废弃物室，以及最终从自动化细胞培养系统中除去。
如本文所述，合适地，非靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和/或RNA中的一种或多种，并且在实施例中，靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和/或RNA中的一种或多种，并且合适地包含T细胞。本文描述了用于将磁性颗粒与非靶生物群体结合的方法和化合物，并且适当地包含抗体、蛋白质或核酸的使用。
本文描述了示例性的磁场，并且合适地由永磁体或电磁体产生。本文描述了用于制备永磁体的材料，并且包含例如磁铁矿、钕、钐钴和/或铝镍钴。在实施例中，永磁体被配置成线性阵列。在其中使用电磁体的实施例中，磁场屏蔽/屏障的插入可以通过关闭电磁体来代替，例如通过简单地从电磁体移除电流以停止磁场。
如全文所述，在实施例中，磁场屏蔽/屏障适当地包括高磁导率和饱和度材料。如本文所述，在实施例中，磁场屏蔽/屏障旋转以将磁场屏蔽/屏障插入到与磁性颗粒结合的非靶生物群体和磁场之间。此类实施例在图8、9和10A-10B中示出，并且在本文中详细地描述。
在进一步的实施例中，本文提供了一种用于在自动化细胞培养系统中洗涤和回收磁性颗粒的方法。
合适地，所述方法包含a.使磁性颗粒循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；b.将磁性颗粒暴露于磁场梯度以捕获磁性颗粒；c.通过施加气体流体相随后施加液体流体相来收集磁性颗粒；d.使磁性颗粒循环通过自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；以及e.重复步骤c-d一次或多次(例如，2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次、10次或更多次等)。
如本文所述，在实施例中，磁性颗粒与靶生物群体结合，这适当地通过抗体、蛋白质或核酸发生。
在另外的实施例中，磁性颗粒与非靶生物群体结合，包含通过抗体、蛋白质或核酸。
本文描述了示例性的非靶生物群体和靶生物群体，并且合适地，靶群体是细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的任何一种或多种，包含T细胞。
在实施例中，磁场梯度由一个或多个永磁体提供，包含包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴的永磁体。如本文所述，永磁体可以配置为线性阵列。在另外的实施例中，磁场梯度由电磁体提供。
合适地，如本文所述，在磁性颗粒和磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以允许通过阻挡磁场来收集磁性颗粒，并且允许释放已经结合至磁源的磁性颗粒。用于磁场屏蔽/屏障的示例性材料包含高磁导率和饱和度材料。在其中利用电磁体的实施例中，可以从一个或多个电磁体移除电流以允许收集磁性颗粒，简单地关闭电磁体的源。
可以用于所述方法中的示例性的气相流体包含空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。可以使用的示例性的液相流体包含水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
珠回收方法
来自阴性选择方法和阳性选择方法的数据，以及磁性颗粒回收，包含多重磁性分 离
图22A-22D示出了磁性颗粒与靶细胞(纯化的细胞)和废弃细胞(非靶群体)的结合。如所示出的，利用试剂量优化的“改进方法”证明了磁性颗粒与废弃细胞(用于阴性选择的非靶群体)之间的高结合，具有较低的“假阴性”。
图23A-23B表示磁性颗粒从细胞中的释放。如所示出的，在图23A中，在自动化细胞培养系统(COCOON)中使用的附着机制示出了与对照相似的珠-细胞释放，说明了按照阳性选择方法回收细胞(或其他靶生物群体)的能力。图23B示出了在使用自动化细胞培养系统释放和去除珠后，珠在靶细胞中剩余的百分比。
为了确定多重磁性分离的益处(即，将样品通过自动化细胞培养系统再循环以暴露于磁场2、3、4、5次等)，在增加暴露于磁体的时间和降低流速时进行了实验。如图24A所示，增加磁体暴露时间(从左到右)，将捕获的结合的细胞百分比从约65％增加到至少90％，相当于对照。类似地，在图24B中降低流速(从右到左)说明了结合的细胞捕获从约60％增加到约85％，再次类似于对照。
下面的表1示出了使用利用本文所述的磁性分离方法的多次通过获得的结合的细胞和总细胞产量的增加。
表1：产量的影响-多次通过磁场
Figure BDA0002995936310000251
Figure BDA0002995936310000261
图24C示出了从分离线释放捕获的生物样品的流体冲洗循环次数的影响，说明了在前两次冲洗后的显著回收率。
图24D-24E示出了使用磁场在分离管中捕获与磁性颗粒结合的细胞(顶部)，并在关闭磁场和应用流体冲洗循环(根据图24C)后释放细胞(底部)，说明了本文所述方法的有效性。
在图25A-25F中，阳性选择方法和阴性选择方法说明了靶生物群体(细胞)的高水平纯化，其中对于阳性选择应用和阴性选择应用，在对照与本文描述的自动化细胞培养系统(COCOON)之间具有相似的回收率。图25G-25I示出了使用阴性选择的细胞纯化，示出了通过使用再循环管线进行多次通过来提高纯度。CD3+CD14+群体是不需要的珠结合的单核细胞-T细胞聚集体。图25J-25L示出了使用阴性选择过程的群体纯化。多次通过成功地移除不想要的珠结合的细胞(由白色圆圈突出显示)。
图26A-26C示出了本文所述的自动化细胞培养系统中磁性分离的优点，其中图26A示出了过程持续时间的显著减少，图26B示出了低细胞损失，并且图26C示出了与基于袋和培养容器的对照相比体积损失的减少。图26D示出了使用阳性选择过程的群体纯化。与单次通过相比，多次通过再循环管线提高了细胞产量。
图27A-27B示出了在本文所述的自动化细胞培养系统中洗涤后回收磁性颗粒的能力，其中图27A示出了分离管701的后续冲洗对绝对回收的影响，并且图27B示出了相对于传统的手动过程，分离管701的后续冲洗对累积颗粒回收的影响。
本发明的各种实施例和/或实例的描述已经被呈现用于说明的目的，但并不旨在穷举或限制于所公开的实施例和/或实例。在不脱离所述实施例的范围和精神的情况下，多种修改和变化对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。选择本文使用的术语是为了最好地解释实施例的原理、实际应用或相对于市场上发现的技术的技术改进，或者使本领域普通技术人员能够理解本文公开的实施例。

Claims (110)

1.一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：
a.将所述靶生物群体与磁性颗粒结合；
b.使所述生物样品循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
c.将与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体暴露于磁场梯度；
d.重复步骤b-c一次或多次；和
e.收集与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的一种或多种。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述靶生物群体包括T细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述靶生物群体结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
7.根据权利要求5至6中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中重复步骤b-c至少两次。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过循环气相流体，然后循环液相流体一次或多次来收集与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括从所述结合的磁性颗粒中去除所述靶生物群体。
14.一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：
a.将所述靶生物群体与磁性颗粒结合；
b.使所述生物样品循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
c.将与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体暴露于磁场梯度，以捕获与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体；
d.使所述生物样品的未结合组分循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
e.在与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体和所述磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以释放与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体；
f.使与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
g.重复步骤b-f一次或多次；和
h.收集与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的一种或多种。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述靶生物群体包括T细胞。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述靶生物群体结合。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
21.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供，并且任选地，其中通过从所述一个或多个电磁体移除电流来替代步骤e中的插入。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的方法，其中步骤b-f重复至少两次。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的方法，其中所述磁场屏蔽/屏障包括高磁导率和饱和度材料。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其中使所述磁场屏蔽/屏障旋转以将所述磁场屏蔽/屏障插入到与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体和所述磁场之间。
25.根据权利要求14至24中任一项所述的方法，其中通过循环气相流体，然后循环液相流体一次或多次来收集所述靶生物群体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
28.根据权利要求14至27中任一项所述的方法，进一步包括从所述结合的磁性颗粒中去除所述靶生物群体。
29.一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：
a.将非靶生物群体与磁性颗粒结合；
b.使所述生物样品循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
c.将与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体暴露于磁场梯度；
d.重复步骤b-c一次或多次；和
e.收集所述靶生物群体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的一种或多种。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述靶生物群体包括T细胞。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中收集所述非靶生物群体。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述非靶生物群体结合。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
36.根据权利要求34至35中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
37.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供。
38.根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中重复步骤b-c至少两次。
39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中通过循环气相流体，然后循环液相流体一次或多次来收集与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
42.一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：
a.将非靶生物群体与磁性颗粒结合；
b.使所述生物样品循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
c.将与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体暴露于磁场梯度，以捕获与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体；
d.使所述生物样品的靶标循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
e.在与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体和所述磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以释放与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体；
f.使与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；和
g.重复步骤b-f一次或多次；和
h.收集所述靶生物种群。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的一种或多种。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述靶生物群体包括T细胞。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中收集所述非靶生物群体。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述靶生物群体结合。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
49.根据权利要求47至48中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
50.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供，并且任选地其中通过从所述一个或多个电磁体移除电流来替代e中的插入步骤。
51.根据权利要求42至50中任一项所述的方法，其中重复步骤b-f至少两次。
52.根据权利要求42至51中任一项所述的方法，其中所述磁场屏蔽/屏障包括高磁导率和饱和度材料。
53.根据权利要求42至51中任一项所述的方法，其中使所述磁场屏蔽/屏障旋转以将所述磁场屏蔽/屏障插入到与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体和所述磁场之间。
54.根据权利要求42至53中任一项所述的方法，其中通过循环气相流体，然后循环液相流体一次或多次来收集所述靶生物群体。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
57.一种用于在自动化细胞培养系统中洗涤和回收磁性颗粒的方法，所述方法包括：
a.使所述磁性颗粒循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；
b.将所述磁性颗粒暴露于磁场梯度以捕获所述磁性颗粒；
c.通过施加气体流体相，随后施加液体流体相来收集所述磁性颗粒；
d.使所述磁性颗粒循环通过所述自动化细胞培养系统的一个或多个流体学路径；和
e.重复步骤c-d一次或多次。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述磁性颗粒与靶生物群体结合。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述靶生物群体结合。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述磁性颗粒与非靶生物群体结合。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述非靶生物群体结合。
62.根据权利要求58至59中任一项所述的方法，其中所述靶生物群体是细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的任一种或多种。
63.根据权利要求62中任一项所述的方法，其中所述靶生物群体是T细胞。
64.根据权利要求57至63中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
66.根据权利要求64至65中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
67.根据权利要求57至67中任一项所述的方法，其中在所述磁性颗粒和所述磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以允许收集所述磁性颗粒。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述磁场屏蔽/屏障包括高磁导率和饱和度材料。
69.根据权利要求57所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供。
70.根据权利要求69所述的方法，其中从所述一个或多个电磁体移除电流，以允许收集所述磁性颗粒。
71.根据权利要求57至70中任一项所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
72.根据权利要求57至71中任一项所述的方法，其中所述液相流体包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
73.根据权利要求57至72中任一项所述的方法，其中重复步骤c-d至少两次。
74.一种用于从生物样品中磁性分离和收集靶生物群体的系统，包括：
a.磁场源；
b.用于使所述生物样品流动的分离管，其与所述磁场源对准；
c.被配置为位于所述磁场源和所述分离管之间的磁场屏蔽/屏障；和
d.用于将所述磁场屏蔽/屏障插入到所述磁场源和所述分离管之间的机构。
75.根据权利要求74所述的系统，其中所述系统是自动化细胞培养系统的一部分。
76.根据权利要求74或权利要求75所述的系统，其中所述磁场屏蔽/屏障是具有高磁导率和饱和度的材料。
77.根据权利要求76所述的系统，所述具有高磁导率和饱和度的材料选自由铁、铁合金、铁素体钢、Hiperco-50组成的组。
78.根据权利要求74至77中任一项所述的系统，其中所述磁场源包括一个或多个永磁体。
79.根据权利要求78所述的系统，其中所述永磁体包括钕、钐钴或铝镍钴。
80.根据权利要求74至78中任一项所述的系统，其中所述磁场源包括以线性阵列配置的多个永磁体。
81.根据权利要求80所述的系统，其中线性阵列中的所述多个永磁体被布置成具有垂直于所述线性阵列的轴线的相反磁极方向。
82.根据权利要求74至80中任一项所述的系统，其中用于插入的所述机构是用于旋转所述磁场源和所述分离管之间的所述磁场屏蔽/屏障的机构。
83.根据权利要求82所述的系统，其中用于旋转的所述机构是由软件控制的机电驱动组件。
84.一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：
a.将靶生物群体与磁性颗粒结合；
b.将与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体暴露于磁场梯度，以捕获与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体；
c.去除所述生物样品的未结合的群体；
d.在与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体和所述磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以释放与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体；和
e.收集与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的一种或多种。
86.根据权利要求84或权利要求85所述的方法，其中所述靶生物群体包括T细胞。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述靶生物群体结合。
88.根据权利要求84至87中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
91.根据权利要求84至90中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供，并且任选地其中通过从所述一个或多个电磁体移除电流来替代步骤d中的插入。
92.根据权利要求84至91中任一项所述的方法，其中所述磁场屏蔽/屏障包括高磁导率和饱和度材料。
93.根据权利要求84至92中任一项所述的方法，其中使所述磁场屏蔽/屏障旋转以将所述磁场屏蔽/屏障插入到与所述磁性颗粒结合的所述靶生物群体和所述磁场之间。
94.根据权利要求84至93中任一项所述的方法，其中通过循环气相流体，然后循环液相流体一次或多次来收集所述靶生物群体。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
97.根据权利要求84至96中任一项所述的方法，进一步包括从所述结合的磁性颗粒中去除所述靶生物群体。
98.一种用于在自动化细胞培养系统中从生物样品中收集靶生物群体的方法，所述方法包括：
a.将非靶生物群体与磁性颗粒结合；
b.将与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体暴露于磁场梯度，以捕获与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体；
c.收集所述靶生物群体；和
d.在与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体和所述磁场之间插入磁场屏蔽/屏障，以释放与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述靶生物群体包括细胞、病毒、细菌、蛋白质、DNA和RNA中的一种或多种。
100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述靶生物群体包括T细胞。
101.根据权利要求98至100中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒通过抗体、蛋白质或核酸与所述非靶生物群体结合。
102.根据权利要求98至101中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个永磁体提供。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述永磁体包括磁铁矿、钕、钐钴或铝镍钴。
104.根据权利要求102至103中任一项所述的方法，其中所述永磁体被配置成线性阵列。
105.根据权利要求98至101中任一项所述的方法，其中所述磁场梯度由一个或多个电磁体提供，并且任选地其中通过从所述一个或多个电磁体移除电流来代替d中的插入步骤。
106.根据权利要求98至105中任一项所述的方法，其中所述磁场屏蔽/屏障包括高磁导率和饱和度材料。
107.根据权利要求98至106中任一项所述的方法，其中使所述磁场屏蔽/屏障旋转以将所述磁场屏蔽/屏障插入到与所述磁性颗粒结合的所述非靶生物群体和所述磁场之间。
108.根据权利要求98至107中任一项所述的方法，其中通过循环气相流体，然后循环液相流体一次或多次来收集所述靶生物群体。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述气相流体包括空气、氮气、氧气和二氧化碳中的一种或多种。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述液相包括水、缓冲盐水溶液、培养基、动物血清、螯合剂和酶中的一种或多种。
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