CN101037676A - 磁性纳米材料的新功能及新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明发现磁性纳米材料具有蛋白酶的催化活性。磁性纳米材料在H2O2存在下，能够与DAB，TMB等辣根过氧化物酶的底物反应，生成与过氧化物酶相同的反应产物，从而产生与过氧化物酶相类似的催化作用。与蛋白酶比较，磁性纳米的酶活性具有更多的优越性，因为磁性纳米材料可以大批量制备，成本低廉，而且室温保存更稳定，易于修饰和标记。磁性纳米材料的酶催化活性不仅可以直接应用于过氧化物酶所应用的范围，如作为标记分子应用于各种检测系统中分子识别和信号放大，而且还可以将磁性纳米材料的磁性与酶学活性相结合，实现分离与检测一体化。这一新功能的发现，赋予磁性纳米材料更多的新用途。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料学、纳米生物学和纳米医学研究领域。更具体而言，本发明涉及磁性纳米材料作为过氧化物酶的应用。
背景技术
磁性纳米材料指具有磁响应性的纳米材料，在外加磁场的作用下这些纳米材料具有强的磁响应信号。常用的磁性纳米材料为三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等。磁性材料可通过不同的方法制备出不同尺度(1-1000nm)和不同形貌的纳米结构，如零维的纳米颗粒，一维的纳米线、纳米棒，二维的纳米薄膜，三维的纳米锥等，还可利用有机高分子包埋技术在磁性纳米颗粒的基础上制备微米级的磁性微球。
磁性纳米材料具有较好的磁响应性，在生物医学和电子等方面应用前景广泛，尤其是生物医药领域。(1)通过DNA或蛋白质分子偶联到磁性纳米材料表面，结合纳米材料的磁性可以制备亲和层析用于生物样品的快速分离和高效纯化(参见，J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science301，1884(2003)；Q.A.Pankhurstl，J.Connolly，S.K.Jones，J.Dobson，J.Phys.D：Appl.Phys.36，R167(2003)；和I.Safarik，M.Safarikova，BiomagnRes Technol.2，7(2004))；(2)通过磁性纳米材料表面进行合适的化学修饰，使材料表面的电荷发生改变，或者特定的化学基团，可以将药物分子或基因结合在材料表面，利用外加磁场的导向，可以将药物或外源基因向特定的部位进行输送，从而实现药物或基因的靶向运输(参见，J.Panyam，V.Labhasetwar，Adv Drug Del Rev 55，329(2003)；和5.N.Morishita，et al.，Biochem Biophys Res Commun.334，1121(2005))；(3)磁性纳米颗粒可以用于活体或细胞水平的磁共振成像，建立高空间分辨率的活体实时成像技术，已经进入临床用于活体成像诊断(参见，M.G.Harishingani，et al.，N.Engl.J.Med.348，2491(2003)；A.S.Arbab，et al.，Radiology 229，838(2003)；和I.J.de Vries，et al.，Nat Biotechnol.23，1407(2005))；(4)磁性纳米材料可以用于肿瘤的治疗，通过药物靶向和磁靶向把磁性纳米颗粒集中在肿瘤部位，在外加磁场的作用下，磁性纳米颗粒可以产生高热，杀死肿瘤部位的细胞，实现肿瘤治疗的目的(参见，A.Ito，et al.，Cancer Lett.212，167(2004)；和F.Sonvico，et al.，Bioconjug Chem.16，1181(2005))。上述磁性纳米材料的应用都是利用了纳米材料的磁性特征。
辣根过氧化物酶(HRP)是免疫酶标技术中最为常用的工具酶之一，常用于标记抗体，在酶联免疫分析、免疫印迹和免疫组化等技术。这种酶含有正铁原卟啉(血红素)，能利用过氧化氢(H2O2)氧化供氢体(DH2，多为无色的还原型染料)，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下：
HRP的这种催化功能主要是借助正铁原卟啉中的铁实现其催化功能的(参见洪伟杰等，生命的化学，25，33(2005))，而磁性纳米颗粒中含有丰富的铁，所以具备过氧化物酶催化功能的物质基础。
发明内容
本发明突破了磁性纳米材料的磁性物理特征，首次发现这种磁性纳米材料具有蛋白酶的催化活性，能够催化过氧化氢或其它过氧化物，从而产生与过氧化物酶相类似的催化功能，这种催化机理遵循的是Fenton反应机理(参见V.Kavitha，et al.Chemosphere 55，1235(2004))，即在铁离子存在下，可以催化H2O2产生自由基。通过对磁性纳米材料酶学行为的研究以及与过氧化物酶的比较，确定磁性纳米材料具有过氧化物酶的酶学活性。
因此，本发明提供以下：
(1)磁性纳米材料作为过氧化物酶的应用。
(2)根据上面(1)所述的应用，其中将磁性纳米材料用于直接分离和鉴定细胞、核酸和蛋白质；工业催化和发酵；监测环境中有害物质；净化污水；或预防和控制与自由基相关的疾病。
(3)根据上面(2)所述的应用，包括以下步骤：
在H2O2水溶液的存在下，磁性纳米材料催化过氧化物酶的底物，生成相应的产物，其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下，催化H2O2产生的自由基，所述的自由基与氢供体底物反应，导致氢供体生成有色或发光产物。
(4)根据上面(1)-(3)中任何一项所述的应用，其中所述的磁性纳米材料为Fe3O4磁性纳米颗粒。
(5)根据上面(3)所述的应用，其中H2O2在反应混合物中的浓度为0.2μM至1.3μM，并且磁性纳米材料催化过氧化物酶的底物的反应是在pH3-6、25-55℃的温度下进行的。
(6)根据上面(1)所述的应用，其中所述的磁性纳米材料的粒径为1-3000nm。
(7)根据上面(1)所述的应用，其中所述的磁性纳米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化硅、羟基和氨基修饰的。
(8)根据上面(1)所述的应用，其中所述的过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
(9)一种将磁性纳米材料用于检测和分离蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
磁性纳米材料标记蛋白；
标记蛋白后的磁性纳米材料与其它蛋白结合；
在H2O2水溶液的存在下，其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下，催化H2O2产生自由基与过氧化物酶底物反应，导致显色反应，从而检测蛋白的结合。
(10)一种将磁性纳米材料用于检测和分离核酸的方法，该方法包括以下步骤：
磁性纳米材料标记抗生物素蛋白；和
标记抗生物素蛋白后的磁性纳米材料在H2O2水溶液的存在下，与生物素化的DNA探针分子结合，
其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下，催化H2O2产生自由基与底物反应，导致显色，从而检测核酸的结合。
通过对磁性纳米材料酶学行为的研究以及与过氧化物酶的比较，确定磁性纳米材料具有过氧化物酶的酶学活性。这一新功能的发现，使磁性纳米材料集磁性和催化活性为一体，丰富了磁性纳米材料的新用途，将推动磁性纳米颗粒在生物医学等领域的应用。例如(1)利用磁性纳米材料的磁性和催化活性，直接分离和鉴定细胞、核酸和蛋白质等生物样品；(2)利用磁性纳米材料的催化活性，应用于过氧化物酶所应用的工业催化和发酵；(3)利用磁性纳米材料的酶催化活性，监测环境中有害物质，应用于污水净化等；(4)磁性纳米材料应用于与自由基相关的疾病预防和控制。
附图说明
图1.磁性纳米颗粒催化底物TMB反应产生颜色产物，其中A.不同尺度和形貌的磁性纳米材料；B.磁性磁性纳米颗粒在H2O2存在的条件下，催化TMB产生颜色反应；C.磁性磁性纳米颗粒催化反应原理。
图2.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB的表观酶促动力学曲线，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性纳米颗粒，HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图3.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB随H2O2的变化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性纳米颗粒，HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图4.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB在不同pH体系中的变化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性纳米颗粒，HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图5.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB随温度的变化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性纳米颗粒，HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图6.不同尺度的磁性纳米材料都具有过氧化物酶活性，但磁性纳米颗粒尺度与酶活性成反比，尺度越小，酶活性越高。
图7.不同基团修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒均具有过氧化物酶催化活性，然而不同基团修饰后的磁性纳米颗粒显示出不同的酶活性。
图8.磁性纳米颗粒作为标记物可直接用于探测蛋白质分子相互识别。
图9.protein A标记的磁性纳米颗粒在ELISA中的应用。NP-proteinA/BSA作阴性对照，NP-protein A/mIgG指利用Fe3O4磁性纳米颗粒探测protein A与mIgG的识别，HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作为阳性对照。
图10.磁性纳米颗粒作为标记物可直接用于探测核酸分子相互识别。
图11.avidin标记的磁性纳米颗粒用于核酸的检测，其中NP-avidin指avidin偶联的Fe3O4磁性纳米颗粒，NP-avidin/biotin-DNA指Fe3O4磁性纳米颗粒直接用于检测核酸分子，HRP-avidin/biotin-DNA作为阳性对照。
图12示意Fe3O4磁性纳米颗粒用于分离和检测mIgG。
图13.Fe3O4磁性纳米颗粒分离和检测mIgG，其中NP-protein A/BSA作阴性对照，NP-protein A-biotin-mIgG指Fe3O4磁性纳米颗粒先分离biotin-mIgG然后再检测，HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作为阳性对照。
图14.Fe3O4磁性纳米颗粒分离和检测核酸。
图15.Fe3O4磁性纳米颗粒分离和检测核酸分子，其中NP-avidin作阴性对照，NP-avidin-biotin-probe指Fe3O4磁性纳米颗粒先分离biotin-DNA然后再检测，HRP-avidin/biotin-DNA作为阳性对照。
具体实施方式
实施例一、磁性纳米材料具有催化活性
试剂：3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。使用的磁性纳米材料是由水热法合成(参见，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))。
方法：取20μg Fe3O4磁性纳米材料(25nm，150nm，300nm，2300nm)，溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μlTMB(10mg/ml，溶于二甲亚砜)，观察颜色反应。
结果：在Fe3O4磁性纳米材料、H2O2和TMB三者都存在时，溶液出现蓝色反应(图1B)，只有Fe3O4磁性纳米材料和H2O2时没有颜色反应，只有Fe3O4磁性纳米材料和TMB时没有颜色反应，只有H2O2和TMB时没有颜色反应。磁性纳米材料包括不同尺度大小，也包括不同形貌(图1A)，表明磁性纳米材料在H2O2存在下催化TMB产生蓝色反应，遵循Fenton催化反应机理(图1C)。
实施例二、磁性纳米材料具有过氧化物酶的催化活性
试剂：3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米材料合成材料均购自北京化学试剂公司。使用的磁性纳米材料是Fe3O4磁性纳米颗粒由水热法合成(参见，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))，纳米粒子直径300nm。
方法：在每个反应体系中，取20μg Fe3O4磁性纳米颗粒，溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)，加入32μl的30％H2O2，分别加入不同容量(0，0.5，1，2，4，6，8，10μl)的TMB溶液(10mg/ml，溶于DMSO)，日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值，时间扫描600s，反应温度25℃。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程。
结果：以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图，计算其斜率，即可得到反应初速度v，然后以TMB摩尔浓度为横坐标，以v为纵坐标作图，经origin处理得到酶促反应动力学曲线。米氏方程
v＝Vmax×[S]/(Km+[S])
分析发现，Fe3O4磁性磁性纳米颗粒表观酶促催化动力学曲线与HRP酶促动力学一致，计算得到的表观米氏常数Km(111.3±0.154μM)要小于HRP的Km(492.8±3.91μM)，表明底物与Fe3O4磁性纳米颗粒的结合要优于HRP(图2)。表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有与HRP相似的活性，表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性，分析表明一个Fe3O4磁性纳米颗粒的催化能力相当于约45个HRP分子。
实施例三、H2O2调节Fe3O4磁性纳米颗粒催化酶学反应
试剂：3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。Fe3O4磁性纳米颗粒大小直径为300nm。
方法：取20μg Fe3O4磁性纳米颗粒，溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入适量的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亚砜)，日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值，时间扫描600s，反应温度25℃。Fe3O4磁性纳米颗粒催化，加入30％H2O2(μl)浓度梯度：0，2，4，8，16，32，64，128。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程，加入30％H2O2(μl)浓度梯度：0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4。
结果：以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图，计算其斜率，即可得到反应初速度v，然后加入H2O2量换算成的摩尔浓度为横坐标，以v为纵坐标作图，Fe3O4磁性纳米颗粒对H2O2的最适浓度在0.2-1.3μM之间，在H2O2低于0.2μM时催化反应速度较低，当H2O2高于1.3μM时催化反应受到抑制。而对于HRP，对H2O2的最适浓度在2.0-9.0nM之间。Fe3O4磁性纳米颗粒与HRP在催化反应中对H2O2的反应基本一致，但前者在催化反应中需要的H2O2要远高于后者(图3)，同时表明Fe3O4磁性纳米颗粒清除H2O2的能力要高于HRP。
实施例四、反应溶液pH调节Fe3O4磁性纳米颗粒催化酶学反应
试剂：3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。Fe3O4磁性纳米颗粒大小直径为300nm。
方法：取20μg Fe3O4磁性纳米颗粒，溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液，加入0.5μl的30％H2O2，然后加入的10μl的10mg/ml的TMB(溶于DMSO)，日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值，时间扫描600s，反应温度25℃。0.2M醋酸钠缓冲液(pH)：1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程。
结果：以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图，计算其斜率，即可得到反应初速度v，然后以pH为横坐标，以v为纵坐标作图，发现Fe3O4磁性纳米颗粒催化反应缓冲液最适pH在3.5-5.5之间，当pH低于3或高于6时，反应受到抑制，HRP催化反应缓冲液最适pH在3.5-5.5之间。这表明Fe3O4磁性纳米颗粒与HRP的最适pH值范围一致(图4)，进一步表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性。
实施例五、温度调节Fe3O4磁性纳米颗粒催化酶学反应
试剂：3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。Fe3O4磁性纳米颗粒大小直径为300nm。
方法：取20μgFe3O4磁性纳米颗粒，溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB，日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值，时间扫描600s。温度处理(℃)：25，30，35，40，45，50，55。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程。
结果：以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图，计算其斜率，即可得到反应初速度v，然后以温度浓度为横坐标，以v为纵坐标作图，发现Fe3O4磁性纳米颗粒和HRP对反应温度的敏感性一致，其最适温度基本一致(图5)，进一步表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性。
实施例六、不同尺度的磁性纳米材料具有过氧化物酶的催化活性
试剂：3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。
使用的磁性纳米材料150nm和300nm的Fe3O4磁性纳米颗粒由水热法合成，25nm的Fe3O4磁性纳米颗粒由共沉淀法合成(参见，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))。
方法：取300nm大小的20μg Fe3O4磁性纳米颗粒，溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)，加入32μl的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亚砜)，日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值，时间扫描400s，反应温度25℃。150nm和25nm的Fe3O4磁性纳米颗粒进行相同的操作
结果：25nm、150nm和300nm的Fe3O4磁性纳米颗粒均具有过氧化物酶催化活性，在相同质量时，催化活力25nm＞150nm＞300nm(图6)
实施例七、不同修饰的磁性纳米材料具有过氧化物酶活性
试剂：葡聚糖(Dextran-40)，聚乙二醇(polyethylene glycol 8000，PEG-8000)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料及修饰均购自北京化学试剂公司。
方法：Fe3O4磁性纳米颗粒PEG和Dextran修饰参见文献[11]，SiO2和NH2修饰参见文献(P.Tartaj，T.Gonzalez-Carreno，C.J.Serna，Adv Mater 13，1620(2001))。取不同修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒各20μg，分别溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2，然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亚砜)，日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值，时间扫描400s，反应温度25℃。
结果：不同基团修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒均具有过氧化物酶催化活性(图7)。然而，不同的修饰材料影响其酶活性。无修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒酶活性最高，其次是葡聚糖修饰高于聚乙二醇修饰，二氧化硅和氨基修饰的磁性纳米颗粒酶活力最低。
实施例八、磁性纳米颗粒标记用于蛋白检测
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具备了HRP的酶催化功能，所以可以应用于HRP所应用的领域，取代HRP用来标记生物分子，实现放大信号的检测功能。如图8示意。
试剂：葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A)，生物素(NHS-biotin)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP labeled goatanti-mouse IgG，HRP-GAmIgG)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)
方法：Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化，然后加入protein A使活化的羟基与蛋白中的氨基反应，通过这种共价偶联使protein A固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，形成复合物NP-protein A。后者与酶标二抗类似，能够通过与一抗的结合，直接发生显色反应。这种protein A修饰的磁性纳米颗粒可应用于ELISA、western blot和免疫组织化学等免疫反应。例如，在ELISA实验中，将鼠IgG(mIgG)包被在ELISA免疫96孔中，经3％BSA封闭1小时，加入NP-protein A在37℃作用1小时，然后加入100μl显色液(配方：500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min，加入50μl 2M H2SO4终止反应，450nm下检测光吸收值。HRP标记的羊抗鼠(HRP-GAmIgG)在本实验中作为阳性对照。牛血清白蛋白(BSA)包被的孔作阴性对照。
结果：Fe3O4磁性纳米颗粒标记protein A(NP-protein A)后，能够与鼠抗体结合并发生显色反应，其OD450吸收值与HRP-羊抗鼠二抗显色的光吸收值相当(图9)，表明Fe3O4磁性纳米颗粒可以用于的HRP所应用的ELISA等各种免疫检测和临床诊断。
实施例九、Fe3O4磁性纳米颗粒标记用于核酸检测
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具备HRP的酶催化功能，所以可以应用于HRP所应用的领域，取代HRP用来标记生物分子，实现放大信号的检测功能。图10示意磁性纳米颗粒标记用于核酸检测。
试剂：葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，亲和素(avidin)，生物素(NHS-biotin)，辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-avidin)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5’-ATCCTTATCAATATT-3’)由赛泰克公司(中国)合成。
方法：Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化，然后加入亲和素avidin使活化的羟基与avdin中的氨基反应，通过这种共价偶联使avidin固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，得到NP-avidin复合物。在ELISA实验中，将生物素化的DNA探针分子(biotin-DNA)包被在ELISA免疫96孔中，经3％BSA封闭1小时，加入NP-avidin在37℃作用1小时，然后加入100μl显色液(配方：500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min，加入50μl 2M H2SO4终止反应，450nm下检测光吸收值。HRP-avidin在本实验中作为阳性对照。BSA包被的孔作阴性对照。
结果：Fe3O4磁性纳米颗粒标记avidin后，能够与生物素化的DNA探针分子(biotin-DNA)结合并产生显色反应，其OD450吸收值与HRP-avidin显色的光吸收值相当(图11)，表明Fe3O4磁性纳米颗粒可以用于核酸的检测。
实施例十、Fe3O4磁性纳米颗粒分离—检测蛋白
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具备磁性和催化双重功能，而磁性使它具备了分离DNA、蛋白质、细胞等功能，所以将磁性与酶催化活性相结合可以实现分离与检测的一体化，即分离—检测“separation-detection”。如图12示意Fe3O4磁性纳米颗粒用于分离和检测mIgG。
试剂：葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，protein A，生物素(NHS-biotin)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP labeled goat anti-mouse IgG，HRP-GAmIgG)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)
方法：Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化，然后加入protein A使活化的羟基与蛋白中的氨基反应，通过这种共价偶联使protein A固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，形成复合物NP-protein A。将biotin-mIgG与BSA混合，加入NP-protein A，37℃作用1小时，然后收集Fe3O4磁性纳米颗粒，PBS洗涤三次，得到NP-protein A-biotin-mIgG复合物，然后将复合物加入到avidin包被的免疫96孔中，在37℃作用1小时，然后加入100μl显色液(配方：500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min。加入50μl 2M H2SO4终止反应，450nm下检测光吸收值。NP-protein A与BSA混合的样品作阴性对照。HRP-GAmIgG作阳性对照，操作是先加入同样量的biotin-mIgG然后加入HRP-GAmIgG检测。
结果：同时将Fe3O4磁性纳米颗粒的分离(separation)与检测(detection)功能相结合，实现了Fe3O4磁性纳米颗粒分离物质的直接检测，结果显示Fe3O4磁性纳米颗粒“separation-detection”得到的光吸收值与在直接显色的实验相当(图13)，表明Fe3O4磁性纳米颗粒的分离和检测功能可以同时得到应用。
实施例十一、Fe3O4磁性纳米颗粒的分离—检测核酸
由于Fe3O4磁性纳米颗粒还具备独特的磁学性能，而磁性使它具备了分离提出DNA、蛋白质、细胞等功能，所以将磁性与酶催化相结合可以实验分离与检测的一体化，即“separation-detection”。如图14示意。下述实施例给出了Fe3O4磁性纳米颗粒用于分离和检测核酸识别的例证。
试剂：葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，亲和素(avidin)，生物素(NHS-biotin)，辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-avidin)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5’-ATCCTTATCAATATT-3’)and target DNA(5’-GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’)由赛泰克公司(中国)合成。
方法：Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化，然后加入亲和素avidin(图14)使活化的羟基与avidin中的氨基反应，通过这种共价偶联使avidin固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，得到NP-avidin复合物。将生物素化DNA探针(biotin-DNA)与无关DNA混合，加入NP-avidin，37℃作用1小时，然后收集Fe3O4磁性纳米颗粒，PBS洗涤三次，得到NP-avidin-biotin-DNA复合物，然后将复合物加入到目标DNA(target DNA，可以与biotin-DNA配对识别杂交)包被的ELISA免疫96孔中(图14)，在37℃作用1小时，然后加入100μl显色液(配方：500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min。加入50μl 2M H2SO4终止反应，450nm下检测光吸收值。NP-avidin与无关DNA混合检测作阴性对照。HRP-avidin作阳性对照，操作是先加入同样量的biotin-DNA然后加入HRP-avidin检测。
结果：同时将Fe3O4磁性纳米颗粒的分离(separation)与检测(detection)功能相结合，实现了Fe3O4磁性纳米颗粒分离物质的直接检测，结果显示Fe3O4磁性纳米颗粒“separation-detection”得到的光吸收值与在直接显色的实验相当(图15)，表明Fe3O4磁性纳米颗粒的分离和检测功能可以同时得到应用。
Claims (10)
1.磁性纳米材料作为过氧化物酶的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中将磁性纳米材料用于直接分离和鉴定细胞、核酸和蛋白质；工业催化和发酵；监测环境中有害物质；净化污水；或预防和控制与自由基相关的疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：
在H2O2水溶液的存在下，磁性纳米材料催化过氧化物酶的底物，生成相应的产物，其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下，催化H2O2产生的自由基，所述的自由基与氢供体底物反应，导致氢供体生成有色或发光产物。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的应用，其中所述的磁性纳米材料为Fe3O4磁性纳米颗粒。
5.根据权利要求3所述的应用，其中H2O2在反应混合物中的浓度为0.2μM至1.3μM，并且磁性纳米材料催化过氧化物酶的底物的反应是在pH 3-6、25-55℃的温度下进行的。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述的磁性纳米材料的粒径为1-3000nm。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述的磁性纳米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化硅、羟基和氨基修饰的。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述的过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
9.一种将磁性纳米材料用于检测和分离蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
磁性纳米材料标记蛋白；
标记蛋白后的磁性纳米材料与其它蛋白结合；
在H2O2水溶液的存在下，其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下，催化H2O2产生自由基与过氧化物酶底物反应，导致显色反应，从而检测蛋白的结合。
10.一种将磁性纳米材料用于检测和分离核酸的方法，该方法包括以下步骤：
磁性纳米材料标记抗生物素蛋白；和
标记抗生物素蛋白后的磁性纳米材料在H2O2水溶液的存在下，与生物素化的DNA探针分子结合，
其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下，催化H2O2产生自由基与底物反应，导致显色，从而检测核酸的结合。
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