JP2024028773A - 磁気分離 - Google Patents

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Abstract

【課題】生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法を提供する。【解決手段】a.標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること;b.生物学的サンプルを自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;c.磁気粒子に結合された標的生物学的集団を磁界勾配に曝露して磁気粒子に結合された標的生物学的集団を捕捉すること;d.生物学的サンプルの非結合構成要素を自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;e.磁界シールド/バリアを磁気粒子に結合された標的生物学的集団と磁界との間に挿入して磁気粒子に結合された標的生物学的集団を放出させること;f.磁気粒子に結合された標的生物学的集団を自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、を反復する方法である。【選択図】図21

Description

本発明は、生物学的サンプルから標的を自動磁気分離するためのデバイス、方法およびシステムに関する。当該デバイス、方法およびシステムは、様々な臨床環境および実験環境において有用性が見いだされる。
磁気分離は、様々な異なるプロセスの適用を通して流体から磁性不純物を分離する方法として利用されている(米国特許第3,985,646号、第4,054,513号および第5,137,629号)。磁気分離技術は、ウイルス、細菌および細胞を含む様々な生物学的標的に結合する抗体またはポリマーでコーティングされた磁気ビーズを使用した生物学的物質の集団の分離にも適用されている(米国特許第3,970,518号、第4,219,411号、第4,795,698号、および第5,385,707号)。その後、生物学的標的は、例えば米国特許第4,710,472号、第5,691,208号、第6,193,892号、およびZborowskiら(Journal of Magnetism and Magnetic Materials,vol.194,pp.224-230,1999)に記載される過去に開発された磁気分離デバイスのうちの1つを使用して流体懸濁液から抽出されることができる。分離デバイスにより生じた磁界は、流体懸濁液内に懸濁された磁気ビーズに力を及ぼし、Shevkoplyasら (Lab on a Chip,vol.7,pp.1294-1302,2007)およびWarnke (IEEE Transactions on Magnetics,vol.39,issue 3,pp.1771-1777,2003)に記載されるように流体懸濁液からビーズを引き出すことができ、ならびに磁気ビーズに結合した任意の生物学的物質を引き出すことができる。これによって、流体懸濁液から取り出す(陽性選択としても知られる)、または流体懸濁液から他の全ての集団を引き出し、磁気結合していない対象集団のみを残す(陰性選択としても知られる)のいずれかによって、所望の集団を単離させることができる。不均一な細胞集団から、例えばT細胞や幹細胞などの細胞を単離することは、様々な疾患の治療に使用される細胞療法の開発に必須である。
1つのシステムは、周辺の磁石の中で静止状態にある懸濁液を利用するものである(STEMCELL Technologies(登録商標)によるEasySep(商標))。他のシステムも知られており、自動化され、磁気ビーズを使用して標的集団を単離するものである(Milytenyi Biotec社のAutoMACS(登録商標)、およびSTEMCELL(商標)TechnologiesのRoboSep(商標))。
しかし生物学的サンプル内の選択標的の迅速かつ信頼性に足る磁気分離を行って、磁界の適用が自動化され、カスタマイズされ、そして所望の高収率および高純度で標的分離を制御し得るというアンメットニーズがいまだ存在する。
本発明は、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法を提供するものであり、当該方法は、a.標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、b.当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、c.当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を、磁界勾配に曝露させること、d.工程b~cを1回以上反復すること、およびe.当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を収集すること、を含む。
本明細書において、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法も提供され、当該方法は、a.標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、b.当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、c.当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を、磁界勾配に曝露させて、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を捕捉すること、d.当該生物学的サンプルの非結合構成要素を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、e.当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入し、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を放出させること、f.当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、g.工程b~fを1回以上反復すること、およびh.当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を収集すること、を含む。
本明細書の追加の実施形態において、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法が提供され、当該方法は、a.非標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、b.当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、c.当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を、磁界勾配に曝露させること、d.工程b~cを1回以上反復すること、およびe.標的生物学的集団を収集すること、を含む。
本明細書のさらなる実施形態において、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法も提供され、当該方法は、a.非標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、b.当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、c.当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を磁界勾配に曝露させて、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を捕捉すること、d.当該生物学的サンプルの標的を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、e.当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入し、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を放出させること、f.当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、g.工程b~fを1回以上反復すること、およびh.当該標的生物学的集団を収集すること、を含む。
本明細書に記載される典型的な態様に関する以下の説明は、添付の図面と併せて読まれることでさらに理解されるであろう。本発明の解説を目的として、現在のところ典型的である態様が図面において示される。しかし本発明は、図面に示される態様の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。類似した参照数値は、図面に示される、および本明細書において言及される様々な実施形態全体で類似の要素を指していることに注意されたい。
本明細書の記載は、以下の図面を考慮することでより完全に理解されるであろう。
図1は、磁気粒子を動かすために使用される磁界勾配を示す。 図2は、細胞分離アプリケーションにおいて使用される様々なサイズの磁気ビーズを示す。 図3は、磁界勾配に応答するビーズに作用する正味の磁力に対するビーズのサイズの効果を示す。 図4は、自動制御された磁界を生成するための様々な概念的方法を示す。 図5は、磁束密度を遮断する高い透磁性および磁気飽和性の物質の能力に関するコンピューター計算モデルを示す。 図6は、カセット上の磁気分離チューブの組み込みを示す。 図7は、交互の極702と703とを伴うレアアース磁石からなる磁石アレイ704と位置合わせされた分離チューブ701に関するコンピューターを使用した設計(CAD)モデルを示す。 図8は、「オン」の位置にある磁石アレイ704と位置合わせされた分離チューブ701のCADモデルアセンブリを示し、それらはモーター802および歯車列803を使用して回転させることができる磁界シールド801内に配置されている。 図9は、磁界シールド801が、チューブ701と磁石アレイ704との間にある「オフ」の位置の磁石アレイと位置合わせされた分離チューブ701のCADアセンブリを示す。 図10は、「オン」の位置または「オフ」の位置にあるアセンブリの断面図を示す。 図11は、磁気分離アセンブリ(704と801)を含有する細胞培養装置1102と位置合わせされた分離チューブ701からなるカセット1101の完全アセンブリを示す。 図12は、限局的な高磁界勾配を生成するための様々な非限定的方法(1201-1208部分)を提示する。 図13は、実用的実施例1から得られた結果を示しており、様々な流量で磁気ビーズから細胞を分離することに成功したことを示している。 図14は、実用的実施例2から得られた結果を示しており、陽性選択された細胞の捕捉および放出に対する様々な流量の効果を示している。 図15は、陽性選択された細胞の捕捉および放出に関し、分離チューブ701を通した磁気分離プロセスに複数回の通過を足した実用的実施例3から得られた結果を示す。 図16は、陽性選択された細胞の捕捉および放出に関し、待ち時間を足すことで、磁気ビーズの磁界への曝露を増加させた実用的実施例4から得られた結果を示す。 図17は、実用的実施例4から得られた偽陽性の割合を、様々なプロセス改変を行うことで、どのように改変させ得るかを示す。 図18は、磁石アレイ704を通過して分離チューブ701を通り流された混合細胞集団の精製に関する実用的実施例5から得られた結果を示す。 図19は、磁石702および磁石703のサイズを変えることで、磁石アレイ704により生成される磁界特性および細胞捕捉がどのように影響を受け得るかについて示す実用的実施例6から得られた結果を示す。 図20は、バー/スペーサー1201をカセットに加えることの効果に関する実用的実施例7から得られた結果を示す。 図21は、本明細書の実施形態に従う、再循環磁気分離方法の概略を示す。 図22A~22Dは、本明細書の実施形態に従う、精製細胞および廃棄細胞の回収を示す。 図23A~23Bは、本明細書の実施形態に従う、細胞からのビーズ放出効率を示す。 図24A~24Cは、磁界との接触強度、および複数サイクルの影響を示す。 同上。 図24D~24Eは、本明細書に記載される、分離チューブ中の細胞の捕捉および除去を示す。 図25A~25Lは、本明細書に記載される、標的細胞の陽性選択および陰性選択の結果を示す。 図25A~25Lは、本明細書に記載される、標的細胞の陽性選択および陰性選択の結果を示す。 図25A~25Lは、本明細書に記載される、標的細胞の陽性選択および陰性選択の結果を示す。 図26A~26Dは、本明細書に記載される、自動化細胞培養システム中の細胞の回収を示す。 図26A~26Dは、本明細書に記載される、自動化細胞培養システム中の細胞の回収を示す。。 図27A~27Bは、本明細書に記載される、自動化細胞培養システムにおける洗浄後の磁気粒子の回収を示す。
本明細書において言及されるすべての公開文献、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体で組み込まれる。本明細書において検討される公開文献および特許出願は、本出願の出願日の前の開示についてのみ提示するものである。本明細書のいかなる記載も、先行発明を理由として当該公開文献に先行する権利が本発明に与えられないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに物質、方法および実施例は、解説のみを目的としており、限定であることは意図されない。
矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が主導をとるものとする。別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書の主題が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、以下の定義は、本発明の理解を促進するために与えられる。
本明細書において使用される場合、要素または構成要素に先行する「a」および「an」といった冠詞は、当該要素または構成要素の例(すなわち存在)の数に関して非限定的であることが意図される。ゆえに「a」または「an」とは、1つまたは少なくとも1つを含むと解釈されるべきであり、当該要素または構成要素の単数形は、当該数が明白に単数であることが意図されない限り、複数も含むものとする。
本明細書において使用される場合、「発明」または「本発明」という用語は、非限定的な用語であり、特定の発明のいずれか1つの態様を指すことは意図されず、しかし本明細書および特許請求の範囲に記載されるすべての可能性のある態様を包含する。
本明細書において使用される場合、「含む」、「含むこと」、「含有する」、「有する」という用語、ならびにその語尾変化形および同根語は、「限定されないが、以下を含む」を意味する。
本明細書において使用される場合、採用される成分、構成要素または反応物の量を改変する「約」という用語は、例えば、濃縮物または溶液の作製に使用される典型的な測定手順および液体処理手順を介して発生する可能性のある数量における変動を指す。さらに変動は、測定手順における不注意なエラー、組成物を作製する、または方法を実施するために採用された成分の製造、供給源または純度における差異などから発生する可能性もある。1つの態様では、「約」という用語は、報告された数値の10%以内を意味する。別の態様では、「約」という用語は、報告された数値の5%以内を意味する。さらに別の態様では、「約」という用語は、報告された数値の10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1%以内を意味する。
値の範囲が列挙されている場合、それは単に簡便さまたは簡潔さを目的としたものであり、可能性のある全ての下位範囲、ならびに当該範囲の内、および当該範囲の境界周辺にある個々の数値も含まれる。全ての数値は、別段で特定されない限り、実際に近い値も含み、そして整数値は小数値を除外しない。下位範囲の値、および実際に近い値は、具体的に開示された値とみなされるものとする。
含有されると本明細書に規定された任意の構成要素は、但し書き、または負の限定を目的として請求される発明から明白に除外される場合もあることを理解されたい。
本明細書において使用される場合、「近い」、「およそ」および「実際に」という用語は、本発明の参照される用語または実施形態または操作または範囲と比較して、有害な結果または効果を有していないそれぞれの関連性または測定結果または量または数量または程度を意味する。
本明細書において使用される場合、例えば、「垂直」、「水平」、「並行」、「反対」、「真っ直ぐ」、「横」、「並行」、「直角」および他の角度的な関連性を指す任意の用語は、およそまだ機能的な、および/または実際的なそれぞれの関連性も意味する。
本明細書において使用される場合、「好ましい」、「好ましくは」、「典型的な」、「典型的には」、または「任意選択的な」という用語は、本発明の範囲またはその実施形態を限定しない。
本明細書において使用される場合、「実質的な」、「大量の」(またはその同義語)という用語は、当該状況に関連して、参照される実態の大半または大部分を包含する測定結果または範囲または量または程度を意味するか、あるいは参照実態と比較して、または参照主題に関して、少なくとも適度、またはさらに高い、または大きい、またはより効率的、またはより重要な程度を意味する。
本明細書において使用される場合、「無視できる程度の」および「わずかな」(またはその同義語)という用語は、参照される用語と比較して、または本発明範囲に対して、実際的な結果を有していない充分に小さなそれぞれの関連性、または測定結果、または量、または数量、または程度を意味する。
本明細書において使用される場合、「~場合がある」という用語は、含有されない、および/または使用されない、および/または実装されない、および/または発生しない選択肢または効果を意味するが、当該選択肢は、本発明範囲を限定することなく、本発明の一部の実施形態またはその結果の少なくとも一部を構成する。
本明細書において使用される場合、「サンプル」は、任意のサンプルであってもよく、植物、ヒト、動物または微生物源から誘導され得る「生物学的サンプル」であってもよい。サンプルは、典型的には不均一なサンプルであり、当該サンプルから、標的が選択され、分離および収集される。標的は、細胞、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、微生物、ウイルスなどであり得る。生物学的サンプルは、標的集団を含有する。
生物学的サンプルは、体液サンプル、体細胞サンプル、または生物学的組織サンプルを含み得る。生物学的流体サンプルまたは体液サンプルの例としては、尿、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、頸管粘液、頸管-膣液、膣液、乳汁、母乳、滑液、精液(semenおよびseminal fluid)、糞便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、房水、硝子体液、腹水(peritoneal fluidおよびascites)、汗、リンパ液、肺の痰(lung sputum)および肺洗浄液、またはそれらに由来するサンプルが挙げられる。生物学的組織サンプルは、細胞、通常は特定の種類の細胞と細胞間物質との凝集物を含有するサンプルであり、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織を含む、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルスの構造の構造物質のうちの1つを形成する。生物学的組織サンプルの例としては、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞も挙げられる。例えば、サンプルは、癌性であると疑われている組織サンプルであってもよい。生物学的組織サンプルは、最初に細胞凝集物を分離させるように処理され得る。
複数の実施形態では、生物学的サンプルは、血球、白血球、または血小板である。白血球には、好中球、リンパ球(Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、T-キラー細胞、ナチュラルキラー細胞を含むT細胞、およびBリンパ球)、単球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。
本明細書において使用される場合、「標的細胞」は、典型的には、特定のタイプの細胞、または他の細胞と比較して例えば特定の抗体または他の化合物もしくは他の粒子と連結する選択的相互アフィニティなどの独特な特徴を有する細胞を、他の細胞から(例えば、検査または診断のために)分離または濃縮することが意図される細胞である。特定の実施形態では、独特な特徴とは、磁気ビーズと連結または結合して、磁性標的細胞を形成する選択的アフィニティである。
本明細書において使用される場合、「患者サンプル」という用語は、診断、スクリーニング、モニタリング、または治療が予期される任意の動物から採取された生物学的サンプルと規定される。動物には、哺乳動物が含まれる。患者とは、疾患状態に罹患しているか、または疾患状態が判定もしくは治療される、例えば、哺乳動物、霊長類、ヒト、または家畜の対象などの対象を指す。患者サンプルは、発生源となる生物集団の源であり得る。
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、またはそれらの抗原結合部分を含むことが意図され、限定されないが、F(ab)、例えばscFvなどのFv断片、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え遺伝子操作抗体、およびFab発現ライブラリが挙げられる。二重特異性抗体も、磁気粒子上に固定されることができる。
本明細書において使用される場合、「標識部分」は、直接または間接的に検出可能である。標識部分は、標識可能な標識であってもよく、および磁気粒子と併せて使用されてもよい。直接標識部分としては、放射性同位体;産物が検出可能な酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなど);蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン色素、カスケードブルー、PerCP、Cy5、Cy7、アロフィコシアニン(APC)、PECy5、または他の異なる蛍光色素のタンデム結合体、テキサスレッドなど);蛍光放射金属、例えば、152Eu、または例えばEDTAなどの金属キレート群を介してタンパク質に付加されるランタニドシリーズの他の物質;化学発光性化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など;生物発光性化合物、例えばルシフェリン、エクオリン(緑色蛍光タンパク質)など;および金属化合物が挙げられる。間接標識部分としては、ポリペプチドに結合する標識分子が挙げられ、例えばポリペプチドに特異的な抗体などがあり、この場合において標識される結合分子は、上述のように標識され、および例えばビオチン(特異的結合ペアのビオチン-アビジンの1つ)、ジゴキシゲニン(特異的結合ペアのジゴキシゲニン-ジゴキシゲニンに対する抗体の1つ)などの特異的結合ペアの1つとして標識される。あるいは標識部分は、限定されないが、本明細書に記載されるものを含む、任意の適切な標識であってもよい。
例えば、抗体、タンパク質または核酸分子などの結合パートナーで標識される磁気粒子は、Miltenyi Biotec GmbH(Friedrich Ebert Str.68,D-51429、ドイツ、ベルギッシュグラートバハ)から市販されている。生体分子を磁気的に標識する方法は当分野に公知であり、任意の公知の方法を使用することができる。例えば、米国特許第6,020,210号は、磁気粒子の調製方法、および磁気粒子に生体分子を付加する方法について記載している。特異的結合ペアの第一のメンバーが、磁気粒子と関連付けられてもよく、この場合において改変される生体分子が、特異的結合ペアのメンバーに結合する部分を含む。あるいは磁気粒子は、例えばリンカーまたはスペーサー(例えば、核酸リンカーなど)を介して抗体またはその免疫反応性断片に連結される。スペーサーまたはリンカーを付加することによって、生体分子がより柔軟に提示されることができるようになり、注意深く化学的操作することで、特定の方向にリガンドを付加することができる。これら連結に使用される多くの化学的操作法があり、多くの企業がプロトコールを公表し、化学分野の当業者の助けとなっている。
磁気粒子に付加されることができる特異的結合ペアのメンバーの例としては、限定されないが、オリゴdT(例えば3’末端のポリA部分などを含む核酸分子への結合用);特異的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド(相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子への結合用);アビジン(例えば、ストレプトアビジン)(ビオチニル化生体分子への結合用);抗原結合ポリペプチド、例えば免疫グロブリン(Ig)またはそのエピトープ結合断片(Igにより認識されるエピトープを含む生体分子への結合用);ポリヌクレオチド結合タンパク質(ポリヌクレオチドへの結合用)、例えば、転写因子、翻訳因子など;NiキレートまたはCoキレート(ポリヒスチジンタグ化タンパク質の固定用);受容体-リガンドシステム、または他の特異的なタンパク質-タンパク質相互作用ペア;アプタマー(例えば、三次元分子標的に対する核酸リガンド);レクチン(糖タンパク質結合用);脂質およびリン脂質(脂質結合タンパク質への結合用)、例えば、ホスファチジルセリンおよびアネキシンVが挙げられる。当業者であれば、磁気粒子に結合され得る特異的結合ペアの他のメンバーを認識しているであろう。
生体分子は、直接的な化学結合により、または物理的会合により磁気粒子に連結(共有結合的または非共有結合的)されてもよい。そうした方法は当分野に公知である。生化学的結合は、例えば、“Bioconjugate Techniques” Greg T.Hermanson,Academic Pressに記載されている。例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、および/またはファンデルワールス力などの非共有結合性の相互作用を使用して、生体分子と磁気粒子とを連結させてもよい。例えば、生体分子をクロマトグラフィーマトリクスに結合させるために使用される標準的な非共有結合性の相互作用を使用してもよい。生体分子を磁気粒子に結合させるために使用することができるそうした非共有結合性の相互作用の1つの非限定的な例は、カオトロピック塩の存在下でのシリカに結合するDNAである。当業者であれば、当該結合を実現するための他のそうした非共有結合および条件について認識している。例えば、Molecular Cloning,Sambrook and Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。
本明細書において使用される場合、「磁気粒子」は、例えば限定されないが、抗体、DNA、ポリペプチド、および細胞などの生物学的サンプル中の生体分子標的に対する標識として使用され、サンプルの複雑な混合物からの分離を補助する。磁気粒子は、サイズに従い以下のように分類される場合がある:約50nm未満のマイクロビーズ;約100~約200nmのナノビーズ;および約1~5μmのダイナビーズ(dynabeads)。さらに磁気粒子は、例えば蛍光標識、抗体、核酸などの所望される生体分子標的との連結または結合のために(官能化された)選択的アフィニティに適合されてもよい。
例えば、Dynal(ノルウェー)、Advanced Magnetics (米国、ケンブリッジ、マス)、Immuncon(米国フィラデルフィア)、Immunotec(フランス、マルセイユ)およびMiltenyi Biotec GmbH (ドイツ)を含む多くの供給源から様々な磁気粒子が入手可能である。好ましい磁性標識方法としては、5~200nmのサイズ範囲、好ましくは10~100nmのサイズのコロイド超常磁性粒子が挙げられる。これら磁気粒子によって、細胞の定量的磁性標識が可能となり、それに伴い、連結された磁性標識の量が、結合された産物の量に比例することとなる。様々な特異性を有したコロイド粒子が、例えばMiltenyi Biotec GmbHを介して入手可能である。
本明細書において使用される場合、「分離」には、周辺の流体バルクから標的細胞を単離または収集蓄積することを含み、ここでバルクとは例えば、細胞の流体混合物もしくは懸濁液もしくはエマルションまたはその組み合わせであり、周辺バルクまたは提供される細胞サンプルと比較した標的細胞の濃縮または富化という意味も含む(沈殿または遠心分離と同様に沈殿物を取得する)。
本明細書において使用される場合、分離と関連した「枯渇」とは、バルクからの標的細胞の除去である(沈殿または遠心分離と同様に上清を取得する)。
本明細書において使用される場合、「高度に質的な」(分離、枯渇)とは、実質的に他の細胞が排除された、または例えば分離細胞の約10%~約1%以下の僅かな量の他の細胞を含む、高純度の標的細胞の分離を意味し、枯渇の場合にはその逆である。
本明細書において使用される場合、「高度に量的な」(分離、枯渇)とは、実質的にすべての標的細胞、または分離細胞の約80%~約99%以上などの非常に大量の標的細胞のサンプルからの高度な回収、分離を意味し、枯渇の場合にはその逆である。
チューブの壁への細胞の付着もしくは接着もしくは粘着、または当該作用に対する類似の用語に関して本明細書において言及がなされるときは常に、必ずしも細胞が壁に直接付着することを意味するのではなく、むしろ例えば細胞の鎖または細胞の群などにより、壁に間接的に接続、結合または引き寄せられることを意味することに注意されたい。
本明細書において使用される場合、「磁気シールディング」は、「磁界シールド」(本明細書において、磁界シールド/バリアとも呼称され、それら用語は相互交換可能である)で磁界を遮断することにより、空間中の磁界を低下および/または遮断する。
本明細書において使用される場合、「HMPSM」とは、高い透磁性および磁気飽和性の物質を意味し、自身の中に高度に集中した磁界を生じさせ、効率的に磁界の影響を低下および/または排除する。
本明細書において使用される場合、「磁界シールド/バリア」は、磁界の使用に関し、制御され得る構造である。
本明細書において使用される場合、「電磁石」は、磁界が電流により生じるタイプの磁石である。磁界は、電流が消えたときに消失する。電磁石は通常、コイルにまかれたワイヤからなる。ワイヤを通る電流が磁界を生成し、磁界はコイル中心の穴に集中する。ワイヤの巻き(wire turn)はしばしば、強磁性物質またはフェリ磁性物質、例えば鉄などから作製される磁性コア周辺で巻き上げられる。磁性コアは、磁束を集中させ、より強力な磁石を作製する。
本明細書において使用される場合、「永久磁石」は、電磁石とは対照的な永久的な磁石であり、電磁石は電流が自身を通って流れたときにのみ磁石のような振る舞いをする。永久磁石は、最も磁性が高い天然鉱物であるマグネタイト(Fe)のような物質、または強力な磁性合成物質であるネオジムから作製される。
本明細書において使用される場合、「磁石アレイ」は、1つ以上の磁石である。1つ以上の磁石は、永久磁石または電磁石であってもよい。1つ以上の永久磁石が、直線アレイにあってもよく、異なるサイズ、異なる強度であってもよく、直線アレイの軸に対して垂直な反対極方向で構成されてもよく、または直線アレイの軸に対して垂直な平面において互いに90°回転して構成されてもよい。アレイ中の任意の数の磁石が、物理的に一緒に保持されてもよく、または接着して互いに保持されてもよい。永久磁石は、鉄、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコから選択される物質の磁石であってもよい。
本発明の全体的な非限定的概略および本発明の実施を以下に提示する。概略は、本発明の実施形態/態様の例示的実施を説明し、様々な、および/または代替的な、および/または多様な態様/実施形態に対する構成的な基礎を提示し、その一部が後に記載される。
本開示は、生物学的サンプル中の所望の生体分子標的を、陽性選択または陰性選択を介して磁気的に分離および収集するためのデバイス、方法およびシステムに関する。本明細書において提示されるように、所望の磁化生体分子標的を含有する生物学的サンプルに実質的に隣接する磁界が生成される。磁界は、自動的に「オン」と「オフ」とを切り替えることができ、その結果、所望の強度、連続期間、断続期間、パルス状期間、およびそれらの組み合わせの磁界が生成される。これは、磁界シールド(本明細書において、磁界シールド/バリアとも呼称される)を導入して、生物学的サンプルに直面する/加えられる磁界の適用を機能的に制御することにより実現される。磁界シールド/バリアは、磁界源と生物学的サンプルとの間に配置され、その高い透磁性および磁気飽和性の物質(HMPSM:high magnetic permeability and saturation material)の機能として、自身の中に高度に集中した磁界を生じさせ、磁化生体分子標的を含有する生物学的サンプルに対する磁界の影響を効率的に低下させ、および/または排除する。
本発明の態様において、細胞生物学的物質はバイオリアクター管で培養され、所望の細胞が、磁気的な分離および収集の生体分子標的である。
本明細書に記載されるデバイス、方法およびシステムは概して、限定されないが典型的には細胞である生物学的サンプル(不均一な生物学的集団)が、サンプル中の特定の生体分子標的(特定の細胞型)結合される磁気ビーズを有し、「磁化細胞」が生じる。典型的な結合方法は、i)生物学的標的の抗体に結合した磁気ビーズを直接結合させること、およびii)生物学的標的が、別の抗原に結合した抗体または結合ペアに結合される複数工程プロセスを使用すること、を含み得る。その後、この抗原/結合ペアが、各抗体/結合ペアに結合される磁気ビーズに結合される。磁気分離の間、磁気ビーズに結合した標的細胞である磁化細胞(抗原を発現している;陽性選択される)は、磁石に近い場所に引き寄せられ、一方でビーズが結合していない細胞集団(陰性選択される)は、生物学的サンプルの媒体中に留まり、結合集団から容易に取り出される。磁気的細胞選択に対する代替的なプロセスは、抗原提示磁気マイクロビーズを使用して、標的細胞上のいくつかのタイプの生物学的プロセスを刺激することである(例えば、磁気活性化ビーズに連結された抗CD3および抗CD28を用いたT細胞活性化)。刺激後、磁気ビーズは取り出され、その後に下流処理が行われなければならない。これには、細胞懸濁液を有効な磁石で処理することが必要である。
分離の間、磁気的に傾斜した粒子は、適用される磁界Bから、以下の式1に規定されるように常磁性粒子に作用する力ベクトルFを受ける(Pamme,2006)。
式中、Vは、粒子の体積であり、Δは、粒子と周辺媒体との磁気感受性(磁化される能力)における差異であり、μは、真空の透磁性であり、B・∇は、磁界と勾配オペレーターとの間のドット積である。この式から、磁気分離システムの成功は、多くのパラメーターに依存することが明白である。第一に粒子のサイズであり、粒子が大きければ、強い磁力を受ける。磁気粒子には3つの典型的なサイズ分類がある。i)50nm未満(例えば、Miltenyi Biotec社のMACS(登録商標)マイクロビーズ)、ii)100~200nm(例えば、BioLegend社(登録商標)のナノビーズ)、またはiii)1~5μm(例えば、Invitrogen社のダイナビーズ(登録商標))であり、サイズが大きくなるほど分離が容易になる。次に、周辺媒体と比較してビーズの磁気感受性を高めることである。ほとんどのビーズは鉄のコアからなることが多く、周辺媒体は、実際には磁化されないため、この値は典型的には相対的に既に大きい。最後に、磁界勾配を高めることで、磁気ビーズに加えられる力を劇的に高めることができる。これは、高勾配の磁界の空間の質がまばらであることが原因で、磁界勾配が、磁気粒子のN極およびS極にまばらな力を生じさせるためである(図1A)。この粒子に対するまばらな力によって、粒子の動きが生じる。完全に均一な磁界では、磁気粒子の2つの極には等しく反対向きの力が生成され、粒子には正味でゼロの力となり、正味の動きは生じない(図1B)。さらに、磁気粒子のサイズを大きくすると、小さなビーズと比較して、2つの極の間で勾配から加えられる磁力の差異が大きくなる(図2および3)。
自動化された分離、単離および収集を目的として、磁気ビーズを引き寄せる勾配を生成することができる磁界を「切り替え可能に」誘導する(オンおよびオフにすることができる)手段が存在する。例えば、電磁石は、電流担持ワイヤを磁気的に感受性の物質(例えば、鉄)の周囲に巻き付けることで形成される(図4A)。電磁石は、ワイヤを通る電流をそれぞれ加える、または除去することによりオンまたはオフを切り替えることができる。もう1つの方法は、電気-永久磁石であり、磁気保磁力が高い硬磁石(磁極を切り替えるほど高い磁界)と、保磁力が低い軟磁石からなる(図4B)。両方の磁石が常磁性物質(例えば、鉄)とともに互いに接続され、磁気回路を完結させる。軟磁石は電流を担持するワイヤで巻き付けられており、ワイヤ中で強電流をパルスすることで、軟磁石の磁極を切り替えることができる。極が位置合わせされていない場合、磁石の「電流」は、常磁性物質を通って流れ、外部磁界が観察されない。しかし極が位置合わせされたとき、磁流は空気を通って移動し、外部磁界が生成される。最後の方法は、永久磁石を使用して、磁界を生成することである。高い磁気飽和性を有する物質を使用することで、磁石の一方の側に対する磁界を遮断することが可能である(図4C)。
本発明の態様において、交互に切り替わる方向性を伴う強い永久磁石のアレイが使用される(図4C)。これによって、アレイから放射状に広がる強い磁気勾配が生成され、ならびにアレイの軸に直線的に沿った勾配が生成される。この設計の改変版は、Halbachアレイであり、アレイ中の磁石は、互いに90°回転する(図4D)。これによって、磁石の一方の側に対する磁界の著しい増加が誘導され、一方で他方の側に対する磁界は減弱される(Kangら)。
この制御可能な磁界を設計することで、生体分子標的を含有する標的の生物学的分画の(陽性選択または陰性選択のいずれかを介した)単離を制御する連続的な活動を行うことが可能となり、同時に非標的の生物学的分画は取り出され、廃棄されることが可能となる。
磁気分離を使用して生物学的サンプルを処理する間に磁界のオンとオフとを切り替えて、陽性細胞選択および陰性細胞選択の両方の自動化を行うことができる能力が主要な操作上の必須要件である。本明細書に記載されるデバイスおよび方法によって、標的生物学的集団の自動化収集が可能となり、それに伴い全体的なプロセスの複雑性が減り、操作上のコストが低下する。
本明細書に記載される「オン」と「オフ」との切り替え可能な磁界は、磁界シールド/バリアを導入することにより、例えば磁気ビーズなどの磁気粒子で標識された生物学的サンプルが直面する磁界を制御する。この制御可能な磁界を介した標的の生物学的保持と、その後の二次放出および捕捉の連続工程とによって、非常にコンパクトでエネルギー効率の良い磁気分離システムを作製することが可能となった。
磁界シールド/バリアは、HMPSMに本来備わる特性により機能する。この高い透磁性および磁気飽和性によって、この物質内に高度に集中した磁界が生じる。磁界源と生物学的サンプルとの間の磁界シールド/バリアとしてHMPSMを配置することによって、生物学的サンプルに対する磁界の影響を実質的に排除することが可能となる。この制御可能な磁気バリアの活性化を通して、高い再現性および比較的低いコストで生物学的サンプルから標的集団を磁気分離することが実現可能となる。
図1は、どのように磁気粒子/ビーズ(例えば、細胞分離および活性化に使用されるもの)が磁界勾配に反応するかについての理論を提示する。これは式1において数学的に実証される。各磁気ビーズは、N極およびS極を有する。磁界勾配に曝されると、粒子の各極に対して作用する磁力(1つは引き付け、1つは反発する)が異なり、その結果、粒子を動かすことのできる正味の力が生じる(図1A)。比較として、磁界勾配が無い場合、各極に作用する力は等しく、そして反対向きである(図1B)。ゆえに正味の力は磁気粒子に加えられず、動きも導かれない。極がNとSとで交互になるように配置された磁石アレイを使用して、これらの必要な磁界勾配を生成することができる。さらに図1Cに示されるように、高い磁界勾配は、アレイ中で極がN方向とS方向とで交互になって配置された、複数の強くて小さい磁石のアレイを使用することで生成することができる。
図2は、細胞の磁気分離に多く使用される磁気ビーズのサイズを提示する。現在あるビーズサイズの範囲は、Miltenyi社の約50nmのMACS(登録商標)マイクロビーズから、約5μm以下のInvitrogen社のダイナビーズ(登録商標)の範囲がある。ビーズサイズを増加させることによって、ビーズの各極に作用する力の差異も増加するため、磁界に応答するビーズの感受性も増加することが多い。
図3は、大きなサイズの磁気ビーズによって、誘導磁界に応答した流体がより効率的に押し出される方法の概要を記載する。一部の実施形態では、ビーズは、ビーズの各極の各々に対して、磁界からの引力および斥力に同時に曝される。磁界源から離れると、磁界の規模および勾配が低下する。ゆえにビーズが受ける正味の力は、磁界源からの距離と、ビーズの直径とに依存する。大きなビーズは、両方の極の距離も大きく、その結果、極に作用する磁力の差も大きくなる。同様に、勾配が強くなると(すなわち磁石に近くなると)、ビーズの各極に作用する力の差も上がる。この正味の力における増加によって、磁石に向かい、流体から出るビーズの引力がより早くなる。
図4は、自動化制御システムを使用した生物学的サンプルへの適用に関して、オン/オフを回転させることができる磁界を発生させる方法を提示する。図4Aにおいて、電磁石が提示されており、ワイヤは、例えば鉄などの強磁性物質の周囲に巻き付けられている。ワイヤに電流を加えることで、磁界は素早く、簡単にオンとなり、逆にオフにもなり得る。しかしこれにより生成された磁界は低い。さらに電磁石は著しいレベルの熱を産生するため、局所的な細胞培養環境にとって非常に問題がある。図4Bは、切り替え不可能なレアアース磁石と、極切り替え可能なアルニコ永久磁石との両方からなる電気-永久磁石を提示しており、両方ともが磁気回路を形成する強磁性物質中に組み込まれている。永久磁石の極が位置合わせされれたとき、カーボンスチールは同じ方向を選び、磁石周囲の空気中に正味の磁束を生成する(これを使用して、流体懸濁液から磁気ビーズを引き出すことができる)。しかし2つの永久磁石の極が反対向きであるときは、磁束は強磁性物質に限定され、磁気ビーズの抽出が阻害される。アルニコ磁石の方向性は、アルニコ磁石周囲のワイヤのコイルを通じて非常に大規模かつ短期間の電流パルスを加えることで切り替えられ、それに伴い、一過性の大規模な磁界が生じる。しかしそうした設定から生じた磁気勾配も、レアアース磁石と比較して非常に低く、この方法はまた、任意の周辺電子機器に未知の有害な影響を及ぼし得る電磁石干渉も生じさせる。図4Cは、極方向が逆の永久磁石のアレイを示しており、例えば鉄、コバルト鉄およびHiperco50などのHMPSMが一方の側にある。このHMPSMを利用することで、反対側で磁界の磁束が増幅され、一方でHMPSM側ではわずかなレベルにまで減少する。永久磁石と磁気ビーズとの間にあるようにHMPSMを作動させることで、ビーズに作用する力を事実上ゼロにまで低下させることができる。逆に、HMPSMを永久磁石の反対側に移動させることで、非常に強力な磁力がビーズに誘導され得る。最後に図4Dにおいて、Halbach直線アレイが提示されており、磁石の90°回転によって、アレイの一方の側に増幅された磁界が生成され、一方で、アレイの反対側では磁界は著しく低減または消失する。
図5は、永久磁石上のHMPSM(x標識)の機能を示すコンピューターモデリングを提示する。磁束は主に、磁石周囲の空気を通じて伝達される。しかし磁束は、HMPSMを通じて伝達されるほどには強くない。このため、磁石に対して反対側のHMPSMには大きな磁束密度は生じないが、磁束密度は主に、永久磁石の2つの極で増幅される。
図6は、カセットフェースの全長に沿って伸びる、磁気ビーズを使用した磁気分離用の分離チューブを備えた自動化細胞培養システム内で多く使用されるカセット例のレイアウトを示す。このチューブは、自動化細胞培養システム内に配置された永久磁石アレイと位置合わせする。分離チューブは、カセット内の様々なチューブやバッグに接続され、当該カセットは、対象細胞の陽性選択または陰性選択に使用される。可能な限り長いチューブを使用することで、分離チューブ内に流され得る体積が増加し、それに伴い磁気分離を発生させるための処理時間が短くなる。
図7は、図6に提示された分離プロセスの実施形態を提示する。細胞に結合した、または結合していない磁気結合ビーズは、分離チューブ701内に流され得る(図7A)。一部の態様では、分離チューブ701は、図7Bに示されるように永久磁石アレイ704と位置合わせされる。他の態様では、分離チューブ701は、永久磁石アレイ704に置き換わった電磁石と位置合わせされる。永久磁石アレイ704は、N極(702)とS極(703)とが交互にある永久磁石からなり、可能な限り高い磁束勾配を生じさせる。分離チューブ701中の磁気ビーズは、磁石アレイ704に引き寄せられ、それによって流体懸濁液からの磁気ビーズの分離が成功する。
図8は、「オン」になった磁界を伴う磁界シールド/バリアの実施形態を示す。分離チューブ701は、永久磁石アレイ704の全長にそって伸びている。永久磁石アレイ704の一部を、HMSPMから生成された磁界シールド801が取り囲んでいる(常磁性シース801として示されている)。一部の態様では、磁界シールド801は、純粋な鉄から生成される。一部の態様では、磁界シールド801は、例えばフェライト鋼、ケイ素鉄、ニッケル鉄またはコバルト鉄などの軟磁性鉄合金から生成される。一部の態様では、磁界シールド801は、例えば、約49%コバルト、約2%バナジウム、および残部の鉄の合金などのコバルト、バナジウムおよび鉄の軟磁石合金から生成される。一部の態様では、シース801は、Hiperco50またはHiperco 50Aから生成され得る。一部の態様では、磁界シールド801の常磁性の特性は、磁石アレイ704によって分離チューブ701に加えられる磁界勾配を増幅させる。実際に、この常磁性によって、磁気ビーズに作用する磁力が増加し、その結果、磁気ビーズはより効率的に流体懸濁液から取り出され、一方で非磁性物質は影響を受けず、スムーズに分離チューブを通過することができる。永久磁石アレイ704および磁界シールド801はさらにサーボ802および歯車列803に接続され、その結果、アセンブリ全体が完全に回転され、必要に応じてオフおよびオンになることができる。
図9は、図8にあるアセンブリと同じアセンブリを示しているが、磁石は「オフ」の位置にある。分離チューブ701はなお永久磁石アレイ704にそって伸びている。しかしオフの位置では、磁石アレイ704および磁界シールド801は、回転サーボ802および歯車列803を使用して回転され、それに伴い、磁界シールド801は、分離チューブ701と永久磁石アレイ704との間にある。図4と図5に示されるように、磁界シールド801に使用されるHMPSM物質は、磁束が通過するのを妨げる。このため、分離チューブ701が曝露される磁束勾配は大きく減少し、磁気ビーズ上に磁界を保持することができなくなる。分離チューブ701に高速の液体または気体の流れを適用することにより、磁気ビーズと磁気結合した細胞を流し出すことができる。
図10は、分離チューブ701、磁界シールド801、および永久磁石アレイ704の間のインターフェースの断面図である。「オン」の位置にあるとき、図10Aに示されるように、分離チューブ701に大きな磁界が作用して、磁気粒子を引き付けられ得る。「オフ」の位置にあるとき、図10Bに示されるように、分離チューブ701に作用する磁界はわずかとなり、それまでに結合した細胞およびビーズは効率的に取り出され得る。
図11は、カセット1101と、自動化細胞培養装置1102とのインターフェースの側面図である。分離チューブ701はカセット1101に取り付けられ、それに伴い、磁性分画または非磁性分画がカセット1101内の異なる領域から動かされ、および異なる領域へと動く。逆に、磁気分離アセンブリ(704と801からなる)は、自動化細胞培養装置1102内に含まれる。装置1102と関連付けられた制御システムは、サーボ802および歯車列803を制御して、磁石アレイ704および磁界シールド801を回転させることができ、その結果、分離チューブ701に付随したときに、磁界は「オン」または「オフ」となる。カセット1101と装置1102とが連結されたとき、分離チューブ701および分離アセンブリ(まとめて704と801)は位置合わせされ、その結果、効率的な磁気分離を行うことが可能となる。さらに装置1102と関連付けられた蠕動ポンプを使用することで、流体(磁気ビーズおよび細胞を含む、または含まない)は、分離チューブ701から移送され、または分離チューブ701から取り出され得る。
図12は、カセット1101の外壁と、細胞培養装置1102の外壁との間に設置された分離チューブ701の側面図から構成され、分離チューブ701内の磁界勾配の数および規模を増加させる様々な手段が示されている。図12Aは、カセット1101の外面上の分離チューブ701の全長に沿って伸びる常磁性/非磁性スペーサー1201を示す。このスペーサー1201は、チューブ701を圧縮して、チューブ701を通って流れる磁化エレメントと磁石アレイ704との間の距離が最小限となるように作用する。その上、磁石アレイ704からのスペーサー1201の磁化(常磁性である場合)によって、カセット1101に最も近い側面上の分離チューブ701において、別の磁界勾配が形成される。さらにスペーサー1201(示さず)の全長にそってスペーサー1201をさらに小さい小片に切断することで、各スペーサーの小片1201の末端部分で、高い磁界勾配が生成され得る。図12は、分離チューブ701内の常磁性ワイヤメッシュ1202を示しており、永久磁石アレイ704により生じた磁界に曝されたとき、メッシュ1202のストランドの周囲に高い磁界勾配が生成されることを示す。図12Cは、分離チューブ701内に設置された常磁性粒子1203を示しており、永久磁石アレイ704に由来する磁界に曝されたとき、限局性の磁界勾配を生成する。図12Dは、分離チューブ701の全長に沿って伸び、縦方向に小さな小片へと破砕された(示さず)常磁性ロッド1204を示しており、磁石アレイ704に曝されたとき、各ロッド1204の末端で、高い磁界勾配を生成することができる。図12Eは、分離チューブ701の全長にそって伸びる一連の常磁性ロッド1205を示しており、アレイ704に由来する磁界に曝されたとき、ロッド1205の間に高い磁界勾配が形成される。図12Fは、分離チューブ701の全長にそって伸びる常磁性スキャUう1206を示しており、アレイ704に由来する磁界に曝されたとき、孔内に高い磁界勾配が形成される。図12Gは、小さな収差(aberration)からなる分離チューブ701の常磁性コーティング1207を示しており、アレイ704に由来する磁界に曝されたとき、それらの間に高い磁界勾配が生成される。図12Hは、分離チューブ701内に置かれた常磁性フィルター1208を示しており、アレイ704に由来する磁界に曝されたとき、フィルター孔内に高い磁界勾配が生成される。
任意で、またはさらに本発明の一部の態様では、例えば磁界強度、生体分子標的の空間分布(濃縮)および/または例えば温度などの他のパラメーターなど、様々なパラメーターが調整可能である。例えば、生物学的サンプル流体の流量および/または粘度および/または弾性を調整して、例えば非標的細胞の凝集を少なくとも実質的に妨げながら、標的細胞を分離することが可能となる。一部の実施形態では、流体を使用して、分離された標的細胞を洗い流してもよい。流動様式および洗浄流体の速度を任意で調整して、チューブの壁からの標的細胞の取り外しが促進される(すなわち除去または放出が促進される)。流れをそのように唐突に変えることで、乱流または衝撃が誘導され、チューブ壁上の標的細胞の除去または不安定化が補助される。
ある実施形態では、様々な方法(例えば、消磁、泡立て、振動、酵素、音波およびそれらの組み合わせ)および方法の組み合わせによる、分離チューブからの分離細胞の放出は、チューブからの細胞の洗い流しの前、および/または同時に実施されてもよい。この周辺的な処理を行って、品質および/または品質に関して所望の標的集団の分離および特性を改善してもよい。例えば、赤血球(RBC)溶解を使用して、粘着性のあるRBCの除去を補助し、純度を改善してもよく、それに伴い、PBMC集団全体からのT細胞の分離が容易になる。
例えばDNaseなどと記載される酵素を使用して、細胞放出を補助してもよい。
さらに(標的細胞の収集ではなく)高品質または高純度の枯渇が目的とされる場合、壁に付着している、および/または凝集している非標的細胞を犠牲にして、収集に使用されるよりも強い、充分に強力な磁界を加えてもよい。
デバイス、システムおよび方法は、1つ以上の試薬、1つ以上の磁気粒子、1つ以上の結合パートナー、磁石アレイ、磁界シールド、および/または使用説明書を含む、キットにおいて、ならびに本発明のうちの1つ以上の実施のためのその使用において具現化されてもよい。
さらなる解説が無くとも、当業者であれば、先行する記載および以下の例示的実施例を使用して、本発明を作製および利用することができ、かつ権利請求される方法を実施することができると考えられる。ゆえに以下の実用的実施例は本発明の典型的な態様を具体的に挙げており、本開示の残りの部分を限定するとは決してみなされないものとする。ゆえに実施例は、説明目的のためだけであり、本発明範囲の限定にはどのようにも使用されない。
実施例1‐流体からのビーズの分離
CD3/CD28活性化ダイナビーズ(登録商標)(Invitrogen社)を使用して活性化および拡張されたT細胞(Lonza社のPBMCから誘導された)を、磁気分離システム(704および801)を使用して処理した。目的はビーズからのT細胞の分離である。31mlのビーズ-細胞(1.6x10細胞/ml)の流体懸濁液(T細胞培地、94% X-Vivo 15、5% HS、1% P/S、10ng/ml IL-2)を、異なる流量(5、10、および20ml/分)で分離チューブ701を通して流した。磁気分離アセンブリ(704および801)は「オン」の位置に設定された。細胞(磁気結合していない)が当該流体懸濁液から除去された可能性は低いため、分離チューブから収集された流体を「細胞分画」と名付けた。磁石アセンブリ(704および801)を手で「オフ」の位置に回転させる(802および803を使用しない)ことによって、常磁性物質801は、分離チューブ701と磁石アレイ704との間にある。分離チューブ701内の3回の洗い流しサイクル(それぞれ4mlに対し、40ml/分での空気および流体のリンスを交互に行うことから構成される)を実施して、チューブ701の壁に付着したダイナビーズ(登録商標)およびすべての細胞を洗い流し、収集した。すべての磁気的に引き寄せられた細胞およびビーズからなるため、これを「磁気分画」と名付けた。
両方の分画からの細胞計数を使用して、ダイナビーズ(登録商標)から分離成功した細胞の割合(すなわち、「細胞分画」において取得された総細胞の割合)を計算した。全ての適用された流量で、ダイナビーズ(登録商標)からの分離に成功した細胞の割合は、およそ95%であった(図13A)。両方の流体分画も血球系を使用して計数し、各分画中のダイナビーズ(登録商標)の数を測定した。全ての流量で、細胞から取り出されたダイナビーズ(登録商標)の割合は、少なくとも95%であった(図13B)。
実施例2-分離チューブを通るビーズ結合細胞の連続的フロー
ストレプトアビジンナノビーズ(BioLegend(登録商標)社)を、カセット1101の外側で継代Jurkatsに結合させ、磁気分離アセンブリ(704および801)を使用して陽性選択した。細胞(10細胞/ml)は最初に、細胞上のFc受容体に結合する遮断剤(5μl/10細胞、Human TruStain FcX(商標)、Biolegend(登録商標)社)を添加して、室温で細胞および剤を一緒に10分間インキュベートすることにより、非特異的結合に対して遮断された。ビオチン結合一次抗体カクテル(10μl/10細胞、ヒトCD14+単球単離、Biolegend(登録商標)社)は、対象細胞に結合するものであり、これを添加して、混合液を15分間、2~8℃でインキュベートした。ストレプトアビジン被覆ナノビーズ(10μl/10細胞)を同様に細胞懸濁液に更に15分間、2~8℃で添加した。ナノビーズ上のストレプトアビジンは、対象細胞の抗体上のビオチンに結合し、それに伴い細胞を磁気的に結合させる。磁気結合細胞の純粋な集団を確保するために、結合細胞を5分間、EasySep(商標)(STEMCELL Technologies(登録商標)社)磁石により5分間、予めソーティングし、その後、非結合細胞で満たされた上清を捨てた。
磁石アレイ704を使用してJurkatsを分離するために、Jurkats(1.5~2ml/分、3ml)を、異なる流量(1~5ml/分)で分離チューブ701に通過させ、同時に磁気分離アセンブリ(704および801)をオンにした。磁気的に引き付けられた細胞は、流体懸濁液から出て、磁石アレイ704に最も近いチューブ701の壁に接着する。オンになった磁石で流体から取り出されなかった全ての細胞は、「陰性分画」(9~12mlの体積で収集された)として捕捉された。磁石アセンブリ(704および801)は手で「オフ」の位置に回転され、3回の洗い流しサイクル(実施例1に記載)を実施して、「陽性分画」を捕捉した。上記の全ての工程は、単離緩衝液(98%DPBS、2%FBS)を使用して実施された。
陰性分画および陽性分画の両方の細胞計数を使用することで、捕捉され損ねた細胞の割合(流された細胞数に対して、「陰性分画」中にある全ての細胞)、ならびに陽性捕捉された細胞(捕捉され、その後、「陽性分画」に無事に入った細胞)の放出効率を決定することが可能となる。分離チューブ701中の捕捉流量を速くすると、システムにより捕捉され損なう細胞の数も増加する(図14Aおよび14C)。この原因は、結合細胞が磁界に曝露される時間が短くなるためである。しかし捕捉流量を5ml/分に速くすることで、結合細胞の放出率が大幅に改善され、ほぼ100%となった(図14Bおよび14D)。これは、流量が早いと懸濁液を離れる細胞が少なく、チューブ回路の様々な接続部でトラップされることが原因である可能性が高い。分離チューブの内径を改変する(厚いチューブ-1/8”ID(内径)(約0.32センチ)、薄いチューブ-3/32”ID(約0.24センチ))ことによって、捕捉失敗が若干増加する(図14Aおよび14C)。しかし細胞放出も若干改善される(図14Bおよび14D)。これらの結果は、流体速度の増加、および薄いチューブの壁のせん断応力が原因である可能性が高い。
実施例3-ビーズ結合細胞を、分離チューブに複数回通過させる
Jurkatsを磁気的に結合させ、実施例2に記載されるように予め選択した。実施例2と同様に、Jurkats(2x10細胞/ml、3ml)を単離緩衝液中で分離チューブ701を5ml/分の流量で通過させながら、磁気分離アセンブリ(704および801)をオンにした。磁石アレイ704に捕捉されなかった細胞は、単離緩衝液中、第一通過の陰性分画として収集された(収集体積は12ml)。再度、細胞を5ml/分の捕捉流量で分離チューブ701に流し、まだ捕捉されなかった細胞を、第二通過の陰性分画として収集した(再び12mlとして収集された)。第二通過の後、分離アセンブリ(704および801)を「オフ」の位置に回転させ、分離チューブ701で捕捉された細胞に、3回の洗い流しサイクル(実施例1に記載)を行い、陽性分画を得た。上記の全ての工程は、単離緩衝液を用いて実施された。
実施例2と同じく、各分画の細胞を計数し、(チューブ701に流された合計細胞の割合として、両方の通過に対して)捕捉失敗、および放出効率に関して定量した。分離チューブ701を過ぎた細胞を、さらに追加で通過させることで、捕捉され損なった細胞の割合の減少に成功し(図15A)、単回通過と比較した放出におけるネガティブな低下も生じなかった(図15B)。
実施例4-分離チューブにおける「待ち時間」
Jurkatsを磁気的に結合させ、実施例2に記載されるように予め選択した。結合細胞が磁界に曝される期間を効率的に増加させるために、分離チューブ701に流された後、Jurkats(1.5x10、3ml)を様々な期間(1~5分)、静止状態に維持しながら磁気アセンブリ(704および801)を「オン」の位置に回転させた。チューブ701を12ml、5ml/分で穏やかにリンスし、流出液を陰性分画として収集した。待ち時間の後、分離アセンブリ(704および801)を「オフ」の位置に回転させ、3回の洗い流しサイクル(実施例1に記載)を行って、陽性分画を収集した。上記の工程はすべて、単離緩衝液を使用して実施された。
収集された陰性分画および陽性分画を再び計数して、捕捉失敗および放出率に関して定量した。待ち時間が増加すると、捕捉失敗が減少するという顕著な傾向が観察された(図16A)。これは、磁気粒子が磁界に応答することができる追加時間が原因である可能性が高い。さらに、待ち時間が増えたにもかかわらず、各待ち時間の放出率は100%に近かった(図16B)。このことから、捕捉率の改善は単にチューブ回路の接続部における細胞ロスの増加が原因ではないことが示唆される。
プロセスに待ち時間を加えることで、陰性細胞がプロセスにより捕捉される可能性が高くなる(以降、「偽陽性」と呼称される)。偽陽性の割合を定量するために、磁気ビーズへの結合を経ていないJurkatsを様々な捕捉流量(5ml/分または10ml/分)で、分離チューブ701に流した(3x10細胞/ml、3ml)。同様に、細胞を様々な待ち時間(1分または3分)で待機させ、様々な「陰性分画」洗い流しを行った。この洗い流しは、磁気アセンブリ(704および801)を「オン」の位置にしたままでの高速の流量の空気または流体のスラッシュからなる。流された細胞は結合しないため、すべての細胞は、「陰性分画」として現れることが予測され、現れなかった細胞は「偽陽性」とみなされた。より標準的な捕捉シーケンス(5ml/分の捕捉流量、3分の待ち時間)を使用したにもかかわらず、擬陽性率は悪く(30%)、捕捉流量を速くし、待ち時間を減少させることで、約20%にまで低下した(図17)。さらに待ち時間の充分な減少、および捕捉流量の加速の両方を組み合わせ(条件5)、さらに40ml/分の空気の洗い流しを加える(条件7)ことで、擬陽性率を3%未満にまで低下させることができた(図17)。
実施例5-混合細胞集団の分離および精製
溶かしたヒト末梢血単核球(PBMC)をダイナビーズ(登録商標)に結合させ、陽性選択により不均一な細胞集団からCD3+細胞を選択した(ThermoFisher Scientific社より)。PBMC(10細胞/ml)は、最初にCD3抗体(5μl/10細胞、FlowComp(商標)ヒトCD3抗体、Invitrogen社)と2~8℃で10分間、インキュベートされた。次いでPBMCを、室温で傾斜させて揺り動かしながら15分間、FlowComp(商標)ダイナビーズ(15μl/10細胞、Invitrogen社)に結合させた。ビーズ結合細胞(5-10x10細胞/ml、1.5ml)を、様々なプロセスパラメーター(図18に記載される、流量、待ち時間、通過回数)を使用して、磁石アレイ704を通る分離チューブ701に流した。磁石に捕捉されなかった全ての細胞(CD3陰性細胞)は、廃液に送られ、特徴解析はなされなかった。磁石アレイ704を「オフ」の位置に回転させ、チューブ701に3回の洗い流しサイクルを行い、「陽性分画」を得た。この分画はビーズ結合したCD3+細胞からなる。上記の全ての工程は、2mM EDTAが補充された単離緩衝液中で実施された。
分離前分画および分離後分画(各ウェルに対し、300k個の細胞)に、生存度(0.031μl/100μl、Live/Dead(商標)Green、Invitrogen社)、CD3(5μl/100μl、PEマウス抗ヒトCD3、BD Biosciences社)、および一部の実験では、CD14(0.625μl/100μl、CD14モノクローナル抗体-パシフィックブルー、Invitrogen社)に関して蛍光染色を行い、フローアシスト細胞選別(FACS)を用いて分析して、得られた分画の表現型を評価した。最初に流された集団は、不均一であるが、主にCD3+であることが判明した(図18-黒線)。比較として、様々なプロセスパラメーターを、磁石アレイ704を使用して検証した。待ち時間を0分から2分に改変しても、アウトプット細胞の純度に限定された影響しかなかったことが観察された(図18A、Bおよび図18F、G)。しかし待ち時間をさらに5分に増やすと、細胞の純度が顕著に低下した(図18C、D)。流量も、3ml/分と10ml/分との間で細胞純度に対して限定された影響しかなかった(図18G、H)。細胞純度に対しての改善が最も大きいのは、プロセスに第二通過を加えることであり、純度が97.5%のCD3+細胞にまで改善された(図18E)。
実施例6-磁気ビーズ捕捉に対して、様々な大きさの磁石
様々な大きさ(1/8インチおよび1インチの長さ)の永久磁石(702および703)を使用して、磁石アレイ704を組み立てた。磁界の規模は、ガウスメーター(AlphaLab Inc.)を使用して、磁石からの様々な特定距離で測定した(図19A)。規模測定から、磁界勾配の推定が計算された(図19B)。最も強い勾配を生じさせるためには、磁石の長さを短くすることが望ましいことが判明した。しかし勾配が強くなると、長い磁石を用いるよりも急速に低下するため、磁石の有効範囲も減少してしまう。このことから、磁石アレイ704において様々な磁石サイズを使用して、例えば弱結合標的の短距離分離や、強結合標的の長距離分離などの様々な分離目的を実現することの可能性が示される。
細胞分離に対する磁石702および703のサイズの効果を検証するために、実施例2に記載されるように、Jurkat細胞を、BioLegend(登録商標)ナノビーズに結合させた。ビーズに結合した細胞(2.5x10細胞/ml、1.5ml)は、流量5ml/分、待ち時間5分で、分離チューブ701内で磁石アレイ704を通り過ぎて流された。非結合細胞は、12mlの単離緩衝液(98%PBS、2%FBS、2mM EDTA)を用いて5ml/分でチューブ701から洗い流された。アレイ704により生じた磁界を、チューブ701から取り除き、3回の洗い流しサイクル(実施例1に記載)を実施して、チューブから陽性分画を取り出した。この結果を、典型的な磁石アセンブリ(704および801)から得られた結果と比較した。1/8インチの長さの磁石702および703は、1インチの長さの磁石702および703と比較して、捕捉失敗を減少させることが観察された(図19C)。上記の工程はすべて、単離緩衝液を使用して実施された。
実施例7-弱結合性の生物学的標的の捕捉を促進するためのアドオン
弱結合標的/小ビーズの捕捉の容易さを変える、または改善する方法の1つは、実施例6に記載されるように、磁石アレイ704と分離チューブ701との間の距離を減少させ、チューブ701内で受ける平均磁界の規模および勾配を増加させることである。これを行うために、3/32インチの厚さのスペーサー1201を分離チューブ701とカセット1101との間に置いた。実施例2に記載されるようにBioLegend(登録商標)ナノビーズに結合したJurkat細胞(2.5~5x10細胞/ml、1.5ml)を、5ml/分の流量で分離チューブ701に流し、3分または5分間の待ち時間とさせた。その後、非捕捉細胞は、5ml/分で洗い流され(11~13ml)、3回の洗い流しサイクル(実施例1に記載)を実施して、捕捉細胞分画を収集した。スペーサー1201をこのセットアップに加えたことで得られた結果から、スペーサーを使用することで、捕捉失敗に関し、3分の待ち時間から、5分の待ち時間で得られるレベルにまで改善されたことが示された(図20A)。上記の工程はすべて、単離緩衝液を使用して実施された。
生物学的標的と磁界との間の距離を減少させるもう1つの方法は、磁化物体(1202-1208)を分離チューブ701に含めることである。磁石アレイ704により生じた磁界は、これら物体(1202-1208)により増幅されることができる。磁界勾配は、物体(1202-1208)の大きさに反比例し、有効範囲は物体(1202-1208)の大きさに比例する。これを示すために、常磁性メッシュ1202を分離チューブ701に加えた。Jurkat細胞(1.25x10細胞/ml)とMACS(登録商標)マイクロビーズ(20μl/10細胞、CD3 マイクロビーズ-ヒト、Miltenyi Biotec社)とを、細胞と、予め結合させたビーズとを一緒に15分間、4~8℃でインキュベートすることにより結合させた。結合後、細胞を、常磁性メッシュ1202を含む分離チューブ701に5ml/分で流しいれ(9x10細胞/ml、1.5ml)、5分間の待ち時間とした。非捕捉細胞は、12mlの単離緩衝液を用いて、5ml/分でチューブ701から洗い流された。磁石アレイ704をオフの位置に回転させ、3回の洗い流しサイクル(実施例1に記載)を行って、チューブ701から陽性捕捉された細胞を取り出した。メッシュ1202による非特異的捕捉を説明するために、結果を、ビーズ無し対照(マイクロビーズに結合していないJurkat)から得た結果(すべての捕捉が、メッシュ1202からの物理的拘束が原因である)に対して正規化した。常磁性メッシュを使用することで、ビーズ無しと比較して、ビーズ有りでは10%の細胞捕捉における相対的増加が生じた(図20B)。上記の工程は、2mM EDTAが補充された単離緩衝液中を使用して実施された。
再循環と磁界を利用した方法
本明細書に記載されるように、例示的実施形態において、生物学的サンプル内の標的を磁気分離する方法は、複数回(すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、10回など)の磁気分離サイクルを通じたサンプルの再循環を適切に利用している。そうした再循環によって、所望の標的の収率は劇的に増加する。
本明細書に記載される方法は、自動化細胞培養システムにおいて適切に実施され、一部の実施形態では、自動化細胞培養システム内のカセットにおいて実行することができる。図6は、カセット例を示し、図21は、自動化細胞培養システムの動線図における本カセットの配置を示す。図21に示されるように、自動化細胞培養システムは、細胞増殖チャンバー2102と、いくつかの流体経路2104、ならびに磁界源2106、ならびに試薬の投入場所2108を適切に含む。
図21は、再循環パス/ラインが図示される実施形態例を示し、この場合において、標的生物学的集団を含む生物学的サンプルは、再循環パス/ライン(太い線)を複数回循環する。各パスの間、サンプルは適切に磁界源2106(例えば、永久磁石または電磁石)による磁界勾配に曝露される。
本明細書に記載される方法は、生物学的サンプルの再循環を利用して標的生物学的集団を取り出しており、陽性選択法もしくは陰性選択法またはそれらの組み合わせに依拠し得る。
陽性選択方法
標的生物学的集団を単離および捕捉する陽性選択方法を利用する実施形態において、本明細書では、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法を提供するものであり、当該方法は、標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を、磁界勾配に曝露させること、循環工程と曝露工程とを1回以上反復すること、および当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を収集すること、を含む。追加の実施形態では、当該方法はさらに、結合磁気粒子から標的生物学的集団を取り出すことを含み得る。
そうした陽性選択方法は、サンプルから所望の標的集団を陽性選択するために磁界を利用した、生物学的サンプルからの標的生物学的集団の直接的な取り出しに依拠する。
本明細書において記載される場合、標的生物学的集団は適切に磁気粒子に結合される。磁気粒子を標的生物学的集団に結合させる方法が本明細書において記載され、当該方法は適切に抗体、タンパク質または核酸を使用する。本明細書において記載される場合、標的生物学的集団は適切に、1つ以上の細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよび/またはRNAを含む。例示的な実施形態では、標的生物学的集団は、T細胞の集団であり、適切には、所望の受容体を含んで産生されたT細胞の集団である。標的集団が取り出される生物学的サンプルは、所望ではない他の細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNA、RNAなど(すなわち非標的集団)も含み得る。
本明細書に記載される陽性選択方法に含まれ得る追加工程としては、生物学的サンプル(例えば、細胞集団)を洗浄する工程、磁気粒子を洗浄する工程、標的生物学的集団を細胞培養ゾーン(例えば、増殖チャンバー)に移す工程、および非標的生物学的集団を廃棄チャンバーに移し、最終的には自動化細胞培養システムから取り出される工程、が挙げられる。
生物学的サンプルは、例えば図21に記載される自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環される。複数の実施形態では、生物学的サンプルは、システムの投入場所2108において細胞培養物サンプルとして始まってもよく、または複数の実施形態では、細胞増殖チャンバー2102において細胞培養物サンプルとして始まってもよく、その後は抗体または他の剤を含有する磁気粒子が提供されるエリアに移され、磁気粒子が所望の標的集団(例えば、細胞)に結合する。この磁気粒子への結合は、当該システム内の増殖チャンバー2102、または任意の投入場所2108の中で発生してもよい。
その後、生物学的サンプルは、磁界2106の源を含む自動化細胞培養システムのセクションを通過し、その結果、磁気粒子に結合した標的生物学的集団は、磁界勾配に曝露される。この曝露の結果として、標的生物学的集団(例えば、所望の細胞集団)は、磁界の源に結合するようになり(例えば、分離チューブ701または他の類似デバイスの側に集まり)、すなわち、磁界を生成する磁界源に隣接する。この分離は、サンプルから標的生物学的集団(または標的生物学的集団の少なくとも一部)を引き出す。磁気粒子に結合した標的生物学的集団はその後、適切に収集される。標的生物学的集団の例示的な収集方法は、磁界への曝露後に標的生物学的集団を取り出し、洗浄することを含む。複数の実施形態では、標的生物学的集団は、気相の流体を循環させ、その後に液相の流体を1回以上、システムを通して循環させることにより収集される。適切には気相の流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む。さらなる実施形態では、液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む。
本明細書において記載される場合、複数回(すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、10回など)の磁気分離サイクルを通してサンプルを再循環させることで、サンプルから取り出される標的集団の量が増加することが判明した。ゆえに適切な実施形態では、自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して生物学的サンプルを循環させ、および磁気粒子に結合した標的生物学的集団が磁界勾配に曝露される、陽性選択方法の工程は、適切には2回以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10回以上)反復される。図21に示されるように、この循環は、適切には再循環サイクルを通して発生し、ここでサンプルは、標的集団に結合する磁界2106の源に隣接して通過し、その後、サンプルは再循環して、再度、磁界の源に隣接して通過して、前回の通過では捕捉され得なかった標的集団をさらに取り出し、その後、最終的には最終標的サンプルが収集される。このサイクルは、標的集団の目的が達成されるまで、または統計的もしくは他の手段を介して、追加サイクルはもう標的集団の収率および/または純度を劇的には増加させないことが判定されるまで、所望の回数を反復され得る。標的生物学的集団の収集後、当該方法は、適切には結合磁気粒子から標的生物学的集団を取り出すことを含み、それにより、標的集団はさらに、例えば本明細書に記載される様々な手段で処理され、または利用され得る。
追加の実施形態では、本明細書に記載される再循環方法は、磁気源(例えば、磁気を基にした方法において使用された分離チューブ)に結合された標的集団をリンスすること、その後、洗浄された標的集団を増殖チャンバーに移して、さらに処理および/または拡張させることを含み得る。これら捕捉、リンスおよび移送の要素は、その後、磁気的に結合した標的集団を含む別の生物学的サンプルで実行され得る。
複数の実施形態では、標的集団が曝露される磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される。永久磁石に利用され得る例示的な材料は本明細書に記載され、適切にはマグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、および/またはアルニコが挙げられる。本明細書に記載される場合、複数の実施形態では、永久磁石は、適切には直線アレイ、例えば図7Bの磁石アレイ704で構成される。
追加的な実施形態では、磁界勾配は、本明細書に記載される1つ以上の電磁石により提供される。
さらなる実施形態では、本明細書において、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集することを含む陽性選択方法が提供され、当該方法は、標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を、磁界勾配に曝露させて、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を捕捉すること、当該生物学的サンプルの非結合構成要素を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入し、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を放出させること、当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、生物学的サンプルを循環させる工程~標的生物学的集団を循環させる工程を1回以上反復すること、および当該磁気粒子に結合した標的生物学的集団を収集すること、を含む。追加の実施形態では、当該陽性選択方法はさらに、結合磁気粒子から標的生物学的集団を取り出すことを含み得る。
本明細書に記載される場合、当該陽性選択方法は、生物学的サンプルが、例えば分離チューブ701を通過する設計を利用する(例えば、図7Aに示される)。生物学的サンプル内で、標的生物学的集団は、磁気粒子に結合される。当該方法は適切には、生物学的サンプルを、分離チューブ701および磁気源の前の、または分離チューブ701および磁気源を含む、1つ以上の流体経路を通して循環させることを含む。磁気粒子に結合された標的生物学的集団は、適切には、磁気粒子に結合された標的生物学的集団を捕捉する磁界勾配に曝露される(そして適切には、この磁界を通って1回以上再循環される)。例えば、図8に示されるように、生物学的サンプルは、分離チューブ701を通過し、結合磁気粒子および標的サンプルは、磁界によってチューブの側面に捕捉される(図24D~24Eも参照のこと)。
その後、生物学的サンプル中の非結合構成要素(すなわち、所望ではない細胞、タンパク質、DNA、または他の構造物)は、1つ以上の流体経路を通って循環し、分離チューブ701から取り出される。
その後、適切には磁界シールド/バリアが、磁気粒子に結合された標的生物学的集団と磁界との間に挿入され、磁気粒子に結合された標的生物学的集団が、磁石から放出される。その後、磁気粒子に結合された標的生物学的集団は、自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通って循環し、例えば自動細胞操作システムの分離エリアにおいて収集される。標的生物学的集団を収集するための様々な方法が本明細書に記載される。
適切には、生物学的サンプルを循環させる工程、当該サンプル(および磁気粒子に結合された標的生物学的集団)を曝露する工程、標的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入する工程、そして標的生物学的集団の収集が、1回以上(適切には2回以上、3回以上、4回以上、5回以上など)繰り返される。このサイクルを通すことで毎回、標的生物学的製剤の収率は増加する。本明細書において記載される場合、その後、標的生物学的集団は適切に結合した磁気粒子から取り出される。
本明細書において記載される場合、標的生物学的集団は適切に、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよび/またはRNAのうちの1つ以上を含み、複数の実施形態では、T細胞を含む。磁気粒子を標的生物学的集団に結合させるための方法および化合物が本明細書において記載され、それらは適切に抗体、タンパク質または核酸の使用を含む。
例示的な磁界が本明細書に記載され、磁界は適切に、永久磁石または電磁石により生成される。永久磁石の作製において使用される材料は本明細書に記載されており、例えば、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、および/またはアルニコが挙げられる。複数の実施形態では、永久磁石は直線アレイで構成される。電磁石が利用される実施形態では、磁界シールド/バリアの挿入は、電磁石をオフにすることと置き換えられることができ、例えば、単純に電磁石から電流を除去し、磁界を停止させることと置き換えられることができる。
本明細書全体を通じて記載されるように、複数の実施形態では、磁界シールド/バリアは適切に、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む。本明細書に記載されるように、複数の実施形態では、磁界シールド/バリアは回転して、磁気粒子に結合された標的生物学的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入する。そうした実施形態は、図8、9、および10A~10Bに図解され、本明細書に詳細に記載される。
陰性選択方法
標的生物学的集団に対して陰性選択方法を利用する実施形態において、本明細書では、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法を提供するものであり、当該方法は、非標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を、磁界勾配に曝露させること、循環工程から曝露工程を1回以上反復すること、および標的生物学的集団を収集すること、を含む。当該方法はさらに、廃棄物として適切に除去するために、非標的生物学的集団を収集することもさらに含み得る。
本明細書において使用される場合、陰性選択方法は、「非標的生物学的サンプル」への磁気粒子の結合を利用しており、非標的生物学的サンプルとは、「標的生物学的集団」に含まれない1つ以上の細胞、タンパク質、DNA、RNAを指し、ゆえに標的生物学的集団を後に残すために生物学的サンプルから取り除かれようとされる。そうした陰性選択方法では、磁気分離を使用して非標的生物学的集団が分離され、サンプルから残りの標的生物学的集団が収集される。
本明細書において記載される場合、非標的生物学的集団は適切に磁気粒子に結合される。磁気粒子を非標的生物学的集団に結合させる方法が本明細書において記載され、当該方法は適切に抗体、タンパク質または核酸を使用する。本明細書において記載される場合、非標的生物学的集団は適切に、1つ以上の細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよび/またはRNAを含む。例示的な実施形態では、標的生物学的集団は、T細胞、適切には望ましい受容体を含むように産生されたT細胞の集団であり、一方で非標的生物学的集団は、標的集団を後に残すために取り除かれるサンプル中の任意の他の細胞、タンパク質などを含む。標的集団が取り出される生物学的サンプルは、所望ではない他の細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNA、RNAなども含み得る。
生物学的サンプルは、例えば図21に記載される自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環される。複数の実施形態では、生物学的サンプルは、投入場所2108において、または細胞増殖チャンバー2102において、またはシステム内の他の場所において、細胞培養物サンプルとして始まってもよく、その後は抗体または他の剤を含有する磁気粒子が提供されるエリアに移され、磁気粒子が所望ではない非標的集団(例えば、所望ではない細胞、タンパク質、DNAなど)に結合する。この磁気粒子への結合は、増殖チャンバー内で、投入場所2108で、または当該システム内の他のチャンバー内で発生してもよい。
その後、生物学的サンプルは、磁界2106の源を含む自動化細胞培養システムのセクションを通過し、その結果、磁気粒子に結合した非標的生物学的集団は、磁界勾配に曝露される(標的生物学的集団も曝露されるが、磁界とは反応しない)。この曝露の結果として、非標的生物学的集団(例えば、所望ではない細胞、タンパク質などの集団)は、磁界の源に結合するようになり(例えば、分離チューブ701または他の類似デバイスの側に集まり)、すなわち、磁界に隣接する。この分離は、サンプルから非標的生物学的集団(または非標的生物学的集団の少なくとも一部)を引き出す。磁気粒子に結合していない標的生物学的集団はその後、適切に収集される。標的生物学的集団の例示的な収集方法は、磁界への曝露後にサンプルから標的生物学的集団をろ過し、取り出し、洗浄すること(ゆえに、非標的生物学的集団の除去)を含む。
複数の実施形態では、標的生物学的集団は、気相の流体を循環させ、その後に液相の流体を1回以上、システムを通して循環させることにより収集される。適切には気相の流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む。さらなる実施形態では、液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む。
本明細書において記載される場合、複数回(すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、10回など)の磁気分離サイクルを通してサンプルを再循環させることで、サンプルから取り出される標的集団の量および/または純度が増加することが判明した。ゆえに適切な実施形態では、自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して生物学的サンプルを循環させ、磁気粒子に結合した非標的生物学的集団が磁界勾配に曝露され、標的生物学的集団が収集される陰性選択方法の工程は、適切には2回以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10回以上)反復される。図21に示されるように、この循環は、適切には再循環サイクルを通して発生し、ここでサンプルは、非標的集団に結合する磁界2106の源に隣接して通過して標的集団が収集され、その後、サンプルは再循環されて、再度、磁界の源に隣接して通過して、前回の通過では捕捉され得なかった非標的集団がさらに除去される。このサイクルは、標的集団の目的が達成されるまで、または統計的もしくは他の手段を介して、追加サイクルはもう標的集団の収率および/または純度を劇的には増加させないことが判定されるまで、所望の回数を反復され得る。標的生物学的集団の収集後、当該方法は、適切には本明細書に記載される様々な手段で標的生物学的集団を処理し、ろ過し、または利用することをさらに含む。
複数の実施形態では、非標的集団が曝露される磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される。永久磁石に利用され得る例示的な材料は本明細書に記載され、適切にはマグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、および/またはアルニコが挙げられる。本明細書に記載される場合、複数の実施形態では、永久磁石は、適切には直線アレイ、例えば図7Bの磁石アレイ704で構成される。
追加的な実施形態では、磁界勾配は、本明細書に記載される1つ以上の電磁石により提供される。
更なる実施形態において、生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集することを含む陰性選択方法が本明細書で提供され、当該方法は、非標的生物学的集団を磁気粒子に結合させること、当該生物学的サンプルを、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を磁界勾配に曝露させて、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を捕捉すること、当該生物学的サンプルの標的生物学的集団を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入し、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を放出させること、当該磁気粒子に結合した非標的生物学的集団を、当該自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること、生物学的サンプルの収集工程から標的生物学的集団の収集工程を1回以上反復すること、および当該標的生物学的集団を収集すること、を含む。
本明細書に記載される場合、当該陰性選択方法は、標的生物学的集団の収集;生物学的サンプルが、例えば分離チューブ701を通過する設計を利用する(例えば、図7Aに示される)。生物学的サンプル内で、非標的生物学的集団は、磁気粒子に結合される。当該方法は適切には、生物学的サンプルを、分離チューブ701の前の、または分離チューブ701を含む、1つ以上の流体経路を通して循環させることを含む。磁気粒子に結合された非標的生物学的集団は、適切には、磁気粒子に結合された非標的生物学的集団を捕捉する磁界勾配に曝露される。例えば、図8に示されるように、生物学的サンプルは、分離チューブ701を通過し、結合磁気粒子および非標的サンプルは、磁界によってチューブの側面に捕捉される(図24D~24Eも参照のこと)。
生物学的サンプル中の非結合構成要素(すなわち、T細胞を含む望ましい細胞、タンパク質、DNAまたは他の構造物を含む標的生物学的集団)はその後、1つ以上の流体経路を通って循環し、例えば自動細胞操作システムの分離エリアにおいて適切にろ過または他のメカニズムにより収集される。
その後、適切には磁界シールド/バリアが、磁気粒子に結合された非標的生物学的集団と磁界との間に挿入され、磁気粒子に結合された非標的生物学的集団が、磁石から放出される。その後、磁気粒子に結合された非標的生物学的集団は、自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通って循環する。
適切には、生物学的サンプルを循環させる工程、当該サンプル(および磁気粒子に結合された非標的生物学的集団)を曝露する工程、非標的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入する工程、そして標的生物学的集団の収集が、1回以上(適切には2回以上、3回以上、4回以上、5回以上など)繰り返される。このリサイクルを通じて毎回、標的生物学的製剤の収率および/または純度が増加し、それによって、益々多くの非標的生物学的集団の除去、ならびにより多くの望ましい標的生物学的製剤の分離および収集が可能となる。
本明細書に記載される陰性選択方法に含まれ得る追加工程としては、生物学的サンプル(例えば、細胞集団)を洗浄する工程、磁気粒子を洗浄する工程、標的生物学的集団を細胞培養ゾーン(例えば、増殖チャンバー)に移す工程、および非標的生物学的集団を廃棄チャンバーに移し、最終的には自動化細胞培養システムから取り出される工程、が挙げられる。
本明細書に記載されるように、適切には、非標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよび/またはRNAのうちの1つ以上を含み、複数の実施形態では、標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよび/またはRNAのうちの1つ以上を含み、適切にはT細胞を含む。磁気粒子を非標的生物学的集団に結合させるための方法および化合物が本明細書において記載され、それらは適切に抗体、タンパク質または核酸の使用を含む。
例示的な磁界が本明細書に記載され、磁界は適切に、永久磁石または電磁石により生成される。永久磁石の作製において使用される材料は本明細書に記載されており、例えば、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、および/またはアルニコが挙げられる。複数の実施形態では、永久磁石は直線アレイで構成される。電磁石が利用される実施形態では、磁界シールド/バリアの挿入は、電磁石をオフにすることと置き換えられることができ、例えば、単純に電磁石から電流を除去し、磁界を停止させることと置き換えられることができる。
本明細書全体を通じて記載されるように、複数の実施形態では、磁界シールド/バリアは適切に、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む。本明細書に記載されるように、複数の実施形態では、磁界シールド/バリアは回転して、磁気粒子に結合された非標的生物学的集団と磁界との間に磁界シールド/バリアを挿入する。そうした実施形態は、図8、9、および10A~10Bに図解され、本明細書に詳細に記載される。
さらなる実施形態では、本明細書において、自動化細胞培養システムにおいて磁気粒子を洗浄および回収する方法が提供される。
適切には、当該方法は、a.自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して磁気粒子を循環させる工程、b.磁気粒子を磁界勾配に曝露して、磁気粒子を捕捉する工程、c.気体流体相、次いで液体流体相を適用することにより、磁気粒子を収集する工程、d.自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して磁気粒子を循環させる工程、およびe.c~dの工程を1回以上(例えば、2回以上、3回以上、4回以上、5回以上、6回以上、7回以上、8回以上、9回以上、10回以上)繰り返す工程、を含む。
本明細書に記載されるように、複数の実施形態では、磁気粒子は標的生物学的集団に結合され、結合は、適切には抗体、タンパク質または核酸を介して発生する。
追加的実施形態では、磁気粒子は非標的生物学的集団に結合され、抗体、タンパク質または核酸を介した結合を含む。
例示的な非標的生物学的集団および標的生物学的集団が本明細書において記載され、適切には標的集団は、T細胞を含む、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちのいずれか1つ以上である。
複数の実施形態では、磁界勾配は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む永久磁石をはじめとする、1つ以上の永久磁石により提供される。永久磁石は、本明細書に記載されるように、直線アレイで構成されてもよい。追加的な実施形態では、磁界勾配は、電磁石により提供される。
適切には、本明細書に記載されるように、磁界シールド/バリアは、磁気粒子と磁界との間に挿入され、磁界を遮断することにより磁気粒子の収集が可能となり、磁気源に結合した磁気粒子が放出される。磁界シールド/バリアでの使用に関し例示的な物質としては、高い透磁性および磁気飽和性の物質が挙げられる。電磁石が利用される実施形態では、1つ以上の電磁石から電流を除去してもよく、単純に電磁石の源が遮断されることで、磁気粒子の収集が可能となる。
当該方法で利用され得る気相流体の例としては、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上が挙げられる。使用され得る液相流体の例としては、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上が挙げられる。
ビーズ回収方法
複数回の磁気分離を含む、陰性選択方法および陽性選択方法、ならびに磁気粒子の回収のデータ
図22A~22Dは、標的細胞(精製細胞)と廃棄細胞(非標的集団)の両方への磁気粒子の結合を示す。図示されるように、試薬量の最適化を利用する「改善プロセス」は、磁気粒子と廃棄細胞(陰性選択の非標的集団)との間の高い結合と、低い「偽陰性」を示している。
図23A~23Bは、細胞からの磁気粒子の放出を示す。図示されるように、図23Aにおいて、自動化細胞培養システム(COCOON)で利用される結合メカニズムは、対照と同様のビーズ-細胞の放出を示しており、陽性選択方法による細胞(または他の標的生物学的集団)の回収の能力が図示されている。図23Bは、自動化細胞培養システムを使用した放出とビーズ除去の後に、標的細胞の中に残存しているビーズの割合を示している。
複数回の磁気分離(すなわち、自動化細胞培養システムを通してサンプルを再循環させ、磁界に2回、3回、4回、5回と曝露させること)を行うことの利益を判定するために、磁石への曝露時間を増加させ、流量を低下させることから判断する実験を実施した。図24Aに示されるように、磁石曝露時間を増加させる(左から右)と、捕捉される結合細胞の割合が約65%から少なくとも90%に増加し、対照と同等であった。同様に、図24Bにおいて流量を低下させる(右から左)と、捕捉される結合細胞が約60%から約85%に増加し、対照と同様であった。
以下の表1は、本明細書に記載される磁気分離法を使用した複数回の通過を行うことで、確保される結合細胞と全体的な細胞収率との両方において増加が得られたことを示している。
図24Cは、捕捉された生物学的サンプルを分離ラインから放出する流体の洗い流しのサイクル数の影響を示しており、最初の2回のフラッシュの後に多く回収されていることが図示されている。
図24D~24Eは、分離チューブにおける、磁界を使用した磁気粒子結合細胞の捕捉(上)と、磁界をオフにして複数サイクルの流体の洗い流し(図24Cに示されるとおり)を行った後の細胞の放出(下)を示しており、本明細書に記載される方法の有効性を示している。
図25A~25Fにおいて、陽性選択法および陰性選択法における、標的生物学的集団(細胞)の高レベルな精製を示しており、陽性選択法および陰性選択法の両方について、本明細書に記載される自動化細胞培養システム(COCOON)と対照との間で同様の回収であったことを示している。図25G~25Iは、陰性選択を使用した細胞の精製を示しており、再循環ラインを使用して複数回の通過を実施することによる純度の改善を示している。CD3+CD14+集団は、所望ではないビーズ結合単球-T細胞凝集体である。図25J~25Lは、陰性選択プロセスを使用した、集団精製を示す。複数回の通過を行うことで、望ましくないビーズ結合細胞の除去に成功した(白色の円で強調されている)。
図26A~26Cは、本明細書に記載される自動化細胞培養システムにおける磁気分離の利点を示す。図26Aは、プロセス期間の大幅な短縮を示し、図26Bは、細胞ロスの低下を示し、図26Cは、バッグおよび培養管ベースの対照と比較した、体積ロスの低下を示す。図26Dは、陽性選択プロセスを使用した、集団精製を示す。再循環ラインを通る複数回の通過で、単回通過と比較して細胞収率が改善されている。
図27A~27Bは、本明細書に記載される自動化細胞培養システムにおける洗浄後の磁気粒子の回収能力を示す。典型的な手で行うプロセスと比較して、図27Aは、絶対回収量に対する分離チューブ701の連続リンスの影響を示し、図27Bは、累積的な粒子回収率に対する分離チューブ701の連続的リンスの影響を示している。
本発明の様々な実施形態および/または実施例に関する記載は、解説の目的で提示されており、包括的である、または開示されている実施形態および/または実施例に限定されることは意図されていない。多くの改変およびバリエーションが、記載される実施形態の主旨および範囲から逸脱することなく当業者には明白であろう。本明細書において使用される専門用語は、実施形態の主旨、実際の適用、または産業界に存在する技術に対する技術的改善を最もよく説明するために選択され、または当業者以外の他者が本明細書に開示される実施形態を理解できるように選択された。
本発明の好適な実施形態は以下の通りである。
〔1〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法であって、
a.上記標的生物学的集団を、磁気粒子に結合させること;
b.上記生物学的サンプルを、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
c.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を磁界勾配に曝露すること;
d.工程b~cを1回以上反復すること;および
e.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を収集すること、を含む方法。
〔2〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちの1つ以上を含む、〔1〕に記載の方法。
〔3〕
上記標的生物学的集団は、T細胞を含む、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕
磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記標的生物学的集団に結合される、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕
上記磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔5〕に記載の方法。
〔7〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔5〕~〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔8〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供される、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕
工程b~cは、少なくとも2回反復される、〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕
上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団は、気相流体、続いて液相流体を1回以上循環することにより収集される、〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔11〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔10〕に記載の方法。
〔12〕
上記液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔10〕に記載の方法。
〔13〕
上記結合された磁気粒子から、上記標的生物学的集団を取り出すことをさらに含む、〔1〕~〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法であって、
a.上記標的生物学的集団を、磁気粒子に結合させること;
b.上記生物学的サンプルを、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
c.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を磁界勾配に曝露して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を捕捉すること;
d.上記生物学的サンプルの非結合構成要素を、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
e.磁界シールド/バリアを、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団と磁界との間に挿入して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を放出させること;
f.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
g.工程b~fを1回以上反復すること;および
h.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を収集すること、を含む方法。
〔15〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちの1つ以上を含む、〔14〕に記載の方法。
〔16〕
上記標的生物学的集団は、T細胞を含む、〔14〕または〔15〕に記載の方法。
〔17〕
磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記標的生物学的集団に結合される、〔14〕~〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔18〕
磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔14〕~〔17〕のいずれかに記載の方法。
〔19〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔18〕に記載の方法。
〔20〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔17〕~〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔21〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供され、任意で工程eの挿入する工程は、上記1つ以上の電磁石から電流を除去する工程に置き換えられる、〔14〕~〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔22〕
工程b~fは、少なくとも2回反復される、〔14〕~〔21〕のいずれかに記載の方法。
〔23〕
上記磁界シールド/バリアは、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む、〔14〕~〔22〕のいずれかに記載の方法。
〔24〕
上記磁界シールド/バリアは回転して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団と上記磁界との間に上記磁界シールド/バリアを挿入する、〔14〕~〔23〕のいずれかに記載の方法。
〔25〕
上記標的生物学的集団は、気相流体、続いて液相流体を1回以上循環することにより収集される、〔14〕~〔24〕のいずれかに記載の方法。
〔26〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔25〕に記載の方法。
〔27〕
上記液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔25〕に記載の方法。
〔28〕
上記結合された磁気粒子から、上記標的生物学的集団を取り出すことをさらに含む、〔14〕~27〕のいずれかに記載の方法。
〔29〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法であって、
a.非標的生物学的集団を、磁気粒子に結合させること;
b.上記生物学的サンプルを、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
c.上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を磁界勾配に曝露すること;
d.工程b~cを1回以上反復すること;および
e.上記標的生物学的集団を収集すること、を含む方法。
〔30〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちの1つ以上を含む、〔29〕に記載の方法。
〔31〕
上記標的生物学的集団は、T細胞を含む、〔29〕または〔30〕に記載の方法。
〔32〕
上記非標的生物学的集団が収集される、〔29〕~〔31〕のいずれかに記載の方法。
〔33〕
磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記非標的生物学的集団に結合される、〔29〕~〔32〕のいずれかに記載の方法。
〔34〕
磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔29〕~〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔35〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔34〕に記載の方法。
〔36〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔34〕~〔35〕のいずれかに記載の方法。
〔37〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供される、〔29〕~〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔38〕
工程b~cは、少なくとも2回反復される、〔29〕~〔37〕のいずれかに記載の方法。
〔39〕
上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団は、気相流体、続いて液相流体を1回以上循環することにより収集される、〔29〕~〔38〕のいずれかに記載の方法。
〔40〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔39〕に記載の方法。
〔41〕
上記液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔39〕に記載の方法。
〔42〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法であって、
a.非標的生物学的集団を、磁気粒子に結合させること;
b.上記生物学的サンプルを、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
c.上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を磁界勾配に曝露して、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を捕捉すること;
d.上記生物学的サンプルの上記標的を、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
e.磁界シールド/バリアを、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団と磁界との間に挿入して、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を放出させること;
f.上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;および
g.工程b~fを1回以上反復すること;および
h.上記標的生物学的集団を収集すること、を含む方法。
〔43〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちの1つ以上を含む、〔42〕に記載の方法。
〔44〕
上記標的生物学的集団は、T細胞を含む、〔42〕または〔43〕に記載の方法。
〔45〕
上記非標的生物学的集団が収集される、〔42〕~〔44〕のいずれかに記載の方法。
〔46〕
磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記標的生物学的集団に結合される、〔42〕~〔45〕のいずれかに記載の方法。
〔47〕
磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔42〕~〔46〕のいずれかに記載の方法。
〔48〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔47〕に記載の方法。
〔49〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔47〕~〔48〕のいずれかに記載の方法。
〔50〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供され、任意でeの挿入する工程は、上記1つ以上の電磁石から電流を除去する工程に置き換えられる、〔42〕~〔46〕のいずれかに記載の方法。
〔51〕
工程b~fは、少なくとも2回反復される、〔42〕~〔50〕のいずれかに記載の方法。
〔52〕
上記磁界シールド/バリアは、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む、〔42〕~〔51〕のいずれかに記載の方法。
〔53〕
上記磁界シールド/バリアは回転して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団と上記磁界との間に上記磁界シールド/バリアを挿入する、〔42〕~51〕のいずれかに記載の方法。
〔54〕
上記標的生物学的集団は、気相流体の後に液相流体を1回以上循環することにより収集される、〔42〕~〔53〕のいずれかに記載の方法。
〔55〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔54〕に記載の方法。
〔56〕
上記液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔54〕に記載の方法。
〔57〕
自動化細胞培養システムにおいて磁気粒子を洗浄および回収する方法であって、
a.上記磁気粒子を、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;
b.上記磁気粒子を、磁界勾配に曝露して、上記磁気粒子を捕捉すること;
c.上記磁気粒子を、気体流体相、次いで液体流体相を適用することにより収集すること;
d.上記磁気粒子を、上記自動化細胞培養システムの1つ以上の流体経路を通して循環させること;および
e.工程c~dを1回以上反復すること、を含む方法。
〔58〕
上記磁気粒子が、標的生物学的集団に結合される、〔57〕に記載の方法。
〔59〕
上記磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記標的生物学的集団に結合される、〔58〕に記載の方法。
〔60〕
上記磁気粒子が、非標的生物学的集団に結合される、〔57〕に記載の方法。
〔61〕
上記磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記非標的生物学的集団に結合される、〔60〕に記載の方法。
〔62〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうち〕のいずれか1つ以上である、〔58〕~〔59〕のいずれかに記載の方法。
〔63〕
上記標的生物学的集団は、T細胞である、〔62〕に記載の方法。
〔64〕
上記磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔57〕~〔63〕のいずれかに記載の方法。
〔65〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔64〕に記載の方法。
〔66〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔64〕~〔65〕のいずれかに記載の方法。
〔67〕
磁界シールド/バリアが、上記磁気粒子と上記磁界との間に挿入され、上記磁気粒子の収集を可能にする、〔57〕~〔67〕のいずれかに記載の方法。
〔68〕
上記磁界シールド/バリアは、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む、〔67〕に記載の方法。
〔69〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供される、〔57〕に記載の方法。
〔70〕
電流が上記1つ以上の電磁石から除去され、上記磁気粒子の収集が可能となる、〔69〕に記載の方法。
〔71〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔57〕~〔70〕のいずれかに記載の方法。
〔72〕
上記液相流体は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔57〕~〔71〕のいずれかに記載の方法。
〔73〕
工程c~dは、少なくとも2回反復される、〔57〕~〔72〕のいずれかに記載の方法。
〔74〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を磁気分離および収集するためのシステムであって、
a.磁界源;
b.上記磁界源と位置合わせされた、上記生物学的サンプルを流すための分離チューブ;
c.上記磁界源と上記分離チューブとの間に配置されるよう構成された磁界シールド/バリア;および
d.上記磁界源と上記分離チューブとの間に上記磁界シールド/バリアを挿入するための装置、を備えるシステム。
〔75〕
上記システムは、自動化細胞培養システムの一部である、〔74〕に記載のシステム。
〔76〕
上記磁界シールド/バリアは、高い透磁性および磁気飽和性を伴う物質である、〔74〕または〔75〕に記載のシステム。
〔77〕
上記高い透磁性および磁気飽和性を伴う物質は、鉄、鉄合金、フェライト鋼、Hiperco-50からなる群から選択される、〔76〕に記載のシステム。
〔78〕
上記磁界源は、1つ以上の永久磁石を含む、〔74〕~〔77〕のいずれかに記載のシステム。
〔79〕
上記永久磁石は、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔78〕に記載のシステム。
〔80〕
上記磁界源は、直線アレイで構成された複数の永久磁石を含む、〔74〕~〔78〕のいずれかに記載のシステム。
〔81〕
上記直線アレイ中の上記複数の永久磁石は、上記直線アレイの軸に対して垂直な反対極の方向で配置される、〔80〕に記載のシステム。
〔82〕
挿入のための上記装置は、上記磁界源と上記分離チューブとの間で上記磁界シールド/バリアを回転させるための装置である、〔74〕~〔80〕のいずれかに記載のシステム。
〔83〕
上記回転のための装置は、ソフトウェアにより制御される電気-機械式ドライブアセンブリである、〔82〕に記載のシステム。
〔84〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法であって、
a.上記標的生物学的集団を、磁気粒子に結合させること;
b.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を磁界勾配に曝露して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を捕捉すること;
c.上記生物学的サンプルの非結合集団を取り出すこと;
d.磁界シールド/バリアを、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団と磁界との間に挿入して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を放出させること;および
e.上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団を収集すること、を含む方法。
〔85〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちの1つ以上を含む、〔84〕に記載の方法。
〔86〕
上記標的生物学的集団は、T細胞を含む、〔84〕または〔85〕に記載の方法。
〔87〕
磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記標的生物学的集団に結合される、〔84〕~〔86〕のいずれかに記載の方法。
〔88〕
磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔84〕~〔87〕のいずれかに記載の方法。
〔89〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔88〕に記載の方法。
〔90〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔84〕~〔89〕のいずれかに記載の方法。
〔91〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供され、任意で工程dの挿入する工程は、上記1つ以上の電磁石から電流を除去する工程に置き換えられる、〔84~90〕のいずれかに記載の方法。
〔92〕
上記磁界シールド/バリアは、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む、〔84〕~〔91〕のいずれかに記載の方法。
〔93〕
上記磁界シールド/バリアは回転して、上記磁気粒子に結合された上記標的生物学的集団と上記磁界との間に上記磁界シールド/バリアを挿入する、〔84〕~〔92〕のいずれかに記載の方法。
〔94〕
上記標的生物学的集団は、気相流体、続いて液相流体を1回以上循環することにより収集される、〔84〕~〔93〕のいずれかに記載の方法。
〔95〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔94〕に記載の方法。
〔96〕
上記液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔94〕に記載の方法。
〔97〕
上記結合された磁気粒子から、上記標的生物学的集団を取り出すことをさらに含む、〔84〕~〔96〕のいずれかに記載の方法。
〔98〕
生物学的サンプルから標的生物学的集団を、自動化細胞培養システムにおいて収集する方法であって、
a.非標的生物学的集団を、磁気粒子に結合させること;
b.上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を磁界勾配に曝露して、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を捕捉すること;
c.上記標的生物学的集団を収集すること;および
d.磁界シールド/バリアを、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団と磁界との間に挿入して、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団を放出させること、を含む方法。
〔99〕
上記標的生物学的集団は、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、DNAおよびRNAのうちの1つ以上を含む、〔98〕に記載の方法。
〔100〕
上記標的生物学的集団は、T細胞を含む、〔98〕または〔99〕に記載の方法。
〔101〕
磁気粒子は、抗体、タンパク質または核酸を介して、上記非標的生物学的集団に結合される、〔98〕~〔100〕のいずれかに記載の方法。
〔102〕
磁界勾配は、1つ以上の永久磁石により提供される、〔98〕~〔101〕のいずれかに記載の方法。
〔103〕
上記永久磁石は、マグネタイト、ネオジム、サマリウム-コバルト、またはアルニコを含む、〔102〕に記載の方法。
〔104〕
上記永久磁石は、直線アレイで構成される、〔102〕~〔103〕のいずれかに記載の方法。
〔105〕
上記磁界勾配は、1つ以上の電磁石により提供され、任意でdの挿入する工程は、上記1つ以上の電磁石から電流を除去する工程に置き換えられる、〔98〕~〔101〕のいずれかに記載の方法。
〔106〕
上記磁界シールド/バリアは、高い透磁性および磁気飽和性の物質を含む、〔98〕~〔105〕のいずれかに記載の方法。
〔107〕
上記磁界シールド/バリアは回転して、上記磁気粒子に結合された上記非標的生物学的集団と上記磁界との間に上記磁界シールド/バリアを挿入する、〔98〕~〔106〕のいずれかに記載の方法。
〔108〕
上記標的生物学的集団は、気相流体、続いて液相流体を1回以上循環することにより収集される、〔98〕~〔107〕のいずれかに記載の方法。
〔109〕
上記気相流体は、空気、窒素、酸素および二酸化炭素のうちの1つ以上を含む、〔108〕に記載の方法。
〔110〕
上記液相は、水、緩衝生理食塩水、培養培地、動物血清、キレート剤および酵素のうちの1つ以上を含む、〔108〕に記載の方法。

Claims (1)

  1. 実質的に明細書に記載された発明。

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