KR20110025975A

KR20110025975A - 세포, 병원체 또는 바이러스의 제거를 위한 초상자성 나노입자

Info

Publication number: KR20110025975A
Application number: KR1020117001104A
Authority: KR
Inventors: 종주 존 장; 케네스 에드워드 스카베리; 에른 베스 디커슨; 존 프란시스 맥도날드
Original assignee: 조지아 테크 리서치 코오포레이션
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2011-03-14
Also published as: EP2303463A4; AU2009260042A1; WO2009155384A1; EP2303463A1; CA2728270A1; JP2011526799A; US20110098623A1

Abstract

본 발명은 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 처치 대상자로부터 선택적으로 제거하는 신체 밖 또는 생체내 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 장치는 신체 밖 순환장치를 포함하고, 상기 신체 밖 순환장치는 적어도 자석, 및 제거가능하고 자성 나노물질을 포획할 수 있는 자화가능한 기질을 포함하는 자성 필터와, 상기 자성 필터와는 유체가 연통되어 있고 상기 신체 밖 순환장치를 통해 유체를 이동시키는 펌프를 포함한다. 기능화된 초상자성 나노입자는 환자로부터의 생물학적 유체와 생체외에서 혼합되거나 환자에게 주입되어, 표적 세포, 병원체 또는 바이러스와 복합체를 형성하고, 자유로운 나노입자는 자성 필터 내에서 생물학적 유체로부터 포획된다. 선택적으로, 상기 기능화된 나노입자는 치료제를 포함하고 전달한다. 일실시예에서, 상기 치료제는 상기 나노입자가 표적 세포, 병원체 또는 바이러스와 결합할 때 방출된다.

Description

세포, 병원체 또는 바이러스의 제거를 위한 초상자성 나노입자 {SUPERPARAMAGNETIC NANOPARTICLES FOR REMOVAL OF CELLS, PATHOGENS OR VIRUSES}

본 출원은 미국특허 가출원 제61/073,161호(2008. 6. 17. 출원) 및 미국특허 가출원 제61/073,973호(2008. 6. 19. 출원)에 대한 우선권을 주장하는 출원이다.

본 발명은 자성 나노입자의 이용 및 제거를 위한 장치 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암치료를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

모든 유형의 암은 미국에서 2번째 사망원인이 되는 질환이다. 대부분 암의 사망률은 종종 1차 종양에서 떨어져 나간 세포의 전이(metastatic dissemination)와 관련된다. 개선된 화학적 치료법 및 방사선 치료법이 건강한 세포에 대한 부수적인 손상을 줄이고 있지만, 표적화된 치료방식은 암치료에 있어 큰 시장으로 존재하고 있다. 종양 덩어리의 외과적 제거 후 남아 있는 세포 또는 전이 세포가 환자로부터 보다 효과적으로 제거될 수 있다면 장기간 생존율은 유의적으로 연장될 수 있을 것이다.

복부내 장기에 발생하는 암(이하, 복부 장기암)(Abdominal cancer)은 암을 갖고 현재 생존하고 있는 1,000만명 이상의 환자의 40%를 차지하고 매년 새롭게 25만명 이상의 복부 장기암 환자가 진단되고 있다. 이들 중 대부분이 말기에서 검사되어 외과적 수술이 바람직한데, 특히 종양이 외과적으로 접근가능하고 시술과정에서 부수적인 손상 위험이 적은 경우에 추천되는 치료 방법이다. 그러나, 종종 수술과정에서 악성 세포들이 자유로운 상태로 떨어져 나가고 복막강(peritoneal cavity)안에 남게 된다. 이어지는 종양에 대한 외과적 추출, 화학적 치료법이 잔존하는 악성 세포를 죽이기 위해 전형적으로 추천되지만 화학적 치료법은 완벽하게 효과적이지 못하다.

대부분의 난소암 재발은 복부 내 2차 영역(장막, 간 등)으로의 자유롭게 떠다니는 암세포들의 전이의 결과이다. 암 덩어리의 외과적인 제거 후 남아 있는 세포들이 환자로부터 보다 효과적으로 제거될 수 있다면 수술 후 난소암 및 다른 암을 처치하는데 요구되는 예후 관리(prognosis) 및 치료법은 상당히 개선될 수 있을 것이다.

현재 가능한 암 치료법은 많은 단점들이 있다. 표적성을 향상시킬 수 있고 건강한 세포에 대해서는 부수적인 손상을 줄이며 궁극적으로는 환자에 대한 장기간 의 예후 관리를 개선시킬 수 있는 치료적 접근에 대한 요구가 있다.

아직 충분히 고려되지 않은 다른 분야로는 나노입자로서 치료를 위한 순환이 완료된 후 체내에서 나노입자를 제거하는 것이다. 최근 대부분의 제안된 치료과정은 사실상 외과적 수술이고 매우 침습적이다. 최소한의 침습적인 기술은 바이오메디컬 치료과정에서 나노입자를 이용하는 사회적인 수용을 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 환자로부터 암세포를 제거하는 개선된 장치 및 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 환자로부터 나노입자를 제거하는 개선된 방법을 제공하는데 있다.

추가로, 본 발명의 목적은 환자의 암 치료 및/또는 암 제거를 향상시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 처치 대상자로부터 선택적으로 제거하는 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 장치는 신체 밖 순환장치(extracorporeal circuit)를 포함하고, 상기 신체 밖 순환장치는 적어도 자석, 및 제거가능하고 자성 나노물질을 포획할 수 있는 자화가능한 기질을 포함하는 자성 필터와, 상기 자성 필터와는 유체가 연통되어 있고 상기 신체 밖 순환장치를 통해 유체를 이동시키는 펌프를 포함한다. 상기 자석은 자기장 내에서 자성 나노물질을 포획하기에 충분한 자기장을 생성할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 표적세포는 암세포 및/또는 병원체원(pathogenic agent)에 의해 감염된 세포이다. 본 발명의 장치는 신체 밖(extracorporeal) 사용 또는 생체 내(in vivo) 사용을 위해 설계될 수 있다. 기능화된(functionalized) 초상자성 나노입자는 환자로부터의 생물학적 유체와 생체 외(ex vivo)에서 혼합되거나 환자에게 주입된다. 그리고 나서, 상기 나노입자를 포함하는 생물학적 유체는 상기 자성 필터로 옮겨져서 상기 표적 세포, 병원체 또는 바이러스와 복합체를 형성한 나노입자 또는 자유로운 나노입자를 제거하게 된다. 선택적으로, 상기 기능화된 나노입자는 치료제를 포함하고 전달한다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 치료제는 상기 나노입자가 상기 표적 세포, 병원체 또는 바이러스와 결합할 때 방출된다.

본 발명에 따르면 환자로부터 암세포를 제거하고, 또한 환자로부터 나노입자를 제거하는 개선된 장치 및 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 환자의 암 치료 및/또는 암 제거를 향상시킬 수 있다.

도 1A 및 도 1B는 초상자성 나노입자로 생물학적 유체를 생체 외(ex vivo)에서 처리하기 위한 예시적인 장치를 도식화한 도면이다.
도 2A 내지 도 2C는 초상자성 나노입자로 환자를 생체 내(in vivo)에서 치료하기 위한 혈액 투석 장치에 대한 예시적인 변형을 도식화한 도면이다.
도 3은 3마리의 Balb/C 암컷 마우스의 복막으로부터 추출된 세포 집단에서의 Hey 세포 및 BG-1 세포의 추출 효율 막대 그래프이다. 비율은 3마리 마우스 각각에 대해 수행된 5번의 계수값을 평균한 것이다. 에러 바는 표준편자를 나타낸다.
도 4A 내지 도 4K는 환자 914의 복수(腹水, ascites) 샘플에 대한 유동 세포계수 분석(flow cytometry analysis) 결과를 나타내는 점 그래프이다. 도 4A 내지 도 4C는 실험 1 내지 실험 3에 대한 점 그래프로서, 게이트 집단(gated populations), 빈도(frequencies) 및 집단 레이블 (1-4)을 나타낸다. 도 4D 내지 도 4F는 환자 914의 잔류물(filtrand)에 대한 유동 세포계수 분석(flow cytometry analysis) 결과를 나타내는 점 그래프(실험 1 내지 3)로서, 처치되지 않은 복수(腹水) 실험(실험 1)으로부터 복제된 게이트(gates), 빈도(frequencies) 및 집단 레이블 (1-4)을 나타낸다. 도 4G 내지 도 4I는 펩타이드 컨쥬게이트를 갖지 않는 나노입자를 이용하여 환자 샘플(환자 914)로부터 추출된 잔류물(filtrand)에 대한 점 그래프이다. 집단 게이트(population gates)는 처치되지 않은 복수(腹水) 및 순수한 나노입자 샘플에 대해 수행된 앞선 실험들로부터 복제되었다. 도 4J 및 도 4K는 펩타이드 기능기를 갖거나(도 4J) 펩타이드 기능기를 갖지 않는(도 4K), 글루쿠론산으로 코팅된 초상자성 나노입자에 대한 점 그래프로서, 처치되지 않은 복수(腹水) 실험(실험 1)으로부터 복제된 게이트(gates)를 나타낸다.
도 5는 실시예 3에서 사용된 실험 셋업의 개략도이다.
도 6은 복강내 주사 후 날짜 경과에 따라 생존하는 특정 그룹, 즉 대조군 A 그룹 ("대조군") (36일째에서 직선), 대조군 B 그룹("처치/나노입자 없음") (44일째에서 계단식 선 모양으로 끝남) 및 실험군(처치/나노입자 있음) (계단식 선 모양으로서 60일째에서 끝남)에서 마우스의 생존곡선을 백분율로 나타낸 것이다.
도 7은 HIV-1 샘플의 실험 회수에 대한 p24/ml의 pg의 선 그래프로서, HIV-1 샘플이 컨쥬게이트가 없는 고농도 초상자성 나노입자로 처치된 경우 및 처치되지 않은 경우, 저농도의 항-cp120 컨쥬게이트를 갖는 저농도 초상자성 나노입자로 처치된 경우, 또는 고농도의 항-cp120 컨쥬게이트를 갖는 고농도 초상자성 나노입자로 처치된 경우의 결과를 나타내는 그래프이다.

I. 장치

자성 필터/트랩을 포함하는 다양한 장치와 시스템이, 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스와 결합하도록 설계된 초상자성 나노입자로 생체 내 또는 생체 외에서 환자를 처치하기 위해 사용될 수 있다. 일실시예에서, 상기 표적 세포는 특정 표면 막 결합 파트너를 발현하는 질환 세포이다. 일실시에에서, 상기 나노입자는 하나 이상의 세포와 특이적으로 결합하도록 설계된 하나 이상의 분자로 기능화(functionalized)된다.

일실시예에 있어서, 본 발명의 장치는 신체 밖 순환장치(extracorporeal circuit)를 포함하고, 상기 신체 밖 순환장치는 자기장에서 자성 나노물질을 포획하기에 충분한 자기장을 생성할 수 있는 자석, 및 제거가능하고 자화될 수 있으며 자성 나노물질을 포획할 수 있는 기질을 포함하는 자성 필터와, 상기 자성 필터와는 유체가 연통되어 있고 상기 신체 밖 순환장치를 통해 유체를 이동시키는 펌프를 포함한다.

다른 실시예에 있어서, 자성 나노입자를 포획하기 위해 하나 이상의 자성 필터가 기존의 장치와 조합된다.

바람직하게는, 생물학적 유체와 접촉하는 본 발명의 장치의 모든 구성요소들은 멸균되는 것이 좋다. 일부 실시예에서 장치 전반에 사용되는 튜브는 멸균될 수 있으나, 통상 사용시 튜브는 일회용일 수 있으므로 튜브가 멸균될 필요성은 없다. 본 명세서에서 사용되는 생물학적 유체("biological fluid" 또는 "biofluid")는 포유류, 특히 인간으로부터 얻은 유체를 지칭한다. 생물학적 유체는 혈액에만 제한되는 것이 아니고 혈청, 혈장, 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 임파액(lymph) 및 복수(peritoneal fluid)를 포함한다.

A. 자성 필터(Magnetic Filter)

자성 필터(10)는 자성, 상자성 및/또는 초상자성 나노입자 및 여기에 부착된 물질을 끌어당기기에 적합한 형상 또는 크기를 가질 수 있다.

자성 필터(10)는 적어도 하나의 자석(12)과, 바람직하게는 자화될 수 있는 기질(14)을 포함하고, 선택적으로 용기(vessel)(16)를 포함한다.

일실시예에 있어서, 자성 필터는 자화될 수 있는 기질을 포함하지 않는다. 이 경우, 자성 필터는 나노입자들이 통과하는 용기(16)와 이러한 용기 벽체의 적어도 일부에 부착된 하나 이상의 자석(12)을 포함한다. 자석은 용기 벽체의 외면 상에 있을 수 있고 용기 내면(즉, 나노입자를 포함하는 생물학적 유체와 접촉하는 면)에 있을 수 있다.

a. 자석(Magnet)

자성 필터(10)는 영구 자석 또는 전자석과 같은 자석(12)을 포함한다. 자석은 자기장에서 자성 나노물질을 포획하기에 충분한 자기장을 생성할 수 있다.

통상, 자석은 초상자성 나노입자와 자석 또는 자화될 수 있는 물질 사이의 접촉점에서 적어도 대략 500 가우스(gauss)가 측정되는 자속(magnetic flux)의 자기장을 제공한다. 1,500 가우스 이상 또는 2,500 가우스 이상과 같은 큰 자속의 자기장을 제공하는 자석이 사용될 수 있으나 이러한 자석이 통상 요구되지는 않는다.

일실시예에 있어서, 자성 필터는 자기장을 생성하는 외부 자석(12)과, 자기적으로 끌어당기는 물질로 형성된 스크린(14)을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 스크린과 상기 자석은 하나의 구성요소로 제공된다.

본 명세서에서 사용된 "자석"은 자기 자신의 자기장을 생성하고 자기장에 반응하는 물질을 지칭한다. 자석은 자화된 상태를 유지하는 영구 자석과, 앞선 자화의 기억을 상실하는 비영구적 자석을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "자기적으로 끌어당기는 물질"("magnetically attractive material")은 자기장을 생성하지는 않지만 자기장에 끌어당겨지거나 자기장의 존재 하에 서로에 대해 끌어당기는 물질로서, 상자성 물질을 포함한다. 자기적으로 끌어당기는 물질로는 아래의 물질을 포함할 수 있고 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다: 철, 바람직하게는 테프론, 폴리이미드 또는 파릴렌, 또는 생체적합성을 갖게 하는 다른 적합한 물질로 코팅된 철, 그리고 강철.

ⅰ. 영구자석

어떠한 영구자석도 자성 필터에 포함될 수 있다. 적합한 영구자석은 강자성 물질(ferromagnetic) 및 페리자성 물질(ferrimagnetic)을 포함한다. 자석은 아래와 같은 물질을 포함할 수 있고 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다: 네오디뮴(희토류), 사마륨 코발트(Samarium Cobalt)(희토류), 세라믹(페라이트) 및 알니코(Alnico) (알루미늄 니켈 코발트).

ii. 전자석(Electromagnet)

일실시예에서, 자성 필터는 전자석을 포함한다. 이러한 경우, 전자석은 테더(tether)를 통해 모듈형 전원(modular power supply)에 부착되는 것이 바람직하다. 테더(tether)는 전도체를 운반하는 것 이외에 전자석 프로브 및 리드(lead)를 냉각시키기 위한 물 또는 가스 순환용 도관을 제공할 수 있다. 안전을 위해, 테더는 접지용 편조선(編粗線)을 가지는 것이 바람직하다. 따라서, 전자석을 가동하기 위해 높은 전류를 운반하는 전도성 리드가 일단 노출되면, 테더는 그라운드로 단락되어 전원은 즉각 차단된다.

영구자석 대신에 전자석을 사용하는 이점은 자기장을 추가적으로 국지화하여 보다 집중되고 강한 자기장을 만들 수 있는 것을 포함한다. 또한, 전자석은 스위칭이 가능하여 사용하지 않을 때 손쉽게 오프상태로 전환이 가능하다.

또한, 전자석은 자신에게 끌어당겨지는 철 성분의 물질을 모니터하고 표시할 수 있기 때문에 모니터로서 사용될 수 있다. 이와 같이 전자석 전원 상의 숫자 표시기 또는 그래픽 표시기는 전자석에 끌어당겨지는 자성 나노입자의 존재 및/또는 상대적 양에 관해 사용자에게 정보를 제공할 수 있다.

b. 스크린(Screen)

바람직하게는, 스크린(14)은 오토클레이브(autoclave)될 수 있는 재료와 같은 멸균가능한 재료로 형성된다. 바람직하기로는 자성 나노물질을 포획할 수 있는 자화될 수 있는 기질(substrate)은 스크린이다.

바람직하게는, 상기 스크린은 용기(16)로부터 제거되거나 용기(16)내에서 교체될 수 있다. 이는 장치의 나머지 부분을 분해하지 않고도 여과된 입자들을 상기 스크린으로부터 쉽게 제거할 수 있게 하고 테스트할 수 있게 한다. 또한 이는 세척된 필터로 교체하여 동일한 환자에게 재사용할 수 있게 하고, 다른 환자에 대해서는 멸균 후 재사용할 수 있게 한다.

i. 형상(Shape)

일실시예에서 있어서, 스크린(14)은 자석 보다 큰 표면적을 가져 스크린의 표면에 부착하는 자성 나노입자에 대한 최대 공간을 제공한다.

일실시예에 있어서, 스크린은 코일 형상일 수 있다. 다른 실시예에서, 스크린은 직사각형 단면을 갖고 그물(mesh) 형태 또는 격자(lattice) 형태일 수 있다. 다른 실시예에서, 스크린은 나노입자가 부착할 수 있는 복수개의 슬랫(slat)을 포함한다.

ii. 재료(Materials)

스크린은 통상 철 또는 강철과 같은 자기적으로 끌어당기는 물질로 형성되며, 바람직하게는 생체적합성을 부여하는 적합한 코팅 재료로 코팅된다.

c. 용기(Vessel)

자성 필터용 용기(16)는 입구(17) 및 출구(18)를 포함하고, 나노입자, 생체적합성 현탁 유체 및 생물학적 유체에 적합한 용량을 가지고 있으며, 사용시 스크린을 포함할 수 있는 형상을 취하고 있다. 일실시예에서, 용기는 스크린을 용기에 부착하기 위한 슬롯 또는 클립(19a, 19b)과 같은 부착수단을 포함한다. 용기는 일정한 처치 또는 1회전(round)의 처치를 위해 필요한 양의 나노입자 및 생물학적 유체를 포함하기 위한 적절한 부피를 갖고 있다. 선택적으로, 용기는 용개 내의 유체의 부피를 표시하기 위해 눈금이 매겨져 있다. 선택적으로 용기는 유체 레벨, 온도 또는 용기 내부 물질의 다른 특성을 나타내기 위한 하나 이상의 센서들(20)을 포함한다. 상시 센서들은 프로세서와 전기적으로 통신가능하거나 무선 통신이 가능하다. 바람직하게는, 상기 프로세서는 관리 소자(150)의 일부이다. 적합한 재료라면 어느 것이라도 용기를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 용기는 멸균가능한 것이 바람직하다. 전형적인 재료로는 유리, 폴리프로필렌(polyproplylene), 폴리메틸펜텐(polymethylpentene) 등을 들 수 있다.

B. 생체외( Ex Vivo ) 처치를 위한 신체 밖 순환장치(Extracorporeal Device)

일실시예에서, 상기 장치는 환자로부터 하나 이상의 유체를 제거하고 유체에 자성 나노입자를 첨가(환자 밖으로 유체가 나온 후)하며, 자성 나노입자와 커플링된 물질과 함께 자성 나노입자를 제거하고, 최종적으로 처리된 생물학적 유체를 환자에게 복귀시키도록 설계된다.

상기 신체 밖 순환장치에는 다양한 상이한 구성들을 갖는 다양한 구성요소들이 사용될 수 있다. 도 1A 및 도 1B에는 2개의 예시적인 구성이 도시되어 있다.

전형적으로, 상기 신체 밖 순환장치(100)는 다음의 구성요소들을 포함한다: 나노입자를 생물학적 유체에 공급하기 위한 저장소(reservoir)(120), 자성 필터(10), 펌프(130), 및 상기 신체 밖 순환장치(체외 순환장치)의 다양한 구성요소들을 연결하고 상기 신체 밖 순환장치의 하나 이상의 구성요소를 통해 생물학적 유체 및/또는 나노입자의 유동을 허용하는 튜브(160). 전형적으로, 상기 신체 밖 순환장치는 자성 필터로 들어가기 전에 나노입자와 생물학적 유체가 혼합되는 혼합 챔버(140)도 포함한다. 바람직하게, 상기 신체 밖 순환장치는 적어도 하나의 관리 소자(150)도 포함한다. 이들 구성요소들은 하우징(180)내에 수용되는 것이 바람직하다.

세포 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포를 선택적으로 제거하기 위한 예시적인 장치가 도 1에 설명되어 있다. 이는 입구 및 출구를 갖는 저장소를 포함한다. 사용시 상기 저장소는 표적 세포 표면 상의 결합 파트너에 결합하는 결합 파트너가 기능기로 붙은(결합 파트너로 기능화된) 초상자성 입자로 채워져 있다. 추가로, 상기 장치는 상기 저장소와 유체가 연통되어 있는 자성 필터를 포함하고, 상기 자성 필터는 자성 입자와 결합할 수 있는 자석 및 스크린을 갖는다. 마지막으로, 상기 장치는 상기 자성 필터와 유체가 연통되어 있는 펌프를 포함하고, 상기 펌프는 상기 저장소로부터 상기 자성 필터로 유체를 이동시킨다.

a. 저장소(Reservoir)

저장소(120)는 나노입자 및 생체적합성 현탁 유체를 포함하도록 설계되고, 선택적으로 완충용액 또는 다른 시약으로 채워질 수 있다. 상기 저장소는 일정한 처치 또는 1회전(round)의 처치를 위해 필요한 양의 나노입자를 포함하기 위한 적절한 부피를 갖고 있다. 적합한 용기(122)라면 저장소로서 사용될 수 있다. 선택적으로, 용기는 용개 내의 유체의 부피를 표시하기 위해 눈금이 매겨져 있다. 선택적으로 용기는 유체 레벨, 온도 또는 용기 내부 물질의 다른 특성을 나타내기 위한 하나 이상의 센서들(124)을 포함한다. 상시 센서들은 프로세서와 전기적으로 통신가능하거나 무선 통신이 가능하다. 바람직하게는, 상기 프로세서는 관리 소자(150)의 일부이다.

적합한 재료라면 어느 것이라도 저장소를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 저장소는 멸균가능한 것이 바람직하다. 저장소는 유리, 폴리프로필렌(polyproplylene), 폴리메틸펜텐(polymethylpentene) 등으로 형성될 수 있다.

상기 저장소는 나노 입자, 현탁제, 완충용액 및/또는 다른 유체가 진입하는 입구(126)를 갖는다. 또한, 상기 저장소는 나노 입자, 현탁제, 완충용액 및/또는 다른 유체가 빠져나가는 출구(128)를 포함한다. 선택적으로, 상기 저장소는 상기 신체 밖 순환장치를 통과한 생물학적 유체가 필요시 재순환되어 들어가는 재순환 입구(129)를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 입구 및 상기 재순환 입구는 동일하고, 다른 실시예에서는 서로 별개의 입구로 되어 있다.

선택적으로, 상기 입구는 상기 저장소로 공급되는 나노 입자, 현탁제, 완충용액 및/또는 다른 유체를 포함하는 용기, 예를 들어, 백(bag) 또는 다른 컨테이너, 주사기 등에 부착하기 위한 적합한 커넥터를 포함한다. 입구와 재순환 입구가 동일한 일부 실시예에서, 상기 커넥터는 생물학적 유체를 운반하는 튜브와 연결됨으로써 상기 입구가 재순환되는 생물학적 유체와 연통되도록 한다. 선택적으로, 상기 커넥터는 2개의 입구 포트 및 1개의 출구 포트를 갖는 T-밸브와 같은 밸브이다.

b. 자성 필터(Magnetic Filter)

다양한 실시예의 자성 필터(10)가 앞에서 기술되었다. 신체 밖 순환장치를 위한 바람직한 실시예에서, 상기 자성 필터는 외부 자석(12), 바람직하게는 전자석, 자기적으로 끌어당기는 물질로 형성된 필터(14) 및 용기(16)를 포함한다.

일부 실시예에서, 상기 신체 밖 순환장치는 하나의 자성 필터를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 신체 밖 순환장치는 하나 이상의 자성 필터를 포함한다.

스크린은 용기(16) 내에 위치하고 용기로부터 제거가능한 것이 바람직하다.

상기 용기는 입구(17) 및 출구(18)를 포함하고, 상기 입구는 생물학적 유체 및 나노입자의 혼합물이 상기 용기로 진입하는 것을 허용하며, 상기 출구는 여과물이 상기 용기를 통해 빠져나오는 것을 허용한다. 일실시예에 있어서, 도 1A에 도시된 바와 같이, 상기 입구(17)는 튜브(160)에 연결되고, 이는 생물학적 유체 및 나노입자의 혼합물을 수용하는 용기와 연결시킨다. 일실시예에서, 상기 출구(18)는 펌프(130)와 연결되는 튜브와 연결되어 있다.

다른 실시예에 있어서, 도 1B에 도시된 바와 같이, 상기 입구(17)는 튜브(160)에 연결되고, 이는 밸브 및 다른 튜브를 통해 펌프(130)에 연결된다. 일실시예에서, 출구(18)는 밸브(180b)와 연결된 튜브에 연결되어 있는데, 상기 밸브는 재순환을 위해 저장소로 가는 생물학적 유체 흐름의 방향을 정하거나 또는 환자로의 전달을 위해 생물학적 유체 출구(174)로 가는 생물학적 유체 흐름의 방향을 정한다.

c. 펌프

펌프(130)는 상기 신체 밖 순환장치의 다양한 구성요소들을 통해 생물학적 유체를 이동시키고 처치 후 이를 환자 몸으로 복귀시키도록 설계된다. 일실시예에서, 상기 폄프는 전형적으로 튜브를 통해 적어도 자성 필터 및 저장소와 유체가 연통되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 펌프는 혼합 챔버, 저장소 및 자성 필터와 유체가 연통되어 있다.

원하는 유량(flow rate)을 위해 적합한 힘을 제공하는 펌프라면 어느 것이라도 사용될 수 있다.

d. 혼합 챔버(Mixing Chamber)

일실시예에서, 생물학적 유체는 자성 필터에 들어가기 전에 혼합 챔버(140)에서 나노입자와 혼합된다. 상기 혼합 챔버는 하나 이상의 입구(142)와, 전형적으로 하나의 출구(144)를 포함한다. 상기 혼합 챔버는 하나 이상의 입구(142)를 통해 저장소(120) 및 생물학적 유체 입구(172)와 유체가 연통되어 있다.

일실시예에 있어서, 도 1A에 도시된 바와 같이, 상기 혼합 챔버(140)는 출구(144)를 통해 자성 필터(10)와 유체가 연통되어 있다.

다른 실시예에 있어서, 도 1B에 도시된 바와 같이, 상기 혼합 챔버(140)는 출구(144)를 통해 펌프(130)와 유체가 연통되어 있다.

나노입자 및 생물학적 유체는 2개의 서로 다른 튜브(160a, 160b)를 통해서 상기 혼합 챔버로 들어갈 수 있지만, 일실시예에서는 하나의 튜브(160c)를 통해 상기 혼합 챔버(140)로 들어간다. 이러한 실시예에서, 생물학적 유체 입구(172)에 연결된 튜브(160a)는 제1 밸브(180a)와 연결되고, 저장소에 연결된 튜브는 동일한 제1 밸브(180a)와 연결된다. 또한, 제1 밸브(180a)는 튜브의 근위쪽(proximal end)(162)에서 튜브(160c)에 연결되는 출구(182a)를 포함하고, 상기 튜브의 원위쪽(distal end)(164)은 상기 입구를 상기 혼합 챔버(142)에 연결한다.

e. 관리 소자(Management Component)

바람직하게는, 상기 신체 밖 순환장치는 하나 이상의 관리 소자들을 포함하고, 이들은 상기 신체 밖 순환장치를 위한 다양한 파라미터들을 제어하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어를 가진 컴퓨터를 포함하며 상기 파라미터들로는 유량, 유체 온도, 압력, 동작 시간, 순환 시간 및 전자석의 턴온 또는 턴오프를 들 수 있는데, 본 발명이 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다.

또한, 상기 관리 소자는 다양한 파라미터들을 모니터링하고 조작하기 위한 사용자 인터페이스를 통상 포함한다.

f. 하우징(Housing)

하우징(170)은 신체 밖 순환장치의 다양한 구성요소들을 감싸고 있다. 바람직하게는, 상기 하우징은 생물학적 유체 입구(172) 및 생물학적 유체 출구(174)를 포함하고, 이들은 튜브 또는 다른 적합한 커넥터를 통해 환자에게 연결가능하다.

또한, 하우징은 관리 소자(management component)에 의해 제어되는 다양한 파라미터들을 모니터링하고 조작하기 위한 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 이들 구성요소들은 바람직하게는 상기 관리 소자 내의 프로세서와 전기적으로 통신가능하거나 무선 통신이 가능하다.

g. 밸브

필수적인 요소는 아니지만, 신체 밖 순환장치는 신체 밖 순환장치의 다양한 구성요소들을 통한 유체의 흐름을 촉진하고 제어하기 위한 하나 이상의 밸브를 통상 포함한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 상기 신체 밖 순환장치는 T-밸브(180a)와 같은 제1 밸브를 포함하는 것이 바람직한데, 상기 제1 밸브는 상기 생물학적 유체 입구에 연결되는 튜브(160a), 상기 저장소에 연결되는 튜브(160b), 및 상기 혼합 챔버로의 입구에 연결되는 튜브(160c)를 연결한다.

도 1A에 도시된 바와 같이, 상기 신체 밖 순환장치는 T-밸브(180b)와 같은 제2 밸브를 포함하는 것이 바람직한데, 상기 제2 밸브는 상기 자성 필터로부터의 여과물을 운반하는 상기 펌프의 출구에 연결된 튜브(16Of), 상기 저장소로 재순환된 여과물을 운반하는 상기 저장소에 연결된 튜브(16Og), 및 상기 여과된 생물학적 유체를 운반하고 이를 적합한 커넥터, 에를 들어, 카테터 또는 니들을 통해 환자에게 복귀시키는 상기 생물학적 유체 출구(174)에 연결된 튜브를 연결한다.

다른 실시예에서, 상기 신체 밖 순환장치는 3개 이상의 밸브를 포함할 수 있다. 예시적인 구성이 도 1B에 도시되어 있다. 여기서, 상기 신체 밖 순환장치는 전술한 바와 같은 제1 밸브 및 제2 밸브를 포함하고, 상기 혼합 챔버(140)를 빠져 나간 생물학적 유체 및 나노입자의 혼합물을 운반하는 상기 펌프의 출구에 연결된 튜브(160i), 생물학적 유체 및 나노입자의 재순환된 혼합물을 운반하는 상기 저장소에 연결된 튜브(160k), 및 생물학적 유체 및 나노입자의 혼합물을 운반하는 상기 자성 필터(10)에 연결된 튜브(160j)를 연결하는 제3 밸브(180c)를 포함한다.

h. 튜브(Tubing)

상기 신체 밖 순환장치의 구성요소들을 통해 수송되는 다양한 유체들은 통상 각 구성 요소 사이의 튜브(160) 내에 수용된다. 원하는 유량을 위해 적합한 직경을 갖는 의료용 등급의 튜브가 사용될 수 있다. 적합한 튜브 재료로는 폴리염화비닐(polyvinylchloride), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리우레탄 및 우레탄과 같은 열가소성 수지(thermoplastics)를 들 수 있고, 튜브는 이들의 혼합물 또는 조합으로 형성될 수 있다.

적합한 직경은 외경이 0.350 인치 이상이고, 내경이 0.005 인치 이상이다.

i. 선택적 구성요소들

i. 자기 쉴드(자기 차폐물)(Magnetic Shielding)

선택적으로, 자성 필터는 환자와 의료진을 자기장으로부터 보호하기 위해 자기 차폐물(200)에 의해 둘러싸여진다. 자기 차폐물은 자기장을 자기쪽으로 끌어당기고 자기장을 차폐된 공간 주위에서 정렬시키는 경로를 제공한다. 이러한 형태의 차폐효능은 재료의 투자율에 따라 감소하는데, 투자율(透磁率)은 매우 낮은 자기장 세기 및 재료가 포화되는 높은 자기장 세기에서 통상 떨어진다. 낮은 잔류 자기장을 달성하기 위해 자기 차폐물(200)은 하나가 다른 하나의 안쪽에 위치하면서 여러개 겹쳐진 봉입물 형태를 가질 수 있고, 이때 각각의 봉입물은 연속적으로 그 내부의 자기장을 감소시킨다.

자기 차폐물은 자성 필터를 둘러싸기 위한 적합한 구조를 갖는다. 자기 차폐물의 바람직한 형상은 자성 필터를 둘러싸는 밀폐된 컨테이너이다. 적합한 차폐 재료라면 어느 것이라도 사용될 수 있다. 예시적인 재료로는 Mu-metal^TM, MuShield^TM 고투자율 자기 차폐 재료(무방향성(non-oriented) 80% 니켈-철-몰리브덴 합금), GIRON^TM 자기 차폐 필름, 및 이와 유사한 재료들을 들 수 있다.

ii. 히터(Heater)

상기 신체 밖 순환장치는 온도가 제어될 수 있다. 선택적으로, 상기 신체 밖 순환장치는 상기 장치를 통과하여 유동하는 유체 또는 상기 장치를 선정된 온도 또는 온도 범위에서 유지하는 히터(210)를 포함한다.

iii. 센서

선택적으로, 상기 신체 밖 순환장치는 유동 순환장치를 통한 생물학적 유체의 흐름을 조절하는 밸브들 및 상기 유동 순환장치를 생물학적 유체가 통과할 때, 특히 강제력이 가해지는 생물학적 유체가 처치 대상 몸으로 재도입되는 경우 생물학적 유체의 유체 압력을 감지하는 하나 이상의 압력 센서를 포함한다.

일실시예에서, 상기 신체 밖 순환장치는 하나 이상의 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자의 존재 여부를 결정하기 위한 광센서 또는 유사한 검출기와 같은 센서들을 포함하고, 이를 이용하여 상기 밸브(180b)를 통한 생물학적 유체의 흐름을 상기 생물학적 유체 출구(174)로 향하게 하거나 재순환되기 위해 상기 저장소(120)로 향하게 한다. 상기 센서가 상기 생물학적 유체가 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자가 없는 것으로 판단하면, 상기 관리 소자는 상기 밸브를 통한 유체 흐름을, 환자에게 복귀시키기 위해 상기 생물학적 유체 출구(174)로 향하게 한다. 따라서, 이러한 센서는 초상자성 나노입자가 처치 대상자의 순환계로 들어가는 것을 방지할 수 있다.

일실시예에 있어서, 하나 이상의 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자의 존재 여부를 결정하기 위한 센서(220)는 상기 펌프(130)의 출구에 연결된 튜브 내에 위치한다(예를 들어, 도 1A 참조). 다른 실시예에 있어서, 하나 이상의 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자의 존재 여부를 결정하기 위한 센서(220)는 상기 자성 필터(10)의 출구에 연결된 튜브 내에 위치한다.

일실시예에 있어서, 나노입자와 표적 세포 또는 병원체 사이의 복합체가 충분한 수준으로 형성되었는지를 결정하기 위한 센서(230)는 상기 펌프(130)의 출구에 연결된 튜브 내에 위치한다(예를 들어, 도 1A 참조). 이러한 센서에 의해 얻은 데이터는 통상 상기 관리 소자와 통신됨으로써 상기 밸브(180c)를 통한 생물학적 유체의 흐름을 상기 자성 필터(10)로 향하게 하거나 저장소(120)로 향하게 하여 혼합 시간을 증가시키고 여과 전에 복합체 형성을 증가시키도록 한다.

iv. 사이펀 튜브(Siphon tube) 또는 샘플링 포트(Sampling port)

선택적으로, 상기 신체 밖 순환장치는 하나 이상의 유동 라인에서 사이펀 튜브 또는 샘플링 포트를 포함하여 시험을 위한 생물학적 유체 샘플의 제거를 허용한다. 일실시예에서, 상기 신체 밖 순환장치는 이들 구성요소들을 포함한다.

B. 생체내( In Vivo ) 처치를 위한 장치

도 1A 및 도 1B에 묘사된 상기 신체 밖 순환장치는 생체내 장치로서 사용될 수도 있다. 그러나, 상기 장치를 사용하기 전에 나노입자를 환자에게 투여하되, 주입을 통한 방식과 같이 비경구적 방식으로 통상 환자에게 투여한다.

생체내 장치를 위한 대안적인 실시예가 도 2A 내지 도 2C에 묘사되어 있다. 도 2A 내지 도 2C는 표준 혈액투석(hemodialysis) 장치 또는 혈액여과(hemofiltration) 장치의 변형예를 설명하고 있는데, 자성 필터(10)를 투석 메카니즘의 순환계(circuitry)로 도입함으로써 추출될 유체로부터 자성 나노입자를 제거하는 것을 설명하고 있다.

도 2A에 도시된 바와 같이, 환자의 생물학적 유체는 환자 몸에 존재하면서 자성 나노입자가 제거되는 자성 필터(10)를 통과한다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 자성 필터(10)는 생물학적 유체 흐름과 직접 접촉하도록 위치하고 표준 반-투과성 막(220)에 인접하여 위치할 수 있다.

상기 자성 필터는 순환계에 어디에도 위치할 수 있다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 상기 자성 필터는 다른 필터들 보다 앞서 상기 순환계의 시작점에 위치될 수 있다. 도 2C에 도시된 바와 같이, 상기 자성 필터(10)는 상기 순환계에 대한 우회로(240)내에 포함될 수 있다. 일실시예에서, 상기 우회로(bypass circuit)는 생물학적 유체 흐름을 조절하기 위해 상기 장치 내에 포함될 수 있다.

C. 다른 처치 시스템과의 조합 장치

선택적으로, 자성 필터, 신체 밖 순환장치 또는 생체내 장치 중 어느 하나는 다른 처치 시스템과 조합되어 조합 처치를 제공할 수 있다.

III. 시스템

일실시예에서, 전술한 바와 같은 복수개의 기능화된 초상자성 나노입자, 신체 밖 순환장치, 생체내 장치 및/또는 자성 필터를 포함하는 시스템이 제공된다.

A. 초상자성 나노입자

적합한 초상자성 나노입자는 선택된 리간드에 커플링하기 위해 큰 표면적을 제공하고, 생물학적 재료에 대한 낮은 비특이적 흡착을 갖는다. 또한, 나노입자는 리간드의 생물학적 활성을 방해하지 않는다. 또한, 나노입자는 도입되는 생물학적 유체에서 잘 분산되고, 인가된 자기장의 존재 하에서만 뭉친다.

상기 초상자성 나노입자는 생체내에 도입될 때 면역 반응을 유발하지 않도록 하나 이상의 생체적합성 물질로 코팅될 수 있다.

상기 나노입자는 펩타이드, 슈도 펩타이드(pseudo peptide), 항체 또는 탈락된 악성 세포 또는 혈액운반(blood-borne) 암에 특이적으로 결합하는 다른 리간드와 같은 특정 구성요소에 의해 통상 기능화된다. 상기 기능화된 나노입자는 다양한 방식으로 도입될 수 있는데, 특히 복강내로 (암에 대한 개복 수술 후 잔존하는 악성 세포에 결합시키기 위함), 또는 정맥내로 (혈액운반 병원체 또는 백혈병 세포에 결합시키기 위함) 도입될 수 있다. 전술한 바와 같은 장치들을 이용한 물리적인 추출은 환자로부터 나노입자/병원체 컨쥬게이트 또는 나노입자/감염세포 컨쥬게이트를 제거하여 실질적으로 개선된 예후를 보이도록 사용될 수 있다.

다른 실시에예서, 상기 초상자성 나노입자는 생체 외(ex vivo)에서 환자의 생물학적 유체에 투여된다. 바람직하게는, 상기 초상자성 나노입자는 적합한 담체를 포함하는 현탁액으로 투여된다. 상기 담체는 처치 대상에 생리학적으로 적합한 유체로서, 등장액의 PBS(phosphate-buffered saline) 용액일 수 있다. 선택적으로, 상기 담체는 또한 시스템 내의 혈액의 응고를 방지하기 위해 헤파린(heparin)을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 담체는 또한 상기 나노입자와 연관될 수 있는 세균 생장을 감소시키기 위해 페니실린 또는 암피실린과 같은 항생제를 유효량 포함한다. 또한, 상기 담체는 생리학적 pH가 되도록 제형화되는 것이 바람직하다.

일부의 경우, 상기 나노입자와 액체 담체가 유동 순환장치로 도입될 때 상기 나노입자가 상기 담체 내에서 상대적으로 균일하게 분산되는 것을 확실하게 하기 위해 상기 나노입자 현탁액을 흔드는 것이 필요할 수 있다.

재료

a. 초상자성 재료

상기 나노입자는 초상자성이다. 초상자성 나노입자는 자기장의 존재 하에서 자화되며, 자기장이 제거되면 탈자화(demagnetized)된다. 따라서, 상기 나노입자는 자기장이 인가되기 전까지 뭉치지 않는다. 초상자성 나노입자는 특히 본 발명의 장치들 및 방법들에서의 사용을 위해 적합한데, 초상자성 나노입자는 많은 수가 분산될 때 표면적 대 부피비 장점을 보유하기 때문에 생체내 적용시 색전증(embolism)과 같은 생리학적 부작용을 유도할 수 있는 뭉침현상을 방지한다.

초상자성 재료는 작은 강자성 클러스터들(예를 들어, 미소결정들( crystallites))로 구성되는데, 상기 클러스터들은 매우 작아 열적 변동 하에서 무작위로 방향을 뒤집을 수 있다. 그 결과, 재료 전체로서는 외부에서 자기장이 인가된 경우를 제외하고는 자화되지 않는다. 초상자성은 자성 물질이 큐리(Curie) 또는 닐(Neel) 온도 이하의 온도에서는 상자성과 유사한 행동을 나타낼 수 있는 현상이다. 이는 작은 길이-규모의 현상으로서 입자의 자성 모멘트 방향을 변화시키는데 필요한 에너지가 대기의 열적 에너지에 상응하는 경우 나타난다. 이때, 입자들이 무작위적으로 방향을 뒤집는 비율(rate)은 유의적이다.

초상자성은 히스테리시스 곡선(hysteresis loop)에 의해 입증될 수 있다. 전형적으로 히스테리시스 곡선은 유도 자화(M)를 인가된 외부 자기장(H)의 세기에 대해 대비한다. 자기장 밀도(magnetic field density)(B)가 도면에 나타난 바와 같이 유도 자화값(M)을 대신할 수 있다. 잔류 자기(Remanence) 및 보자력(保磁力) (coercivity)이 히스테리시스 곡선으로부터 결정될 수 있다. 잔류 자기는 자기장이 일단 제거된 후 재료에 잔존하는 자기이고, 보자력은 재료의 자화를 제로 상태로 되돌리기 위해 역방향으로 인가되는데 요구되는 자기장 세기이다. 히스테리시스는 자석 상에서 행해진 이력으로 히스테리시스 곡선의 폭으로서 정의된다. 히스테리시스 측정은 자기장의 변화를 검출할 수 있는 SQUID(superconducting quantum interference device)를 이용하여 이루어질 수 있다(Gallop, J. C, SQUIDs, the Josephson Effects and Superconducting Electronics. Adam Hilger: 1990).

세포 포획을 위해, Fe₃O₄ 보다 강한 자성을 갖는 나노입자를 이용하는 것이 일반적으로 요구된다. 코발트 스피넬 페라이트(Cobalt spinel ferrite), CoFe₂O₄나노입자들은 마그네타이트(magnetite)와 같은 같은 스피넬 페라이트 부류에 속한다. 일실시예에서 이들은 Fe₃O₄ 보다 훨씬 강한 자성 반응을 대기온도에서 나타내기 때문에 선호된다(Liu, C.; et al., "Chemical Control of Superparamagnetic Properties of Magnesium and Cobalt Spinel Ferrite Nanoparticles through Atomic Level Magnetic Couplings", JACS, 122(26) (2000); Song, Q.; Zhang, Z. J., Journal of Physical Chemistry B, 110 (2006) 참조).

초상자성 입자를 형성하는 다른 예로서의 초상자성 스피넬 페라이트로서는 다음과 같은 것을 들 수 있다. 그러나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아님은 물론이다: Cu_1~xZn_xFe_2~yGa_y0₄(0.0≤x≤0.5, 0≤y≤2), CuFe₂O₄, NiFe₂O₄, CoFe₂O₄, MgFe₂O₄, 및 Ni_0.5Cu_0.5Fe₂O₄ 및 망가니스 옥사이드(Maganese oxide)(Mn₃O₄).

초상자성 특성을 나타내는데 필요한 입자 크기는 재료에 따라 변한다(예를 들어, Sato et al., J. Magn. Magn. Mater., 65, 252 (1987) 참조). 통상, 초상자성은 100nm까지의 크기를 가진 입자들에서 나타난다. 예를 들어, 초상자성 나노입자는 50nm까지의 입자 크기를 가진 MgFe₂O₄스피넬 페라이트 나노입자일 수 있다.

기능화된 초상자성 나노입자의 크기

기능화된 초상자성 나노입자는 통상 1 마이크론 미만의 크기이다. 전형적으로, 상기 기능화된 초상자성 나노입자는 사용되는 코팅에 따라 약 20nm에서 약 1 마이크론의 크기이다.

그러나, 상기 기능화된 초상자성 나노입자는 일부 예에서 1 마이크론 보다 클 수 있다.

형상

나노입자의 형상은 나노입자의 표면으로의 결합 파트너 부착을 최대화하기 위해 선택된다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 나노입자는 매끄러운 구 형상이다.

적어도 하나의 결합 파트너가 기능화된 나노입자에 부착된다. 그러나, 일실시예에서 상기 나노입자 상의 결합 파트너 코팅은 실질적으로 상기 나노입자의 기능화된 표면 전체를 덮는 것이 바람직하다.

나노입자는 구형 또는 비-구형일수 있다. 하나의 바람직한 실시예에서, 나노입자는 구형이다. 다른 실시예에서, 나노입자는 비-구형일 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 타원형(또는 장방형), 가늘고 긴 형태, 나노튜브 형태, 또는 나노 막대 형태일 수 있고, 다음과 같은 문헌들에 기재된 것과 같은 형태를 가질 수 있다: 미국공개특허공보 제2008/0112886호 및 국제공개특허공보 제WO 2008/031035호("Engineering Shape of Polymeric Micro- and Nanoparticles" by S. Mitragotri, et al.) 및/또는 미국공개특허공보 제2006/0201390호("Multiphasic Nanoparticles," by J. Lahann, et al.).

비-구형 나노입자의 평균 직경은 비-구형 나노입자와 같은 부피를 갖는 완전 구형의 직경이다. 나노입자가 비-구형이면, 나노입자는 예를 들어, 타원, 입방체, 섬유상, 튜브, 막대형 또는 불규칙한 형상을 가질 수 있다. 일부 예에서, 나노입자는 속이 비어 있거나 다공성일 수 있다.

또한, 다른 형상들도 가능한데, 예를 들어, 코어/셸 구조(예를 들어, 다른 조성을 가짐), 직사각형 디스크, 높은 종횡비(high aspect ratio)의 직사각형 디스크, 높은 종횡비의 막대형, 애벌레 형태, 편평한 타원형(oblate ellipse), 편장형 타원형(prolate ellipse), 타원형 디스크, UFO 형태, 원형 디스크, 통형, 탄알형, 알약형, 도르래형, 양쪽이 불룩한 렌즈형, 리본형, 라비올리형(ravioli), 납작한 알약형, 비콘형(bicone), 다이아몬드형 디스크, 톱니형 디스크(emarginate disk), 기다란 육각형 디스크(elongated hexagonal disk), 타코스 형태(tacos), 주름진 편장형 타원체, 주름진 편평한 타원체, 다공성 타원체 디스크 등이 가능하다.

생체적합성 코팅(Biocompatible Coatings)

나노입자는 생체적합성을 증가시키기 위해 다당류 중합체(폴리머) 또는 단당류로 코팅될 수 있다. 이러한 기술은 글리칸(glycan)이 통상 면역 반응을 유도하지 않기 때문에 나노입자에 대한 면역 반응을 감소시키는 장점을 제공한다(Lacava, et al., Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 272-276, 2434-2435 (2004)). 또한, 폴리머 코팅은 수 많은 자유 히드록실기를 포함하여 수용액에서 자발적으로 수소결합을 형성한다. 일제히, 많은 표면 히드록실기들이 현탁액에서 나노입자와 표면 코팅을 무제한적인 기간 동안 붙잡게 된다. 상기 코팅은 나노입자가 일반적인 순환계로 주입되거나 복강의 복수액으로 주입되는 경우 바람직하다.

적합한 코팅 재료로는 다음과 같은 것을 들 수 있다. 그러나 본 발명이 이들에 제한되는 것이 아님은 물론이다: 폴리디메틸실록산, 실리콘 오일, 실리콘, 전술한 리스트에 기재된 바와 같은 생체적합성 재료가 비닐 실란에 그라프트된 비닐실란 그라프트 공중합체(vinylsilane graft copolymer)와 같은 실란(silanes); 덱스트란, 글루쿠론산(glucuronic acid), 폴리갈락투론산(polygalacturonic acid), 키토산, 뉴라민산(neuraminic acid), 한천(agar), 아가로오스(agarose), 알지네이트(alginate), 카라기난(carrageenan), 셀룰로오스(cellulose) 및 개질된 셀룰로오즈, 콘드로이틴(condroitin), 히알루론산(hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 전분(starch), 잔탄(xanthan) 및 이들의 조합과 같은 당류(saccharides), 다당류(polysaccharides) 및 이의 유도체. 다른 코팅 재료로는 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리(알킬렌 옥사이드), PEG, PPO, 및 이들의 공중합체, 폴리우레탄; 메타크릴레이트(methacrylate) 및 히드록시알킬 메타크릴레이트와 같은 생체적합성 아크릴레이트 및 알킬아크릴레이트; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 폴리알킬렌; 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)와 같은 폴리에스테르, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐아세테이트, 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트)(poly(ethylene-co-vinylacetate)), 폴리(술폰) 등의 비-분해성 생체적합성 폴리머를 들 수 있다. 또한, 다른 코팅 재료로는 이에 제한되는 것은 아니나, PLA, PGA, 및 이들의 공중합체, 폴리파라디옥산온(poly(p-dioxanone)) 및 이들의 공중합체, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리히드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리(오르토에스테르), 폴리포스파진(polyphosphazine), 폴리(알킬시아노아크릴레이트), 및 젤라틴과 같은 단백질 등의 분해성 생체적합성 폴리머를 들 수 있다. 또한, 상기 코팅은 트윈(Tween), 폴록사머(poloxamer), 플루로닉(pluronic), 테트로닉(tetronic)과 같은 계면활성제를 포함할 수 있다.

기능화(Functionalization)

나노입자는 표면 막 결합 파트너를 발현하거나 나타내는 표적 세포, 예를 들어, 암세포, 또는 특정 병원체 또는 병원체에 의해 감염된 세포에 대한 하나 이상의 결합 파트너로 기능화될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어인 "결합 파트너"는 다른 특정 분자와 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 상기 결합은 높은 특이성을 갖는 것 및/또는 비-공유결합인 것일 수 있다. 서로 높은 특이성, 비-공유적, 생리화학적 상호작용에 의한 결합을 형성하는 결합 파트너들은 "상보적 결합 파트너들"로서 본 명세서에서 정의된다. 본 발명을 제한하지 않는 실시예는 핵산-핵산 결합, 핵산-단백질 결합, 단백질-단백질 결합, 효소-기질 결합, 수용체-리간드 결합, 수용체-호르몬 결합, 항체-항원 결합 등을 포함한다.

추가적인 예로서, 결합 파트너들은 항체/항원 쌍, 리간드/수용체 쌍, 효소/기질 쌍 및 상보적인 핵산 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 결합 파트너로서 사용이 적합한 항체는 항원-결합 단편(fragment)을 포함하고, 이러한 항원-결합 단편으로는 분리된 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, 및 Fv를 들 수 있다. 또한, 항체는 이중-특이(bispecific) 항체이거나 이중-기능(bifunctional) 항체를 포함한다.

결합 파트너들은 공유적으로 부착될 수 있고, 비-공유적 결합 전략을 통해 부착될 수 있는데 본 발명을 제한하지 않는 예로서 디칼코게나이드(dichalcogenide) 결합을 통해 부착될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "제1 결합 파트너"는 통상 초상자성 나노입자에 부착되거나 연관되는 결합 파트너를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "기능화된 초상자성 나노입자"는 나노입자 표면에 부착되거나 연관된 복수개의 결합 파트너들을 포함하는 초상자성 나노입자를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "병원체(pathogenic agent)"는 광의로 정의되며, 제한하지 않는 의미로서 바이러스, 바이러스에 감염된 세포, 세균, 그리고 생물학적 숙주에 존재시 독성을 나타내거나 바람직하지 않은 다른 입자 또는 유기체를 포함한다. 나노 입자를 암세포 또는 병원체 또는 병원체에 의해 감염된 세포로 표적화하는 한가지 방법은 상기 세포들에 의해 발현된 항원에 특이적인 결합 파트너를 나노 입자 표면에 부착하는 것이다.

종양에 의해 발현되는 항원은 상기 종양에 특이적일 수 있거나, 비-종양 세포에 비해 상기 종양 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있다. 나노 입자에 대한 결합 파트너의 결합은 공유 결합 또는 이온 결합, 또는 다른 비-공유적 상호작용에 의해 달성될 수 있다. 미국특허 제5,601,800호는 진단제, 조영제, 방사성 핵종(radionuclide)과 같은 생물학적으로 활성인 물질을 입자에 부착하는 몇가지 방법을 기술하고 있다.

사용시 유용한 링커들과 방법들이 예를 들어 미국특허 제5,824,805호, 미국특허 제5,817,742호 및 미국특허 제6,339,060호에 기술되어 있다. 나노 입자는 나노입자 코팅 상의 기능기에 대한 결합 파트너의 직접적인 공유적 부착을 통해 기능화될 수 있다. 또한, 상기 결합 파트너는 링커를 통해 나노 입자에 공유적으로 부착되거나, 컨쥬게이트되거나 링크될 수 있다. 상기 링커는 합성된 것이거나 천연의 것일 수 있고, 짧은 펩타이드, 또는 트리에틸렌 글리콜 폴리머 또는 폴리에틸렌 글리콜 폴리머와 같은 작은 폴리머를 포함할 수 있다.

a. 나노입자에 부착되는 결합 파트너

나노입자에 부착되는 결합 파트너는 특정 표면 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 이러한 면역 컨쥬게이트는 기능화된 초상자성 나노입자를 항원을 발현하거나 나타내는 표적 세포로 선택적으로 전달하는 것을 가능하게 한다 (예를 들어, Hermentin and Seiler, Behringer Insti. Mitl, 82:197-215 (1988); Gallego et al., Int. J. Cancer 33:773744 (1984); Amon et al., Immunological Rev. 62:5-27(1982) 참조). 항원은 펩타이드, 단백질, 다당류, 당류(saccharides), 지질, 핵산 또는 이들의 조합일 수 있다. 항원은 바이러스, 세균, 기생충, 식물, 원생동물, 균류, 조직, 암 또는 백혈병 세포와 같은 변형된 세포로부터 유래될 수 있고, 이들의 전체 세포 또는 면역원 성분, 예를 들어 세포벽 성분, 또는 이들의 분자 성분일 수 있다.

적합한 항원이 본 기술분야에서 알려져 있고 상업적으로 입수가능하며 과학적 공급원으로부터 입수가능하다. 일실시예에서, 항원은 불활성화되거나 약화된 유기체이다. 이들 유기체는 바이러스, 기생충 및 세균과 같은 감염성 유기체일 수 있다. 또한, 이들 유기체는 종양 세포일 수 있다. 항원은 종양, 또는 바이러스 또는 세균성 공급원으로부터 유래한 정제되거나 부분적으로 정제된 폴리펩타이드일 수 있다. 항원은 이종 발현 시스템에서 폴리펩타이드 항원을 인코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 생산되는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다. 항원은 항원 단백질 전부 또는 일부를 인코딩하는 DNA일 수 있다. 상기 DNA는 플라스미드 DNA와 같은 벡터 DNA 형태일 수 있다.

항원은 단일 항원으로 제공되거나 조합으로 제공될 수 있다. 또한, 항원은 폴리펩타이드 또는 핵산의 복합 혼합물로서 제공될 수 있다.

예를 들어, 나노입자에 부착되는 결합 파트너는 종양 항원을 인지하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체-함유 나노입자는 자기장과 항체-리간드 상호작용에 의해 종양 부위에 위치될 수 있다.

단클론 항체, 항-전(全)유전물질형(anti-idiotype) 항체, Fab, Fab' 및 F(ab')₂단편을 포함하는 항체 및 항체 단편, 또는 선택된 항원을 인지하는 다른 항체 단편은 높은 친화성을 갖는 항체를 스크린하고 선별하여 수득될 수 있다(미국특허 제RE 32,011호; 제4,902,614호; 제4,543,439호 및 제4,411,993호 참조; Monoclonal Antibodies, Hybridonzas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol(eds.), 1980; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) 참조).

대안으로, 항체 또는 항체 단편은 또한 재조합 기술을 이용하여 생산되어 선정될 수 있다(예를 들어, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:5728-5732 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology, 3:1-9 (1990) 참조). 또한, 알려진 병원체 상의 표면 단백질(예를 들어, HIV 바이러스 코트 상의 gp 120)의 항원 결정기에 선택적으로 결합하는 항체는 상업적으로 입수가능하고 종래 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

나노입자에 부착되는 결합 파트너는 세포 특이적인 수용체에 의해 인지되는 리간드일 수 있다. 예를 들어, 뉴라민산(neuraminic acid) 또는 시아릴 루이스 X(sialyl Lewis X)는 초상자성 나노입자에 부착될 수 있다. 이러한 리간드-함유 나노입자는 자기장과 리간드-선택 상호작용에 의해 내피 부위와 같은 특정 부위에 위치될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트는 세균 또는 바이러스 감염, 염증 과정 또는 전이성 종양이 관여된 질병의 치료 또는 예방에 적합하다.

수용체에 의해 인지되는 단백질 또는 합성 분자와 같은 다른 리간드가 초상자성 나노입자와 연관될 수 있다. 또한, 초상자성 나노입자에 부착되거나 연관되는 결합 파트너는 펩타이드, DNA 및/또는 RNA 인지 서열일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "앱타머"라는 용어는 특정 표적 분자에 결합하는 핵산(전형적으로, DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드) 또는 펩타이드를 지칭한다. 앱타머를 제조하고 개질하는 방법 그리고 특정 분자에 대한 앱타머의 결합 분석은 본 발명의 기술분야의 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국특허 제6,111,095호, 제5,861,501호, 제5,840,867호, 제5,792,613호, 제5,780,610호, 제5,780,449호, 제5,756,291호, 제5,631,146호 및 제5,582,981호 참조; 또한, PCT 국제공개공보 제 WO92/14843호, 제WO91/19813호 및 WO92/05285호 참조; 이들 문헌 각각은 본 명세서에 참고로서 통합됨). 앱타머에 결합하는 리간드로는 제한되는 것이 아니나 저분자, 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 호르몬, 당, 대사부산물 및 독소를 들 수 있다.

특정 표적에 결합하도록 구성된 앱타머는 예를 들어, 초기에 잡다한 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고 상기 집단 내에서 특정 표적 분자에 단단히 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선정함으로써 선택될 수 있다. 일단 특정 표적 분자에 결합하는 앱타머가 확인되면 이는 생물학 및 다른 기술분야에 알려진 다양한 기술을 이용하여 복제될 수 있는데, 예를 들어 클로닝 및 전사 후 이어지는 PCR 증폭에 의해 복제될 수 있다.

b. 표적 세포의 막 단백질 상의 결합 파트너

표적 세포는 그 표면 상에 하나 이상의 결합 파트너를 포함할 수 있다. 세포 표면 상에 존재할 수 있는 결합 파트너는 제한되는 것은 아니나 암 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 원생동물 항원 및 균류 항원을 포함한다.

i. 암 항원

알려진 나노입자는 암세포 표면 상의 단백질이되 비-암세포의 표면 상에는 존재하지 않는 단백질에 결합하는 결합 파트너로 기능화될 수 있다. 예시적인 암 특이적인 단백질은 제한되는 것은 아니나 종양 특이 항원으로 지칭되는 암 항원을 포함한다. 예를 들어, 수용체 티로신 카나아제(receptor tyrosine kinase), EphA2는 난소 암종을 가진 환자에서 풍부하게 발현된다. 펩타이드 서열 YSAYPDSVPMMS (서열번호 1)는 에프린 모방물질(ephrin mimetic)로서 작용하고 EphA2에 대해 높은 선택성을 나타낸다. 상기 펩타이드 서열의 유도체(GGGGYSAYPDSVPMMSK) (서열번호 2)로 기능화된 나노입자는 EphA2 발현 시험에서 양성인 집단 내의 세포에 우선적으로 결합한다.

추가 암 항원은 인간 상피 항원(human epithelial antigen)(HEA) 및 MUC 16 세포 표면 단백질의 세포외 도메인, CA125를 포함하고, 이들은 심각한 삼출에서 악성 선암(adenocarcinoma)을 확인하는데 있어 잠재적으로 진단적 도움을 줄 수는 것으로서 널리 연구되었다. 인간 상피 항원(HEA)은 전이성 선암에서 상승된 발현 수준을 나타내는 당단백질 에피톱이다. Ber-EP4는 HEA에 대해 높은 친화도를 가지며 HEA 발현을 입증하기 위해 통상 사용된다. Ber-EP4 세포로 기능화된 나노입자는 CA125를 발현하는 세포에 대해 우선적으로 결합한다.

CA125의 혈청 수준은 난소암을 가진 환자의 90%에서 상승된다. HEA 및 CA125 수준은 높은 수준의 EphA2를 발현하는 동일 세포 집단에서 상승될 것으로 기대되었다.

비록 증가된 EphA2 발현이 난소 암종에 연관되었다고 하더라도, 이는 상기 암세포 형태에 의해 배타적으로 발현되는 것은 아니다. Eph 수용체 부류는 가장 큰 RTK 부류 중 하나이고, Eph/에프린 수용체 시그널링은 세포 이동, 세포 경계 유지 및 혈관 재구성(remodeling)과 밀접하게 연관된다. 에프린 모방물질은 Eph 수용체 발현 세포에 결합할 것으로 기대되나, 또한 높은 Eph 발현을 나타내는 세포에 대해 우선적으로 결합할 것으로 기대된다.

암세포에 대해 특이적인 다른 항원들은 이들 항원들에 대해 특이적으로 결합하는 리간드를 이용하여 유사한 방식으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 많은 암세포 상에서 과발현되는 트랜스페린 수용체에 대한 리간드 또는 항체를 갖는 나노입자는 암세포들에 대해 나노입자를 표적화시킨다. 유사하게, MUCl, MUCl 수용체, ErbB 수용체 또는 다른 생장인자 수용체에 대한 항체를 갖는 나노입자는 암세포에 대해 나노입자를 표적화시키는 것을 도와 준다. 치료제가 적재된 나노입자에 부착된 요소들에 대한 바람직한 표적화를 또한 가능하게 하는 세포 표면 단백질로는 PSA, TACE, MMP-14, CEA (광범위한 다양한 세포에서 광범위하게 과발현되는 발암항원(carcinoembryonic antigen), 우로키나제(Urokinase) 수용체(과발현이 다양한 악성 종양에서의 나쁜 예후와 강한 상관관계 있음) 및 CXCR4 (유방암 침윤 및 전이와 연관)를 들 수 있다. 치료제의 표적화된 전달을 위해 바람직한 표적화를 가능하게 하는 다른 단백질로는 다음과 같은 것을 들 수 있다: CD3, CD2, Fc 감마 RIII 활성화 수용체(CD16), 일부 슈퍼항원(superantigens), 글리코실트랜스퍼라아제-1,4-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제(GalNAc)와 같은 면역 시스템 마커들(Hoon, et al., Int. J. Cancer, 43:857-62(1989); Ando, et al., Int. J. Cancer, 40:12-17(1987); Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:45-54(1987); Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:55-60 (1987)); NUC18 (Lehmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9891-95 (1989); Lehmann, et al., Cancer Res., 47:841-45 (1987)); 흑색종 항원 gp75 (Vijayasardahi, et al., J. Exp. Med., 171:1375-80 (1990); GenBank Accession No. X51455); 인간 시토케라틴 8(human cytokeratin 8); 고분자 흑색종 항원(Natali, et al., Cancer, 59:55-63 (1987); 케라틴 19 (Datta, et al., J. Clin. Oncol., 12:475-82 (1994)).

또한, 표적화될 수 있는 종양-연관 항원은 예를 들어 세포 암유전자-인코딩된 산물 또는 이상 발현된 원발암유전자(proto oncogene)-인코딩된 산물(예를 들어, neu, ras, trk, 및 kit 유전자에 의해 인코딩된 산물), 또는 생장인자 수용체의 돌연변이 형태 또는 수용체-유사 세포 표면 분자(예를 들어, c-erb B 유전자에 의해 인코딩되는 표면 수용체)를 포함할 수 있다. 종양 연관 항원, 메소테린(mesothelin)(단클론 항체 K-1과의 반응성에 의해 규정됨)은, 상피성 난소암, 자궁경부암 및 식도암을 포함하는 대다수의 편평세포암종(squamous cell carcinoma)과, 중피종(mesothelioma) 상에 존재한다(Chang, et al., Cancer Res., 52:181 (1992); Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992); Chang, et al., Int. J. Cancer, 51:548 (1992); Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:136 (1996); Chowdhury, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:669 (1998)). MAb K-1을 이용하여 메소테린은 세포-연관 종양 마커로서만 검출가능하고, 난소암 환자의 혈청 또는 OVCAR-3 세포에 의해 조건이 맞추어진 배지에서 수용성 형태로 발견되지 않는다(Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992)).

알려진 구조와 알려진 또는 기술된 기능을 갖는 종양 항원은 다음과 같은 세포 표면 수용체를 포함한다: HERl (GenBank Accession No. U48722), HER2 (Yoshino, et al., J. Immunol, 152:2393 (1994); Disis, et al., Canc. Res., 54:16 (1994); GenBank Acc. Nos. X03363 and M17730), HER3 (GenBank Acc. Nos. U29339 and M34309), HER4 (Plowman, et al., Nature, 366:473 (1993); GenBank Acc. Nos. L07868 and T64105), EGFR(epidermal growth factor receptor) (GenBank Acc. Nos. U48722, and KO3193), VEGF(vascular endothelial cell growth factor) (GenBank No. M32977), VEGFR(vascular endothelial cell growth factor receptor) (GenBank Acc. Nos. AF022375, 1680143, U48801 and X62568), 인슐린 유사 생장 인자-I(insulin-like growth factor-I)(GenBank Acc. Nos. XOO173, X56774, X56773, X06043, 유럽특허 제GB 2241703호), 인슐린 유사 생장 인자-II(insulin-like growth factor-II)(GenBank Acc. Nos. X03562, X00910, Ml7863 and Ml7862), 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)(Trowbridge and Omary, Proc. Nat. Acad. USA, 78:3039 (1981); GenBank Acc. Nos. XO1060 and Ml1507), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)(GenBank Acc. Nos. M38651, X03635, X99101, U47678 and M12674), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor)(GenBank Acc. Nos. X51730, X69068 and Ml5716), FSH-R(follicle stimulating hormone receptor)(GenBank Acc. Nos. Z34260 and M65085), 레티노산 수용체(retinoic acid receptor)(GenBank Acc. Nos. L12060, M60909, X77664, X57280, X07282 and X06538), MUC-1 (Barnes, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:7159 (1989); GenBank Acc. Nos. M65132 and M64928) NY-ESO-1 (GenBank Acc. Nos. AJ003149 and U87459), NA17-A (PCT 특허공개공보 제WO 96/40039호), 멜란-A(Melan-A)/MART-1 (Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994); GenBank Acc. Nos. U06654 and U06452), 티로시나아제(tyrosinase)(Topalian, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:9461 (1994); GenBank Acc. No. M26729; Weber, et al., J. Clin. Invest, 102:1258 (1998)), Gp-100 (Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994); GenBank Acc. No. S73003, Adema, et al., J. Biol. Chem., 269:20126 (1994)), MAGE (van den Bruggen, et al., Science, 254:1643 (1991)); GenBank Acc. Nos. U93163, AF064589, U66083, D32077, D32076, D32075, U10694, U10693, U10691, U10690, U10689, U10688, U10687, U10686, U10685, L18877, Ul0340, U10339, Ll8920, U03735 and M77481), BAGE (GenBank Acc. No. U19180; 미국특허 제 5,683,886호 및 제5,571,711호), GAGE (GenBank Acc. Nos. AF055475, AF055474, AF055473, U19147, U19146, U19145, U19144, U19143 and U19142), CTA계 수용체들로서, 특히 SSX2 유전자에 의해 인코딩되는 HOM-MEL-40 항원(GenBank Acc. Nos. X86175, U90842, U90841 and X86174), 발암 항원(carcinoembryonic antigen)(CEA, Gold and Freedman, J. Exp. Med., 121:439 (1985); GenBank Acc. Nos. M59710, M59255 and M29540), 및 PyLT(GenBank Acc. Nos. J02289 and J02038); p97 (멜라노트랜스페린) (Brown, et al., J. Immunol., 127:539-46 (1981); Rose, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1261-61 (1986)). 다른 종양-연관 항원들 및 종양-특이적 항원들이 당업자에게 알려져 있고, 이들은 기술된 나노입자를 이용하여 표적화하기에 적합하다.

ii. 바이러스 항원

바이러스 항원은 제한되는 것은 아니나 다음과 같은 바이러스 부류들 중 어느 하나로부터 분리될 수 있다: 아레나바이러스(Arenaviridae), 동맥염바이러스(Arterivirus), 아스트로바이러스(Astroviridae), 바큐로바이러스 (Baculoviridae), 배드나바이러스(Badnavirus), 바르나바이러스(Barnaviridae), 버나바이러스(Birnaviridae), 브로모비리데(Bromoviridae), 부니아바이러스(Bunyaviridae), 칼리시바이러스(Caliciviridae), 카필로바이러스(Capillovirus), 카를라 바이러스(Carlavirus), 칼리모바이러스(Caulimovirus), 칠코바이러스(Circoviridae), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 코모비리데(Comoviridae), 코로나비리데(Coronaviridae) (예를 들어, SARS(severe acute respiratory syndrome) 바이러스와 같은 코로나바이러스), 코르티코비리데(Corticoviridae), 시스토비리데(Cystoviridae), 델타바이러스(Deltavirus), 디안토바이러스(Dianthovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 필로비리데(Filoviridae) (예를 들어, 마버그 바이러스(Marburg virus) 및 에볼라 바이러스(Ebola virus)(예를 들어, 자이레 균주, 레스톤 균주, 아이보리코스트 균주 또는 수단 균주)), 플라비비리데(Flaviviridae)(예를 들어, C형 간염바이러스, 뎅기열 바이러스 1(Dengue virus 1), 뎅기열 바이러스 2, 뎅기열 바이러스 3 및 뎅기열 바이러스 4), 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스(Herpesviridae) (예를 들어, 인간 포진 바이러스 1, 3, 4, 5 및 6, 그리고 거대세포 바이러스(Cytomegalovirus)), 히포비리데(Hypoviridae), 이리도비리데(Iridoviridae), 레비비리데(Leviviridae), 리포트릭스비리데(Lipothrixviridae), 미크로비리데(Microviridae), 오르토믹소비리데(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C), 파포바바이러스(Papovaviridae), 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) (예를 들어, 홍역(measles) 바이러스, 볼거리(mumps) 바이러스 및 인간 호흡기세포융합바이러스(human respiratory syncytial virus)), 파보바이러스(Parvoviridae), 피코르나바이러스(Picornaviridae)(예를 들어, 폴리오바이러스, 리노바이러스(rhinovirus), 헤파토바이러스(hepatovirus) 및 아프타바이러스(aphthovirus)), 폭스바이러스(Poxviridae) (예를 들어, 우두바이러스 및 천연두 바이러스), 레오바이러스(Reoviridae) (예를 들어., 로타바이러스), 레트로바이러스(Retroviridae) (예를 들어, HIV 1(human immunodeficiency virus 1) 및 HIV 2와 같은 렌티바이러스), 랍도바이러스(Rhabdoviridae)(예를 들어, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기세포융합바이러스 등), 토가바이러스(Togaviridae)(예를 들어, 풍진 바이러스(rubella virus), 뎅기열 바이러스 등), 그리고 토티비리데(Totiviridae). 또한, 적합한 바이러스 항원은 뎅기열 단백질 M, 뎅기열 단백질 E, 뎅기열 DlNSl, 뎅기열 D1NS2, 및 뎅기열 D1NS3의 전체 또는 일부를 포함한다.

바이러스 항원은 예를 들어 다음과 같은 바이러스 균주로부터 유래될 수 있다: 유두종 바이러스(papilloma virus), 포진 바이러스, 즉 단순 포진 바이러스 1및 2; 간염 바이러스, 예를 들어, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(delta hepatitis D virus) (HDV), E형 간염 바이러스(HEV) 및 G형 간염 바이러스(HGV), 진드기 매개 뇌염바이러스(tick-borne encephalitis viruses); 파라인플루엔자(parainfluenza), 수두대상포진바이러스(varicella-zoster), 싸이토메그라바이러스(cytomeglavirus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr), 로타바이러스, 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스, 콕삭키바이러스(coxsackieviruses), 말뇌염바이러스(equine encephalitis), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis), 황열 바이러스(yellow fever), 리프트 밸리열 바이러스(Rift Valley fever), 그리고 임파구성 맥락 수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis).

iii. 세균 항원

세균 항원은 제한되는 것은 아니나 다음과 같은 것들로부터 유래될 수 있다: 악티노마이세스(Actinomyces), 아나베나(Anabaena), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 보데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 캄필로박터(Campylobacter), 카울로박터(Caulobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코쿠스(Deinococcus), 에스체리치아(Escherichia), 프란시엘라(Francisella), 할로박테리움(Halobacterium), 헬리오박터(Heliobacter), 헤모필러스(Haemophilus), HIB(Hemophilus influenza type B), 히포미크로비움(Hyphomicrobium), 레지오넬라(Legionella), 렙트스피로시스(Leptspirosis), 리스테리아(Listeria), 수막염균(Meningococcus) A, B 및 C, 메타노박테리움(Methanobacterium), 구균(Micrococcus), 마이오박테리움(Myobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 믹소코커스(Myxococcus), 나이세리아(Neisseria), 니트로박터(Nitrobacter), 오실라토리아(Oscillatoria), 프로클로론(Prochloron), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 포도스필리움(Phodospirillum), 리케치아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스피릴룸(Spirillum), 스피로헤타(Spirochaeta), 포도상구균(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 술폴로부스(Sulfolobus), 테르모플라스마(Thermoplasma), 티오바실러스(Thiobacillus), 트레포네마(Treponema), 비브리오 그리고 여시니아(Yersinia).

iv. 기생충 항원

기생충 항원은 제한되는 것은 아니나 다음과 같은 기생충들로부터 얻거나 이들 기생충들로부터 유래된 항원일 수 있다: 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캡슐래텀(Histoplasma capsulatum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 리케치아 리케치(Rickettsia ricketsii), 리케치아 티피(Rickettsia typhi), 마이코프라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae), 클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 열대열원충(Plasmodium falciparum), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis) 그리고 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni). 이들은 포자소체 단백질(Circumsporozoite protein) 전체 또는 일부와 같은 삼일열 원충 항원, 포자충 항원, 스포로조이트 표면 단백질(Sporozoite surface protein), LSA(liver stage antigen), 첨단 막 연관 단백질(apical membrane associated protein) 또는 메로조이트 표면 단백질(Merozoite surface protein)을 포함한다.

치료제 또는 진단제

일부 실시예에서, 하나 이상의 치료제는 자기장의 제어 하에서 특정 부위로 전달되는 초상자성 나노입자에 통합된다. 치료제는 연결을 통해 초상자성 나노입자에 통합된다. 예를 들어, 치료제는 폴리머에 직접 공유 결합되거나 링커를 통해 결합될 수 있다. 대안으로, 치료제는 폴리머에 직접 이온 결합 또는 연관되거나 링커 또는 유도체를 통해 결합될 수 있다.

치료제는 제한되는 것은 아니나 저분자 화합물, 고분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 효소, DNA, RNA, 유전자, 세포 또는 방사성 핵종(radionuclides)을 포함한다. 치료제는 유효량이 환자에게 투여되었을 때 하나 이상의 치료 특성을 갖는다. 치료제 특성의 비제한적인 예로는 항-대사(antimetabolite), 항진균(antifungal), 항-염증(anti-inflammatory), 항종양(antitumoral), 항감염(antiinfectious), 또는 항생제를 들 수 있다. 나노입자와 연관된 치료제의 치료학적으로 유효량은 당업자에 의해 결정되는데, 환자의 몸무게, 나이, 건강상태, 약의 치료특성, 질환의 성질 및 심각성과 같은 다양한 요소들을 고려하여 특정 질병이나 질환의 유효한 치료를 위해 필요한 양을 결정한다.

치료제를 종양 세포에 표적화하는 것은 암과 연관된 효소에 의해 분해되는 펩타이드를 통해 치료제를 나노입자에 연결함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, MMP-9(matrix metalloprotease 9), MMP-13(matrix metalloprotease 13) 및 MMP-2(matrix metalloprotease 2)와 같은 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteases)의 발현은 수 많은 인간의 상피암에서 상승되는 것이 발견되었는데, 예를 들어 다음과 같은 암에서 발현 상승이 확인되었다: 유방암(Davies et al., British Journal of Cancer 67:1126, 1993); 전립선암(Harndy et al., British Journal of Cancer 69:177, 1994); 결장암(Levy et al., Cancer Research 51:439, 1991); 난소암(Naylor et al., International Journal of Cancer 58:50, 1994); 방광암 (Davies et al., British Journal of Cancer 67:1126, 1993); 및 위암(gastric carcinoma)(d'Errico et al., Mod Pathol. 4:239, 1991). IPVGLIG (서열번호 3) 및 IVSLRS (서열번호 4)와 같은 최적의 MMP-2 분해 모티브가 알려져 있다(Turk et al., Nature Biotechnology 19:661, (2001)). 따라서, IPVGLIG (서열번호 3) 또는 IVSLRS (서열번호 4)를 포함하는 링커를 통해 치료제를 나노입자에 기능화하는 것은 결국 MMP-2에 의해 나노입자로부터 치료제가 방출되도록 한다. 상기 링커는 금속단백질분해효소-13에 의해 분해되는 PQGLA 서열(서열번호 5)을 포함할 수 있다(Kim, et al., Biomacromolecules 4(4):1214-1223 (2003). 금속단백질분해효소에 의해 분해되는 추가의 펩타이드들이 국제공개특허공보 제WO 01/68145호에 개시되어 있다. 다른 예로는 서열 특이적으로 단백질 분해 능력을 갖는 PSA(prostate-specific antigen)와 같은 다른 암세포 특이적이거나 암세포에서 과발현되는 단백질분해효소의 표적이 되는 연결을 포함하는 것을 들 수 있다.

a. 화학적 치료제

나노입자에 부착될 수 있는 치료제는 보다 구체적으로 다음과 같은 화학적 치료제들을 포함한다: 아드리아마이신(adriamycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 브레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 시스플라틴(cisplatin), 아시비신(acivicin); 아클라루비신(aclarubicin); 아코다졸 염산염(acodazole hydrochloride); 아크로닌(acronine); 아도제레신(adozelesin); 알데스루킨(aldesleukin); 알트레타민(altretamine); 앰보마이신(ambomycin); 아메탄트론 아세테이트(ametantrone acetate); 아미노글루트티미드(aminoglutethimide); 암사크린(amsacrine); 아나스트로졸(anastrozole); 안트라마이신(anthramycin); 아스파라기나아제(asparaginase); 아스페르린(asperlin); 아자시티딘(azacitidine); 아제테파(azetepa); 아조토마이신(azotomycin); 바티마스타트(batimastat); 벤조데파(benzodepa); 바이칼루타마이드(bicalutamide); 비산트렌 염산염(bisantrene hydrochloride); 비스나파이드 디메실레이트(bisnafide dimesylate); 비제레신(bizelesin); 브레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate); 브레퀴나르 소디움(brequinar sodium); 브로피리민(bropirimine); 부술판(busulfan); 칵티노마이신(cactinomycin); 칼루스테론(calusterone); 카라세마이드(caracemide); 카베티머(carbetimer); 카르보플라틴(carboplatin); 카무스틴(carmustine); 카루비신 염산염(carubicin hydrochloride); 카제레신(carzelesin); 카데핀골(cedefingol); 클로람부실(chlorambucil); 시로레마이신(cirolemycin); 클라드리빈(cladribine); 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 시타라빈(cytarabine); 다카바진(dacarbazine); 다우노루비신 염산염(daunorubicin hydrochloride); 데시타빈(decitabine); 덱솔마플라틴(dexormaplatin); 데자구아닌(dezaguanine); 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate); 디아지콘(diaziquone); 독소루비신(doxorubicin); 독소루비신 염산염(doxorubicin hydrochloride); 드로록시펜(droloxifene); 드로록시펜 구연산염(droloxifene citrate); 드로모스타노론 프로피오네이트(dromostanolone propionate); 듀아조마이신(duazomycin); 에다트렉세이트(edatrexate); 에플로미틴 염산염(eflomithine hydrochloride); 엘사미트루신(elsamitrucin); 엔로프라틴(enloplatin); 엔프로메이트(enpromate); 에피프로피딘(epipropidine); 에피루비신 염산염(epirubicin hydrochloride); 에르부로졸(erbulozole); 에소루비신 염산염(esorubicin hydrochloride); 에스트라머스틴(estramustine); 에스트라머스틴 포스페이트 소디움(estramustine phosphate sodium); 에타니다졸(etanidazole); 에토포시드(etoposide); 에토포시드 포스페이트(etoposide phosphate); 에토프린(etoprine); 화드로졸 염산염(fadrozole hydrochloride); 화자라빈(fazarabine); 펜레티니드(fenretinide); 플록수리딘(floxuridine); 플루다라빈 포스페이트(fludarabine phosphate); 플루오로우라실(fluorouracil); 플루오로시타빈(fluorocitabine); 포스퀴돈(fosquidone); 포스트리에신 소디움(fostriecin sodium); 젬시타빈(gemcitabine); 젬시타빈 염산염(gemcitabine hydrochloride); 히드록시우레아(hydroxyurea); 이다루비신 염산염(idarubicin hydrochloride); 이포스파마이드(ifosfamide); 일모포신(ilmofosine); 인터루킨 II(interleukin II) (재조합 인터루킨 II 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-nl; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴(iproplatin); 이리노테칸 염산염(irinotecan hydrochloride); 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate); 레트로졸(letrozole); 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate); 리아로졸 염산염(liarozole hydrochloride); 로메트렉솔 소디움(lometrexol sodium); 로머스틴(lomustine); 로소잔트론 염산염(losoxantrone hydrochloride); 마소프로콜(masoprocol); 메이탄신(maytansine); 메클로레타민 염산염(mechlorethamine hydrochloride); 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate); 멜렌게스트롤 아세테이트(melengestrol acetate); 멜파란(melphalan); 메노가릴(menogaril); 머캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 메토트렉세이트 소디움(methotrexate sodium); 메토퓨린(metoprine); 메투레데파(meturedepa); 미틴도미드(mitindomide); 마이토카르신(mitocarcin); 마이토크로민(mitocromin); 마이토질린(mitogillin); 마이토말신(mitomalcin); 마이토마이신(mitomycin); 마이토스페르(mitosper); 마이토탄(mitotane); 마이토잔트론 염산염(mitoxantrone hydrochloride); 마이코페놀산(mycophenolic acid); 노코다졸(nocodazole).

다른 화학적 치료제로는 다음과 같은 항체들을 들 수 있다: 전이성 유방암을 가진 환자를 치료하기 위한 인간화된 항-HER2 단클론 항체인 HERCEPTIN^RTM (트라스투주맵(Trastuzumab) (미국 캘리포니아 소재 제넨텍 제품); 혈전 형성을 방지하기 위한 혈소판 상의 항-당단백질 IIb/IIIa 수용체 REOPRO^RTM (앱시지맵(abciximab)) (미국 센토코 제품); 급성 동종신장이식 거부반응을 방지하기 위한 면역억제제인 인간화된 항-CD25 단클론 항체인 ZENAPAX^RTM (다클리주맵) (스위스 로슈 제품); 쥐의 항-17-IA 세포 표면 항원 IgG2a 항체인 PANOREX^TM (글락소 웰컴/센토코 제품); 쥐의 항-이디오타이프 (GD3 에피톱) IgG 항체인 BEC2(임클론 시스템 제품); 키메라 항--EGFR IgG 항체인 IMC-C225(임클론 시스템 제품); 인간화된 항-αVβ3 인테그린 항체인 VITAXIN^TM (어플라이드 몰르큘 에볼류션/메드이뮨 제품); 인간화된 항-CD52 IgGl 항체인 캠패쓰(Campath) 1H/LDP-03(류코사이트(Leukosite) 제품); 인간화된 항-CD33 IgG 항체인 스마트 Ml95(프로테인 디자인 랩/카네보 제품); 키메라 항-CD20 IgGl 항체인 RITUXAN^TM (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); 인간화된 항-CD22 IgG 항체인 LYMPHOCIDE^TM(Immunomedics); LYMPHOCIDE^TM Y-90 (Immunomedics); 림포산(Lymphoscan)(Tc-99m-표지; 방사선 이미징; Immunomedics); 누비온(Nuvion) (항-CD3; Protein Design Labs); 인간화된 항-ICAM3 항체인 CM3(ICOS Pharm); 영장류화된 항-CD80 항체인 IDEC-114(IDEC Pharm/Mitsubishi); 방사선 표지된 쥐의 항-CD20 항체인 ZEVALIN^TM(IDEC/Schering AG); 인간화된 항-CD40L 항체인 IDEC-131 (IDEC/Eisai); 영장류화된 항-CD4 항체인 IDEC-151(IDEC); 영장류화된 항-CD23 항체인 IDEC-152(IDEC/Seikagaku); 인간화된 항-CD3 IgG 항체인 스마트(SMART) 항-CD3(Protein Design Lab); 인간화된 항-보체 인자 5 (C5) 항체인 5Gl.1 (Alexion Pharm); 인간화된 항-TNF-α 항체인 D2E7(CAT/BASF); 인간화된 항-TNF-α Fab 단편인 CDP870(Celltech); 영장류화된 항-CD4 IgGl 항체인 IDEC-151(IDEC Pharm/SmithKline Beecham); 인간의 항-CD4 IgG 항체인 MDX-CD4 (Medarex/Eisai/Genmab); CD20-스트렙타비딘 (+비오틴-이트륨 90; NeoRx); 인간화된 항-TNF-α IgG4 항체인 CDP57l (Celltech); 인간화된 항-α4β7 항체인 LDP-02 (LeukoSite/Genentech); 인간화된 항-CD4 IgG 항체인 오르토클론(OrthoClone) OKT4A (Ortho Biotech); 인간화된 항-CD40L IgG 항체인 ANTOVA^TM (Biogen); 인간화된 항-VLA-4 IgG 항체인 ANTEGREN^TM (Elan); 그리고 인간의 항-TGF-β₂ 항체인 CAT-152 (Cambridge Ab Tech).

또한, 표적화가능한 나노입자에 대한 치료제는 방사선 동위원소일 수 있다. 이러한 방사선 동위원소는 진단 및/또는 치료 목적으로 유용한 알파, 베타 또는 감사선을 방출하는 화학적 화합물 또는 원소이다. 적합한 방사선 동위원소를 선택하는데 유용한 한가지 요소는, 반감기가 표적에 의한 최대 흡수 시점에서 여전히 검출가능하고 치료효능이 있을 정도로 충분히 길면서도 치료대상에 대한 유해 방사선이 최소화되도록 짧아야 한다는 것이다. 적합한 방사선 동위원소는 본 발명의 기술분야의 당업자라면 즉각 선택이 가능하다. 통상, 알파 및 베타선은 국소 치료를 위해 유용한 것으로 여겨지고 있다. 유용한 치료 방사선 동위원소의 예로는 제한되는 것은 아니나, ³²P, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵³Sm, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Tb, ¹⁶¹Tb, ¹¹¹In, ⁷⁷Br, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²²³Ra, ^21OPo, ¹⁹⁵Pt, ^l95mPt, ²⁵⁵Fm, ¹⁶⁵Dy, ¹⁰⁹Pd, ¹²¹Sn, ¹²⁷Te, ¹⁰³Pd, ¹⁷⁷Lu 및 ²¹¹At를 들 수 있다. 일반적으로 방사선 동위원소는 염에서 라디칼로서 존재하나, 예외적으로 요오드와 라듐은 라디칼이 이온 형태로 존재하지 않는다.

a. 형광(바람직하게는 암세포 또는 다른 병원체에 결합 후)

진단 목적 또는 이미징 목적으로, 나노입자에 부착된 결합 파트너는 암세포에 결합 후 시각화될 수 있는 진단 동위원소 또는 형광단(fluorophore)과 같은 물질로 추가로 기능화될 수 있다. 일실시예에서, 형광 화합물은 짧은 아미노산 체인에 의해 리간드의 결합 도메인으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 로다민 태그가 리간드의 N-말단 상에 컨쥬게이트될 수 있는데, 로다민을 결합 영역으로부터 거리를 두어 항원성 물질 결합에 대한 입체적 방해를 방지하기 위해 4개의 N-말단 글리신 잔기들이 사용된다. 이미징 목적을 위한 많은 로다민 유도체가 있는데, 예를 들어, 테트라메틸로다민(TAMRA) 및 이의 이소티오시아네이트 유도체(isothiocyanate derivative)(TRITC), 설포로다민 101 (및 이의 설포닐 클로라이드 폼인 텍사드 레드(Texas Red)) 그리고 로다민 레드가 있다. TRITC는 구조의 하부 고리(bottom ring) 상의 수소 원자를 대체하는 이소티오시아네이트 그룹 (-N=C=S)으로 기능화된 염기성 로다민 분자이다. 이러한 유도체는 세포 내의 단백질 상의 아민기를 향해 반응한다. 로다민 코어에 부착된 숙신이미딜-에스테르 기능기(NHS-로다민 생성)는 다른 일반적인 아민-반응성 유도체를 형성한다. 로다민의 다른 유도체는 Alexa 546, Alexa 555, Alexa 633, DyLight 549 및 DyLight 633과 같은 새로운 형광단을 포함하는데, 이들은 높은 광안정성, 증가된 밝기, 다른 스펙트럼 특성 또는 다른 부착기가 요구되는 다양한 화학적 및 생물학적 응용을 위해 변형되어 있다.

유용한 진단 방사선 동위원소가 존재하며, 이들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 유용한 진단 및 치료용 동위원소는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.

III. 장치 및/또는 자성 나노입자를 이용한 방법

본 명세서에서 기술된 장치들과 나노입자들은 혈액, 복수(peritoneal fluid), 임파액, 뇌척수액 또는 신체의 다른 장액(serous fluid)를 여과하기 위해 사용될 수 있다. 일실시예에서, 상기 장치들과 나노입자들은 순환계 또는 복강으로부터 암세포를 제거하기 위해 사용된다. 대안으로, 상기 장치들과 기능화된 초상자성 나노입자들은 혈액 운반(blood-borne) 암 전이 및 백혈병을 처치하거나 제거하기 위해 사용될 수 있다.

일실시예에서, 생체내 또는 신체 밖 장치는 암세포를 환자로부터 추출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 생체내 또는 신체 밖 장치는 전이성 암세포를 제거하기 위해 특히 적합하다. 적합하게 기능화된 초상자성 나노입자와 함께 상기 장치들을 사용하면 1차 암종으로부터의 암세포의 전이성 전파를 감소시킬 수 있다.

일실시예에서, 상기 장치는 종양을 제거하는 외과적 수술 및/또는 종양을 축소시키는 화학요법과 조합될 수 있다. 다른 실시예에서, 자성 필터에 의해 생물학적 유체로부터 암세포를 제거한 다음, 암세포는 자성 필터로부터 제거되고 분석되며 적합한 방법에 의해 특성화된다. 이러한 단계는 어떤 방식의 추가적 암 치료가 환자에게 적합한지를 추가적으로 결정하는데 사용될 수 있다.

난소암

난소암은 가장 치명적인 부인과 악성종양들 중 하나이다. 말기 환자의 생존율은 약 20%이다. 난소암의 조기 진단이 어렵기 때문에 전체 환자의 81%가 악성 종양 세포가 전이성 전파된 말기에서 진단된다. 난소 종양 전파의 가장 중요한 경로는 1차 종양 부위로부터의 악성 종양 세포의 탈락이 발생하는 것으로서, 이는 복강을 통해 암세포를 확산시키고(Chi, and Hoskins, W. J., Ovarian Cancer Methods and Protocols. Humana Press: 2000; p 75) 암환자의 예후를 나쁘게 한다(Hanahan & Weinberg, Cell, (l):57-70 (2000), Fidler, Nat. Rev. Cancer, 3(6):453-8 (2003). 또한, 일부 암세포는 1차 암절제 동안 이탈할 수 있고, 이들 세포 내에서 현재 사용되는 화학요법에 대해 내성이 발생하여 종양 세포 집단의 재성장을 유도할 수 있다. 또한, 경계성 악성 상피 난소종양(malignant epithelial ovarian neoplasms)의 수술중 파열은 초기 난소암 환자의 예후를 나쁘게 하는 것으로 보고되고 있다(de la Cuesta, et al., Obstet. Gynecol. 84(1): 1-7 (1994). 따라서, 전이성 전파의 제한을 위해 통상적인 치료 절차의 일부로서 잔존 종양 세포의 추출을 결합하는 것은 암환자의 장기간 생존을 향상시키기 위한 전략이 될 수 있다.

난소암의 경우, 복강으로부터 전파된 암세포의 상당한 제거는 악성 종양 세포 집단의 감소와 전이성 전파의 위험성 감소를 이끌 수 있다. 자성 나노입자로부터의 독성 효과를 포함한 추가적인 연구들이 이러한 방법이 임상 시험 단계로 발전할 수 있도록 선행될 필요가 있다. 이러한 개념의 추가적 개량은 환자 특이적인 종양 단백질 발현 양상을 이용하여 펩타이드 어레이에 의해 추출 과정을 정교하게 하는 것을 포함할 수 있다. 작은 펩타이드들은 방광 종양 세포주를 이용한 쥐 모델에서 조직 상으로 종양세포 부착을 방지하는 것으로 보고되었기 때문에(Goldstein, et al., J Endourol., 7(3):237-41 (1993)), 작은 펩타이들 또한 종양 정착 가능성을 줄이기 위한 자성 세포 추출 기술로 도입되어 전이성 암 전파 방지 효율을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, EphA2는 다른 형태의 암에서도 높은 수준으로 발현되기 때문에 YSA 펩타이드-자성 나노컨쥬게이트의 적용은 난소암을 넘어 확장될 수 있다.

어떠한 암도 본 명세서에 기술된 기능화된 나노입자를 이용하여 처치될 수 있다. 상기 암으로는 제한되는 것은 아니나 다음과 같은 것을 들 수 있다: 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), 항문암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 간외 담관암(extrahepatic bile duct cancer), 눈암(eye cancer), 담낭암, 위암, 두경부암, 하인두암(hypopharyngeal cancer), 신장암, 후두암, 구순 및 구강암, 폐암, 비인두암 또는 구인두암, 구강암, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 갈색세포종(pheochromocytoma), 뇌하수체 암, 전립선암, 직장암, 피부암, 갑상선암, 질암, 뇌종양, 유암종(carcinoid tumor), 위장암종(gastrointestinal carcinoma), PNET(Ewings Family of Tumors), 두개강외 생식세포종양(extracranial germ cell tumor), 소아 눈암(childhood eye cancer), 안구 흑색종(intraocular melanoma), 생식세포종양(germ cell tumor), 생식선외 융모상피 종양(extragonadal gestational trophoblastic tumor), 도세포 암종(islet cell carcinoma), 백혈병, 림프종, 호지킨병(악성 림프종) 및 비-호지킨병(hodgkins and non-hodgkins disease), 중피종(mesothelioma), 흑색종, 메켈 세포암종(merkel cell carcinoma), 균상식육종(mycosis fungoides), 골수이형성증후군(myelodysplastic Syndrome), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorders), 신경모세포종(neuroblastoma), 골육종(osteosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 악성 흉선종(malignant thymoma), 그리고 빌름스 종양(Wilms' tumor).

또한, 이러한 초상자성 나노입자를 이용한 생체내 추출 접근법은 원리적으로 바이러스 및 바이러스 감염된 세포를 표적화하여 제거하고, 이로써 면역계가 감염에 대해 싸우도록 면역계를 강화함으로써 바이러스성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.

A. 생체외 장치( Ex Vivo Device)

다음의 방법은 도 1A에 도시된 바와 같은 장치 개략도를 참조하여 기술된다. 바람직하게는, 생물학적 유체는 튜브에 연결되는 니들 또는 카테터, 또는 이와 유사한 것을 통해 치료대상으로부터 제거된다. 상기 튜브는 근위쪽에서 입구 포트에 부착되고 원위쪽에서 상기 장치에 부착된다. 전형적으로, 이러한 튜브는 치료대상에 대한 사용 후 폐기를 용이하게 하기 위해 상기 장치로부터 제거가능하다.

일실시예에서, 본 발명의 방법은 처치 대상으로부터의 생물학적 유체의 관류(perfusion)와 복수개의 기능화된 초상자성 나노입자의 상기 생물학적 유체로의 도입을 포함한다.

처치 대상으로부터의 생물학적 유체 흐름은 제1 밸브(180a)에 의해 제어되는 것이 바람직하다. 이러한 실시예에서, 상기 방법 및 장치는 처치대상으로부터의 생물학적 유체를 유동 순환장치를 통해 연속적으로 흐르게 하는데, 강제 유동된 생물학적 유체는 처치 대상을 빠져나가는 유량(유속)(flow rate)과 실질적으로 동일한 유량(유속)으로 처치 대상으로 복귀된다. 기능화된 초상자성 나노입자는 저장소(120) 밖으로 펌핑되어 나가고 생물학적 유체와 혼합된다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 전형적으로 나노입자는 제1 밸브(180a)를 통과하고, 생물학적 유체 및 나노입자는 상기 제1 밸브를 빠져나온 후 철저한 혼합을 위해 혼합 챔버(140)로 들어간다.

생물학적 유체로 도입되는 기능화된 초상자성 나노입자의 양 또는 수는 전이성 암세포 또는 바이러스에 의해 감염된 세포의 수준에 따라 가변된다. 따라서, 전이성 암세포 또는 바이러스에 의해 감염된 세포의 수준은 생물학적 유체로 기능화된 초상자성 나노입자가 도입되기 전에 결정되는 것이 바람직하다. 필요하다면, 추가의 기능화된 초상자성 나노입자가 저장소로 추가되어 각각의 암세포 또는 바이러스 감염된 세포가 적어도 하나의 기능화된 초상자성 나노입자에 결합되는 것을 확실하게 할 수 있다.

복수개의 기능화된 초상자성 나노입자의 유동계로의 도입과 측정을 용이하게 하기 위해, 기능화된 초상자성 나노입자의 현탁액이 준비되고 저장소(120)에 저장되는 것이 바람직하다.

다음으로, 생물학적 유체 및 기능화된 초상자성 나노입자는 상기 생물학적 유체를 상기 기능화된 초상자성 나노입자와 혼합하거나 흔들기 위한 혼합 챔버(140)로 유동되어 리간드에 의한 암세포의 접촉을 촉진한다. 생물학적 유체 및 기능화된 초상자성 나노입자의 혼합물은 적절한 시간 동안 혼합 챔버 내에 머물면서 표적 세포가 하나 이상의 기능화된 초상자성 나노입자에 접촉하고 결합하여 복합체를 형성하는 것을 확실하게 한다. 나노입자에 부착된 결합 파트너와 세포 표면 상의 수용체 사이의 접촉시 결합 가능성 및 결합 강도는 수용체에 대한 결합 파트너의 친화도 및 이들이 서로 접촉하는 시간의 함수이다. 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 50% 이상의 표적 세포가 하나 이상의 기능화된 초상자성 나노입자에 결합됨으로써 복합체를 형성하면 유체를 완전히 여과하기 위해 필요한 순환 회수를 감소시킬 수 있다. 예로서, 연구에 의하면 EphA2를 발현하는 암세포 100%는 신체 밖 장치에서 15분 후에 펩타이드 기능기에 의해 제거될 수 있다.

다음 단계로, 생물학적 유체, 나노입자-세포 복합체 그리고 자유로운 나노입자 및 복합체를 형성하지 않은 세포는 혼합 챔버 밖으로 나가고 자성 필터용 용기 입구로 들어간다.

상기 자성 필터는 입구 및 출구를 가진 용기를 포함한다. 또한, 상기 용기는 스크린을 포함하는 것이 바람직하다. 자석은 상기 용기 외부에 있는 것이 바람직하다. 자석은 자기장을 생성한다. 일실시예에서, 자석은 하나 이상의 영구 자석이다. 다른 실시예에서, 자석은 전자석이다. 바람직하게는, 자기장은 스크린을 자화하여 나노입자가 부착하는 보다 큰 표면적을 제공하게 된다.

상기 나노입자-세포 복합체를 가진 생물학적 유체가 스크린과 접촉할 때, 자유로운 나노입자 및/또는 나노입자-세포 복합체는 상기 스크린에 부착한다. 이러한 방식으로, 상기 복합체는 자성 필터를 통한 생물학적 유체의 연속적인 전방향 흐름에 대해 단단히 고착된다. 선택적으로, 상기 흐름은 일정 지점에서 정지될 수 있고, 상기 필터는 자유로운 나노입자 및/또는 나노입자-세포 복합체의 제거와, 선택적으로 나노입자-세포 복합체의 시험을 위해 상기 장치로부터 제거될 수 있다.

어떠한 자유로운 나노입자 및/또는 나노입자-세포 복합체도 스크린에 부착되지 않았다면, 이들은 여과물과 함께 자성 필터 밖으로 유동될 수 있고, 선택적으로 저장소에 도입되어 1회 이상 상기 혼합 챔버 및 자성 필터를 통해 재순환됨으로써 여과물이 환자로 복귀되기 전에 모든 나노입자들이 제거되는 것을 확실하게 할 수 있다. 강제 유동된 생물학적 유체에 의해 자성 필터를 떠난 초상자성 나노입자가 없다는 것을 확인하기 위해 광센서 또는 유사한 검출기(220)가 제공될 수 있다. 센서(220)가 하나 이상의 초상자성 나노입자를 검출하면, 상기 센서는 신호를 관리 소자에게 송신하고 제2 밸브(180b)는 생물학적 유체를 환자로 전송하는 라인에 대해 폐쇄되어 여과물은 재순환을 위해 저장소(120)로 보내진다. 이는 초상자성 나노입자가 처치 대상 순환계로 들어가는 것을 방지한다.

선택적으로, 상기 장치는 하나 이상의 자성 필터를 포함한다. 선택적으로, 상기 자성 필터는 나란히 구성되고, 방향성 밸브 시스템은 자성 필터 사이에서 나노입자-세포 복합체를 포함하는 생물학적 유체의 흐름을 교체하여 자기적으로 부착된 복합체를 하나의 자성 필터로부터 제거하면서 보다 많은 복합체가 제2 필터에 수집되는 것을 가능하게 한다. 즉, 생물학적 유체는 2개 이상의 자성 필터 사이에서 간헐적으로 채널링되어 순환 장치를 통한 생물학적 유체 흐름의 중단 없이 필터들을 세정하는 것을 가능하게 한다.

마지막으로, 생물학적 유체가 하나 이상의 자성 필터를 떠날 때, 생물학적 유체는 실질적으로 미리 선정된 암세포가 제거된 상태가 된다. 생물학적 유체가 충분히 정화된 것을 증명하기 위해, 상기 장치는 자성 필터에 이어 사이펀 튜브 또는 샘플링 포트를 포함할 수 있다.

전체 시스템이 혈액 투석 시스템에서 사용된 것과 유사한 연속적인 유동 순환 장치가 되도록 처치 대상에 직접 이르게 되는 유동 라인(x)이 제공된다.

a. 초상자성 나노입자의 투여량(Dosing)

기능화된 초상자성 나노입자의 적합한 농도 및 부피가 본 명세서에 기술된 장치 및 방법에 사용될 수 있다. 사용되는 양과 부피는 요구되는 처치의 함수이다. 예시로서 일실시예에서 나노입자의 농도는 표적 세포 또는 병원체 당 1-100개의 나노입자를 제공하는 것으로 충분하다.

b. 유량(Flow rate)

유량은 처치에 기반하여 선택된다. 유량은 혈액여과, 혈액투석 및 복막 투석 절차를 위해 인정되는 표준 개요와 일치되도록 설계되고, 유체의 형태나 물리적 특성(즉, 점성)과, 환자의 물리적 특성(즉, 나이, 몸무게, 신장, 성별)에 따라 가변된다.

B. 생체내 처치(In Vivo Treatment)

생체내 처치 단계들은 장치가 전형적으로 혼합 챔버를 포함하지 않고 이에 따라 복합체 형성을 위해 적합한 시간 동안 혼합하는 단계가 없는 것을 제외하고는 생체외 처치 단계들과 유사하다. 또한, 생물학적 유체를 환자로부터 제거하기 전에 기능화된 초상자성 나노입자를 통상 주입을 통해 환자에 먼저 투여한다. 암세포가 초상자성 입자에 대한 복합체를 형성하기에 적합한 시간이 경과한 후, 생물학적 유체의 일부가 적합한 유량으로 환자로부터 제거되고, 초상자성 나노입자 및 이의 복합체의 제거를 위해 생체내 장치(in vivo device)로 투여된다.

a. 초상자성 나노입자의 투여량(Dosing)

b. 유량(Flow rate)

C. 초상자성 나노입자의 제거

일실시예에서, 상기 생체내 장치는 환자에게 투여된 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 자성 필터를 기존의 혈액여과 또는 투석 장치에 추가함으로써 초상자성 나노입자는 환자로부터 제거될 수 있다(예를 들어, 도 2A 내지 도 2C 참조).

다른 실시예에서, 신체 밖 장치가 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자가 미리 투여된 환자로부터 생물학적 유체를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시예에서, 저장소는 화학적 치료제를 추가하고 필요하다면 복강과 같은 체강 내의 유체 수준을 제어(즉, 체강 내에서의 배출 및 충전)하기 위해 사용될 수 있다. 저장소가 불필요하다면, 밸브(180a)는 저장소에 대해 폐쇄될 수 있다. 이러한 실시예에서, 혼합 챔버는 선택사항일 수 있다.

일실시예에서, 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자는 치료제 또는 진단제를 전달하기 위해 먼저 환자에게 투여된다. 일실시예에서, 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자는 형광 염료와, 환자의 동맥 내 폐색을 뚫기 위한 혈전용해제와 함께 적합한 리간드를 포함할 수 있다. 폐색 부위에 유효량의 혈전용해제의 전달 후, 혈전은 용해되면서 환자의 몸 속에 자성, 상자성 또는 초상자성 나노입자를 남기게 된다. 이들 입자들은 본 명세서에서 기술된 장치들을 이용하여 제거될 수 있다.

본 발명의 기술분야의 당업자라면 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 동등물을 인지할 것이며 통상적인 실험을 이용하여 확인할 것이다. 이러한 동등물도 첨부된 청구항에 의해 보호되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예

실시예 1. 펩타이드로 코팅된 초상자성 CoFe ₂ O ₄ 나노입자에 의한 쥐 암세포의 시험관내 포획

생체적합성 폴리머 코팅과 YSA 펩타이드 컨쥬게이트를 가진 초상자성 CoFe ₂ O ₄ 나노입자의 준비

초상자성 CoFe₂O₄ 나노입자는 미셀 방법에 의해 합성되었고, 15% 미만의 크기 분포를 가지면서 평균 직경이 8nm였다. 상세한 실험 과정들은 다음의 문헌에 보고되어 있다(Scarberry, et al., "Magnetic Nanoparticle-Peptide Conjugates for in Vitro and in Vivo Targeting and Extraction of Cancer Cells", J. Amer. Chem. Soc'y., 130 (31), 10258-10262 (2008)).

나노입자 (200 mg) 및 폴리갈락투론산 (600 mg, Alfa Aesar)이 대기온도에서 80 mL의 5M NaOH 용액에 첨가되었다. 모델 60 소닉 디스멤브레이터(Model 60 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific))로 5시간 동안 초음파처리를 한 후 코팅된 나노입자가 자석을 이용하여 용액에서 분리되었다. 물로 수차례 세척한 후, 코팅된 나노입자가 증류수에 재현탁되었다.

글루쿠론산이 유사한 과정으로 생체적합성 코팅으로서 시험되었다. GGGGYSAYPDSVPMMSK의 서열을 갖는 1.9 mg의 펩타이드가 폴리갈락투론산이 코팅된 나노입자의 10mL 수용성 현탁액(∼1.7×10¹⁵ 입자/mL)에 첨가되었다. 상기 혼합물이 수 분 동안 초음파처리되었다. 용액은 빛으로부터 보호되었고 하룻밤 동안 4℃에서 보관되어 폴리머 코팅 상의 카르복시기와 C-말단 리신 잔기 상의 1차 아민 사이의 아미드 결합을 형성하였다.

YSA 펩타이드는 문헌(Clark, et al., J. Biol. Chem., 276: 37431-37435 (2001))에 보고된 바와 같이 표준 Fmoc 화학을 이용하여 합성되었다. 로다민 태그는 N-말단 상에 컨쥬게이트되었고, 로다민을 결합 영역으로부터 거리를 두어 수용체 결합에 대한 입체적 방해를 방지하기 위해 4개의 N-말단 글리신 잔기들이 사용되었다.

세포 생장

BG-1 세포주를 다음의 기관이 제공한 것을 입수하였다(Julie M. Hall and Kenneth S. Korach of the Environmental Disease and Medicine Program, Research Triangle Park, NC). BG-1 세포는 37℃에서 5% CO₂환경 하에 10% 열-불활성화된 FBS(fetal bovine serum) (Invitrogen), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Mediatech, Inc., Herndon, VA)이 보충된 DMEM:F12/50:50 (Invitrogen)에서 배양되었다.

Hey 세포주는 다음의 기관이 제공한 것을 입수하였다(Gordon Mills, Department of Molecular Therapeutics, The University of Texas, MD Anderson Cancer Center). Hey 세포는 37℃에서 5% CO₂환경 하에 2 mM의 L-글루타민(Sigma), 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 RPMI 1640 (Mediatech)에서 증식되었다.

세포 염색

세포들은 37℃에서 5% CO₂환경 하에 하룻밤 동안 20 mg/mL의 플루오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate)(FDA)(Research Organics) 또는 20mg/mL의 5(6)-카르복시에오신 디아세테이트(Research Organics)와 함께 인큐베이션되었다. 세포들은 트립신+EDTA에 의해 세포 배양 플라스크로부터 제거되었고, PBS로 한번 세척한 후 2.8×10⁶세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 공초점 이미징을 위해, 세포들은 챔버 슬라이드(Laboratory Tek)상에서 하룻밤 동안 인큐베이션되었고, 다음날 PBS로 세척하였다. 컨쥬게이트된 YSA 펩타이드가 있거나 없는 로다민-표지된 나노입자가 세포들에 첨가되었고, 37℃에서 5% CO₂환경 하에 1시간 동안 인큐베이션되었다. 세포들은 세척되었고 4% 파라포름알데히드에서 고정된 후 이미징 분석을 위해 덮개 유리로 커버되었다.

마우스 연구

암컷 nu/nu 마우스를 타코닉(Taconic)(Hudson, NY)으로부터 입수하였고, Balb/c 마우스를 할란(Harlan)(Indianapolis, IN)으로부터 입수하였다. 모든 실험들은 조지아 기술 연구소(Georgia Institute of Technology)(Atlanta, GA)에 있는 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행되었다.

현미경

시험관내 연구들은 녹색 및 적색 필터와 수은 쇼트 아크형 HBO 램프(mercury short arc HBO lamp)를 갖춘 올림푸스 IX71 도립현미경 상의 40× 대물렌즈를 이용하여 수행되었다. 이미지와 비디오는 올림푸스 DP71 12.5 밀리온 픽셀 디지탈 카메라를 이용하여 촬영되었다. 공초점 이미지는 Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 40× 대물렌즈에 의해 얻어졌다.

결과 및 분석

자성 CoFe₂O₄ 나노입자는 면역 부작용 반응을 감소시키고 표면 개질을 용이하게 하기 위해 생체적합성 폴리갈락투론산으로 코팅되었다. 폴리머의 코팅 후, 입자들은 불규칙한 형상으로 되었고, 치수가 100-200nm 범주였다. 또한 글루쿠론산 은 각각의 나노입자에 5-10nm 두께의 셸(shell)을 형성하는 생체적합성 코팅으로서 매우 잘 적용되었다.

Hey 및 BG-1 난소 암종 세포주는 실시예 1에서 사용되었다. Hey 및 BG-1 세포주 모두 EphA2의 발현을 나타내는데, Hey 세포주에서의 발현이 수배 높았다. 시험관내에서 세포 표적화 및 자성 끌어당김을 시험하기 위해, 상기 암세포주는 610nm에서 적색 발광하는 로다민 태그를 갖는 나노입자 컨쥬게이트와 구별될 수 있는 515nm에서 녹색 발광하는 플루오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate)(FDA)로 인큐베이션하였다.

표지된 Hey 세포를 연동 펌프(peristaltic pump)에 의해 구동되는 순환계로 도입하여 EphA2 발현 세포가 유동 스트림(flow stream)으로부터 추출될 수 있는지를 결정하였다. ~1.22 mL/분의 내부 유속(flow rate)를 갖는 모세관을 순환 장치 중심에 놓고 현미경의 대물렌즈 위에 위치시켰다. 녹색 형광의 Hey 세포의 연속적인 유동이 모세관을 통해 관찰되었다.

로다민-태그된 자성 나노입자-YSA 펩타이드 컨쥬게이트의 도입 후 대략 2분 후에 ∼2600 가우스의 자기장 세기를 갖는 자석을 상기 모세관 일측에 위치시켰고 그 결과 상기 자석에 가장 근접한 모세관 벽에 Hey 세포들이 모였다. 자석이 제거될 때, 모여진 Hey 세포 집합체는 신속히 순환 스트림으로 되돌아가 분산되었다.

세포들은 동일한 자성 나노입자가 사용되었으나 YSA 펩타이드가 없는 경우 자석에 대한 반응을 나타내지 않았다.

자석에 의한 암세포의 포획은, 펩타이드로 기능화된 나노입자가 세포로 하여금 자기적으로 끌어당겨지게 되도록 유발하는 것을 설명하고 있다.

Hey 세포들에 대한 YSA-컨쥬게이트된 자성 나노입자의 특이적 결합은 공초점 현미경 연구에 의해 입증되었다. Hey 세포들은 하룻밤 동안 챔버 슬라이드에서 인큐베이션되었고, 상기 슬라이드에 부착되도록 하였다. 다음날, 세포들은 세척되었고, 로다민-태그된 자성 나노입자, 또는 로다민-태그된 자성 나노입자와 YSA 펩타이드의 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션되었다. 그런 다음, 세포들은 고정되었고, 세포들에 대한 자성 나노입자의 결합은 형광 하에서 조사되었다.

로다민-태그된 자성 나노입자와 함께 인큐베이션된 세포들은 나노입자에 대해 결합이 거의 되지 않거나 전무한 반면에, 로다민-태그된 자성 나노입자와 YSA 펩타이드의 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션된 세포들은 세포 표면적의 상당 부분에 걸쳐 나노입자의 결합을 보였다(20O배 확대 관찰). 또한, 로다민-태그된 자성 나노입자와 YSA 펩타이드의 컨쥬게이트를 가진 Hey 세포들은 보다 높은 배율(400배)에서 관찰되었다. 고배율 관찰은 자성 나노입자들이 YSA 펩타이드/EphA2 상호작용을 통해 Hey 세포들에 대해 특이적으로 결합하는 것을 증명하였고 이는 YSA 태그가 없는 나노입자의 비특이적 결합은 배경신호값에 가깝다는 것을 설명하였다.

생체내 세포 포획 시험을 위해, 500 ㎕의 PBS 내의 대략 1.4×10⁶ FDA-적재된 Hey 세포들이 마취된 암컷 nu/nu 마우스의 복막으로 주입에 의해 도입되어 세포 확산을 촉진하기 위해 5분간 부드러운 복부 마사지로 세포 확산이 이루어지게 하였다.

마우스의 복부는 입체 현미경 하에서 488nm 광에 노출되었고, 주입 부위나 근처에서 가시적인 형광 신호는 검출되지 않았다. 이러한 단계 후 500 ㎕의 로다민-태그된 자성 나노입자-YSA 펩타이드의 컨쥬게이트를 주입하였다.

추가의 5분간의 복수 마사지 후 마우스의 복부를 현미경 하에서 조사하였다. 가시적인 형광신호는 관찰되지 않았다.

~1cm³의 크기를 갖는 2600 가우스의 자석을 30초 동안 마우스 복부 피부 위에 위치시킨 후 제거하고, 마우스를 재차 488 nm 광에 노출시켰다. FDA-적재된 Hey 세포들로부터의 녹색광 방출이 자석을 위치시킨 곳의 피부를 통해 명확히 관찰되었고, 이는 상기 위치에서 Hey 세포들이 상당량 모인 것을 나타낸다. 로다민 태그를 여기시키기 위해 여기 파장이 530nm로 전환될 때, 적색광 방출이 동일한 지점에서 피부를 통해 관찰되었고 이는 로다민-태그된 나노입자 컨쥬게이트의 존재를 나타내며, 이는 투명한 시야에서의 검은 덩어리의 존재와 일치하는 것이었다.

자석을 이동시켜 최초 집합체 부위로부터 약 1cm 정도 끌어당겼고, 녹색 및 적색 형광 스팟은 새로운 위치로 이동되었다. 마우스에 대한 자석의 적용 전에 가시적인 형광신호가 검출되지 않은 것은 세포들과 나노컨쥬게이트의 분산을 암시하였다.

자석 적용으로 얻어진 결과들은 Hey 세포들이 YSA 펩타이드/EphA2 인지를 통해 마우스의 복강 내에서 자성 나노입자 컨쥬게이트에 의해 포획되었고, 자석을 복강 상부로 위치시켜 강화되었음을 나타낸다.

동일한 연구가 FDA-적재된 BG-1 난소암세포에 대해 수행되었다. 시험관 내에서는 BG-1 세포들의 형광이 Hey 세포들 만큼 강하지만, 488nm 여기광에 마우스의 복부 노출시 피부를 통한 가시적인 형광 방출은 관찰되지 않았다. 외부 복부 피부를 제거한 후 복부를 통한 형광이 관찰되었다. 방출 형광은 동일한 수의 Hey 세포들에 의해 생성된 형광에 비해 훨씬 약했다. 여기 파장이 530nm로 전환될 때 강한 적색 형광이 명확히 보였고, 나노입자는 밝은 시야에서 쉽게 관찰되었다.

이는 BG-1 세포 집합체의 결여가 로다민-태그된 자성 나노입자 컨쥬게이트에 기인한 것이 아니라는 것을 나타낸다. 따라서, BG-1 세포들로부터의 낮은 형광 방출 강도는 BG-1 세포주에 의한 EphA2 수용체 발현이 상대적으로 낮기 때문에 나노입자 컨쥬게이트에 의해 포획되는 세포 수가 적기 때문인 것으로 해석될 수 있다.

전체 4회 실험은 각 세포주에 대해 수행되었고 유사한 결과를 나타내었다.

Hey 세포들과 BG-1 세포들의 추출 효율의 상이점은, YSA 펩타이드의 특이도는 복강 내에서 Hey 세포들과 BG-1 세포들의 혼합 집단에 대한 생체내 자성 추출 실험에 의해 확인됨을 시사한다. Hey 세포들은 FDA로 인큐베이션되었고, BG-1 세포들은 560nm 방출을 갖는 5(6)-카르복시에오신 디아세테이트(CDA)로 인큐베이션되었다. 각 세포주로부터 동등한 수의 세포들이 혼합되고 3마리의 Balb/c 암컷 마우스의 복강 내로 도입되었다. 5분간의 세포 인큐베이션 및 복부 마사지 후, 자성 나노입자 컨쥬게이트가 복강 내로 주사되었고 5분간 인큐베이션되었다. 복수를 추출하여 자기적으로 여과한 후 혈구 계산기(hemocytometer)를 이용하여 조사함으로써 녹색 형광(Hey) 및 적색 형광(BG-1) 세포들의 수를 결정하였다.

최초 혼합된 세포 집단은 50% Hey 세포들과 50% BG-1 세포들을 포함하였으나, 3회 실험의 평균을 할 때 Hey 세포들이 추출된 세포 집단의 95-100%를 차지하였다(도 3 참조). 추출된 세포 집단에서 BG-1 세포들의 결핍은 YSA 펩타이드-자성 나노컨쥬게이트의 특이도와 일치하였다. EphA2 수용체에 대한 YSA 펩타이드의 높은 특이적 결합은 자성 컨쥬게이트로 하여금 EphA2가 많은 난소암종을 EphA2가 적은 세포들로부터 식별하는 것을 가능하게 해 준다.

실시예 2. 펩타이드로 코팅된 초상자성 CoFe ₂ O ₄ 나노입자의 인간 복수 샘플 내의 세포들에 대한 시험관내 결합

나노입자 합성

초상자성 CoFe₂O₄ 나노입자는 마이크로에멀션 기술에 의해 합성되었고, 15% 미만의 크기 분포를 가지면서 평균 직경이 8nm였다. 상세한 실험 과정들은 다음의 문헌에 보고되어 있다(Scarberry, et al., "Magnetic Nanoparticle-Peptide Conjugates for in Vitro and in Vivo Targeting and Extraction of Cancer Cells", J. Amer. Chem. Soc'y., 130 (31), 10258-10262 (2008)).

나노입자 코팅 및 펩타이드 컨쥬게이션

600mg의 CoFe₂O₄ 나노입자들을 300mL의 5M NaOH에 첨가하였고, 10분 동안 초음파처리하였다[모델 60 소닉 디스멤브레이터(Model 60 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific)-19로 파워 세팅]. 1800 mg의 글루쿠론산이 용액에 첨가되었고, 1.5시간 동안 초음파 처리가 지속되었다. 얻어진 산물을 5000 가우스 자석을 이용하여 자기적으로 분리하였고, PBS로 3회 세척한 후 600 mL의 증류수에 재현탁하여 나노입자 농도를 대략 1 mg/mL로 맞추었다. 대조군 연구에 사용된 입자들은 이러한 보관 용액에서 취하여 사용되었다.

펩타이드 컨쥬게이트를 추가하기 위해, 글루쿠론산으로 코팅된 나노입자들은 300 mL의 보관 용액으로부터 자기적으로 여과된 후 30mL의 0.2 M 중탄산나트륨(pH 9.6)에서 재현탁되었다. 0.088 M 나트륨 과요오드산(sodium periodate) 용액 중 3 mL가 첨가되었고, 20분간 암실에서 반응하도록 하였다. 5000 가우스 자석을 이용하여 나노입자들을 재차 용액으로부터 자기적으로 여과하였고, 30mL의 0.2 M 중탄산나트륨(pH 9.6)에서 재현탁하였다. 60mg의 N-말단이 로다민으로 컨쥬게이트된 펩타이드 GGGGYSAYPDSVPMMSK (2127.9 g/mol)가 6 mL의 0.2 M 중탄산나트륨(pH 9.6)에 용해되었고, 30 mL의 나노입자 용액과 섞었다. 2시간 동안 빛을 줄인 환경 하에서 실온에서 플랫폼 쉐이커 상에서 반응이 수행되었다. 360㎕의 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)(5M)가 흄후드(fume hood)에서 용액에 첨가되었고, 동일한 조건 하에서 추가 30분 동안 반응이 진행되었다. 1.8 mL의 2-아미노에탄올이 미반응 알데히드에 첨가되었고 추가 30분 동안 반응이 진행되었다. 최종 산물은 5000 가우스 자석을 이용하여 용액으로부터 자기적으로 분리되었고, 0.1 M 소디움 포스페이트 완충용액(sodium phosphate buffer)으로 10회 세척되었으며, 300 mL의 증류수에 재현탁되었다.

나노입자의 평균 직경 (약 8 nm), 나노입자의 밀도 (5.29 g/mL), 및 펩타이드의 분자량(2127.9 Da)은 대략적인 펩타이드 대 입자 비율(거의 81:1)을 계산하는데 사용되었고, 전체 반응물 소비량을 추측하였다.

펩타이드 합성

GGGGYSAYPDSVPMMSK 펩타이드는 문헌(Clark, et al., J. Biol. Chem., 276: 37431-37435 (2001))에 보고된 바와 같이 표준 Fmoc 화학을 이용하여 합성되었다. 로다민 태그는 N-말단 상에 컨쥬게이트되었고, 로다민을 결합 영역으로부터 거리를 두어 EphA2 수용체 결합에 대한 입체적 방해를 방지하기 위해 4개의 N-말단 글리신 잔기들이 사용되었다.

복수액(Ascites Fluid) 준비

복수 샘플은 다음과 같은 기관으로부터 입수하였다(Ovarian Cancer Institute of Atlanta, Georgia). 복수 샘플은 10% DMSO 내에서 -80℃에서 보관되었고 사용준비를 위해 37℃ 항온조(water bath)에서 해동시켰다.

세포추출

시험되는 각 샘플에 대해, 5개의 12×75 mm 크기의 바닥이 둥근 튜브가 다음과 같이 표지되었다: 튜브 1-순수한 복수, 튜브 2-잔류물(filtrand), 튜브 3-여과액(filtrate), 튜브 4-잔류물(filtrand) 대조군, 튜브 5-여과액 대조군.

500 ㎕의 복수액이 튜브 1, 2 및 4에 첨가되었다. 700 ㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)가 튜브 1에 첨가되었고, 분석을 위해 얼음 상에 보관되었다. 200 ㎕의 펩타이드 컨쥬게이트된 자성 나노입자(1 mg/mL) 및 500 ㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)가 튜브 2에 첨가되었다. 튜브 2는 15초간 볼텍싱되었고 손으로 10분간 흔들었다. 그런 다음, 튜브 2는 10분간 5000 가우스 자석에 부착하였다. 상기 튜브에 자석이 부착된 상태로 복수액은 튜브 2로부터 피펫으로 취해졌고 튜브 3으로 옮겨 튜브 3은 분석을 위해 얼음 상에서 보관되었다. 포획된 자성 나노입자는 멸균된 PBS로 3회 세척되었고 300㎕의 멸균된 PBS에서 재현탁되었다. 300 ㎕의 나노입자 용액은 12×75 mm 크기의 바닥이 둥근 튜브의 캡을 통해 여과되었고 멸균된 PBS를 이용하여 1200 ㎕까지 부피를 늘렸으며, 튜브 2는 분석을 위해 얼음 상에서 보관되었다. 펩타이드 컨쥬게이트(1 mg/mL)를 갖지 않는 200 ㎕의 자성 나노입자와 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)가 튜브 4에 첨가되었다. 튜브 4는 15초간 볼텍싱되었고 손으로 10분간 흔든 다음 10분 동안 5000 가우스 자석에 부착되었다. 상기 튜브에 자석이 부착된 상태로 복수액은 튜브 4로부터 피펫으로 취해졌고 튜브 5로 옮겨 튜브 5는 분석을 위해 얼음 상에서 보관되었다. 포획된 자성 나노입자는 멸균된 PBS로 3회 세척되었고 300㎕의 멸균된 PBS에서 재현탁되었다. 300 ㎕의 나노입자 용액은 12×75 mm 크기의 바닥이 둥근 튜브의 캡을 통해 여과되었고 멸균된 PBS를 이용하여 1200 ㎕까지 부피를 늘렸으며, 튜브 4는 분석을 위해 얼음 상에서 보관되었다. 튜브 1-5는 BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용하여 즉각 분석되었다.

세포표면 염색

300 ㎕의 복수액을 500㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)를 포함하는 12×75 mm 크기의 바닥이 둥근 튜브 내에서 재현탁하였다. 형광단-컨쥬게이트된 항체를 포함하는 모든 작업들은 암실에서 행해졌다. 샘플들은 4℃에서 5분 동안 800 RPM으로 원심분리되었고, 상등액 부피는 튜브 바닥의 300㎕ 까지 감소시켰다. 100㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)를 샘플에 첨가하였고, 튜브를 부드럽게 흔들어서 세포들을 재현탁시켰다. 10㎕의 1차 항체가 첨가되었고, 샘플은 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션되도록 처리되었다. 500 ㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)가 각 샘플에 첨가되었고, 샘플들은 4℃에서 5분 동안 800 RPM으로 원심분리되었다.

a. 직접 염색(Direct Staining)

먼저 3회에 걸친 세척 과정이 수행되었고, 세포들은 1200㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)에서 재현탁되었으며, BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용하여 즉각 분석되었다.

b. 간접 염색(Indirect Staining)

3회에 걸친 세척 과정이 수행되었고, 세포들은 100㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)에서 재현탁되었다. 10㎕의 2차 항체가 첨가되었고, 샘플은 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션되도록 처리되었다. 500 ㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)가 각 샘플에 첨가되었고, 샘플들은 4℃에서 5분 동안 800 RPM으로 원심분리되었다. 3회에 걸친 세척 과정이 수행되었고, 세포들은 1200㎕의 얼음 냉각 PBS (10% FBS, 1% 소디움 아자이드)에서 재현탁되었으며, BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용하여 즉각 분석되었다.

유동세포계수법(Flow Cytometry)

BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용한 각 샘플의 분석을 위해, 소프트웨어 구성들(BD Facs/Diva, BD Biosciences)을 일치시켜 유지하였다. 전면 산란 검출기(FSC) 및 측면 산란 검출기(SSC) 패턴들이 4-데케이드 로그 증폭기(4-decade log amplifier)에 의해 기록되었다. 역치는 2000으로 설정되었고, FSC, SSC, FITC 및 PE-A 파라미터들을 위한 전압은 각각 505, 236, 500, 및 401로 설정되었다.

각 시험에 대해 10,000개의 이벤트가 기록되었다. 집단의 게이팅(Gating)이 특정 환자 샘플에 대해 설정되었고 통계적 생존력(statistical viability)을 보존하기 위해 연속되는 실험들로 카피되었다.

형광 현미경

유동세포계수 분석을 위해 사용되는 각 튜브로부터의 100 ㎕ 용액이 10㎕의 트립판 블루와 함께 팔콘 튜브(falcon tube)에 첨가되었고, 관찰을 위해 소량이 플레이트 위에 놓여졌다. 2500 가우스의 자석이 튜브 2로부터 용액 내 자성 나노입자들을 모으기 위해 사용되었고, 모아진 집합체 및 유체는 관찰(올림푸스 X51 도립 형광현미경) 및 이미징(올림푸스 DP-71)을 위해 현미경 슬라이드 위에 놓여 졌다.

결과들

세포유동계수법이 순수한 복수액, 펩타이드-컨쥬게이트되거나 컨쥬게이트되지 않은 초상자성 나노입자를 이용하여 샘플들로부터 제거된 잔류물(filtrand), 그리고 잔류물이 제거된 후 샘플 내에 잔존하는 여과액(filtrate)을 분석하기 위해 사용되었다.

2변수 분석이 펩타이드-컨쥬게이트된 나노입자를 이용하여 추출된 세포수와, 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 나노입자를 이용하여 추출된 세포수 사이의 유의적인 변이를 확립하기 위해 사용되었다.

면역표현형 기술(Immunophenotyping techniques)은, 집단 내에 존재하는 추출된 세포들이 난소선암세포와 연관된 마커들 또는 이들 마커들을 나타낼 수 있는 항원 제공 세포들에 대해 양성인지를 여부를 시험하여 입증하기 위해 사용되었다.

추출된 세포 집단의 확인

복수액 샘플 내에 체류하는 세포 집단들에 대한 기준치(baseline)는 처치되지 않은 샘플들을 BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용하여 분석할 때 생성되는 전면 산란 검출기(FSC) 및 측면 산란 검출기(SSC) 패턴들의 2변수 표시들을 관찰함으로써 결정되었다. 환자 샘플 914 및 923에 대해 수행된 3번의 분리된 실험에 대한 점 그래프가 준비되었다. 산포도(scattergram)에서의 분포는 각 실험에 걸친 형태적인 일치성을 보여준다. 이러한 일치도의 양적인 확인은, 각 환자에 대한 첫번째 실험에 대한 밀도 그래프 상에서 시각적으로 분리되는 집단들을 게이팅(gating)하고 이들 게이트들(gates)을 각각의 연속되는 실험에 복제하며, 각각의 게이팅된 집단에 대한 전체 기록 이벤트의 백분율(전체 %)을 나타냄으로써 획득될 수 있었다.

글루쿠론산으로 코팅되고 N-말단에서 로다민이 컨쥬게이트된 17개 잔기의 펩타이드 기능기(GGGGYSAYPDSVPMMSK)를 갖는 초상자성 CoFe₂O₄나노입자 (200㎕-1 mg/mL)를 멸균 PBS 내에 희석된 1.0 mL의 복수 삼출 샘플 (희석비 1:2)에 첨가하였고, 10분 동안 대기 온도 하에서 인큐베이션하였다. 초상자성 나노입자 컨쥬게이트(잔류물)는 5000 가우스의 자석에 대해 10분간 노출된 샘플로부터 자기적으로 여과되었다. 상기 잔류물은 멸균된 PBS로 3회 세척되었고 300㎕의 멸균된 PBS에서 재현탁되었으며, 12×75 mm 크기의 팔콘 튜브의 캡을 통해 4℃에서 5분간 800 RPM으로 여과되었다. 상기 잔류물 샘플의 부피는 1200 ㎕까지 증가되었다. 추출 후 잔존하는 여과액은 12×75 mm 크기의 팔콘 튜브에 첨가되었다. 잔류물 및 여과액은 BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용하여 분석되었다.

잔류물 및 여과액 샘플에 대한 유동세포계수 분석의 점 그래프들의 형태는 환자 914 및 923으로부터 처치되지 않은 복수액 샘플에 대한 유동세포계수 분석(실험 1-3)의 점 그래프들과 유사하지 않았다. 각 환자에 대해 처치되지 않은 복수액 실험으로부터의 게이트들(gates)은 잔류물 및 여과액 샘플로부터 얻어진 점 그래프들 상에 겹쳐게 하여 각 집단에 대한 전체 % 변화(델타)를 결정하였다.

코팅된 자성 나노입자 단독 집합체에 의한 배경값 방해를 줄이기 위해, 펩타이드 컨쥬게이트가 있는 글루쿠론산 코팅된 나노입자 및 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 글루쿠론산 코팅된 나노입자 200㎕를 1.0mL 멸균 PBS를 포함하는 분리된 12×75 mm 크기의 팔콘 튜브에 첨가하였고, 샘플들을 BD LSR 유세포분석기(flow cytometer) (BD Biosciences)를 이용하여 분서하였다. 나노입자에 의해 생성된 2변수 플롯(plot)이 게이팅되었고, 복수액 샘플 2번 집단 및 3번 집단에 대한 게이트들이 상기 영역과 중첩되는 것을 최소화하기 위해 조정되었다.

실험은 각 환자 샘플에 대해 3회 반복되었고, 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 글루쿠론산 코팅된 나노입자를 이용하여 3회 이상 실험을 수행하였다.

하기 표 1은 처치되지 않은 복수액 샘플(환자 914 및 923)의 게이팅된 집단에서의 평균 세포 계수값(실험 1-3)을 펩타이드 컨쥬게이트를 가진 나노입자 및 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 나노입자를 이용하여 추출된 평균 세포 계수값과 비교하고 있다. EphA2, HEA, CA125, MAC387, 및 CD83를 발현하는 각 세포 집단에서의 세포들에 대한 "전체 %" 또한 제시되어 있다. 게이트 P1에 대해 펩타이드 컨쥬게이트된 나노입자를 이용하여 제거된 세포계수값은 비정상적으로 높지만 이는 상기 게이트에서 나노입자 단독에 의해 보여지는 배경값 방해에 의해 설명될 수 있다.

도 4A 내지 도 4K는 각 환자에 대한 세포유동계수 분석의 점 그래프들을 도시하고 있다.

표 1

각 환자의 처치되지 않은 복수액 샘플에 대한 전면 산란 검출기(FSC) 패턴 대 측면 산란 검출기(SSC) 패턴의 플롯팅에 대한 시각적 검사로 적어도 4개의 구별되는 하위 집단들을 확인하였고, 게이트 집단 1("Pl") 및 게이트 집단 2("P2")에 의해 포괄되는 영역들은 최초 가장 큰 평균 이벤트 수를 유지하였다(표 1 참조). 잔류물 및 여과물 대조군 실험으로부터의 각 집단에 대한 평균 전체 % 값 역시 표 1에 다루어져 있다.

환자 914로부터의 복수액 샘플에서 세포 평균값 5.60% +/- 1.54% (평균 +/- 표준 편차), 17.97% +/- 2.81%, 89.84% +/- 20.58%, 및 4.81% +/- 0.56%는 각각 집단 P1, P2, P3 및 P4로부터 펩타이드 컨쥬게이트된 나노입자를 이용하여 추출된 것이었고, 세포 평균값 0.19% +/- 0.13%, 0.46% +/- 0.19%, 4.53% +/- 0.74 %, 및 0.27% +/- 0.27%는 동일한 각각의 게이팅된 집단으로부터 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 나노입자를 이용하여 추출된 것이었다.

환자 923 샘플의 경우, 세포 평균값 13.70% +/- 1.0%, 20.92% +/- 2.24%, 32.05% +/- 2.37%, 및 2.13% +/- 0.87%는 각각 집단 P1, P2, P3 및 P4로부터 펩타이드 컨쥬게이트된 나노입자를 이용하여 추출된 것이었고, 세포 평균값 2.45% +/- 0.64%, 5.02% +/- 0.45%, 6.58% +/- 0.91%, 및 0.00%는 각각 집단 P1, P2, P3 및 P4로부터 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 나노입자를 이용하여 추출된 것이었다.

난소암 세포의 펩타이드 컨쥬게이트된 나노입자에 대한 결합 입증

전술한 바와 같이 환원 아민화 기술을 이용하여 나노입자에 대해 GGGGYSAYPDSVPMMSK 펩타이드를 컨쥬게이션하는 것은 PBS로 다수 세척에 의해 깨끗하게 된 자기적으로 집합된 입자들을 취하고 형광 현미경을 이용하여 이들을 관찰함으로써 입증되었다. 로다만-컨쥬게이트된 펩타이드를 가진 자성 나노입자의 집합체는 올림푸스 X51 도립 형광 현미경 상에서 올림푸스 로다민 필터를 이용하여 관찰되었다. 상기 집합체에 의해 생성된 적색 형광은 펩타이드들이 성공적으로 연결된 것을 확인하기 위해 촬영되었다.

나노입자에 대한 세포들의 흡착 그리고 이어지는 유동세포계수 분석을 시각적으로 확인하기 위해, 잔류물 샘플 100㎕이 10㎕의 트립판 블루로 염색되었고, 밝은 현미경 시야를 이용하여 이미징화되었다. 앞서 -80℃에서 보관되었기 때문에, 복수액은 죽은 세포 집단을 포함하는 것으로 추정된다. 죽은 세포들은 세포막을 통한 트립판 블루의 통과를 더 이상 방해하지 않아 이러한 기술을 이용한 밝은 시야의 이미징은 시각적으로 향상된다. 2500 가우스 자석이 사용되어 자성 나노입자들을 큰 클러스터로 집합시켜 추가적인 이미징 향상을 제공하게 된다. 나노입자 집합체는 파란색으로 나타나며, 이는 나노입자에 죽은 세포가 부착됨을 시사한다.

펩타이드 컨쥬게이트된 나노입자가 인간 복수액으로부터 난소암세포를 성공적으로 추출할 수 있는 것을 입증

추출된 세포 계수값은 카이제곱 분석에 의해 각 환자 및 실험에 대해 실험 샘플과 대조군 샘플 사이에서 비교되었다. 시험된 귀무가설(null hypothesis)은 각 게이팅된 집단에 대한 실험 그룹과 대조군 그룹에서 수집된 세포수에 있어 유의적인 차이가 없다는 것이었다. 글루쿠론산에 의해 코팅되고 17개 잔기 펩타이드 서열(GGGGYSAYPDSVPMMSK)에 컨쥬게이트된 초상자성 나노입자를 이용하여 얻어진 잔류물로부터의 세포계수값은 실험데이터 세트(a)를 구성하였고, 글루쿠론산에 의해 코팅되고 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 초상자성 나노입자를 이용하여 얻어진 잔류물로부터의 세포계수값은 대조군 데이터 세트(c)를 구성하였다. 유의도 수준 p 값의 최소값은 0.05였다. p 값이 0.05 보다 큰 경우, 컨쥬게이트된 펩타이드가 추출된 세포수에 대해 유의적인 영향을 갖지 않는 것으로 결론내렸다. p 값이 0.05 이하인 경우, 세포계수값이 펩타이드 컨쥬게이트를 이용하여 유의적으로 향상된 것으로 결론내렸다.

각각의 실험(실험 그룹 및 대조군 그룹 각각을 위한 H₁ 및 H_o)에 대해 사용되는 순수한 복수액에 대한 유동세포계수 분석으로부터 각 출발 집단의 세포수 조사가 이루어졌다. 대부분의 환자에 대한 p값이 0.05 이하로 나타났고, 17개 잔기의 펩타이드 컨쥬게이트를 가진 초상자성 나노입자는 펩타이드 컨쥬게이트가 없는 나노입자 보다 유의적으로 많은 수의 세포를 추출할 수 있는 것으로 결론내렸다.

0.05 보다 높은 p값은 보이는 유일한 실험이 환자 923으로부터 분석된 샘플들 중 집단 4로부터 나왔다. 이러한 집단으로부터 추출된 세포들은 비특이적으로 포획된 것으로 결정하였다.

17개 잔기의 펩타이드(GGGGYSAYPDSVPMMSK)가 선종에 의해 통상 발현되는 마커들을 발현하는 세포 집단들을 표적화하는 성향을 입증하기 위해 복수 삼출액이 이들 마커들에 대한 고친화성을 갖는 단클론 항체들의 패널을 이용하여 면역염색되었다.

단일 파라미터 빈도 히스토그램이 대조군과 실험 샘플을 분석하기 위해 사용되었다. 각 환자에 대해 처치되지 않은 복수액 샘플은 대조군 시편으로서 사용되었고 자기형광(autoflourescence) 수준이 4-데케이드 로그 증폭기를 이용하여 기록되었다. 각 환자로부터의 복수 삼출액의 실험 샘플들에 대해 항-CD83, 항-MAC387, BerEP4, 항-EphA2 및 항-CA125를 이용하여 분리된 실험이 수행되었다. 각각의 단클론 항체는 FITC 컨쥬게이트 또는 피코에리틴 컨쥬게이트(phycoerythrin conjugate) (EphA2)를 갖는 2차 항체를 가졌다.

실험 샘플들로부터의 히스토그램은 대조군에 대해 겹쳐져서 양자간에 변이가 있는지를 결정하였다. 이들 그래프들로부터, 환자 914 샘플에 대해 계수된 10,000개 이벤트들 중 0.22%가 EphA2 수용체에 대한 양성 발현을 나타내었고, 게이팅된 집단 Pl에서 발생하였다. 집단 P2, P3 및 P4에 대한 값은 각각 16.15%, 12.87%, 및 0.30%이었다. 환자 923으로부터의 샘플에서 양성 EphA2 발현을 보이는 백분율은 0.36% (게이트 집단 Pl), 5.6% (게이트 집단 P2), 2.71% (게이트 집단 P3), 및 0.58% (게이트 집단 P4)이었다.

EphA2 및 CAl25의 발현 수준 사이의 공분산은 환자 914로부터의 샘플들에 대한 게이팅된 집단 Pl, P2 및 P3, 그리고 환자 923으로부터의 샘플들에 대한 게이팅된 집단 Pl, P2, P3 및 P4에서 양성인 것으로 나타났다. 예를 들어, CAl25 및 EphA2는 환자 914로부터의 샘플들에 대한 P1에서 무시가능한 수준으로 발현되었고(각각 0.16% 및 0.22%), 게이팅된 집단 P2에서는 많은 수가 발현되었다(CA125의 경우 30.90%, EphA2의 경우 16.15%).

CAl25, EphA2, HEA, 및 MAC387을 발현하는 세포수가 가장 많은 것은 환자 914로부터의 샘플들에 대한 게이트 집단 P2 및 P3에서 나왔다. 그러나, HEA 발현은 양 집단에서 각각 1.43% 및 0.75 %로서 드문 편이었다.

환자 923으로부터의 샘플들의 경우, HEA를 발현하는 세포수는 P2의 경우 8.06%이었고, P3의 경우 1.52%이었다. 또한, 집단 P2, P3,및 P4에서 EphA2, HEA, CAl25, 및 MAC387을 발현하는 세포수 사이의 양성 공분산(covariance)이 존재하였고, 이들 마커들을 발현하는 세포수가 가장 많은 것은 집단 P2에서 나왔다.

CD83의 발현 수준은 양쪽 환자 샘플 모두에 대해 매우 낮았다. 환자 914로부터의 샘플들에 있어 4개의 모든 집단에 걸쳐서 평균 CD83+ 세포계수값은 0.12% +/- 0.14% (평균 +/- 표준편차)이었고, 환자 923의 경우에는 0.19% +/- 0.28%이었으며, 이는 이들 복수액 샘플에서 성숙 수지상 세포가 거의 존재하지 않는 것을 시사한다.

실시예 3. 마우스에서의 난소암 연구

난소암 생존 연구는 분산된 종양 세포의 포획과 제거가 전이를 완화시키고 생명을 연장시키는 치료적 수단으로서 채택될 수 있는지를 평가하기 위해 수행되었다. GFP(green fluorescent protein) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)로 트랜스펙션된 쥐의 난소암 세포주(ID8 GFP VEGF)가 연구를 위해 사용되었다. VEGF 발현은 신생혈관형성을 자극하고 면역 반응을 억제하여 종양 진행을 촉진할 수 있다. GFP의 발현은 정성적으로 그리고 정량적으로 분석될 수 있어 악성 종양 세포의 분산을 추적하는 메카니즘을 제공한다.

본 연구에 사용된 마우스는 2개의 대조군과 하나의 실험군으로 나누었다. 각 그룹에 7백만개의 ID8 GFP VEGF 세포를 복강 내 주사하였다. 7마리의 암컷 C57BL/6 마우스 (5-8주령)로 이루어진 제1 대조군 (대조군 A)은 추가적인 처치를 받지 않고 관찰을 위해 따로 두었다. 9마리의 암컷 C57BL/6 마우스 (5-8주령)로 이루어진 제2 대조군 (대조군 B)은 2주째와 4주째에 나노입자 없이 신체 밖 순환장치에 의한 부분적인 처치를 받았다. 8마리의 암컷 C57BL/6 마우스 (5-8주령)로 이루어진 실험군은 2주째와 4주째에 10 mg/mL의 글루쿠론산으로 코팅된 초상자성 나노입자 4mL로 완전 처치를 받았다.

실험군에 대해 설정된 "완전 처치"는 도 5에 설명되어 있다. 이는 복막을 통해 유체를 순환시키는데 사용되는 입구 캐뉼라(도 5의 부호 6) 및 출구 캐뉼라(도 5의 부호 5)에 의해 마우스를 캐뉼라 순환시키는 것을 포함한다. 캐뉼라 순환 전에 신체 밖 순환장치가 멸균 PBS 또는 링커액으로 먼저 순환처리되었다. 난소암세포 표면 수용체에 대해 선택적인 펩타이드로 기능화된 나노입자들이 혼합 챔버(도 5의 부호 3)에 첨가되었다. 일단 활성화되면, 펌프(도 5의 부호 4)는 복수액을 혼합 챔버로 순환시켰다. 복수액 내의 전이성 세포들은 혼합 챔버에서 기능화된 자성 나노입자들에 의해 포획되었고 악성 종양 세포/자성 나노입자 컨쥬게이트는 잔존 전이성 세포들이 제거되는 자성 필터 챔버(도 5의 부호 1 및 2)로 순환되었다. 여과된 용액(즉, 악성 종양 세포 및 자성 나노입자가 없는 용액)은 처치 대상의 복막으로 되돌아 순환되었다.

각 처치는 약 20분간 지속되었고, 이 시간은 전술한 장치 설정을 이용하여 마우스의 복강 내 평균 체적(약 2mL)을 10번 순환시키는데 필요한 계산된 시간이다.

시술 후, 마우스는 신체 밖 순환장치로부터 분리되었고 라인들은 배수되었다. 배수 장치는 순환 장치 내의 남아 있는 세포를 재포획하기 위해 구성되어 있고 펠릿은 마우스 복강 내로 다시 주사되었다. 이러한 마지막 단계는 추가적인 변수가 실험에 개입될 가능성을 제거하기 위해 수행되었다. 이러한 단계를 수행하지 않는 경우에는 복강 내의 전이성 세포들을 미세 전이 세포수에 영향을 주는 순환장치로 단순히 끌어들임으로써 복강 내 전이성 세포수가 효과적으로 감소될 것이다.

전술한 바와 같은 동일한 처치가 변형된 형태로 대조군 B에 대해 수행되었다. 나노입자가 사용되지 않았다. 이 대조군의 복수액은 단지 순환장치를 통해 순환되기만 하기 때문에 상기 장치 자체가 처치 대상에 치료효과를 갖는지를 결정할 수 있다. 자성 필터 내용물의 질적 분석이 시술 후 형광 현미경을 사용하여 수행되었다. 자성 필터에 의해 제거된 자성 나노입자의 밝은 시야의 이미지와, 나노입자에 결합된 녹색 형광 단백질의 존재를 나타내는 어두운 시야의 이미지는 형광 현미경을 통해 관찰되었다. 이들 이미지들은 순환 장치로부터 전이성 세포를 포획하였음을 질적으로 확인해 주었다.

ID8 GFP VEGF 세포주의 초기 복강 내 주사 후 2주째 및 4주째에 처치가 행해졌다. 이는 악성 종양 세포가 처치 대상 복강 내에 정착하고 증식하는데 2주가 걸림을 의미한다. 이러한 접근법은 대조군 및 실험군 모두 결국에는 종양이 발생할 가능성을 증가시킨다. 따라서, 상기 처치는 본 모델에서 종양 생장을 방해할 것으로 기대하지 않았다. 그러나, 그 전파는 더디게 할 것으로 기대되었다.

본 연구의 마우스는 악성 종양 세포를 최초 주입한 시점에 기록된 체중의 150%되는 시점에서 희생시켰다.

ID8 GFP VEGF 세포주를 이용한 예비 연구는 세포들이 결국에는 처치 대상에서 복수액이 많은 양으로 축적되게 하는 것을 보여 주었다. 이러한 결과를 이용하여 생존곡선이 도 6과 같이 그려졌다. 대조군 A에서 처치 대상의 100%는 36일째에 희생되어야 했다. 대조군 B는 44일째에 희생된 최종 처치대상의 11.1% 만이 43일째까지 위험한 상태였다. 대조적으로, 실험군은 60일째에 희생된 최종 처치대상의 12.5%가 49일째까지 위험한 상태였다.

로그-랭크 (멘텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트가 사용되어 3개 그룹의 생존곡선을 비교하였고, 0.0228의 p값이 얻어져서 기능화된 초상자성 나노입자로 처치함으로써 실험군이 유의적으로 혜택을 본 것이 양적으로 뒷받침되었다.

실시예 4. HIV-1 포획

HlV-1 샘플

HIV-1 샘플은 다음의 기관으로부터 입수하였다(Centers for Disease Control (Atlanta, GA)).

HIV-1 검출

ZeptoMetrix HIV-1 p24 항원 ELISA를 이용하여 RPMI 생장배지 내의 p24 단백질의 농도를, 항-gp120 컨쥬게이트를 갖는 자성 나노입자 및 항-gp120 컨쥬게이트를 갖지 않는 자성 나노입자로 처리하기 전후에 검출하였다.

결과

HIV-1 바이러스의 농도는 항-gp120 컨쥬게이트를 갖는 자성 나노입자를 이용하면 HIV-1 샘플에서 유의적으로 감소하였다. 도 6은 항체 컨쥬게이트가 없는 자성 나노입자와, 항-gp120로 기능화된 적은 수의 자성 나노입자 및 많은 수의 자성 나노입자로 처리하기 전후에서의 HIV-1을 포함하는 샘플의 p24 농도를 비교하여 도시하고 있다.

실험 조건 및 사용된 자성나노입자 숫자는 하기 표 2에 제시되어 있다. 각 그룹의 평군값은 통계학적 유의성을 결정하기 위해 원웨이 ANOVA(one way ANOVA)를 이용하여 분석되었다.

표 2: HIV-1 포획 연구 조건 및 결과의 요약

<110> Georgia Tech Research Corporation <120> SUPERPARAMAGNETIC NANOPARTICLES FOR REMOVAL OF CELLS, PATHOGENS OR VIRUSES <130> GTRC 3970/4066 <150> US 61/073,161 <151> 2008-06-17 <150> US 61/073,973 <151> 2008-06-19 <150> PCT/US2009/047717 <151> 2009-06-17 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ser Val Pro Met Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ser Val Pro Met Met Ser 1 5 10 15 Lys <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Ile Pro Val Gly Leu Ile Gly 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Ile Val Ser Leu Arg Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Pro Gln Gly Leu Ala 1 5

Claims

신체 밖 순환장치를 포함하고,
상기 신체 밖 순환장치는,
자기장 내에서 자성 나노물질을 포획하기에 충분한 자기장을 생성할 수 있는 자석, 및 제거가능하고 자성 나노물질을 포획할 수 있는 자화가능한 기질을 포함하는 자성 필터와,
상기 자성 필터와는 유체가 연통되어 있고 상기 신체 밖 순환장치를 통해 유체를 이동시키는 펌프를 포함하는, 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
상기 자화가능한 기질은 스크린인 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
상기 자성 필터와 유체가 연통되어 있는 저장소를 더 포함하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
상기 저장소와 상기 자성 필터 사이에 위치하고 상기 저장소 및 상기 자성 필터와는 유체가 연통되어 있는 혼합 챔버를 더 포함하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
장치를 이동하는 유체를 가열하는 히터를 더 포함하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
유체의 유량을 모니터링하고 유지하기 위해 상기 펌프와 전기적으로 통신가능하거나 무선 통신이 가능한 관리 소자를 더 포함하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
미리 결정된 온도로 유체를 유지하기 위해 히터와 전기적으로 통신가능하거나 무선 통신이 가능한 관리 소자를 더 포함하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
상기 자화가능한 기질은 상기 자성 필터로부터 제거가능한 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항에 있어서,
상기 저장소 및 상기 자화가능한 기질은 멸균가능한 것인 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저장소는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스의 표면 상의 결합 파트너에 결합하는 제1 결합파트너로 기능화된 초상자성 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제10항에 있어서,
상기 표적 세포 상의 결합 파트너는 상기 제1 결합 파트너에 결합할 수 있는 종양 특이적인 항원 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제11항에 있어서,
상기 초상자성 나노입자 상의 상기 제1 결합 파트너는 핵산 앱타머, 펩타이드 앱타머, 슈도 펩타이드, 표적을 위해 선택된 합성 리간드, 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 초상자성 나노입자는 입자의 단위 표면적 당 적어도 하나의 결합 파트너를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 상에 결합 파트너를 발현하는 표적 세포, 병원체 또는 바이러스를 선택적으로 제거하는 장치.
처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법에 있어서,
환자로부터 생물학적 유체를 제거하고, 상기 생물학적 유체를 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 장치로 수송하는 단계와,
상기 초상자성 나노입자 및 상기 생물학적 유체의 혼합물을 상기 자성 필터를 통해 통과시키는 단계와,
여과물을 상기 저장소 또는 상기 환자로 복귀시키는 단계를 포함하고, 상기 표적 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
제14항에 있어서,
상기 처치대상에 교체 유체를 투여하는 단계를 더 포함하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
제14항에 있어서,
상기 생물학적 유체는 혈액, 혈청, 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 임파액(lymph) 및 복수(peritoneal fluid)로 구성된 군으로부터 선택된 유체인 것을 특징으로 하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법에 있어서,
환자로부터 생물학적 유체를 제거하고, 상기 생물학적 유체를 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 장치로 수송하는 단계와,
상기 초상자성 나노입자 및 상기 생물학적 유체의 혼합물을 상기 자성 필터를 통해 통과시키는 단계와,
여과물을 상기 저장소 또는 상기 환자로 복귀시키는 단계를 포함하고, 상기 표적 세포는 감염된 세포인 것을 특징으로 하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
제17항에 있어서,
상기 감염된 세포는 바이러스, 세균, 원생동물 또는 균류에 의해 감염된 것을 특징으로 하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
제17항에 있어서,
상기 처치대상에 교체 유체를 투여하는 단계를 더 포함하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
제17항에 있어서,
상기 초상자성 나노입자 상의 상기 결합 파트너는 핵산 앱타머, 펩타이드 앱타머, 슈도 펩타이드, 및 표적을 위해 선택된 합성 리간드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 처치가 필요한 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체외 방법.
처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체내 방법에 있어서,
환자로부터 생물학적 유체를 얻는 단계와,
상기 생물학적 유체를 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 장치로 수송하는 단계와,
상기 초상자성 나노입자 및 상기 생물학적 유체의 혼합물을 상기 자성 필터를 통해 통과시키는 단계와,
여과물을 상기 저장소 또는 상기 환자로 복귀시키는 단계를 포함하는, 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 생체내 방법.
제14항, 제17항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과물을 상기 저장소 또는 상기 환자로 복귀시키기 전에 초상자성 나노입자가 존재하는지를 결정하기 위해 상기 여과물을 샘플링하는 단계를 더 포함하는 처치 대상으로부터 표적 세포, 유기체 또는 바이러스를 제거하는 방법.
처치 대상으로부터 자성 특성을 갖는 나노물질을 제거하는 생체외 방법에 있어서,
처치 대상으로부터 자성 특성을 갖는 나노물질을 포함하는 생물학적 유체를 얻는 단계와,
상기 생물학적 유체를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 장치로 수송하는 단계를 포함하고,
상기 생물학적 유체 내의 나노물질은 상기 자성 필터에 의해 포획되고, 여과물을 상기 저장소 또는 환자로 복귀시키는 것을 특징으로 하는, 처치 대상으로부터 자성 특성을 갖는 나노물질을 제거하는 생체외 방법.