CN113122422A - 一种磁性纯化方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用磁性颗粒从一个或多个容器中的介质中分离生物物质的方法。本发明采取特定分离装置固定磁性颗粒转移介质的方式通过工作站来纯化蛋白，实现了自动化，比传统工艺快速经济。
Description
技术领域
本发明属于纯化领域，具体涉及利用磁性颗粒对生物物质的纯化。
背景技术
生物物质纯化领域特别是蛋白纯化领域，目前主流还是传统填料的柱层析工艺，市面上的Protein A和AKTA系列是最为常见的耗材与仪器。现阶段最常用的Protein A亲和层析介质是通过将Protein A用化学偶联的方法固定在琼脂糖凝胶表面制成亲和填料，然后装填成层析柱。从发酵液下罐，离心过滤得上清，过柱纯化等流程走下来，比较耗时，并且多个样品只能以一个接一个的模式纯化，通量有限。
在提升纯化效率方面，磁性颗粒具有优势。磁性颗粒在各种化学过程中以固相形式使用，化学成分可粘附在磁性颗粒表面，借助于磁场移动。磁性颗粒的使用使得固相的可用表面变得尽可能大。
磁性颗粒以超顺磁微球为基质，具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁性颗粒均匀的分散开。磁性颗粒具有合适的且均一粒径，保证了足够强的磁响应性又不易沉降。而且，磁性颗粒具有丰富的表面活性基团，以便可以和生物物质偶联，并在外磁场的作用下实现与待测样品的分离。磁性颗粒用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离与富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。但是目前大多数实验室磁性颗粒纯化还仅仅停留在人工纯手动操作这层面上，效率较低，均一性得不到保证，不同人操作可能得到完全不一样纯化结果。
传统的磁性分离方式是将装有磁性颗粒的容器直接放置于大块磁体上，即可将磁性微球吸附到微孔板或PCR底部。这种方法虽简单，但将磁性微球吸附到孔底后，进行后续洗涤、分离过程时，会有部分磁性微球被带出微孔或PCR管，从而影响后续反应。目前市面上已有的磁性颗粒自动纯化仪器有Thermo的Kingfisher和金斯瑞的Am MagSA等等，设备和耗材均价格较高。而且，这些设备采用的都是磁棒头转移磁性颗粒的方式来纯化，当磁体处于较低位置时，颗粒可以收集在杆表面，尤其是末端。当磁体升高到较高位置时，颗粒可以相应地从磁棒释放。但是，有限的板位成了该工艺的瓶颈，一次只能处理有限的样品，并且对于酸洗脱后中和液的添加以及洗涤孔板内缓冲液的添加都需要额外的设备，而手工添加不仅费时费力，而且错误率高。此外，样品、液体均保留在磁棒表面，这可能会导致后续步骤中污染的风险。
因此，本发明亟待一种对于各种规模纯化工艺兼容性强的自动化磁性颗粒纯化方法和系统。
发明内容
本发明提出了一种利用特定分离装置固定磁性颗粒来纯化生物物质的高通量、自动化方法和系统。通过固定磁性颗粒转移液体的方法，区别于常规磁棒吸附磁性颗粒的半自动化方式，实现高通量纯化，避免了交叉污染，增加了回收率。
具体而言，本发明第一方面提供一种易于移液的磁性分离装置，包括承载部，该承载部用于承载多容器盘，在所述承载部上垂直设置有多个数组排列的磁响应部件，所述磁响应部件均匀分布在所述多容器盘的各容器的周围，且所述磁响应部件的顶部高出容器底部2厘米以内。
在一个或多个实施方案中，每个容器周围均匀分布四个磁响应部件。
在一个或多个实施方案中，磁响应部件为圆柱体结构或方形柱体结构，其侧壁与相邻容器的外表面相邻。
在一个或多个实施方案中，磁响应部件的顶部高出容器底部1厘米以内、高出0.8厘米以内、高出0.7厘米以内、高出0.6厘米以内、高出0.5厘米以内、高出0.4厘米以内、或高出0.3厘米以内。使用时，磁性颗粒吸附在略高于容器底部的内侧壁上。
优选地，磁性颗粒吸附在距离容器底部小于或等于容器全长的50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％的内侧壁上。
在一个或多个实施方案中，磁响应部件是铁块、永磁体或电磁体。优选地，磁响应部件包含选自以下的材料：铁、钕铁硼、钐钴、铝钴镍。
在一个或多个实施方案中，所述多容器盘是24孔板、48孔板、96孔板、或384孔板，包括微孔板或PCR板。
在一个或多个实施方案中，所述承载部的四角为方便不同裙边的多容器盘适用的倒角结构。
在一个或多个实施方案中，所述承载部的外周尺寸略小于多容器盘的裙边尺寸。
在一个或多个实施方案中，磁响应部件与多容器盘的容器相互卡固，使多容器盘固定在承载部上。
在一个或多个实施方案中，承载部与多容器盘相互卡固，使多容器盘固定在承载部上。
在一个或多个实施方案中，所述装置还包括设置在承载部上用于固定多容器盘的定位装置。
在一个或多个实施方案中，所述定位装置包括数个与多容器盘固定连接的支撑柱，支撑柱底端放置于承载部上开设的定位孔内，将定位装置定位在承载部上。
在一个或多个实施方案中，承载部可采用PC材料或其他工程塑料加工而成。
在一个或多个实施方案中，每四个磁响应部件之间的空间分别与多容器盘的一个容器相对应。
本发明提供一种利用磁性颗粒从一个或多个容器中的介质中分离生物物质的方法，所述容器包含侧壁和底部，包括：
(1)将包含该生物物质的介质以及经处理能够与该生物物质关联的磁性颗粒接触并在该生物物质与磁性颗粒关联的条件下孵育，
(2)在容器的侧壁施加磁场，将磁性颗粒聚集到容器内侧壁，所述磁场覆盖侧壁周长的至少10％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，从而可在水平方向上将磁性颗粒聚集到容器的多个方向的内侧壁上，优选所述磁场覆盖侧壁全周长，
(3)将容器中的介质移出，优选通过抽吸移出，
任选的(4)撤销磁场，使用平衡液清洗捕获了生物物质的磁性颗粒，重复步骤(2)-(3)，
(5)撤销磁场，使用洗脱液将生物物质从磁性颗粒洗脱，重复步骤(2)-(3)，
任选的(6)使用中和液将生物物质调至适当pH。
在一个或多个实施方案中，所述磁场优选位于容器的下部，距离容器底部小于或等于容器全长的50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％。
优选地，所述磁场由本文第一方面所述的磁性分离装置产生，步骤(2)包括将多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上，从而磁响应部件在容器底部的四周聚集磁性颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述生物物质是DNA、RNA、蛋白或多肽。
在一个或多个实施方案中，所述容器是多容器盘的容器，例如多孔板的孔。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)中的磁性颗粒经活化，包括但不限于碱液处理、平衡液处理和/或水处理。在一个或多个实施方案中，磁性颗粒的活化方法为：先通过磁分离将存储磁性颗粒的溶液去除，得磁性颗粒；然后用碱液清洗磁性颗粒；再用平衡液清洗磁性颗粒，清洗2～5次，得活化的磁性颗粒。
在一个或多个实施方案中，碱液处理10分钟-2小时，优选20分钟-1小时，例如30分钟。
在一个或多个实施方案中，所述碱液是0.1M NaOH溶液。
在一个或多个实施方案中，平衡液处理10CV，即平衡液与磁性颗粒的体积比为10:1。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中的孵育包括震荡孵育。例如将磁性颗粒与发酵液充分接触，震荡孵育，使磁性颗粒捕获目的蛋白。具体的，孵育时间为0.5～24h。优选的，孵育时间为1～4小时。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中的抽吸包括利用负压将介质从容器移出的步骤。优选地，所述抽吸使用多通道枪头从多个容器中同时移出溶液。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)中的清洗包括震荡清洗，例如震荡1-10分钟。步骤(4)中的平衡液可清除非特异性结合杂质。所述平衡液为0.05～0.5M Tris缓冲液，pH6.7～7.3。
优选的，所述平衡液为0.06～0.4M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.07～0.3M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.08～0.2M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.09～0.1M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.1M Tris缓冲液。
优选的，所述平衡液的pH值为pH 6.8～7.2；优选的，所述平衡液的pH值为pH 6.9～7.1；优选的，所述平衡液的pH值为pH 7.0。
优选的，所述步骤(4)中，用平衡液清洗多次；优选的，所述步骤(4)中，用平衡液清洗2-8次。
在一个或多个实施方案中，步骤(5)中所述洗脱液使目的蛋白与磁性颗粒分离，溶于洗脱液中。步骤(5)中的洗脱包括震荡洗脱，例如震荡1-10分钟。所述洗脱液为0.05～0.5M甘氨酸溶液，pH 2.5～3.5。
优选的，所述洗脱液为0.06～0.4M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.07～0.3M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.08～0.2M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.09～0.1M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.1M甘氨酸溶液。
优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.6～3.4；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.7～3.3；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.8～3.2；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.9～3.1；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 3.0。
优选的，所述步骤(5)中，用洗脱液共洗脱多次；优选的，所述步骤(5)中，用洗脱液洗脱2-8次。
步骤(6)中的中和包括震荡中和，例如震荡1-10分钟。
在一个或多个实施方案中，所述震荡使用工作站震荡模块进行。具体地，将容器放入工作站震荡模块，调用工作站程序，设置工作站参数，如样品体积、平衡液体积、操作次数、洗脱液体积、中和液体积等参数。
一种提高生物物质纯度的方法，包括
(1)将包含该生物物质的介质以及经处理能够与该生物物质关联的磁性颗粒接触并在该生物物质与磁性颗粒关联的条件下孵育，
(2)在含有磁性颗粒的容器的侧壁施加磁场，将磁性颗粒聚集到容器内侧壁，所述磁场覆盖侧壁周长的至少10％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，从而可在水平方向上将磁性颗粒聚集到容器的多个方向的内侧壁上，优选所述磁场覆盖侧壁全周长，
(3)将容器中的介质移出，优选通过抽吸移出，
任选的(4)撤销磁场，使用平衡液清洗捕获了生物物质的磁性颗粒，重复步骤(2)-(3)，
(5)撤销磁场，使用洗脱液将生物物质从磁性颗粒洗脱，重复步骤(2)-(3)，
任选的(6)使用中和液将生物物质调至适当pH。
在一个或多个实施方案中，所述磁场优选位于容器的下部，距离容器底部小于或等于容器全长的50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％。
优选地，所述磁场由本文第一方面所述的磁性分离装置产生，步骤(2)包括将多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上，从而磁响应部件在容器底部的四周聚集磁性颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述生物物质是DNA、RNA、蛋白或多肽。
在一个或多个实施方案中，所述容器是多容器盘的容器，例如多孔板的孔。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)中的磁性颗粒经活化，包括但不限于碱液处理、平衡液处理和/或水处理。在一个或多个实施方案中，磁性颗粒的活化方法为：先通过磁分离将存储磁性颗粒的溶液去除，得磁性颗粒；然后用碱液清洗磁性颗粒；再用平衡液清洗磁性颗粒，清洗2～5次，得活化的磁性颗粒。
在一个或多个实施方案中，碱液处理10分钟-2小时，优选20分钟-1小时，例如30分钟。
在一个或多个实施方案中，所述碱液是0.1M NaOH溶液。
在一个或多个实施方案中，平衡液处理10CV，即平衡液与磁性颗粒的体积比为10:1。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中的孵育包括震荡孵育。例如将磁性颗粒与发酵液充分接触，震荡孵育，使磁性颗粒捕获目的蛋白。具体的，孵育时间为0.5～24h。优选的，孵育时间为1～4小时。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中的抽吸包括利用负压将介质从容器移出的步骤。优选地，所述抽吸使用多通道枪头从多个容器中同时移出溶液。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)中的清洗包括震荡清洗，例如震荡1-10分钟。步骤(4)中的平衡液可清除非特异性结合杂质。所述平衡液为0.05～0.5M Tris缓冲液，pH6.7～7.3。
优选的，所述平衡液为0.06～0.4M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.07～0.3M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.08～0.2M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.09～0.1M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.1M Tris缓冲液。
优选的，所述平衡液的pH值为pH 6.8～7.2；优选的，所述平衡液的pH值为pH 6.9～7.1；优选的，所述平衡液的pH值为pH 7.0。
优选的，所述步骤(4)中，用平衡液清洗多次；优选的，所述步骤(4)中，用平衡液清洗2-8次。
在一个或多个实施方案中，步骤(5)中所述洗脱液使目的蛋白与磁性颗粒分离，溶于洗脱液中。步骤(5)中的洗脱包括震荡洗脱，例如震荡1-10分钟。所述洗脱液为0.05～0.5M甘氨酸溶液，pH 2.5～3.5。
优选的，所述洗脱液为0.06～0.4M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.07～0.3M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.08～0.2M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.09～0.1M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.1M甘氨酸溶液。
优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.6～3.4；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.7～3.3；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.8～3.2；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.9～3.1；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 3.0。
优选的，所述步骤(5)中，用洗脱液共洗脱多次；优选的，所述步骤(5)中，用洗脱液洗脱2-8次。
步骤(6)中的中和包括震荡中和，例如震荡1-10分钟。
在一个或多个实施方案中，所述震荡使用工作站震荡模块进行。具体地，将容器放入工作站震荡模块，调用工作站程序，设置工作站参数，如样品体积、平衡液体积、操作次数、洗脱液体积、中和液体积等参数。
本发明的方法将含有生物物质的样品与磁性颗粒混合，孵育使生物物质与磁性颗粒充分结合，通过分布在容器侧壁的磁场将磁性颗粒吸附于管壁四周，移出、添加缓冲液无需额外的设备，可机械操作无需人工，降低错误率。所有步骤均在单一容器中完成，降低了污染风险。
附图说明
图1为根据本发明一实施方案的磁性分离装置的俯视图。
图2为根据本发明一实施方案的磁性分离装置的立体示意图。
图3为根据本发明一实施方案的磁性分离装置的侧视图。
图4为根据本发明一实施方案中多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上时容器与磁响应部件的侧视图。
图5为根据本发明另一实施方案中多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上时容器与磁响应部件的侧视图。
图6为根据本发明另一实施方案中多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上时容器与磁响应部件的侧视图。
图7为根据本发明一实施方案中多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上时容器与磁响应部件的俯视图。
图8为本发明一实施方式的方法与柱层析方法分别纯化的蛋白的纯度的比较。
图9为本发明一实施方式的方法与柱层析方法分别纯化的蛋白的回收产量的比较。
图10为工作站照片。
图11为根据本发明一实施方案的磁性分离装置的照片。
图12为根据本发明一实施方案中24孔板与磁性分离装置配合使用的照片。
图13为根据本发明一实施方案中磁性分离装置对24孔板中的磁性颗粒的吸附的照片。
图14工作站布局图。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。本文所述实施方式仅为说明本发明的技术思想所用，不能以此限定本发明的保护范围。凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
本发明涉及基于工作站的多孔板磁性颗粒自动化纯化工艺，采用固定磁性颗粒转移介质的方式实现高通量纯化，区别于常规磁棒吸附磁性颗粒的半自动化方式。所述工艺不需要专门的磁性颗粒纯化仪，也不需要特制的耗材，兼容各种纯化工艺和缓冲液体系，方便移植到大多数液体工作站上完成。
本发明第一方面提供一种易于移液的磁性分离装置，包括承载部，该承载部用于承载多容器盘，在所述承载部上垂直设置有多个数组排列的磁响应部件，所述磁响应部件均匀分布在所述多容器盘的各容器的周围，且所述磁响应部件的顶部高出容器底部2厘米以内。每四个磁响应部件之间的空间分别与多容器盘的一个容器相对应。
图1至图3所示为本文磁性分离装置的一种实施方式的图，包括承载部1，在承载部1上设置有5行7列的磁响应部件2。图4-6是承载了24孔板的承载部1的多种实施方式的局部图，其中容器3分别为容器31、32、33，图7是图6的俯视图。使用时，将24孔板放置在装置上，容器3与磁响应部件2的相对位置示意图如图4-6所示。24孔板的每个容器3周围均匀分布四个圆柱体磁响应部件2，并且磁响应部件2的侧壁与相邻容器3的外表面相邻，增加了磁通量，提高了磁性吸附效率。磁响应部件的顶部高出容器底部1厘米以内。由于磁铁的位置总是位于管下部四周，管内磁性颗粒被磁铁吸附在从管底部向上延伸的管内壁上，而管底部没有磁性颗粒。这样不仅方便使用移液装置伸入管底部单独将液体完全取出，而且由于磁铁与管壁相邻，磁吸附力强，可将本装置与24孔板一同倾斜、翻转从而将液体移出。
本文装置中，每个容器周围可均匀分布四个磁响应部件。磁响应部件可为圆柱体结构或方形柱体结构，其侧壁与相邻容器的外表面相邻。
本文的装置中，磁响应部件的顶部高出容器底部1厘米以内、高出0.8厘米以内、高出0.7厘米以内、高出0.6厘米以内、高出0.5厘米以内、高出0.4厘米以内、高出0.3厘米以内。使用时，磁性颗粒吸附在略高于容器底部的内侧壁上。优选地，磁性颗粒吸附在距离容器底部小于或等于容器全长的50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％的内侧壁上。
本文所述磁响应部件可以是铁快、永磁体或电磁体。优选地，磁响应部件包含选自以下的材料：铁、钕铁硼、钐钴、铝钴镍。
本文所述多容器盘可以是任何数组排列的容器板，包括微孔板或PCR板。常用的多容器盘包括24孔板、48孔板、96孔板、或384孔板。
本文的装置中承载部可采用不响应磁性的金属或PC材料或其他工程塑料加工而成。承载部的四角可为方便不同裙边的多容器盘适用的倒角结构。可将承载部的四角切去，使承载部的四个角具有方便不同裙边微孔板适用的倒角结构。可将承载部的外周尺寸设置为略小于多容器盘裙边尺寸，以使带有不同形状裙边的多容器盘均能适用。
磁响应部件或承载部可与多容器盘相互卡固，使多容器盘固定在承载部上。同时还设置有装设于承载部上用于多容器盘的定位装置。定位装置可为数个与多容器盘固定连接的支撑柱，支撑柱底端放置于承载部上开设的定位孔内，将定位装置定位在承载部上。
本文的装置中磁响应部件可与多容器盘的容器相互卡固，使多容器盘固定在承载部上。或者或此外，承载部与多容器盘相互卡固，使多容器盘固定在承载部上。
本发明具体还涉及一种利用磁性颗粒从容器中分离生物物质的方法，所述容器包含侧壁和底部，包括：
(1)将包含该生物物质的介质以及经处理能够与该生物物质关联的磁性颗粒接触并在该生物物质与磁性颗粒关联的条件下孵育，
(2)在容器的侧壁施加磁场，将磁性颗粒聚集到容器内侧壁，所述磁场覆盖侧壁周长的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，优选所述磁场覆盖侧壁全周长，
(3)将容器中的介质移出，优选通过抽吸移出，
任选的(4)撤销磁场，使用平衡液清洗捕获了生物物质的磁性颗粒，重复步骤(2)-(3)，
(5)撤销磁场，使用洗脱液将生物物质从磁性颗粒洗脱，重复步骤(2)-(3)，
任选的(6)使用中和液将生物物质调至适当pH。
本文所述容器包括但不限于任何可用于纯化生物物质的容器，优选多孔板，例如24孔板、96孔板等。在一块板上可以完成数个平行纯化。
本文所述生物物质可以是任何衍生自生物体的物质，包括但不限于细胞、病毒、亚细胞器、DNA、RNA、蛋白或多肽。示例性的生物物质是DNA、RNA和蛋白质。
磁性颗粒优选是顺磁性的。颗粒的尺寸通常小于50μm，优选0.1-10μm，最优选1-5μm。颗粒的浓度可以是例如0.01-5mg/ml，优选0.05-3mg/ml，最优选0.2-2mg/ml。通常，本文所述磁性颗粒包被有可与感兴趣的生物物质关联、偶联、结合、吸引的基团，例如硅基、氨基、羧基、凝集素和/或其他反应性官能团，例如寡核苷酸，抗体，抗原，链霉亲和素或生物素。本文所用的磁性颗粒在使用前经活化，包括但不限于碱液处理、平衡液处理和/或水处理。碱液清洗磁性颗粒，起到除热源除杂作用，平衡液可再生磁性颗粒。具体地，磁性颗粒的活化方法为：先通过磁分离将存储磁性颗粒的溶液去除，得磁性颗粒；然后用碱液清洗磁性颗粒；再用平衡液清洗磁性颗粒，清洗2～5次，得活化的磁性颗粒。在一个或多个实施方案中，碱液是0.05-0.2M的NaOH溶液，处理时间为10分钟-2小时，优选20分钟-1小时，例如30分钟。在一个或多个实施方案中，平衡液为0.05～0.5M Tris缓冲液，pH 6.7～7.3，平衡液体积为10个磁珠体积。在一个或多个实施方案中，本文所述平衡液也称为洗涤液。优选的，所述平衡液为0.06～0.4M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.07～0.3M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.08～0.2M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.09～0.1M Tris缓冲液；优选的，所述平衡液为0.1M Tris缓冲液。优选的，所述平衡液的pH值为pH 6.8～7.2；优选的，所述平衡液的pH值为pH6.9～7.1；优选的，所述平衡液的pH值为pH 7.0。通常，可用平衡液清洗多次，例如清洗2-8次。
在生物物质与包被有能与之相关联的基团的磁性颗粒孵育后，所述生物物质固定在磁性颗粒上，可通过磁场将生物物质与磁性颗粒一同移动。在使用洗脱液处理偶联有生物物质的磁性颗粒后，生物物质可与磁性颗粒分离，从而实现纯化。
示例性地，磁场将磁性颗粒吸附于容器内侧壁四周，然后从容器底部将除颗粒以外的介质移出。从容器中移除介质可用本领域已知的任何方法实现，例如使用细管道伸入介质进行抽吸。优选地所述抽吸使用多通道枪头从多个容器中同时移出介质。所述介质包括其中生物物质已被磁性颗粒固定后的剩余介质，或用于处理或洗涤磁性颗粒的平衡液，或包含感兴趣的生物物质的洗脱液。
因此，本文所述磁场能将容器中磁性颗粒聚集到容器内侧壁，优选所述磁场覆盖侧壁周长的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，从而可在水平方向上将磁性颗粒聚集到容器的多个方向的内侧壁上。优选地，优选所述磁场覆盖侧壁全周长，从而可在水平方向上将磁性颗粒聚集到容器的各个方向的内侧壁上。所述磁场优选位于容器的下部，距离容器底部小于或等于容器全长的50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％，使得磁性颗粒聚集在容器下部50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％的内侧壁上。
本文中磁场通过本文所述的磁性分离装置实现。本发明的磁性分离装置包括承载部，该承载部用于承载多容器盘，在所述承载部上垂直设置有多个数组排列的磁响应部件，所述磁响应部件均匀分布在所述多容器盘的各容器的周围，且所述磁响应部件的顶部高出容器底部2厘米以内。每四个磁响应部件之间的空间分别与多容器盘的一个容器相对应。
在生物物质固定后，将磁性颗粒洗涤数次以除去所有由反应或其他污染物引起的反应组分，或非特异性结合杂质。可以通过将颗粒释放并收集在平衡缓冲液中以及将颗粒转移至含有新鲜平衡缓冲液的另一孔中来进行洗涤。
为了分离磁性颗粒和其上结合的生物物质，可使用洗脱缓冲液孵育磁性颗粒。本领域技术人员知晓针对不同生物物质的洗脱液成分。例如为了分离mRNA，可以使用低盐洗脱液，例如含吐温的EDTA溶液；为了分离DNA，可以使用；为了分离蛋白质，可以使用pH 2.5～3.5的0.05～0.5M甘氨酸溶液。优选的，所述洗脱液为0.06～0.4M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.07～0.3M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.08～0.2M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.09～0.1M甘氨酸溶液；优选的，所述洗脱液为0.1M甘氨酸溶液。优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.6～3.4；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.7～3.3；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.8～3.2；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 2.9～3.1；优选的，所述洗脱液的pH值为pH 3.0。通常可用洗脱液洗脱多次；例如洗脱2-8次。
为了保证蛋白的稳定性，洗脱下来的生物物质可能需要加入中和液将pH调至适当的pH。本领域技术人员知晓各种生物物质的最适pH以及针对各种生物物质调节pH的试剂和方法。
本文中所述孵育、清洗、洗脱、中和的方式可为任何形式的处理方式。通常，震荡可以使介质与磁性颗粒充分接触，缩短处理时间。因此，震荡时间可为1分钟～24h，例如1分钟-10分钟、1小时～4小时。本文中的震荡可通过工作站震荡模块实现。具体地，将容器放入工作站震荡模块，调用工作站程序，设置工作站参数，如样品体积、平衡液体积、操作次数、洗脱液体积、中和液体积等参数后启动工作站。
本发明方法和系统的优点：
1)本发明工艺的回收率和纯度与传统工艺具有一致性。
2)本发明工艺相较传统工艺高效快速，统计1258个样，相比传统柱层析工艺，每年可以节约上百个工作日。(1258样*2h/样＝104.8天,1258样*2h/24样＝4.4天)
3)本发明工艺相较传统工艺成本低，统计1258个样，相比传统柱层析工艺，每年可省上万元。
实施例
实施例1，磁性颗粒纯化蛋白
1)处理磁性颗粒，用0.1MNaOH消毒处理磁性颗粒30min，移除碱液，加入平衡液(PBS)，平衡10个磁珠体积后移除平衡液，并按1:1的量加入平衡液，备用；
2)悬浮磁性颗粒，向24孔板发酵板中加入200uL磁性颗粒悬浮液(磁性颗粒与平衡液体积比为1:1)；
3)放入工作站震荡模块上，调用工作站特别编程的Method，设置工作站参数，如样品体积(mL)、Wash buffer体积(mL)、Wash次数3次、Elution buffer体积(mL)、Neutralization buffer体积(mL)等要用的参数，点击“OK”，运行方法(示例性参数如图14所示)；
4)孵育：震荡模块开始运行，300rpm/min震荡1h，让发酵液与磁性颗粒充分孵育，1h后，夹具模块将24孔板转移至特制磁力架板位上，磁力底座将磁性颗粒聚集到孔板底部四壁，机械臂4通道枪头移除发酵液；
5)平衡：加入1mL平衡液，夹具模块将24孔板移震荡模块，震荡1min，再转移样品孔板到磁力架模块上，重复此过程3次；
6)洗脱：加入1mL洗脱液(0.1M Glycine-HCl，pH 2-3或50mMNa-Citrate，150mMNaCl，pH 3.0)，夹具模块将24孔板转移到震荡模块上，震荡1min，将孔板转移到磁力架模块上，磁力底座将磁性颗粒聚集到孔板底部四壁，机械臂4通道枪头转移溶有目的蛋白的洗脱液到终产品板位的新孔板中；
7)中和：加入0.1mL中和液(1MTris-HCl，pH 9.0)到新孔板中，夹具模块将24孔板转移到震荡模块上，震荡1min，再将孔板转移到终产品板位上，结束整个纯化过程。
实施例2，柱层析纯化蛋白
1)传统层析柱方法发酵液需要先离心过滤，10000rcf，离心30min，去除沉淀，用0.22um滤器过滤上清；
2)利用AKTA上样，通过样品泵将发酵液泵入亲和层析柱，目的蛋白被捕获；
3)平衡，将平衡液泵入层析柱，平衡10个柱体积；
4)洗脱，将洗脱液泵入层析柱，洗脱5个柱体积，根据UV变化收集组分，并加入中和液；
柱层析纯化蛋白每次纯化一个样品，一个晚上纯化6个样品，不能实现平行纯化，通量低于24孔板自动化纯化。
需说明的是，本发明的图式仅为方便说明而例示性的绘示，其中，多容器盘、磁响应部件、各组件的形状、比例、大小均不为图式中所限制，其可根据需求而任意更改形状为圆形、方型或任意形状。
以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在使熟习此项技艺的人士能够了解本发明的内容并据以实施，当不能以的限定本发明的专利范围，即凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的专利范围内。
Claims (10)
1.一种易于移液的磁性分离装置，包括承载部，该承载部用于承载多容器盘，在所述承载部上垂直设置有多个数组排列的磁响应部件，所述磁响应部件均匀分布在所述多容器盘的各容器的周围，且所述磁响应部件的顶部高出容器底部2厘米以内。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置具有选自以下的一个或多个特征：
每个容器周围均匀分布四个磁响应部件，
磁响应部件为圆柱体结构或方形柱体结构，
磁响应部件的顶部高出容器底部1厘米以内、高出0.8厘米以内、高出0.7厘米以内、高出0.6厘米以内、高出0.5厘米以内、高出0.4厘米以内、高出0.3厘米以内，
所述承载部的四角为方便不同裙边的多容器盘适用的倒角结构，
所述承载部的外周尺寸略小于多容器盘的裙边尺寸，
承载部与多容器盘相互卡固，使多容器盘固定在承载部上，
所述装置还包括设置在承载部上用于固定多容器盘的定位装置，
所述定位装置包括数个与多容器盘固定连接的支撑柱，支撑柱底端放置于承载部上开设的定位孔内，将定位装置定位在承载部上，
每四个磁响应部件之间的空间分别与多容器盘的一个容器相对应。
3.一种利用磁性颗粒从一个或多个容器中的介质中分离生物物质的方法，所述容器包含侧壁和底部，包括：
(1)将包含该生物物质的介质以及经处理能够与该生物物质关联的磁性颗粒接触并在该生物物质与磁性颗粒关联的条件下孵育，
(2)在容器的侧壁施加磁场，将磁性颗粒聚集到容器内侧壁，所述磁场覆盖侧壁周长的至少10％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，从而可在水平方向上将磁性颗粒聚集到容器的多个方向的内侧壁上，优选所述磁场覆盖侧壁全周长，
(3)将容器中的介质移出，
任选的(4)撤销磁场，使用平衡液清洗捕获了生物物质的磁性颗粒，重复步骤(2)-(3)，
(5)撤销磁场，使用洗脱液将生物物质从磁性颗粒洗脱，重复步骤(2)-(3)，
任选的(6)使用中和液将生物物质调至适当pH。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁场位于容器的下部，距离容器底部小于或等于容器全长的50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁场由权利要求1或2所述的磁性分离装置产生，其中，步骤(2)包括将多容器盘置于承载部具有磁响应部件的面上，从而磁响应部件在容器底部的四周聚集磁性颗粒。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物物质是DNA、RNA、蛋白或多肽。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的磁性颗粒经活化，包括碱液处理、平衡液处理和/或水处理，优选具有选自以下的一个或多个特征：
所述碱液处理10分钟-2小时，
所述碱液是0.1M NaOH溶液，
所述平衡液与磁性颗粒的体积比为10:1，
所述平衡液为0.05～0.5M Tris缓冲液，pH 6.7～7.3。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中的孵育包括震荡孵育；优选孵育时间为0.5～24h，和/或
步骤(3)中的抽吸包括利用负压将介质从容器移出的步骤；优选地，所述抽吸使用多通道枪头从多个容器中同时移出溶液，和/或
步骤(4)中的清洗包括震荡清洗；优选地，所述平衡液为0.05～0.5M Tris缓冲液，pH6.7～7.3；优选地，使用平衡液清洗多次，和/或
步骤(5)中的洗脱包括震荡洗脱；优选地，所述洗脱液为0.05～0.5M甘氨酸溶液，pH2.5～3.5；优选的，使用洗脱液洗脱多次，和/或
步骤(6)中的中和包括震荡中和。
9.如权利要求8中所述的方法，其特征在于，所述震荡使用工作站震荡模块进行，优选地，所述震荡包括将容器放入工作站震荡模块，调用工作站程序，设置工作站参数。
10.如权利要求3-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自以下的一个或多个特征：
所述平衡液为0.06～0.4M Tris缓冲液，
所述平衡液的pH值为pH 6.8～7.2，
所述洗脱液为0.06～0.4M甘氨酸溶液，
所述洗脱液的pH值为pH 2.6～3.4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911413057.3A CN113122422A (zh) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | 一种磁性纯化方法和系统 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911413057.3A CN113122422A (zh) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | 一种磁性纯化方法和系统 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113122422A true CN113122422A (zh) | 2021-07-16 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| CN (1) | CN113122422A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023241597A1 (zh) * | 2022-06-14 | 2023-12-21 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 一种用于细胞分选的管路系统、细胞分选设备及控制方法 |
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2019
- 2019-12-31 CN CN201911413057.3A patent/CN113122422A/zh active Pending
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