KR20210086630A - 자기 분리 - Google Patents

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KR20210086630A
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KR
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magnetic field
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magnetic
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KR1020217012775A
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티머시 스미스
누알라 트레이노
케빈 미들턴
알렉시스 피에탁
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옥테인 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

생물학적 샘플에서 자화된 표적의 자동 자기 분리를 위한 시스템, 장치 및 방법이 본원에 개시되며, 여기에서 이들은 생물학적 샘플 내에서 자화된 표적 도달 및 유인 측면에서 자기장을 제어하도록 제어가능하게 작동가능한 자기장 실드/장벽을 포함한다.

Description

자기 분리
분야
본 발명은 생물학적 샘플로부터 표적의 자동화된 자기 분리를 위한 장치, 방법 및 시스템에 관한 것이다. 그러한 장치, 방법 및 시스템은 여러 가지의 임상 및 실험실 설정에서 사용된다.
배경
자기 분리는 여러 가지의 상이한 공정들의 적용을 통해 유체로부터 자기 불순물을 분리시키는 방법으로서 활용되었다 (U.S. 3,985,646; U.S. 4,054,513; 및 U.S. 5,137,629). 자기 분리 기술은 또한, 바이러스, 박테리아, 및 세포를 포함하는, 다양한 생물학적 표적에 결합하기 위해 항체 또는 중합체로 코팅되었다 (U.S. 3,970,518; U.S. 4,219,411; U.S. 4,795,698; 및 U.S. 5,385,707). 생물학적 표적은 그 다음 예를 들어 U.S. 4,710,472; U.S. 5,691,208; U.S. 6,193,892; 및 Zborowski 등, (Journal of Magnetism and Magnetic Materials, vol. 194, pp. 224-230, 1999)에서 기재된 이전에 개발된 자기 분리 장치들 중 하나를 사용하여 유체 현탁액으로부터 추출될 수 있다. 분리 장치에서 생성된 자기장은 내부에서 현탁된 자기 비드에서 힘을 가하고, Shevkoplyas 등, (Lab on a Chip, vol. 7, pp. 1294-1302, 2007) 및 Warnke (IEEE Transactions on Magnetics, vol. 39, issue 3, pp. 1771-1777, 2003)에서 기재된 바와 같이, 유체 현탁액 밖으로 비드를 뿐만 아니라 자기 비드에 결합된 임의의 생물학적 재료를 끌어낼 수 있다. 이것은, (양성 선택으로서 공지된) 유체 현탁액으로부터 제거함으로써, 또는 (음성 선택으로서 공지된) 관심의 비-자성으로 결합된 모집단만을 남기기 위해 유체 현탁액으로부터 모든 기타 모집단을 제거함으로써, 원하는 모집단이 단리되게 한다. 이종 세포 모집단으로부터, 세포, 예컨대 T-세포 및 줄기 세포의 단리는 여러 가지의 질환을 치료하는데 사용된 세포 요법의 개발에 필요하다.
하나의 시스템은 주변 자석 내에서 정적 현탁액을 활용한다 (STEMCELL Technologies®제 EasySep™). 자동화되고 자기 비드를 사용하여 표적 모집단을 단리시키는 기타 시스템은 또한 공지된다 (Milytenyi Biotec로부터 AutoMACSⓒ, 및 STEMCELL™ Technologies로부터 RoboSep™).
자기장의 인가가 원하는 고 수율 및 고 순도로 표적의 분리를 위하여 자동화, 맞춤화 그리고 제어될 수 있는 생물학적 샘플 내에서 선택된 표적의 신속한 그리고 신뢰할만한 자기 분리에 대하여 미충족된 필요가 여전하다.
개요
본 발명은 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, a. 자기 입자에 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; b. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; c. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시키는 단계; d. 단계 b-c를 1회 이상 반복하는 단계; 및 e. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, a. 자기 입자에 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; b. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; c. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계; d. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플의 미-결합된 성분을 순환시키는 단계; e. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계; f. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계; g. 단계 b-f를 1회 이상 반복하는 단계; 및 h. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다
추가의 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, a. 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; b. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; c. 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시키는 단계; d. 단계 b-c를 1회 이상 반복하는 단계; 및 e. 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다;
더욱 추가 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, a. 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; b. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; c. 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계; d. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플의 표적을 순환시키는 단계; e. 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계; f. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계; g. 단계 b-f를 1회 이상 반복하는 단계; 및 h. 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
도면의 간단한 설명
본원에 기재된 전형적인 양태의 하기 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명할 목적으로, 현재 전형적인 도면 양태로 도시된다. 하지만, 본 발명이 도면에서 도시된 양태의 정확한 배열 및 방편에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 유사 참조 번호가 도면에서 도시되고 설명에서 참조된 바와 같이 상이한 구현예에 걸쳐 유사한 요소를 지칭하는 것이 주목된다.
본원에 설명은 하기 도면의 관점에서 더욱 충분히 이해될 것이다:
도 1은 자기 입자를 움직이는데 사용된 자기장 기울기를 도시하고;
도 2는 세포 분리 적용에 사용된 상이한 크기화된 자기 비드를 도시하고;
도 3은 자기장 기울기에 반응하여 비드에서 작용하는 순 자력에 관한 비드 크기의 효과를 도시하고;
도 4는 자동적으로 제어된 자기장을 생산하기 위한 상이한 개념적 방법을 도시하고;
도 5는 자기 플럭스 밀도를 차단하기 위한 높은 투자율 및 포화 재료의 능력의 컴퓨터계산 모델을 도시하고;
도 6은 카셋트에 자기 분리 튜브의 편입을 도시하고;
도 7은 교류 극 (702 및 703)을 가진 희토류 자석으로 이루어지는 자석 배열 (704)로 정렬된 분리 튜브 (701)의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 모델을 도시하고;
도 8은, 모터 (802) 및 기어 트레인 (803)을 사용하여 회전될 수 있는 자기장 실드 (801) 내에서 위치한, "온" 위치에서, 자석 배열 (704)로 정렬된 분리 튜브 (701)의 CAD 모델 어셈블리를 도시하고;
도 9는, 자기장 실드 (801 801)가 튜브 (701)와 자석 배열 (704) 사이인 "오프" 위치에서 자석 배열로 정렬된 분리 튜브 (701)의 CAD 어셈블리를 도시하고;
도 10은 "온" 또는 "오프" 위치에서 어셈블리의 횡단면도를 도시하고;
도 11은 자기 분리 어셈블리 (704 및 801)을 함유하는 세포 배양 기기 (1102)로 정렬된 분리 튜브 (701)로 이루어지는 카셋트 (1101)의 전체 어셈블리를 도시하고;
도 12는 국한된 고 자기장 기울기를 생성하기 위한 상이한, 비-한정적 방법 (부분 1201-1208)을 제시하고;
도 13은 상이한 유속에 자기 비드로부터 세포의 성공적 분리를 증명하는 작업예 1로부터 수득된 결과를 도시하고;
도 14는 양성으로 선택된 세포의 포착 및 방출에 관한 상이한 유속의 효과를 증명하는 작업예 2로부터 수득된 결과를 도시하고;
도 15는 양성으로 선택된 세포의 포착 및 방출의 측면에서 분리 튜브 (701)를 통해 자기 분리 공정에 다중 통과 추가의 작업예 3으로부터 결과를 도시하고;
도 16은 양성으로 선택된 세포의 포착 및 방출의 측면에서 대기 시간의 추가를 통해 자기장에 자기 비드 노출 증가의 작업예 4로부터 결과를 도시하고;
도 17은 다양한 공정 수정이 작업예 4로부터 수득된 위양성의 백분율을 수정할 수 있는 방법을 도시하고;
도 18은 자석 배열 (704)을 지나서 분리 튜브 (701)를 통해 유동된 혼합된 세포 모집단의 정제의 작업예 5로부터 수득된 결과를 도시하고;
도 19는 자석 (702 및 703) 크기를 수정하는 것이 자석 배열 (704) 및 세포 포착에 의해 생성된 자기장 특성에 영향을 미칠 수 있는 방법을 증명하는 작업예 6으로부터 수득된 결과를 도시하고;
도 20은 카셋트에 막대/스페이서 (1201) 추가의 효과에 관한 작업예 7로부터 수득된 결과를 도시한다.
도 21은 이의 구현예에 따라 재순환 자기 분리 방법의 개략도를 도시한다.
도 22a-22d는 이의 구현예에 따라 정제된 및 폐기물 세포의 회수를 도시한다.
도 23a-23b는 이의 구현예에 따라 세포로부터 비드 방출의 효율을 도시한다.
도 24a-24c는 자기장 및 다중 사이클과 접촉의 강도의 영향을 도시한다.
도 24d-24e는, 본원에 기재된 바와 같이, 분리 튜브에서 세포의 포착 및 제거를 도시한다.
도 25a-25l은 본원에 기재된 바와 같이 표적 세포의 양성 및 음성 선택의 결과를 도시한다.
도 26a-26d는 본원에 기재된 바와 같이 자동화된 세포 배양 시스템에서 세포의 회수를 도시한다.
도 27a-27b는 본원에 기재된 바와 같이 자동화된 세포 배양 시스템에서 세정후 자기 입자의 회수를 도시한다.
상세한 설명
본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 그들 전체가 참고로 편입된다. 본원에 논의된 공보 및 출원은 본원의 출원일에 앞서 그들의 공개를 위해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 공보보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이고 제한되지 않아야 한다.
상충의 경우, 정의를 포함하는, 본 명세서가 지배할 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본원에서 주제가 속하는 당업자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해 공급된다.
본원에 사용된 바와 같이, 요소 또는 성분을 선행하는 관사 ("한" 및 "하나")는 요소 또는 성분의 경우 (즉 발생)의 수에 관하여 비-한정적이기 위한 것이다. 그러므로, "한" 및 "하나"는 하나 또는 적어도 하나를 포함하도록 읽혀져야 하고, 그 요소 또는 성분의 단수 단어 형태는 또한 숫자가 단수로 명백히 의미되지 않는 한 복수를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비-제한 용어이고 특정 발명의 임의의 단일 양태를 지칭하기 위한 것이 아니고 본 명세서 및 청구항에서 기재된 바와 같이 모든 가능한 양태를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 '포함하는', 포함한다', '포괄하는', '갖는' 및 그들의 어형변화 및 활용형은 '비제한적으로 포함하는'을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 이용된 구성성분, 성분, 또는 반응물의 양을 수식하는 용어 "약"은, 예를 들어, 농축물 또는 용액을 만드는데 사용된 전형적인 측정 및 액체 취급 절차를 통해 발생할 수 있는 수량에서의 변동을 지칭한다. 게다가, 변동은 측정 절차에서 부주의한 오류, 제조에서의 차이, 공급원, 또는 조성물을 만드는데 또는 방법을 실시하는데 이용된 구성성분의 순도, 및 기타 등등으로부터 발생할 수 있다. 일 양태에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 10% 이내를 의미한다. 또 다른 양태에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 5% 이내를 의미한다. 게다가, 또 다른 양태에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이내를 의미한다.
값의 범위가 인용되면, 이는 단지 편의 또는 간결함을 위한 것이고 그 범위의 경계 이내 및 주위 개별 수치 뿐만 아니라 가능한 모든 하위-범위를 포함한다. 임의의 수치는, 달리 명시되지 않는 한, 또한 실제 가까운 값을 포함하고 정수 값은 분수 값을 배제하지 않는다. 하위-범위 값 및 실제로 가까운 값은 구체적으로 개시된 값으로서 간주되어야 한다.
포함될 것으로 본원에 정의된 임의의 성분이 단서적 또는 부정적 제한의 방식으로 청구된 발명으로부터 명시적으로 배제될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용될 바와 같이 용어 '가까운', '대략' 및 '실제로'는 본 발명의 인용된 용어 또는 구현예 또는 작업 또는 범위에 대해 부작용 또는 역효과가 없는 각각의 관계 또는 측정 또는 양 또는 수량 또는 정도를 나타낸다.
본원에 사용될 바와 같이 기하학적 관계 예컨대 '세로', '가로', '평행', '반대', '직선형', "측면", "평행", "수직" 및 기타 각 관계를 지칭하는 임의의 용어는 또한 대략적이지만 기능적이고/거나 실제적, 각각의 관계를 나타낸다.
본원에 사용될 바와 같이, 용어 '바람직한', '바람직하게는', '전형적', '전형적으로' 또는 '선택적으로'는 본 발명 또는 이의 구현예의 범위를 제한하지 않는다.
본원에 사용될 바와 같이 용어 '실질적', '상당한' (또는 이의 유의어)은 맥락과 관련하여 참조된 본체의 대부분 또는 대다수를 포괄하는 측정 또는 한도 또는 양 또는 정도, 또는 참조된 본체에 대해 또는 참조된 주제와 관련하여 적어도 적당하게 또는 훨씬 더 큰 또는 더 많은 또는 더욱 효과적인 또는 더욱 중요한 정도를 나타낸다.
본원에 사용될 바와 같이 용어 '미미한', 및 '약간' (또는 이의 유의어)은 충분히 작은 각각의 관계 또는 측정 또는 양 또는 수량 또는 본 발명의 범위에 관해 그리고 참조된 용어에 대해 실제적 결과가 없는 정도를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 '할 수 있다'는 어느 한쪽이거나 포함되지 않고/거나 사용되지 않고/거나 이행되지 않고/거나 발생하지 않는 옵션 또는 효과를 나타내고, 게다가 상기 옵션은 본 발명의 일부 구현예의 적어도 한 부분 또는 이의 결과를, 본 발명의 범위 제한 없이, 구성한다.
본원에 사용된 바와 같이 "샘플"은 임의의 샘플일 수 있고 식물, 인간, 동물, 또는 미생물 공급원에서 유래될 수 있는 "생물학적 샘플"일 수 있다. 샘플은 전형적으로 표적이 분리 및 수집을 위하여 선택되는 이종 샘플이다. 표적은 세포, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 미생물, 바이러스 및 기타 등등일 수 있다. 생물학적 샘플은 표적 모집단을 함유한다.
생물학적 샘플은 체액 샘플, 바디 세포 샘플 또는 생물학적 조직 샘플을 포함할 수 있다. 생물학적 또는 체액 샘플의 예는 소변, 림프, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 자궁경부액, 자궁경부-질액, 질액, 유방액, 모유, 활액, 정액, 정장액, 대변, 객담, 뇌척수액, 눈물, 점액, 간질액, 여포액, 양수, 방수, 유리체액, 복막액, 복수, 땀, 림프액, 폐 가래 및 세척 또는 이들로부터 유래된 샘플을 포함한다. 생물학적 조직 샘플은, 결합, 상피, 근육 및 신경 조직을 포함하는, 인간, 동물, 식물, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스 구조의 구조적 재료 중 하나를 형성하는 세포간 물질과 함께, 일반적으로 특정 종류의, 세포의 집합체를 함유하는 샘플이다. 생물학적 조직 샘플의 예는 또한 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별 세포(들)을 포함한다. 예를 들어, 샘플은 암으로 의심되는 조직 샘플일 수 있다. 생물학적 조직 샘플은 세포의 집합체를 분리시키기 위해 먼저 처리될 수 있다.
구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 세포, 백색 혈액 세포 또는 혈소판이다. 백색 혈액 세포 (백혈구)는 호중구, 림프구 (T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, T-살해 세포, 자연 살해, B 림프구를 포함하는 T 세포), 단핵구, 호산구, 호염구, 마크로파지, 및 수지상 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 세포"는, 다른 세포에 대해 별개의 특징, 예컨대 특정 항체 또는 다른 화합물 또는 다른 입자와 커플링하기 위해 선택적 상호 친화도를 갖거나 특정 유형의, 다른 세포로부터 분리 또는 농축을 위하여 (예컨대 검사 또는 진단을 위하여) 전형적으로 의도된 세포이다. 특정한 구현예에서, 별개의 특징은 자기 비드와 커플링 또는 결합하여 자기 표적 세포를 형성하기 위한 선택적 친화도이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자 샘플"은 진단, 스크리닝, 모니터링 또는 치료가 고려되는 임의의 동물로부터 채취된 생물학적 샘플로서 정의된다. 동물은 포유동물을 포함한다. 환자는 질환 병태에 걸린 또는 질환 병태가 결정되거나 치료되는 대상체 예컨대 포유동물, 영장류, 인간 또는 가축 대상체를 지칭한다. 환자 샘플은 근원 생물학적 모집단의 출처일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "항체"는, 비제한적으로, F(ab) 및 Fv 단편 예컨대 sc Fv, 단일 쇄 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 재조합 조작된 항체 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하는, 임의의 아이소타입 (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM), 또는 이의 항원-결합 부분의 다클론성 및 단클론성 항체를 포함하기 위한 것이다. 이중특이적 항체는 또한 자기 입자 상에서 고정화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표지 모이어티"는, 어느 한쪽 직접적으로 또는 간접적으로, 검출가능하다. 표지 모이어티는 검출가능한 표지일 수 있고 자기 입자와 함께 사용될 수 있다. 직접 표지 모이어티는 방사성동위원소; 생산물이 검출가능한 효소 (예를 들면, 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 및 기타 등등); 형광 표지 (예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린, 시아닌 염료, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), PerCP, Cy5, Cy7, 알로피코시아닌 (APC), PECy5 또는 상이한 형광색소의 다른 탠덤 컨쥬게이트, 텍사스 레드(Texas Red), 및 기타 등등); 형광 발출 금속, 예를 들면, 152Eu, 또는 금속 킬레이트화 그룹 예컨대 EDTA를 통해 단백질에 부착된, 란타니드 계열의 기타; 화학발광 화합물, 예를 들면, 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 염, 및 기타 등등; 생물발광 화합물, 예를 들면, 루시페린, 에쿼린 (녹색 형광 단백질), 및 기타 등등; 및 금속성 화합물을 포함한다. 간접 표지 모이어티는 폴리펩타이드에 결합하는 표지화된 분자, 예를 들면, 폴리펩타이드에 특이적인 항체, 여기서 상기 표지화된 결합 분자는 상기 기재된 바와 같이 표지화됨; 그리고 특이적 결합 쌍, 예를 들면, 비오틴의 구성원 (특이적 결합 쌍 비오틴-아비딘의 구성원), 디곡시게닌 (특이적 결합 쌍 디곡시게닌-항체 내지 디곡시게닌의 구성원) 및 기타 등등을 포함한다. 대안적으로, 표지 모이어티는 비제한적으로 본원에 기재된 것들을 포함하는 임의의 적합한 표지일 수 있다.
결합 파트너 예컨대 항체, 단백질, 또는 핵산 분자로 표지화된 자기 입자는 Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Germany)로부터 상업적으로 이용가능하다. 생체분자를 자성으로 표지화하는 방법은 종래 기술에서 공지되고; 임의의 공지된 방법은 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,020,210은 자기 입자의 제조, 그리고 거기에 생체분자의 부착을 위한 방법을 기재한다. 특이적 결합 쌍의 제1 구성원은 자기 입자와 회합될 수 있고, 여기서 변형되어야 하는 생체분자는 특이적 결합 쌍의 구성원에 결합하는 모이어티를 포함한다. 대안적으로, 자기 입자는, 예를 들면 항체 또는 이의 면역학적으로 반응성 단편에, 링커 또는 스페이서 (예컨대, 예를 들면, 핵산 링커)를 통해 커플링된다. 스페이서 또는 링커의 부가는 생체분자가 더욱 유연한 방식으로 제시되도록 할 것이고, 신중한 화학물질은 리간드를 특이적 배향으로 부착할 수 있다. 많은 회사들이 프로토콜을 공개함에 따라 이들 커플링에 사용된 수많은 화학물질이 있고 화학 관련 분야에서 숙련된 장인을 도울 것이다.
자기 입자에 부착될 수 있는 특이적 결합 쌍의 구성원의 예는, 비제한적으로, (예를 들면, 3' 말단에 폴리-A 트랙을 포함하는 핵산 분자에 결합하기 위한) 올리고 dT; (상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 결합하기 위한) 특이적 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드; (비오틴화된 생체분자에 결합하기 위한) 아비딘 (예를 들면, 스트렙타비딘); (Ig에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 생체분자에 결합하기 위한) 항원-결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 면역글로불린 (Ig) 또는 이의 에피토프-결합 단편; (폴리뉴클레오타이드에 결합하기 위한) 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 예를 들면, 전사 인자, 번역 인자, 및 기타 등등; (폴리-히스티딘-태그된 단백질을 고정화하기 위해) Ni 또는 Co 킬레이트; 수용체-리간드 시스템, 또는 다른 특이적 단백질-단백질 상호작용 쌍; 압타머 (예를 들면, 3차원 분자 표적을 위한 핵산 리간드); (당단백질을 결합하기 위한) 렉틴; (지질-결합 단백질에 결합하는) 지질 및 인지질, 예를 들면, 포스파티딜 세린 및 아넥신 V를 포함한다. 당업자들은 자기 입자에 부착될 수 있는 특이적 결합 쌍의 다른 구성원을 인지할 것이다.
생체분자는 또한 직접 화학 컨쥬게이션에 의해 또는 물리적 회합에 의해 자기 입자에 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 커플링될 수 있다. 그러한 방법은 종래 기술에서 널리 공지된다. 생화학 컨쥬게이션은, 예를 들면, "Bioconjugate Techniques" Greg T. Hermanson, Academic Press에서 기재된다. 비-공유 상호작용, 예컨대 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 및/또는 반 데르 발스 인력은 또한 생체분자를 자기 입자와 커플링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분자를 크로마토그래피 매트릭스에 결합시키는데 사용된 표준 비-공유 상호작용은 사용될 수 있다. 생체분자를 자기 입자에 결합시키는데 사용될 수 있는 그와 같은 비-공유 상호작용의 하나의 비-제한 예는 카오트로픽 염의 존재 하에서 실리카에 대한 DNA 결합이다. 당업자는 다른 그러한 비-공유 결합 그리고 이를 달성하기 위한 조건을 알고 있다. 예를 들면, Molecular Cloning, Sambrook and Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참고.
본원에 사용된 바와 같이 "자기 입자"는 샘플의 복합체 혼합물로부터 그들의 분리를 돕기 위해 생물학적 샘플에서 생체분자 표적 예컨대, 비제한적으로, 항체, DNA, 폴리펩타이드 및 세포를 위한 표지로서 사용된다. 자기 입자는 크기에 따라 분류될 수 있다: 약 <50 nm인 마이크로비드; 약 100 내지 약 200 nm인 나노비드; 그리고 약 1-5 μm인 다이나비드. 게다가, 자기 입자는 원하는 생체분자 표적 예컨대 형광 표지, 항체, 핵산 및 기타 등등과 커플링 또는 결합을 위하여 (기능화된) 선택적 친화도에 맞게 적응될 수 있다.
상이한 자기 입자는 예를 들어, 다이날(Dynal) (Norway), 어드밴스드 마그네틱스(Advanced Magnetics) (Cambridge, Mass., U.S.A.), 임뮤콘(Immuncon) (Philadelphia, U.S.A.), 임뮤노텍(Immunotec) (Marseilles, France), 및 밀테니이 바이오텍 게엠베하(Miltenyi Biotec GmbH) (Germany)를 포함하는, 다수의 공급원으로부터 이용가능하다. 바람직한 자기 표지화 방법은 5 내지 200 nm의 크기 범위, 바람직하게는 10 내지 100 nm의 크기에서 콜로이드성 초상자성 입자를 포함한다. 이들 자기 입자는 세포의 정량적 자기 표지화를 허용하고, 그래서 커플링된 자기 표지의 양은 결합된 생산물의 양에 비례한다. 다양한 특이성을 가진 콜로이드성 입자는, 예를 들어, 밀테니이 바이오텍 게엠베하를 통해 이용가능하다.
본원에 사용된 바와 같이 "분리"는 주위 유체 벌크로부터 표적 세포의 단리 또는 수집 축적을 포함하고, 여기에서 상기 벌크는, 예를 들어, (침전 또는 원심분리와 유사하게 침전물을 수득하는) 세포의 제공된 샘플 또는 주위 벌크에 대해 표적 세포의 농축 또는 풍부화를 또한 암시하는, 세포의 유탁액의 유체성 혼합물 또는 현탁액 또는 이의 조합이다.
본원에 사용된 바와 같이 분리와 관련하여 "고갈"은 (침전 또는 원심분리와 유사하게 상청액을 수득하는) 벌크로부터 표적 세포의 제거이다.
본원에 사용된 바와 같이 "고 정량적" (분리, 고갈)은 다른 세포를 실질적으로 배제하는 표적 세포의 고 순도, 분리를 의미하거나, 다른 세포의 미미한 양 예컨대 분리된 세포, 및 반대로 고갈의 약 10% 내지 약 1% 또는 더 적은 양을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "고 정량적" (분리, 고갈)은 실질적으로 모든 표적 세포의 높은 회수, 분리, 또는 샘플로부터 표적 세포의 매우 많은 양, 예컨대 약 80% 내지 약 99% 또는 더 많은 또는 분리된 세포, 그리고 반대로 고갈을 의미한다.
본원에 튜브의 벽에 부착하거나 점착하거나 고착하는 세포, 또는 그 효과와 유사한 용어를 참조할 때마다, 세포가 벽에 직접적으로 부착하는 것을 반드시 의미하지 않고, 오히려, 이들이 또한 예컨대 세포의 사슬 또는 세포의 그룹에 의해 벽에 결합하거나 연결하거나 간접적으로 부착되는 것이 유의된다.
본원에 사용된 바와 같이 "자기 차폐"는 (교환가능한 양쪽 용어로, 자기장 실드/장벽으로서 본원에 또한 지칭된) "자기장 실드"로 장을 차단함으로써 공간에서 자기장을 감소시키고/거나 차단한다.
본원에 사용된 바와 같이 "HMPSM"은 자기장의 영향을 효과적으로 감소시키고/거나 제거하는 자체 내에서 고도로 집중된 자기장을 초래하는 높은 투자율 및 포화 재료를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 "자기장 실드/장벽"은 자기장 사용과 관련하여 제어될 수 있는 구조물이다.
본원에 사용된 바와 같이 "전자석"은 자기장이 전류에 의해 생산되는 자석의 한 유형이다. 자기장은 전류가 꺼지는 경우 사라진다. 전자석은 일반적으로 코일에 감긴 전선으로 이루어진다. 전선을 통해 전류는 코일의 중심에서 구멍에 집중되는 자기장을 창출한다. 전선 턴은 강자성 또는 페리자성 재료 예컨대 철로 만들어진 자기 코어 주위에 종종 감겨지고; 자기 코어는 자기 플럭스를 집중하고 더욱 강력한 자석을 만든다.
본원에 사용된 바와 같이 "영구 자석은, 전류가 자석을 통해 유동하고 있는 경우 자석 같이 행동할 뿐인, 전자석과 대조로, 영구적인 자석이다. 영구 자석은, 가장 자기성 자연 발생 광물인, 자철광 (Fe3O4), 또는 강력하게 자기 합성 물질인, 네오디뮴 같은 물질로 만들어진다.
본원에 사용된 바와 같이 "자석 배열"은 하나 이상의 자석이다. 하나 이상의 자석은 영구 자석 또는 전자석일 수 있다. 하나 이상의 영구 자석은 선형 배열, 상이한 크기, 상이한 강도, 선형 배열의 축에 수직인 반대 극 방향으로 구성될 수 있거나 선형 배열의 축에 수직인 평면에서 서로에 90°회전으로 구성될 수 있다. 배열에서 임의의 수의 자석은 물리적으로 함께 결합될 수 있거나 접착적으로 함께 결합될 수 있다. 영구 자석은 철, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코로부터 선택된 재료일 수 있다.
본 발명 및 본 발명 실시의 일반적 비-제한 개요는 아래에서 제시된다. 개요는, 건설적 기반을 여러가지의 및/또는 대안적 및/또는 발산적 양태/구현예를 제공하는, 본 발명의 구현예/양태의 예시적 실시를 약술하고, 이의 일부는 이후 기재된다.
본 개시내용은 양성 또는 음성 선택을 통해 생물학적 샘플에서 원하는 생체분자 표적을 자성으로 분리 및 수집하기 위한 장치, 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본원에 제시된 바와 같이, 원하는 자화된 생체분자 표적을 함유하는 생물학적 샘플에 실질적으로 인접하는 자기장은 생산된다. 자기장은 원하는 강도, 연속 시간 지속기간, 간헐적 지속기간, 박동 지속기간 및 이들의 조합의 자기장을 제공하기 위해 자동 방식으로 "온(ON)" 및 "오프(OFF)" 전환될 수 있다. 이것은 생물학적 샘플에 직면된/인가된 자기장의 응용을 기능적으로 제어하기 위해 (본원에 자기장 실드/장벽으로서 또한 지칭된) 자기장 실드의 도입에 의해 달성된다. 자기장 실드/장벽은 자기장의 소스와 생물학적 샘플 사이에 그리고 이의 높은 투자율 및 포화 재료 (HMPSM)의 기능으로서 위치하고, 자화된 생체분자 표적을 함유하는 생물학적 샘플에 관한 자기장의 영향을 효과적으로 감소시키고/거나 제거하는 자체 내에서 고도로 집중된 자기장을 초래한다.
본 발명의 양태에서, 세포성 생물학적 재료는 생물반응기 용기에서 배양되고, 원하는 세포는 자기 분리 및 수집을 위한 생체분자 표적이다.
본원에 기재된 장치, 방법 및 시스템은, 전형적으로, 비제한적으로, 세포인, 생물학적 샘플 (이종 생물학적 모집단)이 "자화된 세포"를 창출하는 샘플에서 특이적 생체분자 표적 (특이적 세포 유형)에 결합된 자기 비드를 갖는 접근법을 일반적으로 이용한다. 전형적 결합 방법은 i) 생물학적 표적의 항체에 컨쥬게이션되는 자기 비드의 직접 결합; 그리고 ii) 생물학적 표적이 또 다른 항원 또는 결합 쌍과 컨쥬게이션되는 항체에 결합되는 다단계 공정 사용을 포함할 수 있다. 이러한 항원/결합 쌍은 그 다음 각각의 항체/결합 쌍에 컨쥬게이션되는 자기 비드에 결합된다. 자기 분리 동안, (항원을 발현시키는; 양성으로 선택된) 자기 비드에 부착된 표적 세포인 자화된 세포는 자석 근처 위치에 유인되는 반면, (음성으로 선택된) 비드에 부착되지 않은 세포 모집단은 생물학적 샘플의 배지에 잔류하고 결합된 모집단으로부터 쉽게 제거된다. 자기 세포 선택에 대한 대안적 공정은 표적에서 일부 유형의 생물학적 공정 (예컨대 자기 활성화 비드에 커플링된 항-CD3 및 항-CD28을 이용한 T 세포 활성화)을 자극하기 위한 항원-제시 자기 마이크로비드의 사용이다. 자극 후, 자기 비드는 다운스트림 처리에 앞서 제거되어야 하고, 이는 효과적 자석으로 세포 현탁액을 처리하는 것이 필요하다.
분리 동안, 자성으로 기울어진 입자는 아래 방정식 1에 의해 정의된 바와 같이 상자성 입자에서 작용하는, 인가된 자기장, B 로부터, 힘 벡터, F 를 경험한다 (Pamme, 2006).
Figure pct00001
식중 V는 입자의 부피이고, △χ는 입자 및 주변 매체의 자화율 (자화되기 위한 능력)에서 차이이고, μ 0 은 진공의 투자율이고, B·▽는 자기장과 기울기 연산자 사이에 점 산물이다. 이 방정식으로부터, 명백하게 자기 분리 시스템의 성공은 파라미터의 수에 의존한다. 첫째, 입자 크기, 여기에서 더 큰 입자는 더 강한 자력을 경험한다. 자기 입자에 대하여 3개의 전형적인 크기 분류화, i) <50 nm (예를 들면 Miltenyi Biotec제 MACS® MicroBeads), ii) 100-200 nm (예를 들면 BioLegend®로 나노비드), 또는 iii) 1-5 μm (예를 들면 Invitrogen제 Dynabeads®)가 있고, 이는 증가하는 크기로 쉽게 분리된다. 다음으로, 주위 매체에 대해 비드의 자화율 증가. 대다수의 비드가 전형적으로 철 코어로 이루어지고, 주위 매체가 실제적으로 자성이 아니므로, 이러한 값은 전형적으로 이미 비교적 더 크다. 마지막으로, 자기장 기울기 증가는 자기 비드에 인가된 힘을 현저히 증가시킬 수 있다. 이것은, 고-기울기 장의 불균일 공간 품질로 인해, 자기장 기울기가 자기 입자의 북극 및 남극에서 불균일 힘을 생성하기 때문이다 (도 1a). 입자 상에서 이러한 불균일 힘은 입자 움직임으로 이어진다. 완벽하게 균질한 자기장에서, 동등 및 반대 힘은 자기 입자의 2개 극에서 생성되어, 입자에서 0 순 힘 그리고 순 움직임 없음으로 이어진다 (도 1b). 게다가, 더 큰 크기화된 자기 입자로, 기울기로부터 인가된 자력의 차이는 더 작은 비드와 비교하여 2개 극 사이에 더 크다 (도 2 및 3).
자동화된 분리, 단리 및 수집을 위하여 자기 비드를 유인하기 위해 기울기를 생성할 수 있는 "전환가능한" (켜지고 꺼질 수 있는) 자기장을 유도하기 위한 수단이 있다. 예를 들어, 전자석은 자성으로 민감한 재료 (예를 들면 철)의 막대기 주위 전류 전달 전선을 감음으로써 형성된다 (도 4a). 이들은 각각 전선을 통해 전류를 인가 또는 제거함으로써 온 또는 오프 전환될 수 있다. 또 다른 방법은, 높은 자기 보자력 (자석 극을 전환시키기 위한 높은 자기장)을 가진 경 자석, 그리고 낮은 보자력을 가진 연 자석으로 이루어지는, 전자-영구 자석이다 (도 4b). 두 자석은 상자성 재료 (예컨대 철)로 서로에 연결되어 자기 회로를 완성한다. 연 자석은 전류 전달 전선에서 랩핑되고, 전선에서 강한 전류를 펄싱함으로써, 연 자석의 자극은 전환될 수 있다. 극이 오정렬되는 경우, 자기 "전류"는 상자성 재료를 통해 유동하고, 외부 자기장은 관찰되지 않는다. 하지만, 극이 정렬되는 경우, 자기 전류는 공기를 통해 이동하고, 외부 자기장은 생성된다. 최종 방법은 자기장을 생성하기 위한 영구 자석의 사용이다. 높은 자기 포화를 가진 재료를 사용함으로써, 자석의 한쪽에서 자기장을 차단하는 것이 가능하다 (도 4c).
본 발명의 양태에서, 교대 배향을 가진 강한 영구 자석의 배열은 사용된다 (도 4c). 이것은 배열로부터 방사상으로 강한 자기 기울기, 뿐만 아니라 배열의 축을 따라 선형으로 기울기를 창출한다. 이러한 설계의 변형은 할박(Halbach) 배열이고, 여기에서 배열의 자석은 서로에 관하여 90°회전된다 (도 4d). 이것은 자석의 한쪽에서 자기장에서의 상당한 증가를 유도하는 반면, 다른 쪽에서 이것을 완화시킨다 (Kang 등).
제어가능한 자기장은 비-표적화된 생물학적 분획을 동시에 제거되고 폐기되게 할 수 있으면서 (어느 한쪽 양성 또는 음성 선택을 통해) 생체분자 표적을 함유하는 표적화된 생물학적 분획의 단리 제어의 순차적 활동을 수행하도록 설계될 수 있다.
자기 분리를 사용하여 생물학적 샘플의 처리 동안, 자기장을 온 및 오프 전환하는, 이에 의해 양쪽 양성 및 음성 세포 선택의 자동화를 가능하는 능력은 주요 작동적 요건이다. 본원에 기재된 장치 및 방법은 표적 생물학적 모집단의 자동화된 수집을 가능하게 하여 이에 의해 전체적 공정 복잡성을 감소시키고 작동 비용을 감소시킨다.
본원에 기재된 "온" 및 "오프" 전환가능한 자기장은 자기 입자 예컨대 자기 비드로 표지화된 생물학적 샘플에 의해 직면된 자기장을 제어하기 위한 자기장 실드/장벽의 도입에 의한 것이다. 이러한 제어가능한 자기장을 통해, 표적 생물학적 보유 이어서 2차 방출 및 포착의 순차적 단계는 매우 작고 에너지 효율적인 자기 분리 시스템을 생산하게 한다.
자기장 실드/장벽은 HMPSM의 고유 특성에 의해 기능적이다. 이러한 높은 투자율 및 포화는 이러한 재료 내에서 고도로 집중된 자기장을 초래한다. 자기장의 소스와 생물학적 샘플 사이에 자기장 실드/장벽으로서 HMPSM의 배치는 생물학적 샘플에 관한 자기장의 영향을 실제로 제거하게 한다. 자기 장벽의 이러한 제어가능한 활성화를 통해, 생물학적 샘플로부터 표적 모집단의 자기 분리는 높은 재현성 및 비교적 저비용으로 달성될 수 있다.
도 1은 자기 입자/비드 (예컨대 세포 분리 및 활성화에 사용된 것들)이 자기장 기울기에 반응하는 방법에 관한 이론을 제시한다. 이것은 방정식 1에서 수학적으로 예시된다. 각 자기 비드는 북극 및 남극을 갖는다. 자기장 기울기에 노출된 경우, 입자의 각 극에서 작용하는 자력 (인력, 척력)은 상이하여, 입자를 움직일 수 있는 순 힘을 초래할 것이다 (도 1a). 비교로, 자기장 기울기가 없는 경우, 각 극에서 작용하는 힘은 동등 및 반대일 것이다 (도 1b). 그러므로, 순 힘은 자기 입자에 인가되지 않을 것이고, 움직임은 유도되지 않을 것이다. 극이 북 (N)과 남 (S) 사이에 교대되도록 배열된 자석의 배열은 이들 필요한 자기장 기울기를 생성하는데 사용될 수 있다. 게다가, 도 1c에서 도시된 바와 같이, 높은 자기장 기울기는 배열에서 교대 북 내지 남 방향을 가진 극으로 배열된 다중 강한, 소형 자석의 배열을 사용함으로써 생성될 수 있다.
도 2는 세포의 자기 분리에 전형적으로 사용된 자기 비드의 크기를 제시한다. 밀테니이제 약 50 nm MACS® MicroBeads 내지 Invitrogen제 최대 약 5 μm Dynabeads® 범위인, 현재 실재하는 일정 범위의 비드 크기가 있다. 비드 크기 증가는 비드의 각 극에서 작용하는 증가된 힘의 차이로 인해 자기장에 반응하기 위해 비드의 민감성을 전형적으로 증가시킨다.
도 3은 대형화된 자기 비드가 유도된 자기장에 반응하여 유체 밖으로 더욱 효율적으로 강제되는 방법을 약술한다. 일부 구현예에서, 비드는 비드 개별 극의 각각에서 자기장으로부터 인력 및 척력에 동시에 노출된다. 자기장 소스로부터 멀리 움직여서, 자기장의 규모 및 기울기는 감소한다. 비드가 경험하는 순 힘은, 그러므로, 자기장의 소스로부터의 거리, 그리고 비드의 직경에 의존한다. 대형 비드는 양쪽 극 사이에 거리가 더 멀어서, 극에서 작용하는 자력에서 더 큰 차이를 초래한다. 유사하게, 더 강한 (즉 자석에 더 가까운) 기울기 비드의 개별 극에서 작용하는 힘의 차이를 스케일링한다. 순 힘에서 이러한 증가는 자석 쪽으로 그리고 유체 밖으로 비드의 더욱 신속한 유인을 초래한다.
도 4는 자동 제어 시스템을 사용하여 생물학적 샘플에 적용과 관련하여 켜짐/꺼짐될 수 있는 자기장을 개발하기 위한 방법을 제시한다. 도 4a에서, 전자석은 제시되고, 여기에서 전선은 강자성 재료, 예컨대 철 주위 랩핑된다. 전류를 전선에 인가함으로써, 자기장은 빨리 그리고 쉽게 켜질 수 있고, 반대로, 꺼질 수 있다. 하지만, 이로부터 생성된 자기장은 낮을 것이다. 게다가, 전자석은 상당한 수준의 열을 생산하며, 이는 국소 세포 배양 환경에 상당히 문제적이다. 도 4b는, 자기 회로를 형성하는 강자성 재료에서 양쪽 설정된, 양쪽 비-전환가능한 희토류 자석, 및 극 전환가능한 알니코 영구 자석으로 이루어지는 전자-영구 자석을 제시한다. 영구 자석의 극이 정렬되는 경우, 탄소 강은 동일한 배향을 채택하여, (유체 현탁액 밖으로 자기 비드를 끌어당기는데 사용될 수 있는) 자석 주위 공기에서 순 자기 플럭스를 생산한다. 하지만, 2개 영구 자석의 극이 반대인 경우, 자기 플럭스는 강자성 재료로 국한되어, 자기 비드의 추출을 방지한다. 알니코 자석의 배향은 이를 둘러싸는 전선의 코일을 통해 전류의 매우 높은 규모 및 짧은 지속기간 펄스를 인가함으로써 전환되고, 이에 의해 높은 규모, 과도 자기장을 생산한다. 하지만, 그와 같은 기구로부터 생성된 자기 기울기는 또한 희토류 자석과 비교하여 상당히 낮을 것이며, 이러한 방법은 임의의 주위 전자기기에 미지의 역효과를 가질 수 있는 전자기 간섭을 또한 생산할 것이다. 도 4c는, 한쪽에서, HMPSM, 예컨대 철, 코발트 철, 및 Hiperco 50과, 반전 극 배향을 가진 영구 자석의 배열을 제시한다. 이러한 HMPSM을 활용함으로써, 자기장의 자기 플럭스는 반대 쪽에서 증폭될 반면, HMPSM을 가진 쪽에서 미미한 수준으로 완화될 것이다. 영구 자석과 자기 비드 사이에 놓이도록 HMPSM을 작동화함으로써, 비드에서 작용하는 힘은 효과적으로 0으로 감소될 수 있다. 반대로, 영구 자석의 반대 쪽으로 HMPSM를 움직여서, 매우 강한 자석력은 비드에 유도될 수 있다. 마지막으로, 도 4d에서 자석의 90°회전이 배열의 한쪽에서 증폭된 자기장의 생성을 허용하는 반면, 배열의 반대 쪽에서 장을 상당히 완화되거나 폐지된 할박 선형 배열은 제시된다.
도 5는 영구 자석에서 HMPSM (표지화된 x)의 기능을 증명하는 컴퓨터계산 모델링을 제시한다. 자기 플럭스는 자기를 둘러싸는 공기를 통해 주로 전한다. 하지만, 자기 플럭스는 HMPSM을 통해 전할만큼 충분히 강하지 않다. 이것은 자석에 대한 HMPSM의 반대 쪽에서 상당한 자기 플럭스 밀도가 없음을 초래하는 반면, 플럭스 밀도는 영구 자석의 2개 극에 주로 증폭된다.
도 6은 카셋트 면의 길이를 따라 운용하는 자기 비드를 사용하여 자기 분리를 위한 분리 튜브를 가진 자동화된 세포 배양 시스템 내에서 전형적으로 사용된 예 카셋트의 레이아웃을 나타낸다. 이러한 튜브는 자동화된 세포 배양 시스템 내에서 위치한 영구 자석 배열로 정렬한다. 분리 튜빙은 어느 한쪽 관심 세포의 양성 또는 음성 결합에 사용되는 카셋트 내에서 다양한 튜빙 및 백에 연결된다. 가능한 한 긴 튜브의 사용은 분리 튜빙에 적재될 수 있는 부피를 증가시켜, 이에 의해 자기 분리가 발생하기 위한 처리 시간을 감소시킨다.
도 7은 도 6에서 제시된 분리 공정의 구현예를 제공한다. 세포에 어느 한쪽 부착된 또는 미부착된 자성으로 결합된 비드는 분리 튜브 (701)에 적재될 수 있다 (도 7a). 일부 양태에서 분리 튜브 (701)는 도 7b에서 제시된 바와 같이 영구 자석 배열 (704)로 정렬된다. 다른 양태에서 분리 튜브 (701)는 영구 자석 배열 (704)을 대체하는 전자석으로 정렬된다. 영구 자석 배열 (704)은 북극 (702) 및 남극 (703)이 교대로 있는 영구 자석으로 이루어져서 가능한 한 높은 자기 플럭스 기울기를 생성한다. 분리 튜브 (701)에서 자기 비드는 자석 배열 (704)에 의해 유인되어서, 유체 현탁액으로부터 자기 비드를 성공적으로 분리제거한다.
도 8은 "켜진" 자기장을 가진 자기장 실드/장벽의 구현예를 제시한다. 분리 튜브 (701)는 영구 자석 배열 (704)의 길이를 따라 운용한다. 영구 자석 배열 (704)의 한 부분을 둘러싸는 것은 HMSPM으로부터 생산된 (상자성 외장 (801)으로서 도시된) 자기장 실드 (801)이다. 일부 양태에서 자기장 실드 (801)는 순수한 철로부터 생산된다. 일부 양태에서 자기장 실드 (801)는 연성 자기 철 합금, 예컨대 페라이트계 강, 실리콘 철, 니켈 철, 또는 코발트 철로부터 생산된다. 일부 양태에서 자기장 실드 (801)는 코발트, 바나듐, 및 철의 연성-자석 합금 예컨대 약 49% 코발트, 약 2% 바나듐, 및 나머지 철의 합금으로부터 생산된다. 일부 양태에서 외장 (801)은 Hiperco50 또는 Hiperco 50A로부터 생산될 수 있다. 일부 양태에서 자기장 실드 (801)의 상자성 특성은 자석 배열 (704)에 의해 분리 튜브 (701)에 인가된 자기장 기울기를 증폭시킨다. 이것은, 사실상, 이들을 유체 현탁액으로부터 더욱 효과적으로 제거되도록 하는 자기 비드에서 작용하는 자력을 증가시키는 반면, 비-자기 물질은 영향받지 않을 것이고 미실행된 분리 튜빙을 통과할 것이다. 영구 자석 배열 (704) 및 자기장 실드 (801)는 또한 서보 (802) 및 기어 트레인 (803)에 연결되어, 전체 어셈블리가 완전히 회전되도록 하고, 필요시 꺼지고 켜지게 한다.
도 9는 도 8에서 발견된 동일한 어셈블리를 제시하지만, 대신 자석이 "오프" 위치이다. 분리 튜브 (701)는 영구 자석 배열 (704)을 따라 여전히 운용한다. 하지만, 오프 위치에서, 자석 배열 (704) 및 자기장 실드 (801)는 자기장 실드 (801)가 분리 튜브 (701)와 영구 자석 (704) 사이이도록 서보 (802) 및 기어 트레인 (803)을 사용하여 회전된다. 도 4 및 5로 기재된 바와 같이, 자기장 실드 (801)에 사용된 HMPSM 재료는 자기 플럭스가 그것을 통과하는 것을 방지한다. 이것 때문에, 분리 튜브 (701)가 노출되는 자기 플럭스 기울기는 상당히 감소되고, 이에 의해 자기 비드 상에서 자기장의 지배를 잃는다. 분리 튜브 (701)에 액체 또는 기체의 높은 유속의 적용은 자기 비드 및 자성으로 결합된 세포를 플러싱하는데 사용될 수 있다.
도 10은 분리 튜브 (701), 자기장 실드 (801), 및 영구 자석 배열 (704) 사이의 인터페이스의 횡단면이다. "온" 위치에서의 경우, 도 10a에서 제시된 바와 같이, 자기 입자를 유인할 수 있는 분리 튜브 (701)에서 작용하는 상당한 자기장이 실재한다. "오프" 위치에서의 경우, 도 10b에서 제시된 바와 같이, 분리 튜브 (701)에서 작용하는 자기장은 미미하고, 이전에 결합된 세포 및 비드는 효과적으로 제거될 수 있다.
도 11은 카셋트 (1101) 및 자동화된 세포 배양 기기 (1102)의 인터페이싱의 측면도이다. 분리 튜브 (701)는 카셋트 (1101)에 부착되어, 어느 한쪽 자기 또는 비-자기 분획이 카셋트 (1101) 내에서 상이한 영역으로부터 그리고 영역쪽으로 움직이도록 한다. 반대로, (함께 (704) 및 (801)로 이루어지는) 자기 분리 어셈블리는 자동화된 세포 배양 기기 (1102) 내에서 함유된다. 기기 (1102)와 연관된 제어 시스템은 서보 (802) 및 기어 트레인 (803)을 제어하여 자석 배열 (704) 및 자기장 실드 (801)를 회전시켜, 이에 의해 분리 튜브 (701)에 속하므로 자기장을 "켜짐" 또는 "꺼짐"할 수 있다. 카셋트 (1101) 및 기기 (1102)가 함께 인터페이싱되는 경우, 분리 튜브 (701) 및 분리 어셈블리 ((704) 및 (801) 함께)는 정렬되어, 효과적인 자기 분리가 수행되도록 한다. 게다가, 기기 (1102)와 연관된 연동 펌프를 사용하여, (어느 한쪽 자기 비드 및 세포가 있거나 없는) 유체는 분리 튜빙 (701)으로부터 수송 또는 제거될 수 있다.
도 12는 카셋트 (1101)의 외부 벽과 분리 튜브 (701) 내에서 자기장 기울기의 규모 및 수를 증가시키는 다양한 수단을 가진 세포 배양 기기 (1102)의 외부 벽 사이에 위치해 있는 분리 튜브 (701)의 측면도로 이루어진다. 도 12a는 카셋트 (1101)의 외부 면에서 분리 튜브 (701)의 길이를 운용하는 상자성/비-자기 스페이서 (1201)를 제시한다. 이러한 스페이서 (1201)는 튜브 (701)를 압축시키는 작용을 하여 튜브 (701) 및 자석 배열 (704)를 통해 유동하는 자화된 요소들 사이에 거리를 최소화한다. 또한, 자석 배열 (704)로부터 (상자성이면) 스페이서 (1201)의 자기화는 카셋트 (1101)에 가장 가까운 쪽의 분리 튜브 (701)에서 또 다른 자기장 기울기의 형성을 초래할 것이다. 게다가, 스페이서 (1201)를 더 작은 서브섹션으로 스페이서 (1201) (도시되지 않음)의 길이를 따른 컷팅은 각 스페이서 서브섹션 (1201)의 말단에서 높은 기울기 자기장의 생성을 허용할 수 있다. 도 12b는, 영구 자석 배열 (704)에 의해 생성된 자기장에 노출된 경우, 메시 (1202)의 가닥들 주변에서 높은 자기장 기울기를 생성하는 분리 튜브 (701) 내에서 상자성 전선 메시 (1202)를 제시한다. 도 12c는 영구 자석 배열 (704)로부터 자기장에 노출된 경우 국한된 자기장 기울기를 생성하는 분리 튜브 (701) 내에서 위치해 있는 상자성 입자 (1203)를 제시한다. 도 12d는 분리 튜브 (701)의 길이를 따라 운용하고 더 작은 서브섹션 길이방식으로 파괴되고 (도시되지 않음), 자석 배열 (704)에 노출된 경우 각 막대기 (1204)의 끝에 높은 자기장 기울기를 생성할 수 있는 상자성 막대기 (1204)를 제시한다. 도 12e는 배열 (704)로부터 자기장에 노출되는 이들이 경우 막대기 (1205)들 사이에 높은 자기장 기울기가 형성되는 분리 튜브 (701)의 길이를 따라 운용하는 일련의 상자성 막대기 (1205)를 도시한다. 도 12f는 배열 (704)로부터 자기장에 노출된 경우 기공 내에서 높은 자기장 기울기가 형성되는 분리 튜브 (701)의 길이를 따라 운용하는 상자성 스캐폴드 (1206)를 제시한다. 도 12g는 배열 (704)로부터 자기장에 노출된 경우 이들 사이에 높은 자기장 기울기를 생성하는 작은 수차로 이루어지는 분리 튜브 (701)의 상자성 코팅물 (1207)을 도시한다. 도 12h는 배열 (704)로부터 자기장에 노출된 경우 필터 기공 내에서 높은 자기장 기울기를 생성하는 분리 튜브 (701) 내에서 배치된 상자성 필터 (1208)를 도시한다.
선택적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 일부 양태에서 다양한 파라미터 예컨대 자기장 강도, 생체분자 표적의 공간 분포 (집중) 및/또는 다른 파라미터 예컨대 온도는 조정가능하다. 예를 들어, 생물학적 샘플 유체의 유속 및/또는 점성 및/또는 탄력성은 예컨대 표적 세포의 분리를 허용하면서, 적어도 실질적으로, 비-표적 세포의 응집을 예방하도록 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 유체는 분리된 표적 세포를 세정하는데 사용될 수 있다. 세정 유체의 유동 체계 및 속도는 튜브 벽으로부터 표적 세포 탈락을 촉진 (즉 제거 또는 방출을 촉진)하도록 선택적으로 조정되어서, 유동을 갑자기 변경시켜 이에 의해 튜브 벽에서 표적 세포를 불안정화시키거나 부식을 돕는 난류 또는 충격을 유도한다.
특정 구현예에서, 여러 가지의 방법 및 방법의 조합 (예를 들면 자기소거, 버블링, 진동, 효소, 음파 및 이들의 조합)에 의한 분리 튜브의 분리된 세포의 방출은 튜브 밖으로 세포 세정에 앞서 및/또는 이와 동시에 실시될 수 있다. 이러한 주변 처리는 품질 및/또는 품질과 관련하여 원하는 표적 모집단의 특징 및 분리를 개선하기 위해 실시될 수 있다. 예를 들어, 적색 혈액 세포 (RBC) 용해를 사용하는 것은 점착성 RBC를 제거하는데, 순도를 개선하는데 그리고 그러므로 일반 PBMC 모집단으로부터 T 세포 분리를 더 쉽게 만드는데 도움이 될 수 있다.
언급된 바와 같은 효소 예컨대 DNase는 세포 방출을 돕는데 사용될 수 있다.
게다가, 높은 품질 또는 순도 고갈이 (오히려 표적 세포의 수집 보다) 의도되는 경우, 벽에 대한 비-표적 세포 고착 및/또는 응집화를 희생하여, 수집을 위하여 사용된 것보다 더 강한 충분히 강한 자기장은 인가될 수 있다.
장치, 시스템 및 방법은, 하나 이상의 시약, 하나 이상의 자기 입자, 하나 이상의 결합 파트너, 자석 배열, 자기장 실드, 및/또는 사용 지침을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 방법을 실행하기 위하여, 키트, 뿐만 아니라 이의 용도에서 구현될 수 있다.
추가 설명 없이, 당업자가, 이전의 설명 및 하기 예시적 실시예를 사용하여, 본 발명을 만들고 활용할 수 있으며 청구된 방법을 실시할 수 있다고 믿어진다. 하기 작업예는 그러므로, 본 발명의 전형적인 양태를 구체적으로 밝히고 본 개시내용의 나머지를 어떠한 식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그래서, 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않아야 한다.
실시예:
실시예 1 - 유체로부터 비드의 분리
CD3/CD28 Activation Dynabeads® (Invitrogen제)을 사용하여 활성화되었고 확대되었던 (Lonza제 PBMC에서 유래된) T 세포는 비드로부터 T 세포를 분리시킬 목표로 자기 분리 시스템 (704 및 801)을 사용하여 처리되었다. 31 ml의 비드-세포 (1.6x106 세포/ml) 유체 현탁액 (T 세포 배지, 94% X-Vivo 15, 5% HS, 1% P/S, 10 ng/ml IL-2)은 "온" 위치에 설정된 자기 분리 어셈블리 (704 및 801)로 상이한 유속 (5, 10, 및 20 ml/분)에 분리 튜브 (701)를 통해 적재되었다. (자성으로 결합되지 않은) 세포가 유체 현탁액으로부터 제거되지 않았을 것 같기 때문에, 분리 튜브로부터 수집된 유체는 "세포 분획"으로 명명되었다. 자석 어셈블리 (704 및 801)는 "오프" 위치까지 ((802 및 803)의 사용 없이) 수동으로 회전되어서, 상자성 재료 (801)가 분리 튜브 (701)와 자석 배열 (704) 사이이었다. 분리 튜브 (701)에서 (4 ml 각각에 대하여 40 ml/분에 공기 및 유체 린스 교대로 이루어지는) 3개의 플러싱 사이클은 튜빙 (701) 벽에 부착된 임의의 세포 및 Dynabeads®를 수집하고 린스제거하기 위해 수행되었다. 모든 자성으로 유인된 세포 및 비드로 이루어졌음에 따라 이것은 "자기 분획"으로 명명되었다.
양쪽 분획으로부터 세포 카운트를 사용하여, Dynabeads®로부터 성공적으로 분리된 세포의 백분율 (즉 "세포 분획"에서 수득된 총 세포의 백분율)은 계산되었다. 모든 적용된 유속에서, Dynabeads®로부터 성공적으로 분리된 세포의 백분율은 대략 95%이었다 (도 13a). 양쪽 유체 분획은 또한 혈색소계를 사용하여 카운팅되어 각 개별 분획에서 Dynabeads®의 수를 측정하였다. 모든 유속에, 세포로부터 제거된 Dynabeads®의 백분율은 적어도 95%이었다 (도 13b).
실시예 2 - 분리 튜브를 통한 비드 결합된 세포의 연속 유동
(BioLegend®로부터) 스트렙타비딘 나노비드는 자기 분리 어셈블리 (704 및 801)를 사용하여 양성 선택을 위한 카셋트 (1101)의 외부에서 통과된 주르카트(Jurkat)에 결합되었다. 세포 (107 세포/ml)는 실온에서 10 분 동안 세포 및 제제를 함께 인큐베이션함으로써 세포 상에서 Fc 수용체에 결합하는 차단 제제 (5 μl/107 세포, Human TruStain FcX™, Biolegend®)를 부가하는 비-특이적 결합을 위하여 먼저 차단되었다. 관심 세포에 결합하는 비오틴 컨쥬게이션된 일차 항체 칵테일 (10 μl/107 세포, Human CD14+ Monocyte Isolation, Biolegend®)은 부가되었고 혼합물은 2-8℃에 15 분 동안 인큐베이션되었다. 스트렙타비딘 코팅된 나노비드 (10 μl/107 세포)는 2-8℃에 추가의 15 분 동안 세포 현탁액에 유사하게 부가되었다. 나노비드 상에서 스트렙타비딘은 관심 세포의 항체에서 비오틴에 결합하고, 이에 의해 세포를 자성으로 결합시킨다. 자성으로 결합된 세포의 순수한 모집단을 보장하기 위해, 결합된 세포는 5 분 동안 EasySep™ (STEMCELL Technologies®제) 자석에 적재함으로써 사전분류되었고, 그 다음 미결합된 세포 충전된 상청액은 부어졌다.
자석 배열 (704)을 사용하여 주르카트를 분리하기 위해, 주르카트 (1.5-2 ml/분, 3 ml)는 자기 분리 어셈블리 (704 및 801) 동안 상이한 유속 (1-5 ml/분)에 분리 튜브 (701)를 통과되었다. 자성으로 유인된 세포는 유동 현탁액 밖으로 끌어당겨졌고 자석 배열 (704)에 가장 근처인 튜빙 (701)의 벽에 고착되었다. 자석이 켜진 상태에서 유동으로부터 제거되지 않은 모든 세포는 (9-12 ml의 부피로 수집된) "음성 분획"으로서 포착되었다. 자석 어셈블리 (704 및 801)는 "오프" 위치까지 수동으로 회전되었고, (실시예 1에서 기재된) 3개 플러싱 사이클은 "양성 분획"을 포착하기 위해 수행되었다. 모든 상기 단계들은 단리 완충액 (98% DPBS, 2% FBS)를 사용하여 수행되었다.
음성 및 양성 분획 둘 모두의 세포 카운트를 사용하여, 포착되지 못했던 세포 (적재된 세포의 수와 비교하여 "음성 분획"에서 모든 세포)의 백분율, 뿐만 아니라 양성으로 포착된 세포 (포착된 그 다음 "양성 분획"에서 성공적으로 수득된 세포)의 방출 효율을 결정하는 것이 가능하였다. 분리 튜브 (701)에서 포착 유속을 증가시키는 것은 시스템에 의해 포착되지 못했던 세포의 증가된 수를 초래하였고 (도 14a 및 c), 이는 결합된 세포가 자기장에 노출될 감소된 시간에 기인된다. 하지만, 포착 유속을 5 ml/분까지 증가시키는 것은 결합된 세포의 방출 속도를 최대 거의 100% 크게 개선하였다 (도 14b 및 d). 이것은 더 높은 유속으로 현탁액을 떠나고 튜빙 회로에서 다양한 접합부에 갇히는 더 적은 세포 때문일 것 같다. 분리 튜브 내부 직경 수정 (두꺼운 튜빙 - 1/8" ID, 얇은 튜빙 - 3/32" ID)은 포착에 대한 약간 증가된 실패 (도 14a 및 c), 그러나 약간 개선된 세포 방출 (도 14b 및 d)를 초래하였다. 이들 결과는 증가된 유동 속도 그리고 얇은 튜브에서 벽 전단 스트레스 때문일 것 같다.
실시예 3 - 분리 튜브를 통한 비드 결합된 세포의 다중 통과
주르카트는 실시예 2에서 기재된 바와 같이 자성으로 결합되었고 사전-선택되었다. 실시예 2와 유사하게, 주르카트 (2x106 세포/ml, 3 ml)는 자기 분리 어셈블리 (704 및 801)가 켜졌던 동안 5 ml/분의 유속으로 단리 완충액내 분리 튜브 (701)에 통과되었다. 자석 배열 (704)에 의해 포착되지 않았던 세포는 단리 완충액내 첫번째 통과의 음성 분획 (12 ml의 수집 부피)으로서 수집되었다. 세포는 5 ml/분의 포착 유속으로 분리 튜브 (701)에 재차 적재되었고, 여전히 포착되지 않았던 세포는 두번째 통과의 음성 분획으로서 수집되었다 (12 ml로서 재차 수집되었다). 두번째 통과 후, 분리 어셈블리 (704 및 801)는 "오프" 위치로 돌려졌고, 분리 튜브 (701)에서 포착된 세포는 (실시예 1에서 기재된) 3개 플러싱 사이클에 노출되어 양성 분획을 획득하였다. 모든 상기 단계들은 단리 완충액으로 수행되었다.
실시예 2에서와 같이, 각 분획으로부터 세포는 카운팅되었고 (튜브 (701)에 적재된 총 세포의 백분율로서 양쪽 통과를 위하여) 포착 실패, 및 방출 효율의 측면에서 정량화되었다. 분리 튜브 (701)를 지나서 세포의 추가의 통과를 부가하는 것은 단일 통과와 비교하여 포착되지 못했던 세포의 백분율을 성공적으로 감소시켰고 (도 15a) 방출에서 임의의 음성 감소를 초래하지 않았다 (도 15b).
실시예 4 - 분리 튜브내 "대기 시간"
주르카트는 실시예 2에서 기재된 바와 같이 자성으로 결합되었고 사전-선택되었다. 결합된 세포가 자기장에 노출된 지속기간을 효과적으로 증가시키기 위해, 분리 튜브 (701)에 적재된 후, 주르카트 (1.5x106, 3 ml)는 "온" 위치로 돌려진 자기 어셈블리 (704 및 801)로 시간의 상이한 지속기간 (1-5 분) 동안 정적으로 유지되었다. 튜브 (701)는 12 ml로 5 ml/분에 부드럽게 린스되었고, 유출물은 음성 분획으로서 수집되었다. 대기 지속기간 후, 분리 어셈블리 (704 및 801)는 "오프" 위치로 돌려졌고, (실시예 1에서 기재된) 3개 플러싱 사이클은 양성 분획을 수집하기 위해 적용되었다. 상기 단계들은 모두 단리 완충액을 사용하여 수행되었다.
수집된 음성 및 양성 분획은 포착 실패 및 방출 속도의 측면에서 재차 카운팅되었고 정량화되었다. 감소된 포착 실패로 이어지는 증가하는 대기 시간의 유의미한 추세는 관찰되었고 (도 16a), 이는 자기 입자가 자기장에 반응할 수 있는 추가의 시간때문인 것 같다. 추가적으로, 증가된 대기 시간에도 불구하고, 각 대기 지속기간 동안 방출 속도는, 개선된 포착 속도가 단순히 튜빙 회로에서 접합부내 증가된 세포 손실때문이 아니라는 것을 제안하는, 100%에 가까웠다 (도 16b).
공정에 대기 지속기간의 추가로, 음성 세포가 (이후 "위양성"으로서 지칭된) 공정에 의해 포착될 가능성이 더 높다. 위양성의 백분율을 정량화하기 위해, 자기 비드와의 결합을 경험하지 않았던 주르카트는 분리 튜브 (701)에 상이한 포착 유속 (5 ml/분 또는 10 ml/분)으로 적재되었다 (3x106 세포/ml, 3 ml). 또한, 세포는 시간 (1 분 또는 3 분)의 상이한 지속기간 동안 대기하였고, 여전히 "온" 위치에서 자기 어셈블리 (704 및 801)와, 높은 유속 공기 또는 유체 플러시로 이루어지는, 상이한 "음성 분획" 플러시에 노출하였다. 적재되었던 세포가 미결합되었으므로, 모든 세포는 "음성 분획"에서 나올 것으로 예상되었고, 그렇지 않았던 어떠한 것은 "위양성"으로 간주되었다. 더욱 종래의 포착 순서 (5 ml/분 포착 유속, 3 분 대기 시간)을 사용하는 것이 위양성의 불량율 (30%)을 초래하였어도, 포착 유속 증가 그리고 대기 시간 감소 양쪽은 이것을 약 20%로 감소시켰다 (도 17). 게다가, 대기 시간의 상당한 감소 그리고 포착 유속 (조건 5) 및 40 ml/분 공기 플러시의 추가 (조건 7)에서의 증가 양쪽은 위양성율을 <3%로 감소시킬 수 있다 (도 17).
실시예 5 - 세포의 혼합된 모집단의 분리 및 정제
해동된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 (ThermoFisher Scientific으로부터) 양성 선택에 의한 이종 세포 모집단으로부터 CD3+ 세포 선택을 위하여 Dynabeads®와 결합되었다. PBMC (107 세포/ml)는 10 분 동안 2-8℃에 CD3 항체 (5 μl/107 세포, FlowComp™ Human CD3 Antibody, Invitrogen)로 먼저 인큐베이션되었다. PBMC는 그 다음 실온에서 흔들기와 틸팅 하에 15 분 동안 FlowComp™ Dynabeads (15 μl/107 세포, Invitrogen)와 결합되었다. 비드 결합된 세포 (5-10x106 세포/ml, 1.5 ml)는 상이한 공정 파라미터 (도 18에서 기재된, 유속, 대기 시간, 통과 수)를 사용하여 자석 배열 (704)을 지나서 분리 튜브 (701)를 통해 적재되었다. 자석에 의해 포착되지 않은 모든 세포 (CD3 음성 세포)는 폐기물에 보내졌고 특성규명되지 않았다. 자석 배열 (704)은 "오프" 위치로 돌려졌고 튜브 (701)는 3개 플러싱 사이클을 경험하여 "양성 분획"을 획득하였고, 이는 비드 결합된 CD3+ 세포로 이루어질 것이다. 상기 모든 단계들은 2 mM EDTA로 보충된 단리 완충액에서 수행되었다.
사전- 및 사후- 분리 분획 (각 웰에 대하여 300k 세포)은 생존력 (0.031 μl/100 μl, Live/Dead™ Green, Invitrogen), CD3 (5 μl/100 μl, PE 마우스 항-인간 CD3, BD Biosciences) 및, 일부 실험에서, CD14 (0.625 μl/100 μl, CD14 Monoclonal Antibody - Pacific Blue, Invitrogen)를 위하여 형광적으로 염색되었고, 유동 보조 세포 분류 (FACS)를 사용하여 분석되어 수득된 분획의 표현형을 평가하였다. 초기 적재된 모집단은 이종성, 그러나 주로 CD3+인 것으로 발견되었다 (도 18 - 흑색 선). 비교로, 다양한 공정 파라미터는 자석 배열 (704)을 사용하여 시험되었다. Dynabead® 결합된 세포로 대기 시간 0 내지 2 분 수정이 유출 세포의 순도에 제한된 효과를 갖는다는 것이 관찰되었다 (도 18a, b 및 도 18f, g). 하지만, 대기 시간을 추가로 5 분까지 증가시키는 것은 세포의 순도를 상당히 감소시켰다 (도 18c, d). 유속은 또한 3 ml/분 내지 10 ml/분 세포 순도에 제한된 효과를 가졌다 (도 18g, h). 세포 순도에 관한 가장 실질적인 개선은 공정에 두번째 통과를 추가함으로써 나왔고, 이는 순도를 97.5% CD3+ 세포까지 개선하였다 (도 18E).
실시예 6 - 자기 비드 포착을 위한 상이한 크기의 자석
상이한 크기 (1/8" 및 1" 길이)의 영구 자석 (702 및 703)은 자석 배열 (704)을 조립하는데 사용되었다. 자기장의 규모는 가우스미터(Gaussmeter) (AlphaLab Inc.)를 사용하여 자석으로부터 상이한 특정 거리에 측정되었다 (도 19a). 규모 측정으로부터 자기장 기울기의 추정치는 계산되었다 (도 19b). 가장 강한 기울기를 생성하기 위해, 더 작은 길이 자석이 더욱 바람직하다는 것이 결정되었다. 하지만, 이러한 더 강한 기울기는 더 긴 자석을 이용한 것보다 더욱 신속하게 저하하였고, 이에 의해 자석의 효과적인 범위를 감소시켰다. 이것은 상이한 분리 목표, 예컨대 약하게 결합된 표적의 짧은-범위 분리, 및 강하게 결합된 표적의 긴-범위 분리를 달성하기 위해 자석 배열 (704)에서 상이한 자석 크기 사용의 잠재력을 증명하였다.
세포 분리에 관한 자석 (702 및 703) 크기의 효과를 시험하기 위해, 주르카트 세포는 실시예 2에서 기재된 바와 같이 BioLegend® 나노비드에 의해 결합되었다. 비드 결합된 세포 (2.5x106 세포/ml, 1.5 ml)는 5 ml/분의 유속으로 그리고 5 분의 대기 시간으로 분리 튜빙 (701) 내에서 자석 배열 (704)을 지나서 유동되었다. 미결합된 세포는 5 ml/분에 12 ml의 단리 완충액 (98% PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA)으로 튜빙 (701) 밖으로 플러싱되었다. 배열 (704)에 의해 생성된 자기장은 튜빙 (701)으로부터 제거되었고 (실시예 1에서 기재된) 3개 플러싱 사이클은 튜빙으로부터 양성 분획을 제거하기 위해 수행되었다. 결과는 전형적 자석 어셈블리 (704 및 801)로부터 수득된 것들과 비교되었다. 1/8" 길이 자석 (702 및 703)이 1" 길이 자석 (702 및 703)과 비교하여 포착 실패를 감소시켰다는 것이 관측되었다 (도 19c). 모든 이전의 단계들은 단리 완충액을 사용하여 수행되었다.
실시예 7 - 약하게 결합된 생물학적 표적의 포착을 촉진시키기 위한 부가물
악하게 결합된 표적/소형 비드에 대하여 포착의 용이성을 변경 또는 개선하기 위한 하나의 방법은 자석 배열 (704)과 분리 튜브 (701) 사이에 거리를 감소시키고, 이에 의해 실시예 6에 의해 증명된 바와 같이 튜브 (701) 내에서 경험된 평균 자기장 규모 및 기울기를 증가시키는 것이다. 이것을 하기 위해, 3/32" 두께의 스페이서 (1201)는 분리 튜브 (701)과 카셋트 (1101) 사이에 배치되었다. 실시예 2에서 기재된 바와 같이, BioLegend® 나노비드와 결합된 주르카트 세포 (2.5-5x106 세포/ml, 1.5 ml)는 5 ml/분의 유속으로 분리 튜브 (701)에 유동되었고 3 또는 5 분 동안 대기하게 되었다. 비-포착된 세포는 그 다음 5 ml/분 (11-13 ml)으로 유동되었고, (실시예 1에서 기재된) 3개 플러싱 사이클은 포착된 세포 분획을 수집하기 위해 수행되었다. 기구에 추가된 스페이서 (1201)로 수득된 결과는 스페이서를 사용하여 포착 실패의 측면에서 개선 그리고 5-분 대기 시간으로 수득된 수준까지 3-분 대기 시간을 증명하였다 (도 20a). 이전의 단계들은 단리 완충액을 사용하여 수행되었다.
생물학적 표적과 자기장 사이의 거리를 감소시키기 위한 또 다른 방법은 분리 튜브 (701) 내에 자화성 물체 (1202-1208)를 포함하는 것이다. 자석 배열 (704)에 의해 생산된 자기장은 이들 물체 (1202-1208)에 의해 증폭되어, 물체 (1202-1208)의 크기에 반비례, 그리고 물체 (1202-1208)의 크기에 비례하는 유효 범위로 자기장 기울기를 생산할 수 있다. 이것을 증명하기 위해, 상자성 메시 (1202)는 분리 튜브 (701)에 추가되었다. 주르카트 세포 (1.25x107 세포/ml)는 4-8℃에 15 분 동안 세포 및 컨쥬게이션 이전의 비드를 함께 인큐베이션함으로써 MACS® MicroBeads (20 μl/107 세포, CD3 Microbeads - Human, Miltenyi Biotec)와 결합되었다. 결합 후, 세포는 5 ml/분으로 상자성 메시 (1202) (9x106 세포/ml, 1.5 ml)를 함유하는 분리 튜브 (701)에 유동되었고 5 분 동안 대기하게 되었다. 미포착된 세포는 12 ml의 단리 완충액으로 5 ml/분에 튜브 (701)로부터 플러싱되었다. 자석 배열 (704)은 오프 위치로 돌려졌고, (실시예 1에서 기재된) 3개 플러싱 사이클은 튜브 (701)로부터 양성으로 포착된 세포를 제거하기 위해 적용되었다. 메시 (1202)에 의한 비-특이적 포착을 설명하기 위해, 결과는 비드 없는 대조군 (MicroBeads에 의해 결합되지 않은 주르카트)으로부터 수득된 것들로 정상화되었고, 여기에서 모든 포착은 메시 (1202)로부터 물리적 제동장치로 인한 것일 것이다. 상자성 메시를 사용하는 것은 비드 없음과 비교하여 비드가 있는 10%의 포착된 세포에서 상대적 증가를 초래하였다 (도 20b). 이전의 단계들은 2 mM EDTA로 보충된 단리 완충액을 사용하여 수행되었다.
재순환 및 자기장을 활용하는 방법
본원에 기재된 바와 같이, 예시적 구현예에서, 생물학적 샘플 내에서 표적의 자기 분리 방법은 자기 분리의 다중 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 사이클을 통해 샘플의 재순환을 적당히 활용한다. 그러한 재순환을 통해, 원하는 표적의 수율은 급격히 증가된다.
본원에 기재된 방법은 자동화된 세포 배양 시스템에서 적당히 실시될 수 있고, 구현예에서 자동화된 세포 배양 시스템 내의 카셋트에서 발생할 수 있다. 도　6은 예시적 카셋트를 도시하고, 도 21은 자동화된 세포 배양 시스템의 흐름도에서 이러한 카셋트의 배치를 도시한다. 도 21에서 도시된 바와 같이, 자동화된 세포 배양 시스템은 적당히 세포 증식 챔버 (2102) 및 몇몇 유체공학적 경로 (2104) 뿐만 아니라 자기장 소스 (2106), 또한 반응물 (2108)을 위한 투입 위치를 포함한다.
도 21은 재순환 경로/라인이 예시되는 예시적 구현예를 도시하고, 여기에서 표적 생물학적 모집단을 함유하는 생물학적 샘플은 재순환 경로/라인 (굵은 선)을 통해 여러번 순환된다. 적합하게는, 각 통과 동안, 샘플은 자기장 소스 (2106) (예를 들면, 영구 또는 전자석)에 의해 자기장 기울기에 노출된다.
표적 생물학적 모집단을 제거하기 위해 생물학적 샘플의 재순환을 활용하는 본원에 기재된 방법은 양성 또는 음성 선택 방법, 또는 양쪽의 조합에 의존할 수 있다.
양성 선택 방법
표적 생물학적 모집단을 단리 및 포착하기 위하여 양성 선택 방법을 활용하는 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 자기 입자에 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시키는 단계; 순환 및 노출 단계를 1회 이상 반복하는 단계; 및 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 결합된 자기 입자로부터 표적 생물학적 모집단을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
그러한 양성 선택 방법은, 샘플로부터 원하는 표적 모집단을 양성으로 선택하기 위해 자기장을 활용하여, 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단의 직접 제거에 의존한다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 표적 생물학적 모집단은 자기 입자에 결합된다. 표적 생물학적 모집단에 자기 입자를 결합시키는 방법은 본원에 기재되고 항체, 단백질 또는 핵산을 적당히 사용한다. 본원에 기재된 바와 같이, 표적 생물학적 모집단은 적당히 하나 이상의 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 예시적 구현예에서, 표적 생물학적 모집단은 T 세포, 적합하게는 원하는 수용체를 포함하기 위해 생산된 T 세포의 모집단이다. 표적 모집단이 제거되는 생물학적 샘플은 또한 원하지 않은 다른 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA, RNA, 등 (즉, 비-표적 모집단)을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 양성 선택 방법에서 포함될 수 있는 추가의 단계는 생물학적 샘플 (예를 들면, 세포 모집단)의 세정, 자기 입자의 세정, 표적 생물학적 모집단의 세포 배양 구역 (예를 들면, 증식 챔버)로의 이송, 및 비-표적 생물학적 모집단의 폐기물 챔버로의 이송, 그리고 자동화된 세포 배양 시스템으로부터 궁극적 제거를 포함한다.
생물학적 샘플은, 예를 들어 도 21에서 예시된 바와 같이, 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환된다. 구현예에서, 생물학적 샘플은 시스템의 투입 위치 지점 (2108)에서 세포 배양 샘플로서 시작할 수 있거나, 구현예에서, 세포 증식 챔버 (2102)에서, 그 후 항체 또는 다른 제제를 함유하는 자기 입자가 제공되는 영역에 이송되어, 이로써 자기 입자가 원하는, 표적 모집단 (예를 들면, 세포)에 결합한다. 자기 입자에 이러한 결합은 또한 증식 챔버 (2102) 또는 임의의 투입 위치 (2108) 또는 시스템 내의 챔버 내에서 발생할 수 있다.
생물학적 샘플은 그 다음 자기장 (2106)의 소스를 포함하는 자동화된 세포 배양 시스템의 섹션에 통과되어, 이로써 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단이 자기장 기울기에 노출된다. 이러한 노출의 결과로서, 표적 생물학적 모집단 (예를 들면, 원하는 세포의 모집단)은, 자기장을 생산하는 자기장 소스에 인접하는, 자기장의 소스에 결합한다 (예를 들면, 분리 튜브 (701) 또는 다른 유사한 장치의 쪽에 수집한다). 이러한 분리는 표적 생물학적 모집단 (또는 적어도 표적 생물학적 모집단의 한 부분)을 샘플 밖으로 끌어당긴다. 자기 입자에 결합되는 표적 생물학적 모집단은 그 다음 적당히 수집된다. 표적 생물학적 모집단 수집의 예시적 방법은 자기장에 노출 후 표적 생물학적 모집단을 제거 및 세정하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 표적 생물학적 모집단은, 시스템을 통해, 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집된다. 적합하게는, 기상 유체는 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함한다. 추가 구현예에서, 액상은 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 자기 분리의 다중 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 사이클을 통한 샘플의 재순환이 샘플로부터 제거되는 표적 모집단의 양을 증가시킨다는 것이 입증되었다. 그래서, 적당한 구현예에서, 생물학적 샘플이 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환되고 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단이 자기장 기울기에 노출되는 양성 선택 방법의 단계는 2 이상 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등, 또는 초과) 회 적당히 반복된다. 도 21에서 도시된 바와 같이, 이러한 재순환은 재순환 사이클을 통해 적당히 발생하고, 여기에서 샘플은 자기장 (2106)의 소스에 인접해 통과되어 표적 모집단을 결합시키고, 그 다음 샘플은 재-순환되고 자기장의 소스에 인접해 재차 통과되어, 궁극적으로 최종 표적 샘플 수집에 앞서, 이전 통과에서 포착되지 않을 수 있는 심지어 더 많은 표적 모집단을 제거한다. 이러한 사이클은 표적 모집단의 어느 한쪽 목표가 달성되는 때까지 원하는 만큼 다수 회 반복될 수 있거나, 추가의 사이클이 표적 모집단의 수율 및/또는 순도를 극적으로 증가시키지 않을 다른 수단을 통해 또는 통계적으로 어느 한쪽 결정된다. 표적 생물학적 모집단의 수집 이후, 상기 방법은 결합된 자기 입자로부터 표적 생물학적 모집단을 제거하는 단계를 적당히 포함하고, 그래서 표적 모집단은, 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 절차 등에서 추가로 가공 또는 활용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 재순환 방법은 자기 소스 (예를 들면, 자기-기반 방법에서 사용된 분리 튜브)에 결합되는 표적 모집단의 린스, 이어서 추가 가공 및/또는 확장을 위하여 증식 챔버에 세정된 표적 모집단을 이송하는 단계를 포함할 수 있다. 포착, 린스 및 이송의 이들 요소들은 그 다음 자성으로-결합된 표적 모집단을 포함하는 또 다른 생물학적 샘플로 실시될 수 있다.
구현예에서, 표적 모집단이 노출되는 자기장 기울기는 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공된다. 영구 자석에서 활용될 수 있는 예시적 재료는 본원에 기재되고 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 및/또는 알니코를 적당히 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 구현예에서, 영구 자석은 선형 배열, 예컨대 도 7b에서 자석 배열 (704)로 적당히 구성된다.
추가의 구현예에서, 자기장 기울기는, 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 전자석에 의해 제공된다.
추가 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 양성 선택 방법에 있어서, 자기 입자에 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계, 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계, 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계, 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플의 미-결합된 성분을 순환시키는 단계, 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계, 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계, 표적 생물학적 모집단 단계 순환을 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계를 1회 이상 반복하는 단계; 및 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 추가의 구현예에서, 양성 선택 방법은 결합된 자기 입자로부터 표적 생물학적 모집단을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 그러한 양성 선택 방법은 생물학적 샘플이, 예를 들어, (예컨대 도 7a에서 도시된) 분리 튜브 (701)에 통과되는 설계를 활용한다. 생물학적 샘플 내에서, 표적 생물학적 모집단은 자기 입자에 결합된다. 상기 방법은 적당히 분리 튜브 (701) 및 자기 소스를 포함하거나 이에 앞서 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계를 포함한다. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단은 자기장 기울기에 적당히 노출되어 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 포착한다 (그리고 이러한 자기장을 통해 1회 이상 적당히 재순환된다). 예를 들어, 도 8에서 예시된 바와 같이, 생물학적 샘플은 분리 튜브 (701)를 통과하고, 결합된 자기 입자를 가진 표적 샘플은 자기장에 의해 튜브의 쪽에 포착된다 (또한 도 24d-24e 참고).
생물학적 샘플에서 미-결합된 성분 (즉, 원하지 않는 세포, 단백질, DNA, 또는 다른 구조물)은 그 다음 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환되어 이들을 분리 튜브 (701)로부터 제거한다.
자기장 실드/장벽은 그 다음 적당히 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 삽입되어 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단을 자석으로부터 방출시킨다. 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단은 그 다음 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환되고, 예를 들어, 자동화된 세포 조작 시스템의 별도 영역에서 수집된다. 표적 생물학적 모집단의 다양한 수집 방법은 본원에 기재된다.
적합하게는, 생물학적 샘플을 순환시키는, 샘플 (및 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단)을 노출시키는, 표적 모집단과 자기장 사이에 자기 실드/장벽을 삽입하는, 그리고 표적 생물학적 모집단의 수집 단계는 1회 이상 (적당히 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 등) 반복된다. 이러한 사이클링을 통한 각각의 시간은 표적 생물학적 제조의 수율을 증가시킨다. 그 다음, 본원에 기재된 바와 같이, 표적 생물학적 모집단은 결합된 자기 입자로부터 적당히 제거된다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 표적 생물학적 모집단은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및/또는 RNA 중 하나 이상을 포함하고, 구현예에서 T 세포를 포함한다. 표적 생물학적 모집단에 자기 입자를 결합시키기 위한 방법 및 화합물은 본원에 기재되고 적당히 항체, 단백질 또는 핵산의 사용을 포함한다.
예시적 자기장은 본원에 기재되고, 적합하게는 영구 자석 또는 전자석에 의해 생성된다. 영구 자석 제조에서 사용을 위한 재료는 본원에 기재되고, 예를 들어, 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 및/또는 알니코를 포함한다. 구현예에서, 영구 자석은 선형 배열로 구성된다. 전자석이 활용되는 구현예에서, 자기장 실드/장벽의 삽입은 전자석을 끔으로써, 예를 들어 전류를 전자석으로부터 제거하여 자기장을 중지시킴으로써 대체될 수 있다.
전체적으로 기재된 바와 같이, 구현예에서, 자기장 실드/장벽은 적당히 높은 투자율 및 포화 재료를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 구현예에서, 자기장 실드/장벽은 회전하여 자기 입자에 결합된 표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입한다. 그와 같은 구현예는 도 8, 9 및 10a-10b에서 예시되고, 본원에 상세히 기재된다.
음성 선택 방법
표적 생물학적 모집단을 위하여 음성 선택 방법을 활용하는 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시키는 단계; 노출 단계를 통해 순환시키는 단계를 1회 이상 반복하는 단계; 및 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 또한 추가로, 적합하게는 폐기물로서 제거를 위하여, 비-표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 음성 선택의 방법은, "표적 생물학적 모집단"에서 포함되지 않고 그래서, 표적 생물학적 모집단을 버리는, 생물학적 샘플로부터 제거되도록 하는, 하나 이상의 세포, 단백질, DNA, RNA, 등을 지칭하는, "비-표적 생물학적 샘플"에 자기 입자를 결합시키는 단계를 활용한다. 그러한 음성 선택 방법에서, 자기 분리는 비-표적 생물학적 모집단을 분리시키는데 사용되어, 샘플로부터 잔류하는 표적 생물학적 모집단을 수집한다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 비-표적 생물학적 모집단은 자기 입자에 결합된다. 비-표적 생물학적 모집단에 자기 입자를 결합시키는 방법은 본원에 기재되고 적당히 항체, 단백질 또는 핵산을 사용한다. 본원에 기재된 바와 같이, 비-표적 생물학적 모집단은 적당히 하나 이상의 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 예시적 구현예에서, 표적 생물학적 모집단은 T 세포, 적합하게는 원하는 수용체를 포함하기 위해 생산된 T 세포의 모집단인 반면, 비-표적 생물학적 모집단은, 표적 모집단을 버리는, 제거될 필요가 있는 샘플에서, 임의의 다른 세포, 단백질, 등을 포함한다. 표적 모집단이 제거되는 생물학적 샘플은 또한 원하지 않는 다른 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA, RNA, 등을 포함할 수 있다.
생물학적 샘플은, 예를 들어 도 21에서 예시된 바와 같이, 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환된다. 구현예에서, 생물학적 샘플은 투입 위치 (2108), 또는 세포 증식 챔버 (2102)에, 또는 시스템 내에서 다른 위치에 세포 배양 샘플로서 시작할 수 있고, 그 후 항체 또는 다른 제제를 함유하는 자기 입자가 제공되는 영역으로 이송되어, 이로써 자기 입자는 원하지 않는, 비-표적 모집단 (예를 들면, 원하지 않는 세포, 단백질, DNA, 등)에 결합한다. 자기 입자에 이러한 결합은 또한 증식 챔버 내에서, 투입 위치 (2108), 또는 시스템 내에서 다른 챔버에 발생할 수 있다.
생물학적 샘플은 그 다음 자기장 (2106)의 소스를 포함하는 자동화된 세포 배양 시스템의 섹션에 통과되어, 이로써 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단은 자기장 기울기에 노출된다 (표적 생물학적 모집단은 또한 노출되지만, 자기장에 반응하지 않는다). 이러한 노출의 결과로서, 비-표적 생물학적 모집단 (예를 들면, 원하지 않는 세포, 단백질, 등의 모집단)은, 자기장에 인접하는, 자기장의 소스에 결합된다 (예를 들면, 분리 튜브 (701) 또는 다른 유사한 장치의 쪽에 수집한다). 이러한 분리는 비-표적 생물학적 모집단 (또는 비-표적 생물학적 모집단의 적어도 한 부분)을 샘플 밖으로 끌어당긴다. 자기 입자에 결합되지 않는 표적 생물학적 모집단은 그 다음 적당히 수집된다. 표적 생물학적 모집단의 예시적 수집 방법은 자기장에 노출후 샘플로부터 표적 생물학적 모집단 여과, 제거 및 세정 (및 그래서 비-표적 생물학적 모집단의 제거)을 포함한다.
구현예에서, 표적 생물학적 모집단은, 시스템을 통해, 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집된다. 적합하게는, 기상 유체는 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함한다. 추가 구현예에서, 액상은 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 자기 분리의 다중 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 사이클을 통한 샘플의 재순환이 샘플로부터 제거되는 표적 모집단의 양 및/또는 순도를 증가시킨다는 것이 증명되었다. 그래서, 적당한 구현예에서, 생물학적 샘플이 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환되는 음성 선택 방법의 단계, 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단은 자기장 기울기에 노출되고; 표적 생물학적 모집단의 수집은 2 이상 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등, 또는 초과) 회 적당히 반복된다. 도 21에서 도시된 바와 같이, 이러한 재순환은 적당히 재순환 사이클을 통해 발생하고, 여기에서 샘플은 자기장 (2106)의 소스에 인접해 통과되어 비-표적 모집단을 결합시키고, 표적 모집단은 수집되고, 그 다음 샘플은 재-순환되고 자기장의 소스에 인접해 재차 통과되어 이전 통과에서 포착되지 않았을 수 있는 심지어 더 많은 비-표적 모집단을 제거한다. 이러한 사이클은 표적 모집단의 어느 한쪽 목표가 달성되는 때까지 원하는 만큼 다수 회 반복될 수 있거나, 추가의 사이클이 표적 모집단의 수율 및/또는 순도를 극적으로 증가시키지 않을 다른 수단을 통해 또는 통계적으로 어느 한쪽 결정된다. 표적 생물학적 모집단의 수집 이후, 상기 방법은 적합하게는, 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 절차 등에서 표적 생물학적 모집단의 추가 가공, 여과 또는 활용을 포함한다.
구현예에서, 비-표적 모집단이 노출되는 자기장 기울기는 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공된다. 영구 자석에서 활용될 수 있는 예시적 재료는 본원에 기재되고 적당히 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 및/또는 알니코를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 구현예에서, 영구 자석은 선형 배열, 예컨대 도 7b에서 자석 배열 (704)로 적당히 구성된다.
추가의 구현예에서, 자기장 기울기는, 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 전자석에 의해 제공된다.
추가 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 음성 선택 방법에 있어서, 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계; 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계; 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계; 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플의 표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계; 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계; 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계; 표적 생물학적 모집단 단계의 수집을 통해 생물학적 샘플의 순환을 1회 이상 반복하는 단계; 및 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다
본원에 기재된 바와 같이, 그러한 음성 선택 방법은 표적 생물학적 모집단 수집; 생물학적 샘플이, 예를 들어, (예컨대 도 7a에서 도시된) 분리 튜브 (701)에 통과되는 설계를 활용한다. 생물학적 샘플 내에서, 비-표적 생물학적 모집단은 자기 입자에 결합된다. 상기 방법은 적당히 분리 튜브 (701)를 사용하거나 이에 앞서 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 생물학적 샘플을 순환시키는 단계를 포함한다. 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단은 자기장 기울기에 적당히 노출되어 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 포착한다. 예를 들어, 도 8에서 예시된 바와 같이, 생물학적 샘플은 분리 튜브 (701)에 통과되고, 결합된 자기 입자가 있는 비-표적 샘플은 자기장에 의해 튜브의 쪽에 포착된다 (또한 도 24d-24e 참고).
생물학적 샘플에서 미-결합된 성분 (즉, 세포, 단백질, DNA, 또는 T-세포를 포함하여 원해지는 다른 구조물을 포함하는, 표적 생물학적 모집단)은 그 다음 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환되고, 예를 들어, 자동화된 세포 조작 시스템의 별도 영역에서 여과 또는 다른 메커니즘에 의해 적당히 수집된다.
자기장 실드/장벽은 그 다음 적당히 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 삽입되어 자석으로부터 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단을 방출시킨다. 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단은 그 다음 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 순환된다.
적합하게는, 생물학적 샘플을 순환시키는 단계, 샘플 (및 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단)을 노출시키는 단계, 비-표적 모집단과 자기장 사이에 자기 실드/장벽을 삽입하는 단계, 그리고 표적 생물학적 모집단의 수집 단계는 1회 이상 (적당히 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 등) 반복된다. 이러한 리사이클링을 통한 각각의 시간은 표적 생물학적 제조의 수율 및/또는 순도를 증가시켜, 점점 더 많은 비-표적 생물학적 모집단의 제거를 허용하고 원하는, 더 많은 표적 생물학적 제조의 분리 및 수집을 허용한다.
본원에 기재된 음성 선택 방법에서 포함될 수 있는 추가의 단계는 생물학적 샘플 (예를 들면, 세포 모집단)의 세정, 자기 입자의 세정, 표적 생물학적 모집단의 세포 배양 구역 (예를 들면, 증식 챔버)에의 이송, 및 비-표적 생물학적 모집단의 폐기물 챔버에의 이송, 그리고 자동화된 세포 배양 시스템으로부터 궁극적 제거를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 비-표적 생물학적 모집단은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및/또는 RNA 중 하나 이상을 포함하고, 구현예에서 표적 생물학적 모집단은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및/또는 RNA 중 하나 이상을 포함하고, 적합하게는 T 세포를 포함한다. 비-표적 생물학적 모집단에 자기 입자를 결합시키기 위한 방법 및 화합물은 본원에 기재되고 적당히 항체, 단백질 또는 핵산의 사용을 포함한다.
예시적 자기장은 본원에 기재되고, 적합하게는 영구 자석 또는 전자석에 의해 생성된다. 영구 자석 제조에서 사용을 위한 재료는 본원에 기재되고, 예를 들어, 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 및/또는 알니코를 포함한다. 구현예에서, 영구 자석은 선형 배열로 구성된다. 전자석이 활용되는 구현예에서, 자기장의 실드/장벽의 삽입은 전자석을 끔으로써, 예를 들어 전류를 전자석으로부터 제거하여 자기장을 중지시킴으로써 대체될 수 있다.
전체적으로 기재된 바와 같이, 구현예에서, 자기장 실드/장벽은 적당히 높은 투자율 및 포화 재료를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 구현예에서, 자기장 실드/장벽은 회전하여 자기 입자에 결합된 비-표적 생물학적 모집단과 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입한다. 그와 같은 구현예는 도 8, 9 및 10a-10b에서 예시되고, 본원에 상세히 기재된다.
추가 구현예에서, 자동화된 세포 배양 시스템에서 자기 입자를 세정 및 회수하기 위한 방법이 본원에 제공된다.
적합하게는, 상기 방법은 a. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 자기 입자를 순환시키는 단계; b. 자기장 기울기에 자기 입자를 노출시켜 자기 입자를 포착하는 단계; c. 기체 유체상에 이어서 액체 유체상을 적용함으로써 자기 입자를 수집하는 단계; d. 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 자기 입자를 순환시키는 단계; 및 e. 단계 c-d를 1회 이상 (예를 들면, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상 등) 반복하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 구현예에서, 자기 입자는 표적 생물학적 모집단에 결합되고, 이는 적당히 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 발생한다.
추가의 구현예에서, 자기 입자는, 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 포함하여, 비-표적 생물학적 모집단에 결합된다.
예시적 비-표적 및 표적 생물학적 모집단은 본원에 기재되고, 적합하게는 표적 모집단은, T 세포를 포함하여, 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 임의의 하나 이상이다.
구현예에서, 자기장 기울기는, 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는 영구 자석을 포함하여, 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공된다. 영구 자석은, 본원에 기재된 바와 같이, 선형 배열로 구성될 수 있다. 추가의 구현예에서, 자기장 기울기는 전자석에 의해 제공된다.
적합하게는, 본원에 기재된 바와 같이, 자기장 실드/장벽은 자기 입자와 자기장 사이에 삽입되어 자기장을 차단함으로서 자기 입자의 수집을 허용하고, 자기 소스에 결합된 자기 입자의 방출을 허용한다. 자기장 실드/장벽에서 사용을 위한 예시적 재료는 높은 투자율 및 포화 재료를 포함한다. 전자석이 활용되는 구현예에서, 전류는 하나 이상의 전자석으로부터 제거되어 자기 입자의 수집을 허용하여, 전자석의 소스를 단순히 중단시킬 수 있다.
상기 방법에서 활용될 수 있는 예시적 기상 유체는 공기, 질소, 산소, 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적 액상 유체는 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제, 및 효소 중 하나 이상을 포함한다.
비드 회수 방법
다중 자기 분리를 포함하는, 음성 및 양성 선택 방법, 그리고 자기 입자 회수로부터의 데이터
도 22a-22d는 표적 세포 (정제된 세포) 및 폐기물 세포 (비-표적 모집단) 양쪽에 자기 입자의 결합을 도시한다. 예시된 바와 같이, 반응물 수량의 최적화를 활용하는 "개선된 공정"은, 더 낮은 "위음성"으로, 자기 입자와 폐기물 세포 (음성 선택을 위한 비-표적 모집단) 사이에 높은 결합을 증명한다.
도 23a-23b는 자기 입자의 세포로부터 방출을 제시한다. 예시된 바와 같이, 도 23a에서 자동화된 세포 배양 시스템 (COCOON)에서 활용된 부착 메커니즘은 대조군의 것과 유사한 비드-세포 방출을 나타내어, 양성 선택 방법에 따라 세포 (또는 다른 표적 생물학적 모집단)를 회수하는 능력을 예시한다. 도 23b는 자동화된 세포 배양 시스템을 사용하여 방출 및 비드 제거 후 표적 세포 중에 잔류하는 비드의 백분율을 도시한다.
다중 자기 분리 (즉, 2, 3, 4, 5회, 등 자기장에 노출될 자동화된 세포 배양 시스템을 통한 샘플의 재순환)의 이익을 결정하기 위해, 실험은 자석에의 노출 시간 증가 및 유속 감소를 고려하여 수행되었다. 도 24a에서 도시된, (좌에서 우로) 자석 노출 시간을 증가시키고, 대조군과 동등한, 약 65% 내지 적어도 90% 포착된 결합된 세포의 퍼센트를 증가시킨다. 유사하게, 도 24b에서 (우에서 좌로) 유속 감소는, 대조군과 유사한, 재차, 약 60% 내지 약 85% 결합된 세포 포착에서의 증가를 예시한다.
아래 표 1은, 본원에 기재된 자기 분리 방법을 사용하는 다중 통과를 사용하여, 획득된 결합된 세포, 및 총 세포 수율 양쪽에서 증가를 나타낸다.
Figure pct00002
도 24c는, 첫번째 2개 플러시 후 유의미한 회수를 예시하는, 분리 라인으로부터 포착된 생물학적 샘플을 방출시키기 위한 유체 플러시의 사이클의 수의 영향을 도시한다.
도 24d-24e는, 본원에 기재된 방법의 유효성을 예시하는, (도 24c에 따라) 자기장을 끄고 유체 플러시의 사이클을 적용한 후 자기장을 사용하는 분리 튜브에서 자기 입자에 결합된 세포의 포착 (최상부), 그리고 세포의 방출 (최하부)를 도시한다.
도 25a-25f에서, 양성 및 음성 선택 방법은, 양성 및 음성 선택 적용 양쪽에 대하여 본원에 기재된 대조군과 자동화된 세포 배양 시스템 (COCOON) 사이에 유사한 회수로, 표적 생물학적 모집단 (세포)의 정제의 높은 수준을 예시한다. 도 25g-25i는 재순환 라인을 사용하여 다중 통과를 수행함으로써 순도의 개선을 나타내는 음성 선택을 사용하여 세포의 정제를 도시한다. CD3+CD14+ 모집단은 원하지 않는 비드 결합된 단핵구-T 세포 집합체이다. 도 25j-25l은 음성 선택 공정을 사용하는 모집단 정제를 도시한다. 다중 통과는 (백색 원형으로 강조된) 불필요한 비드 결합된 세포를 성공적으로 제거한다.
도 26a-26c는 본원에 기재된 자동화된 세포 배양 시스템에서 자기 분리의 이점을 도시하고, 백 및 배양-용기-기반 대조군과 비교하여, 도 26a는 공정 지속기간에서 유의미한 감소를 예시하고, 도 26b는 낮은 세포 손실을 예시하고, 도 26c는 부피 손실의 감소를 도시한다. 도 26d는 양성 선택 공정을 사용하는 모집단 정제를 도시한다. 재순환 라인을 통한 다중 통과는 단일 통과와 비교하여 세포 수율을 개선한다.
도 27a-27b는 본원에 기재된 자동화된 세포 배양 시스템에서 세정 후 자기 입자를 회수하는 능력을 도시하고, 도 27a는 절대 회수로 분리 튜브 (701)의 후속 린스의 영향을 예시하고, 도 27b는 전형적 수동 공정에 비해 분리 튜브 (701)의 후속 린스의 누적 입자 회수에 관한 영향을 예시한다.
본 발명의 다양한 구현예 및/또는 실시예의 설명은 예시 목적으로 제시되었지만 개시된 구현예 및/또는 실시예를 소모시키거나 제한되기 위한 것은 아니다. 많은 수정 및 변형이 기재된 구현예의 범위 및 사상으로부터 이탈 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 사용된 전문용어는 시장에서 발견된 기술보다 구현예의 원리, 실제 적용 또는 기술적 개선을 최상으로 설명하도록, 또는 다른 당업자가 본원에 개시된 구현예를 이해할 수 있도록 선택되었다.

Claims (110)

  1. 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는, 방법:
    a. 자기 입자에 상기 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계;
    b. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 생물학적 샘플을 순환시키는 단계;
    c. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시키는 단계;
    d. 단계 b-c를 1회 이상 반복하는 단계; 및
    e. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b-c가 적어도 2회 반복되는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단이 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집되는, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 액상이 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합된 자기 입자로부터 상기 표적 생물학적 모집단을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는, 방법:
    a. 자기 입자에 상기 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계;
    b. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 생물학적 샘플을 순환시키는 단계;
    c. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계;
    d. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 생물학적 샘플의 미-결합된 성분을 순환시키는 단계;
    e. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계;
    f. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계;
    g. 단계 b-f를 1회 이상 반복하는 단계; 및
    h. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  21. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되고 선택적으로 단계 e에서의 삽입이 상기 하나 이상의 전자석으로부터 전류를 제거함으로써 대체되는, 방법.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b-f가 적어도 2회 반복되는, 방법.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 높은 투자율 및 포화 재료를 포함하는, 방법.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 회전하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 상기 자기장 실드/장벽을 삽입하는, 방법.
  25. 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집되는, 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 액상이 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  28. 제 14 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합된 자기 입자로부터 상기 표적 생물학적 모집단을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    a. 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계;
    b. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 생물학적 샘플을 순환시키는 단계;
    c. 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시키는 단계;
    d. 단계 b-c를 1회 이상 반복하는 단계; 및
    e. 상기 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-표적 생물학적 모집단이 수집되는, 방법.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 비-표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  37. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되는, 방법.
  38. 제 29 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b-c가 적어도 2회 반복되는, 방법.
  39. 제 29 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단이 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집되는, 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 상기 액상이 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  42. 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    a. 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계;
    b. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 생물학적 샘플을 순환시키는 단계;
    c. 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계;
    d. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 생물학적 샘플의 상기 표적을 순환시키는 단계;
    e. 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계;
    f. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 순환시키는 단계; 및
    g. 단계 b-f를 1회 이상 반복하는 단계; 및
    h. 상기 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  45. 제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-표적 생물학적 모집단이 수집되는, 방법.
  46. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  47. 제 42 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  49. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  50. 제 42 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되고 선택적으로 e에서의 삽입 단계가 상기 하나 이상의 전자석으로부터 전류를 제거함으로써 대체되는, 방법.
  51. 제 42 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b-f가 적어도 2회 반복되는, 방법.
  52. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 높은 투자율 및 포화 재료를 포함하는, 방법.
  53. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 회전하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 상기 자기장 실드/장벽을 삽입하는, 방법.
  54. 제 42 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집되는, 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  56. 제 54 항에 있어서, 상기 액상이 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  57. 자동화된 세포 배양 시스템에서 자기 입자를 세정 및 회수하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    a. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 자기 입자를 순환시키는 단계;
    b. 자기장 기울기에 상기 자기 입자를 노출시켜 상기 자기 입자를 포착하는 단계;
    c. 기체 유체상에 이어서 액체 유체상을 적용함으로써 상기 자기 입자를 수집하는 단계;
    d. 상기 자동화된 세포 배양 시스템의 하나 이상의 유체공학적 경로를 통해 상기 자기 입자를 순환시키는 단계; 및
    e. 단계 c-d를 1회 이상 반복하는 단계.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 자기 입자가 표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  60. 제 57 항에 있어서, 상기 자기 입자가 비-표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 비-표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  62. 제 58 항 또는 제 59 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 어느 하나 이상인, 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포인, 방법.
  64. 제 57 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  67. 제 57 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장 실드/장벽이 상기 자기 입자와 상기 자기장 사이에 삽입되어 상기 자기 입자의 수집을 허용하는, 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 높은 투자율 및 포화 재료를 포함하는, 방법.
  69. 제 57 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되는, 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 전류가 상기 하나 이상의 전자석으로부터 제거되어 상기 자기 입자의 수집을 허용하는, 방법.
  71. 제 57 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소, 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  72. 제 57 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액상 유체가 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제, 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  73. 제 57 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c-d가 적어도 2회 반복되는, 방법.
  74. 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 자성으로 분리 및 수집하는 시스템에 있어서, 하기를 포함하는 시스템:
    a. 자기장 소스;
    b. 상기 자기장 소스와 정렬된, 상기 생물학적 샘플 유동을 위한 분리 튜브;
    c. 상기 자기장 소스와 상기 분리 튜브 사이에 위치하도록 구성된 자기장 실드/장벽; 및
    d. 상기 자기장 소스와 상기 분리 튜브 사이에 상기 자기장 실드/장벽 삽입을 위한 메커니즘.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 시스템이 자동화된 세포 배양 시스템의 부분인, 시스템.
  76. 제 74 항 또는 제 75 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 높은 투자율 및 포화를 가진 재료인, 시스템.
  77. 제 76 항에 있어서, 높은 투자율 및 포화를 가진 상기 재료가 철, 철 합금, 페라이트계 강, Hiperco-50으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 시스템.
  78. 제 74 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 소스가 하나 이상의 영구 자석을 포함하는, 시스템.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 영구 자석이 네오디뮴, 사마륨-코발트, 또는 알니코를 포함하는, 시스템.
  80. 제 74 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 소스가 선형 배열로 구성된 다중 영구 자석을 포함하는, 시스템.
  81. 제 80 항에 있어서, 선형 배열의 상기 다중 영구 자석이 상기 선형 배열의 축에 수직인 반대 극 방향으로 배열되는, 시스템.
  82. 제 74 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입을 위한 상기 메커니즘이 상기 자기장 소스와 상기 분리 튜브 사이에 상기 자기장 실드/장벽 회전을 위한 메커니즘인, 시스템.
  83. 제 82 항에 있어서, 회전을 위한 상기 메커니즘이 소프트웨어에 의해 제어된 전기기계식 구동 어셈블리인, 시스템.
  84. 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    a. 자기 입자에 상기 표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계;
    b. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계;
    c. 상기 생물학적 샘플의 미-결합된 모집단을 제거하는 단계;
    d. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계; 및
    e. 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  86. 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  87. 제 84 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  88. 제 84 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  90. 제 84 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  91. 제 84 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되고 선택적으로 단계 d에서의 삽입이 상기 하나 이상의 전자석으로부터 전류를 제거함으로써 대체되는, 방법.
  92. 제 84 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 높은 투자율 및 포화 재료를 포함하는, 방법.
  93. 제 84 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 회전하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 상기 자기장 실드/장벽을 삽입하는, 방법.
  94. 제 84 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집되는, 방법.
  95. 제 94 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  96. 제 94 항에 있어서, 상기 액상이 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  97. 제 84 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합된 자기 입자로부터 상기 표적 생물학적 모집단을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
  98. 자동화된 세포 배양 시스템에서 생물학적 샘플로부터 표적 생물학적 모집단을 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    a. 자기 입자에 비-표적 생물학적 모집단을 결합시키는 단계;
    b. 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 자기장 기울기에 노출시켜 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 포착하는 단계;
    c. 상기 표적 생물학적 모집단을 수집하는 단계; 및
    d. 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 자기장 실드/장벽을 삽입하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단을 방출시키는 단계.
  99. 제 98 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, DNA 및 RNA 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  100. 제 98 항 또는 제 99 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  101. 제 98 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 입자가 항체, 단백질 또는 핵산을 통해 상기 비-표적 생물학적 모집단에 결합되는, 방법.
  102. 제 98 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장 기울기가 하나 이상의 영구 자석에 의해 제공되는, 방법.
  103. 제 102 항에 있어서, 상기 영구 자석이 자철광, 네오디뮴, 사마륨-코발트 또는 알니코를 포함하는, 방법.
  104. 제 102 항 또는 제 103 항에 있어서, 상기 영구 자석이 선형 배열로 구성되는, 방법.
  105. 제 98 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 기울기가 하나 이상의 전자석에 의해 제공되고 선택적으로 d에서의 삽입 단계가 상기 하나 이상의 전자석으로부터 전류를 제거함으로써 대체되는, 방법.
  106. 제 98 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 높은 투자율 및 포화 재료를 포함하는, 방법.
  107. 제 98 항 내지 제 106 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기장 실드/장벽이 회전하여 상기 자기 입자에 결합된 상기 비-표적 생물학적 모집단과 상기 자기장 사이에 상기 자기장 실드/장벽을 삽입하는, 방법.
  108. 제 98 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 생물학적 모집단이 기상 유체에 이어서 액상 유체를 1회 이상 순환시킴으로써 수집되는, 방법.
  109. 제 108 항에 있어서, 상기 기상 유체가 공기, 질소, 산소 및 이산화탄소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  110. 제 108 항에 있어서, 상기 액상이 물, 완충 식염 용액, 배양 배지, 동물 혈청, 킬레이트제 및 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8747290B2 (en) 2007-12-07 2014-06-10 Miltenyi Biotec Gmbh Centrifuge for separating a sample into at least two components
CN111621416A (zh) * 2020-05-14 2020-09-04 南京大学 一种基于移动磁网的生物磁性分离方法
US20220050105A1 (en) * 2020-08-12 2022-02-17 Boston Molecules, Inc. Method and apparatus for detecting viruses in biological samples
JP2023029014A (ja) * 2021-08-20 2023-03-03 株式会社日立ハイテク 試料分析装置
CN113721015B (zh) * 2021-09-08 2023-03-21 中国农业大学 微生物自动化检测装置、系统及方法
CN116371596B (zh) * 2023-05-26 2023-08-18 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种集成式磁分离设备

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7166443B2 (en) * 2001-10-11 2007-01-23 Aviva Biosciences Corporation Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples
GB2425498A (en) * 2005-04-25 2006-11-01 Dynal Biotech Asa A magnetic separation device
JP2007203244A (ja) * 2006-02-03 2007-08-16 Michio Shibatani 破砕攪拌方法
US9046514B2 (en) * 2007-02-09 2015-06-02 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods employing magnetic beads
US8071395B2 (en) 2007-12-12 2011-12-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and apparatus for magnetic separation of cells
US8316861B2 (en) * 2008-10-21 2012-11-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University System and method for guiding a medical instrument with magnetic force control
US8790916B2 (en) 2009-05-14 2014-07-29 Genestream, Inc. Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid
AU2013225823A1 (en) * 2012-02-29 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Rapid antibiotic susceptibility testing
CN105792926B (zh) * 2013-09-09 2018-06-22 微球实验公司 用于磁性分离的新工艺和系统
CN205570357U (zh) * 2016-01-04 2016-09-14 上海医脉赛科技有限公司 一种提取及检测生物样本的装置
CN105586258B (zh) * 2016-03-14 2018-08-17 佛山市汇广健医疗科技有限公司 磁性吸附转移棒

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Publication number Publication date
US20210403856A1 (en) 2021-12-30
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SG11202102841WA (en) 2021-04-29
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IL281737A (en) 2021-05-31
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WO2020061696A1 (en) 2020-04-02

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