CN102568728A

CN102568728A - 低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102568728A
Application number: CN2012100264528A
Authority: CN
Inventors: 何农跃; 曾新; 江红荣; 李传燕
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-02-07
Also published as: CN102568728B

Abstract

低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法及其应用，制备步骤为：制备磁性纳米Fe₃O₄颗粒；制备Fe₃O₄SiO₂颗粒并于其表面修饰氨基基团；以硼氢化钠还原氯金酸得到小粒径的纳米金颗粒；以1:3的体积比例混合上述Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液和纳米金混悬液并超声搅拌，纳米金颗粒通过与Fe₃O₄SiO₂颗粒表面的氨基基团配位结合而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。本发明采用自组装技术制备Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合颗粒，制备过程简单，反应条件温和，制备的颗粒尺寸可控、分布均匀、具有良好的分散性、稳定性与生物相容性，制备成本较低。具有成本低和操作简便的优点。

Description

低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于复合纳米材料合成领域，涉及一种低荧光背景的组装型金包覆磁性铁氧化合物的复合纳米材料，即Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒及其制备方法，特别涉及采用自组装技术方案制备适于直接在其表面进行荧光信号检测的金磁复合纳米颗粒。

背景技术

磁性材料是一种历史悠久的传统材料。研究表明当其尺寸进入纳米尺度后，所得磁性纳米材料将呈现出一些特殊的物理现象，如：矫顽力的变化、超顺磁性、居里温度的下降等。因为这些特性，磁性纳米颗粒作为纳米材料的重要组成部分，目前已成为材料、信息、生物、化学等领域的研究热点。由于磁性纳米颗粒具有分离速度快、效率高、操作简单、易实现功能化、易实现自动化及不影响分离物质的活性等优越的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离分选，生物大分子的分离、纯化、检测，靶向诊断与治疗等诸多领域。其中，以磁性纳米颗粒进行生物大分子检测主要是通过在其表面修饰上特异性的探针或抗体后即可利用它们对目标分子（核酸或蛋白质）进行特异性的检测。但单纯的铁氧磁性纳米颗粒在空气中易被氧化、从而发生团聚，且具有强的荧光背景甚至能够淬灭荧光，不利于在其表面直接进行以荧光为信号的生物分子检测。

纳米金颗粒具有特殊的稳定性、小尺寸效应、量子效应、表面效应和良好的生物相容性，在纳米电子学、光电子器件、纳米涂层材料、纳米催化、分子识别和生物标记等领域有着巨大的潜在应用价值，因此一直是纳米材料领域研究的热点。关于纳米金颗粒的制备方法、性能及应用研究在国内外已经有很多的文献报道。而将磁性纳米颗粒与纳米金颗粒结合起来的金磁复合颗粒，由于兼具二者的优点而具有更为广阔的应用前景，关于其制备方法、性能及应用研究目前亦已有许多文献报道。但很多方法制备得到的金磁复合颗粒在生物分子的分离、纯化及检测方面的应用常常局限于将纳米金颗粒表面仅仅作为与生物分子结合的载体，对纳米金颗粒的其他性能（如：近红外区的光热转换性质、荧光增效作用）应用得并不够全面。

目前制备铁氧磁性纳米颗粒的方法主要有共沉淀法、水热法、高温分解法等若干种物理或化学方法，根据颗粒的需求不同可采取相应的方案。而目前制备金磁复合颗粒主要采用表面原位还原方案和自组装方案。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种低荧光背景的、兼具有良好生物相容性与易于分离性的组装型金-磁复合纳米颗粒及其操作简便的制备方法。本发明采用软模板法制备粒径500 nm左右Fe₃O₄磁性纳米颗粒，之后经种子聚合法及经典的St?ber 过程在其表面包覆一层硅壳，制备粒径550 nm 左右的Fe₃O₄SiO₂颗粒，用硅烷偶联剂对稳定性和分散性较好的Fe₃O₄SiO₂颗粒表面进行氨基修饰；以还原法制得粒径3-5 nm左右的纳米金颗粒；混合上述Fe₃O₄SiO₂和纳米金混悬液并搅拌，通过金与氨基的配位结合从而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。经测试，该金磁复合纳米颗粒与表面经功能化基团修饰的金磁复合纳米颗粒均既具备金良好的生物分子固定化容量，又具备磁性材料易于分离的性质，尤其是具备荧光背景低的优点，在生物检测尤其是直接于颗粒表面进行以荧光为信号的生物分子检测及自动化检测方面将具有广阔的应用前景。

技术方案：低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法，制备步骤为：a. 制备磁性纳米Fe₃O₄颗粒：软模板法制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒，室温下将FeCl₃·6H₂O、NH₄Ac和葡聚糖以质量比1:2:1.5称量，溶解于乙二醇中，并磁力搅拌，混匀后倒入聚四氟乙烯内衬反应釜中，然后放入恒温烘箱中，保持在200℃反应8 小时，之后冷却至室温，最后黑色沉淀形成，用水与乙醇交替清洗干净，得到粒径约为500 nm的Fe₃O₄颗粒；b．制备Fe₃O₄SiO₂颗粒并于其表面修饰氨基基团：按体积比4:1将乙醇和水混合并与上述Fe₃O₄颗粒混合均匀，超声后倒入三颈烧瓶，之后在通氮气保护的条件下进行搅拌，并保持水浴35 ℃，接下来加入体积比为2:1的正硅酸四乙酯和氨水混合溶液，混合溶液与Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液的体积比例为1:25，反应6 小时，之后以乙醇与水交替洗涤，从而得到Fe₃O₄SiO₂颗粒；取上述Fe₃O₄SiO₂颗粒进行磁分离后加入体积比为9:1的乙醇和水混合液，用95 %乙醇定容；再加入体积比为1:1.5的3-氨丙基三乙氧基硅烷和氨水混合溶液至上述Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液中，混合溶液与Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液的体积比例为1:50，振荡2小时，之后用无水乙醇清洗3 次，将上述颗粒磁分离后，加入0.1 M的盐酸将pH值调节至5-6，以水清洗干净，保存待用；c．以硼氢化钠还原氯金酸得到小粒径的纳米金颗粒：将浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵溶液和浓度为0.01M的四氯化金酸三水合物溶液以14:1的体积比例混合加入到塑胶管中，上下颠倒混匀，溶液变为亮黄，立即加入浓度为0.01M的硼氢化钠水溶液，其中硼氢化钠与四氯化金酸三水合物溶液的体积比例为2:1，颠倒混匀2 分钟，静置得到淡黄色的胶体金溶液；d．以1:3的体积比例混合上述Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液和纳米金混悬液并超声搅拌，纳米金颗粒通过与Fe₃O₄SiO₂颗粒表面的氨基基团配位结合而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。

组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒在以荧光信号为检测手段的生物大分子检测与分析中的应用。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、一般采用磁性纳米颗粒为载体、以荧光信号检测为手段进行生物大分子检测时，由于受到磁性纳米颗粒本身本底荧光背景影响，需要将荧光探针变性下来点样于载玻片上或者转移到新的容器中，再进行荧光信号的检测与读值。本发明制备的金-磁复合纳米颗粒表面经功能化修饰后，不但具有良好的生物相容性，而且荧光背景低，适于直接应用于荧光检测系统的生物信号检测，可作为构建磁性颗粒微阵列的载体，能够与生物芯片技术结合而实现操作简单、高通量、高灵敏度和自动化的荧光检测。

2、本发明采用自组装技术制备Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合颗粒，制备过程简单，反应条件温和，制备的颗粒尺寸可控、分布均匀、具有良好的分散性、稳定性与生物相容性，只使用了少量廉价的化学试剂（除必须的金前驱体外），制备成本较低。具有成本低和操作简便的优点。

附图说明

图1为本发明中低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒Fe₃O₄SiO₂Au的制备流程图。

图2为组装型金磁复合纳米颗粒Fe₃O₄SiO₂Au及其中间体的透射电镜图。图2A为Fe₃O₄磁性纳米颗粒的透射电镜图；图2B为Fe₃O₄SiO₂磁性纳米颗粒的透射电镜图；图2C为纳米金颗粒的透射电镜图；图2D为Fe₃O₄SiO₂Au复合纳米颗粒的透射电镜图。

图3为组装型金磁复合纳米颗粒Fe₃O₄SiO₂Au的荧光背景检测。图3A为各次洗涤液的荧光扫描纪录；图3B为连接有荧光标记寡核苷酸片段的金磁颗粒与空白金磁颗粒的荧光强度对照图。

具体实施方式

磁性纳米颗粒是指颗粒尺度至少有一维在1-1000 nm之间的材料，当它们达到一定的临界尺度时，会呈单磁畴并表现出超顺磁性，是20世纪70年代以来逐步产生和发展起来的新型生物医学功能材料。在通常情况下，处于胶态的磁性微粒呈杂乱无序的运动状态，可稳定悬浮于液相介质中，方便地进行各种生物学反应；而在外磁场作用下磁性微粒便表现出良好的磁响应性，可方便地将微粒与介质分离开来；当撤去外加磁场后，磁性微粒又可重新悬浮于液相介质中而不聚集。一般的磁性纳米颗粒存在一定的荧光背景，若在其表面以荧光为信号进行生物分子检测，不利于直接采集检测信号，因此需要在磁性纳米颗粒表面修饰金壳，有效消除磁性纳米颗粒的荧光背景才适合在其表面直接读取荧光信号进行生物分子检测。

本发明提供的技术方案为：① 制备粒径在500 nm左右Fe₃O₄磁性纳米颗粒，之后经种子聚合法及经典的St?ber 过程在其表面包覆一层硅壳，制备粒径在550 nm 左右的Fe₃O₄SiO₂颗粒，用硅烷偶联剂对上述稳定性和分散性较好的Fe₃O₄SiO₂颗粒表面进行氨基修饰；② 制备小粒径的纳米金颗粒；③ 混合步骤①的Fe₃O₄SiO₂混悬液和步骤②的纳米金混悬液并于一定条件下搅拌，纳米金颗粒通过与Fe₃O₄SiO₂颗粒表面的氨基基团配位结合而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。④ 于该组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒表面进行功能化修饰进而进行荧光信号检测。

本发明的具体实现过程如下：

1) 采用软模板法制备粒径约为500 nm的磁性Fe₃O₄纳米颗粒。之后经种子聚合法及经典的St?ber 过程在其表面包覆一层硅壳，制备粒径约为500 nm的Fe₃O₄SiO₂颗粒，用硅烷偶联剂对此稳定性和分散性较好的Fe₃O₄SiO₂颗粒表面进行氨基修饰，保存于有机溶剂中。

所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)。

所述保存氨基化Fe₃O₄SiO₂颗粒的有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、丙酮、正丁醇、四氢呋喃、或N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂。这对于本领域的普通技术人员是显然的。所列举的有机溶剂只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。

2) 以还原金前驱体溶液的方法得到小粒径的纳米金颗粒。

所述还原前驱体溶液的方法包括添加还原剂的方法、照射紫外线的方法、添加醇的方法、照射超声波的方法、微生物还原的方法、植物还原法等等。本发明优选添加还原剂的方法。

所述添加的还原剂包括柠檬酸或柠檬酸盐、羟胺类化合物、硼氢化合物等。本发明优选硼氢化钠为还原剂。

所述金前驱体可以是无机含金化合物或有机含金化合物，如氯金酸或氯金酸盐（氯金酸钠、氯金酸钾）、乙酸金等。

所述小粒径的纳米金颗粒，其粒径控制为1-30 nm。本发明优选粒径控制于3-5 nm的纳米金颗粒。

3）混合Fe₃O₄SiO₂混悬液和纳米金混悬液并于一定条件下搅拌，得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。

所述搅拌条件优选为超声搅拌；搅拌速度优选为200转/分。

4）于该组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒表面进行功能化修饰从而进行荧光信号检测。

所述功能化修饰包括羧基修饰、氨基修饰、链亲和素修饰等。这些对于本领域的普通技术人员是显然的。所列举的修饰方法只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。

所述荧光物质包括Cy3、Cy5、FAM、Rox、TET、HEX、JOE、罗丹明等。这些对于本领域的普通技术人员是显然的。所列举的荧光物质只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。

以下特定的实施例旨在更详细地描述本发明。这些实施例的目的在于解释本发明，而不应理解为限定本发明的范围。

实施例1 组装型金磁复合纳米颗粒的制备

图1给出了组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒的合成过程，包括四个步骤：① 制备磁性纳米Fe₃O₄颗粒；②制备Fe₃O₄SiO₂颗粒并于其表面修饰氨基基团；③ 以硼氢化钠还原氯金酸得到小粒径的纳米金颗粒；④ 混合上述Fe₃O₄SiO₂混悬液和纳米金混悬液并超声搅拌，从而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。

具体实验过程如下所述。

（1）软模板法制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒。室温下称量1.3 g氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、2.6 g醋酸铵（NH₄Ac）和1.95 g葡聚糖（质量比例为1:2:1.5），溶解于50 mL乙二醇中，磁力搅拌，之后混匀后倒入聚四氟乙烯内衬反应釜中。然后放入恒温烘箱中，保持在200 ℃ 反应8 小时，再冷却至室温，最后黑色沉淀形成。用水与乙醇交替清洗干净，得到粒径约为500 nm的Fe₃O₄颗粒。图2A给出了Fe₃O₄磁性纳米颗粒的透射电镜图，可以看出颗粒呈球形、大小均匀，并有较好的分散性，粒径约为500 nm。

（2）制备Fe₃O₄SiO₂颗粒。将乙醇浓度为80%vt的水溶液150 mL与上述Fe₃O₄颗粒混合均匀，超声后倒入三颈烧瓶，之后在通氮气(N₂)保护的条件下进行搅拌，并保持水浴35 ℃，接下来加入4 mL正硅酸四乙酯（Tetraethyl orthosilicate, TEOS）和2 mL氨水（正硅酸四乙酯和氨水的体积比为2:1），反应6 小时，之后以乙醇与水交替洗涤，从而得到Fe₃O₄SiO₂颗粒。图2B给出了Fe₃O₄SiO₂磁性纳米颗粒的透射电镜图，可以看出颗粒呈球形、大小均匀，内层黑色区域为Fe₃O₄核而外层灰色区域为SiO₂壳，该颗粒具有较好的分散性，粒径约为550 nm。

（3）于Fe₃O₄SiO₂颗粒表面修饰氨基。取上述1 mL Fe₃O₄SiO₂颗粒，磁分离后加入乙醇浓度为90%vt的水溶液1 mL，用95 %vt乙醇定容至5 mL，然后加入40 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)和60 μL氨水（二者的体积比为1:1.5），混合振荡2小时，再用无水乙醇清洗3 次。将上述颗粒磁分离后，加入0.1 M的盐酸3 mL处理1 小时，目的在于调节pH值至5-6以提高APTES质子化处理颗粒的效率，从而提高胶体金的吸附率。以水清洗干净，保存待用。

（4）还原法制备纳米金颗粒。硼氢化钠还原制备胶体金：在塑胶管中，先加入17.5 mL浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide, CTAB）溶液，再取1.25 mL浓度为0.01M的四氯化金酸三水合物（HAuCl₄·3H₂O）溶液加入到上述溶液中（二者体积比为14:1），上下颠倒混匀，溶液变为亮黄，接着，立即加入2.5 mL浓度为0.01M的硼氢化钠水溶液（硼氢化钠与四氯化金酸三水合物溶液的体积比为2:1），之后快速颠倒混匀2 分钟，之后放置2 小时以上即得到淡黄色的胶体金溶液。图2C给出了纳米金颗粒的透射电镜图，可以看出颗粒呈球形、大小均匀，并有较好的分散性，粒径约为3-5 nm。

（5）组装Fe₃O₄SiO₂颗粒与纳米金颗粒得到Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。将上述1 mL 由APTES修饰的Fe₃O₄SiO₂颗粒磁分离后加入3 mL胶体金溶液（Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液和胶体金混悬液的比例是1:3），超声搅拌吸附4 小时，纳米金颗粒通过与Fe₃O₄SiO₂颗粒表面的氨基基团配位结合而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒，之后以水清洗干净。图2D给出了Fe₃O₄SiO₂Au复合纳米颗粒的透射电镜图，可以看出黑色的胶体金颗粒吸附于灰色的SiO₂壳层表面，形成了一层均匀的胶体金表层，且复合颗粒的分散性良好，便于在其表面进行荧光信号为检测手段的生物大分子检测与分析。

实施例2 链亲和素修饰组装型金磁复合纳米颗粒

将浓度为20 mM的11-巯基十一烷酸（11-Mercaptoundecanoic acid, MUDA）和上述实施例1制备得到的金磁复合纳米颗粒（金磁复合纳米颗粒和MUDA的质量体积比例是5:1）混合振荡24 小时。待反应完全后，以95%乙醇与灭菌水交叉洗涤各两次，最终以4 mg/mL的浓度分散于灭菌水中。之后，取浓度为0.01 M的NaOH水溶液（金磁复合纳米颗粒混悬液和NaOH溶液的体积比例是5:1）加入到上述修饰的金磁复合纳米颗粒中反应15 分钟，反应完全后，用灭菌水洗涤三次。接着加入浓度为20 mg/mL的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC·HCl)溶液（金磁复合纳米颗粒混悬液和EDC·HCl溶液的体积比例是2.5:1），涡旋混匀，于4℃条件下反应30分钟。反应完全后，磁分离、弃上清，用去离子水和浓度为25 mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-N-morpholino ethanesulfonic acid, MES)溶液快速冲洗1次。尔后将一定量的浓度为2.5 mg/mL的链亲和素/MES溶液加入到上述金磁纳米颗粒中（金磁复合纳米颗粒混悬液和链亲和素/MES溶液的体积比例是5:1），室温下反应4小时，从而将链亲和素共价结合到金磁纳米颗粒的表面，得到链亲和素-金磁颗粒。

实施例3 组装型金磁复合纳米颗粒的荧光背景检测

将浓度为1 μM的生物素与Cy3双标记的寡核苷酸片段（5’-biotin-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-Cy3-3’）与上述实施例2制备得到的链亲和素-金磁颗粒以质量比例1:2混合，室温振荡反应15分钟，反应结束后，磁分离，用磷酸缓冲液（phosphate buffer, PB）充分洗涤，收集每次洗涤液，点样于载玻片上，经配有Cy3滤色片的扫描仪扫描后记录洗涤液荧光值，至荧光数值不再变化。图3A示各次洗涤液的荧光扫描纪录，行a为未经PB缓冲液清洗的链亲和素-金磁颗粒上清溶液，行b-f依次为经PB缓冲液清洗1-6次的链亲和素-金磁颗粒上清溶液。从图中可以看出，经过六次洗涤，荧光读值基本稳定地趋近于无，说明已将游离或吸附于金磁颗粒表面的荧光标记的寡核苷酸片段洗掉，颗粒表面剩下的荧光信号为通过链亲和素-生物素反应后稳定连接的荧光标记的寡核苷酸片段。图3B示空白金磁颗粒与连接有荧光标记的寡核苷酸片段之金磁颗粒的荧光强度对照，行a为PB缓冲液荧光强度对照，行b为空白金磁颗粒的荧光强度，行c为连接有荧光标记的寡核苷酸片段之金磁颗粒的荧光强度，行d为连接有荧光标记的寡核苷酸片段之金磁颗粒的上清溶液的荧光强度。从图中可以看出，空白金磁颗粒的荧光强度很弱、接近于无，而连接有荧光标记的寡核苷酸片段的金磁颗粒的荧光强度很强，说明组装型金磁复合纳米颗粒的低荧光背景适于在其表面直接进行检测荧光信号的生物分析方法。

序列表

<110> 东南大学

<120> 低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaaggagaa ggtgtctgcg gga 23

Claims

1.低荧光背景的组装型金磁复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于制备步骤为：

a. 制备磁性纳米Fe₃O₄颗粒：软模板法制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒，室温下将FeCl₃·6H₂O、NH₄Ac和葡聚糖以质量比1:2:1.5称量，溶解于乙二醇中，并磁力搅拌，混匀后倒入聚四氟乙烯内衬反应釜中，然后放入恒温烘箱中，保持在200℃反应8 小时，之后冷却至室温，最后黑色沉淀形成，用水与乙醇交替清洗干净，得到粒径约为500 nm的Fe₃O₄颗粒；

b．制备Fe₃O₄SiO₂颗粒并于其表面修饰氨基基团：按体积比4:1将乙醇和水混合并与上述Fe₃O₄颗粒混合均匀，超声后倒入三颈烧瓶，之后在通氮气保护的条件下进行搅拌，并保持水浴35 ℃，接下来加入体积比为2:1的正硅酸四乙酯和氨水混合溶液，混合溶液与Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液的体积比例为1:25，反应6 小时，之后以乙醇与水交替洗涤，从而得到Fe₃O₄SiO₂颗粒；取上述Fe₃O₄SiO₂颗粒进行磁分离后加入体积比为9:1的乙醇和水混合液，用95 %乙醇定容；再加入体积比为1:1.5的3-氨丙基三乙氧基硅烷和氨水混合溶液至上述Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液中，混合溶液与Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液的体积比例为1:50，振荡2小时，之后用无水乙醇清洗3 次，将上述颗粒磁分离后，加入0.1 M的盐酸将pH值调节至5-6，以水清洗干净，保存待用；

c．以硼氢化钠还原氯金酸得到小粒径的纳米金颗粒：将浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵溶液和浓度为0.01M的四氯化金酸三水合物溶液以14:1的体积比例混合加入到塑胶管中，上下颠倒混匀，溶液变为亮黄，立即加入浓度为0.01M的硼氢化钠水溶液，其中硼氢化钠与四氯化金酸三水合物溶液的体积比例为2:1，颠倒混匀2 分钟，静置得到淡黄色的胶体金溶液；

d．以1:3的体积比例混合上述Fe₃O₄SiO₂颗粒混悬液和纳米金混悬液并超声搅拌，纳米金颗粒通过与Fe₃O₄SiO₂颗粒表面的氨基基团配位结合而得到组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒。

2.权利要求1所述的组装型Fe₃O₄SiO₂Au金磁复合纳米颗粒在以荧光信号为检测手段的生物大分子检测与分析中的应用。