发明内容
本发明突破了磁性纳米材料的磁性物理特征,首次发现这种磁性纳米材料具有蛋白酶的催化活性,能够催化过氧化氢或其它过氧化物,从而产生与过氧化物酶相类似的催化功能,这种催化机理遵循的是Fenton反应机理(参见V.Kavitha,et al.Chemosphere 55,1235(2004)),即在铁离子存在下,可以催化H2O2产生自由基。通过对磁性纳米材料酶学行为的研究以及与过氧化物酶的比较,确定磁性纳米材料具有过氧化物酶的酶学活性。
因此,本发明提供以下:
(1)磁性纳米材料作为过氧化物酶的应用。
(2)根据上面(1)所述的应用,其中将磁性纳米材料用于直接分离和鉴定细胞、核酸和蛋白质;工业催化和发酵;监测环境中有害物质;净化污水;或预防和控制与自由基相关的疾病。
(3)根据上面(2)所述的应用,包括以下步骤:
在H2O2水溶液的存在下,磁性纳米材料催化过氧化物酶的底物,生成相应的产物,其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下,催化H2O2产生的自由基,所述的自由基与氢供体底物反应,导致氢供体生成有色或发光产物。
(4)根据上面(1)-(3)中任何一项所述的应用,其中所述的磁性纳米材料为Fe3O4磁性纳米颗粒。
(5)根据上面(3)所述的应用,其中H2O2在反应混合物中的浓度为0.2μM至1.3μM,并且磁性纳米材料催化过氧化物酶的底物的反应是在pH3-6、25-55℃的温度下进行的。
(6)根据上面(1)所述的应用,其中所述的磁性纳米材料的粒径为1-3000nm。
(7)根据上面(1)所述的应用,其中所述的磁性纳米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化硅、羟基和氨基修饰的。
(8)根据上面(1)所述的应用,其中所述的过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
(9)一种将磁性纳米材料用于检测和分离蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
磁性纳米材料标记蛋白;
标记蛋白后的磁性纳米材料与其它蛋白结合;
在H2O2水溶液的存在下,其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下,催化H2O2产生自由基与过氧化物酶底物反应,导致显色反应,从而检测蛋白的结合。
(10)一种将磁性纳米材料用于检测和分离核酸的方法,该方法包括以下步骤:
磁性纳米材料标记抗生物素蛋白;和
标记抗生物素蛋白后的磁性纳米材料在H2O2水溶液的存在下,与生物素化的DNA探针分子结合,
其中磁性纳米材料中包含的铁在H2O2存在下,催化H2O2产生自由基与底物反应,导致显色,从而检测核酸的结合。
通过对磁性纳米材料酶学行为的研究以及与过氧化物酶的比较,确定磁性纳米材料具有过氧化物酶的酶学活性。这一新功能的发现,使磁性纳米材料集磁性和催化活性为一体,丰富了磁性纳米材料的新用途,将推动磁性纳米颗粒在生物医学等领域的应用。例如(1)利用磁性纳米材料的磁性和催化活性,直接分离和鉴定细胞、核酸和蛋白质等生物样品;(2)利用磁性纳米材料的催化活性,应用于过氧化物酶所应用的工业催化和发酵;(3)利用磁性纳米材料的酶催化活性,监测环境中有害物质,应用于污水净化等;(4)磁性纳米材料应用于与自由基相关的疾病预防和控制。
附图说明
图1.磁性纳米颗粒催化底物TMB反应产生颜色产物,其中A.不同尺度和形貌的磁性纳米材料;B.磁性磁性纳米颗粒在H2O2存在的条件下,催化TMB产生颜色反应;C.磁性磁性纳米颗粒催化反应原理。
图2.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB的表观酶促动力学曲线,其中Fe3O4 NP指Fe3O4磁性纳米颗粒,HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图3.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB随H2O2的变化,其中Fe3O4 NP指Fe3O4磁性纳米颗粒,HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图4.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB在不同pH体系中的变化,其中Fe3O4 NP指Fe3O4磁性纳米颗粒,HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图5.Fe3O4磁性纳米颗粒催化TMB随温度的变化,其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性纳米颗粒,HRP指辣根过氧化物酶作对照。
图6.不同尺度的磁性纳米材料都具有过氧化物酶活性,但磁性纳米颗粒尺度与酶活性成反比,尺度越小,酶活性越高。
图7.不同基团修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒均具有过氧化物酶催化活性,然而不同基团修饰后的磁性纳米颗粒显示出不同的酶活性。
图8.磁性纳米颗粒作为标记物可直接用于探测蛋白质分子相互识别。
图9.protein A标记的磁性纳米颗粒在ELISA中的应用。NP-proteinA/BSA作阴性对照,NP-protein A/mIgG指利用Fe3O4磁性纳米颗粒探测protein A与mIgG的识别,HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作为阳性对照。
图10.磁性纳米颗粒作为标记物可直接用于探测核酸分子相互识别。
图11.avidin标记的磁性纳米颗粒用于核酸的检测,其中NP-avidin指avidin偶联的Fe3O4磁性纳米颗粒,NP-avidin/biotin-DNA指Fe3O4磁性纳米颗粒直接用于检测核酸分子,HRP-avidin/biotin-DNA作为阳性对照。
图12示意Fe3O4磁性纳米颗粒用于分离和检测mIgG。
图13.Fe3O4磁性纳米颗粒分离和检测mIgG,其中NP-protein A/BSA作阴性对照,NP-protein A-biotin-mIgG指Fe3O4磁性纳米颗粒先分离biotin-mIgG然后再检测,HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作为阳性对照。
图14.Fe3O4磁性纳米颗粒分离和检测核酸。
图15.Fe3O4磁性纳米颗粒分离和检测核酸分子,其中NP-avidin作阴性对照,NP-avidin-biotin-probe指Fe3O4磁性纳米颗粒先分离biotin-DNA然后再检测,HRP-avidin/biotin-DNA作为阳性对照。
具体实施方式
实施例一、磁性纳米材料具有催化活性
试剂:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。使用的磁性纳米材料是由水热法合成(参见,W. Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y.C.Chen,C.Y. Hong,J. Magn.Magn.Mater. 283,210(2004);和H.Deng,X.L.Li,Q.Peng,X.Wang,J.P Chen,Y. D.Li,Angew.Chem.Int.Ed.44,2782(2005))。
方法:取20μgFe3O4磁性纳米材料(25nm,150nm,300nm,2300nm),溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入32μl的30%H2O2和10μlTMB(10mg/ml,溶于二甲亚砜),观察颜色反应。
结果:在Fe3O4磁性纳米材料、H2O2和TMB三者都存在时,溶液出现蓝色反应(图1B),只有Fe3O4磁性纳米材料和H2O2时没有颜色反应,只有Fe3O4磁性纳米材料和TMB时没有颜色反应,只有H2O2和TMB时没有颜色反应。磁性纳米材料包括不同尺度大小,也包括不同形貌(图1A),表明磁性纳米材料在H2O2存在下催化TMB产生蓝色反应,遵循Fenton催化反应机理(图1C)。
实施例二、磁性纳米材料具有过氧化物酶的催化活性
试剂:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米材料合成材料均购自北京化学试剂公司。使用的磁性纳米材料是Fe3O4磁性纳米颗粒由水热法合成(参见,W. Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y. C.Chen,C.Y. Hong,J. Magn.Magn.Mater.283,210(2004);和H.Deng,X.L.Li,Q.Peng,X.Wang,J.P. Chen,Y. D.Li,Angew.Chem.Int.Ed.44,2782(2005)),纳米粒子直径300nm。
方法:在每个反应体系中,取20μgFe3O4磁性纳米颗粒,溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH 4.5),加入32μl的30%H2O2,分别加入不同容量(0,0.5,1,2,4,6,8,10μl)的TMB溶液(10mg/ml,溶于DMSO),日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值,时间扫描600s,反应温度25℃。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程。
结果:以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图,计算其斜率,即可得到反应初速度v,然后以TMB摩尔浓度为横坐标,以v为纵坐标作图,经origin处理得到酶促反应动力学曲线。米氏方程
v=Vmax×[S]/(Km+[S])
分析发现,Fe3O4磁性磁性纳米颗粒表观酶促催化动力学曲线与HRP酶促动力学一致,计算得到的表观米氏常数Km(111.3±0.154μM)要小于HRP的Km(492.8±3.91μM),表明底物与Fe3O4磁性纳米颗粒的结合要优于HRP(图2)。表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有与HRP相似的活性,表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性,分析表明一个Fe3O4磁性纳米颗粒的催化能力相当于约45个HRP分子。
实施例三、H2O2调节Fe3O4磁性纳米颗粒催化酶学反应
试剂:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。Fe3O4磁性纳米颗粒大小直径为300nm。
方法:取20μg Fe3O4磁性纳米颗粒,溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入适量的30%H2O2,然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亚砜),日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值,时间扫描600s,反应温度25℃。Fe3O4磁性纳米颗粒催化,加入30%H2O2(μl)浓度梯度:0,2,4,8,16,32,64,128。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程,加入30%H2O2(μl)浓度梯度:0,0.0625,0.125,0.25,0.5,1,2,4。
结果:以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图,计算其斜率,即可得到反应初速度v,然后加入H2O2量换算成的摩尔浓度为横坐标,以v为纵坐标作图,Fe3O4磁性纳米颗粒对H2O2的最适浓度在0.2-1.3μM之间,在H2O2低于0.2μM时催化反应速度较低,当H2O2高于1.3μM时催化反应受到抑制。而对于HRP,对H2O2的最适浓度在2.0-9.0 nM之间。Fe3O4磁性纳米颗粒与HRP在催化反应中对H2O2的反应基本一致,但前者在催化反应中需要的H2O2要远高于后者(图3),同时表明Fe3O4磁性纳米颗粒清除H2O2的能力要高于HRP。
实施例四、反应溶液pH调节Fe3O4磁性纳米颗粒催化酶学反应
试剂:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。Fe3O4磁性纳米颗粒大小直径为300nm。
方法:取20μgFe3O4磁性纳米颗粒,溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液,加入0.5μl的30%H2O2,然后加入的10μl的10mg/ml的TMB(溶于DMSO),日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值,时间扫描600s,反应温度25℃。0.2M醋酸钠缓冲液(pH):1.5,2.5,3.5,4.5,5.5,6.5,7.5,8.5,9.5,10.5。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程。
结果:以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图,计算其斜率,即可得到反应初速度v,然后以pH为横坐标,以v为纵坐标作图,发现Fe3O4磁性纳米颗粒催化反应缓冲液最适pH在3.5-5.5之间,当pH低于3或高于6时,反应受到抑制,HRP催化反应缓冲液最适pH在3.5-5.5之间。这表明Fe3O4磁性纳米颗粒与HRP的最适pH值范围一致(图4),进一步表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性。
实施例五、温度调节Fe3O4磁性纳米颗粒催化酶学反应
试剂:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。Fe3O4磁性纳米颗粒大小直径为300nm。
方法:取20μgFe3O4磁性纳米颗粒,溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入32μl的30%H2O2,然后加入10μl的10mg/ml的TMB,日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值,时间扫描600s。温度处理(℃):25,30,35,40,45,50,55。辣根过氧化物酶(0.2ng)也在同样条件下监测催化TMB的过程。
结果:以反应最初20秒内652nm光吸收值的变化作图,计算其斜率,即可得到反应初速度v,然后以温度浓度为横坐标,以v为纵坐标作图,发现Fe3O4磁性纳米颗粒和HRP对反应温度的敏感性一致,其最适温度基本一致(图5),进一步表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性。
实施例六、不同尺度的磁性纳米材料具有过氧化物酶的催化活性
试剂:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料均购自北京化学试剂公司。
使用的磁性纳米材料150nm和300nm的Fe3O4磁性纳米颗粒由水热法合成,25nm的Fe3O4磁性纳米颗粒由共沉淀法合成(参见,W. Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y. C.Chen,C.Y. Hong,J.Magn.Magn.Mater. 283,210(2004);和H.Deng,X.L Li,Q.Peng,X.Wang,J.P.Chen,Y. D.Li,Angew.Chem.Int.Ed.44,2782(2005))。
方法:取300nm大小的20μgFe3O4磁性纳米颗粒,溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入32μl的30%H2O2,然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亚砜),日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值,时间扫描400s,反应温度25℃。150nm和25nm的Fe3O4磁性纳米颗粒进行相同的操作
结果:25nm、150nm和300nm的Fe3O4磁性纳米颗粒均具有过氧化物酶催化活性,在相同质量时,催化活力25nm>150nm>300nm(图6)
实施例七、不同修饰的磁性纳米材料具有过氧化物酶活性
试剂:葡聚糖(Dextran-40),聚乙二醇(polyethylene glycol 8000,PEG-8000),3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7,>300 units/mg),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30%H2O2和醋酸钠以及Fe3O4磁性纳米颗粒合成材料及修饰均购自北京化学试剂公司。
方法:Fe3O4磁性纳米颗粒PEG和Dextran修饰参见文献[11],SiO2和NH2修饰参见文献(P.Tartaj,T.Gonzalez-Carreno,C.J.Serna,Adv Mater 13,1620(2001))。取不同修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒各20μg,分别溶于500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH 4.5),加入32μl的30%H2O2,然后加入10μl的10mg/ml的TMB(溶于二甲亚砜),日立UV2010紫外可见分光光度计检测652nm下的光吸收值,时间扫描400s,反应温度25℃。
结果:不同基团修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒均具有过氧化物酶催化活性(图7)。然而,不同的修饰材料影响其酶活性。无修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒酶活性最高,其次是葡聚糖修饰高于聚乙二醇修饰,二氧化硅和氨基修饰的磁性纳米颗粒酶活力最低。
实施例八、磁性纳米颗粒标记用于蛋白检测
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具备了HRP的酶催化功能,所以可以应用于HRP所应用的领域,取代HRP用来标记生物分子,实现放大信号的检测功能。如图8示意。
试剂:葡聚糖(Dextran-40),羰基二咪唑(carboxyl diimidazole,CDI),鼠IgG(mouse immunoglobulin G,mIgG),金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A),生物素(NHS-biotin),辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP labeled goatanti-mouse IgG, HRP-GAmIgG),3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)
方法:Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y. C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化,然后加入protein A使活化的羟基与蛋白中的氨基反应,通过这种共价偶联使protein A固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,形成复合物NP-protein A。后者与酶标二抗类似,能够通过与一抗的结合,直接发生显色反应。这种protein A修饰的磁性纳米颗粒可应用于ELISA、western blot和免疫组织化学等免疫反应。例如,在ELISA实验中,将鼠IgG(mIgG)包被在ELISA免疫96孔中,经3%BSA封闭1小时,加入NP-protein A在37℃作用1小时,然后加入100μl显色液(配方:500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入32μl的30%H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min,加入50μl 2M H2SO4终止反应,450nm下检测光吸收值。HRP标记的羊抗鼠(HRP-GAmIgG)在本实验中作为阳性对照。牛血清白蛋白(BSA)包被的孔作阴性对照。
结果:Fe3O4磁性纳米颗粒标记protein A(NP-protein A)后,能够与鼠抗体结合并发生显色反应,其OD450吸收值与HRP-羊抗鼠二抗显色的光吸收值相当(图9),表明Fe3O4磁性纳米颗粒可以用于的HRP所应用的ELISA等各种免疫检测和临床诊断。
实施例九、Fe3O4磁性纳米颗粒标记用于核酸检测
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具备HRP的酶催化功能,所以可以应用于HRP所应用的领域,取代HRP用来标记生物分子,实现放大信号的检测功能。图10示意磁性纳米颗粒标记用于核酸检测。
试剂:葡聚糖(Dextran-40),羰基二咪唑(carboxyl diimidazole,CDI),鼠IgG(mouse immunoglobulin G, mIgG),亲和素(avidin),生物素(NHS-biotin),辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-avidin),3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),购自Sigma-Aldrich(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5’-ATCCTTATCAATATT-3’)由赛泰克公司(中国)合成。
方法:Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y. C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole,CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化,然后加入亲和素avidin使活化的羟基与avdin中的氨基反应,通过这种共价偶联使avidin固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,得到NP-avidin复合物。在ELISA实验中,将生物素化的DNA探针分子(biotin-DNA)包被在ELISA免疫96孔中,经3%BSA封闭1小时,加入NP-avidin在37℃作用1小时,然后加入100μl显色液(配方:500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入32μl的30%H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min,加入50μl 2M H2SO4终止反应,450nm下检测光吸收值。HRP-avidin在本实验中作为阳性对照。BSA包被的孔作阴性对照。
结果:Fe3O4磁性纳米颗粒标记avidin后,能够与生物素化的DNA探针分子(biotin-DNA)结合并产生显色反应,其OD450吸收值与HRP-avidin显色的光吸收值相当(图11),表明Fe3O4磁性纳米颗粒可以用于核酸的检测。
实施例十、Fe3O4磁性纳米颗粒分离—检测蛋白
由于Fe3O4磁性纳米颗粒具备磁性和催化双重功能,而磁性使它具备了分离DNA、蛋白质、细胞等功能,所以将磁性与酶催化活性相结合可以实现分离与检测的一体化,即分离—检测“separation-detection”。如图12示意Fe3O4磁性纳米颗粒用于分离和检测mIgG。
试剂:葡聚糖(Dextran-40),羰基二咪唑(carboxyl diimidazole,CDI),鼠IgG(mouse immunoglobulin G,mIgG),protein A,生物素(NHS-biotin),辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP labeled goat anti-mouse IgG,HRP-GAmIgG),3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)
方法:Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W. Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y. C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化,然后加入protein A使活化的羟基与蛋白中的氨基反应,通过这种共价偶联使protein A固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,形成复合物NP-protein A。将biotin-mIgG与BSA混合,加入NP-protein A,37 ℃作用1小时,然后收集Fe3O4磁性纳米颗粒,PBS洗涤三次,得到NP-protein A-biotin-mIgG复合物,然后将复合物加入到avidin包被的免疫96孔中,在37℃作用1小时,然后加入100μl显色液(配方:500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH 4.5),加入32μl的30%H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min。加入50μl 2M H2SO4终止反应,450nm下检测光吸收值。NP-protein A与BSA混合的样品作阴性对照。HRP-GAmIgG作阳性对照,操作是先加入同样量的biotin-mIgG然后加入HRP-GAmIgG检测。
结果:同时将Fe3O4磁性纳米颗粒的分离(separation)与检测(detection)功能相结合,实现了Fe3O4磁性纳米颗粒分离物质的直接检测,结果显示Fe3O4磁性纳米颗粒“separation-detection”得到的光吸收值与在直接显色的实验相当(图13),表明Fe3O4磁性纳米颗粒的分离和检测功能可以同时得到应用。
实施例十一、Fe3O4磁性纳米颗粒的分离—检测核酸
由于Fe3O4磁性纳米颗粒还具备独特的磁学性能,而磁性使它具备了分离提出DNA、蛋白质、细胞等功能,所以将磁性与酶催化相结合可以实验分离与检测的一体化,即“separation-detection”。如图14示意。下述实施例给出了Fe3O4磁性纳米颗粒用于分离和检测核酸识别的例证。
试剂:葡聚糖(Dextran-40),羰基二咪唑(carboxyl diimidazole,CDI),鼠IgG(mouse immunoglobulin G, mIgG),亲和素(avidin),生物素(NHS-biotin),辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-avidin),3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),购自Sigma-Aldrich Inc.(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5’-ATCCTTATCAATATT-3’)and target DNA(5’-GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’)由赛泰克公司(中国)合成。
方法:Fe3O4磁性纳米颗粒的葡聚糖(Dextran)修饰参见参考文献(W.Q.Jiang,H.C.Yang,S.Y. Yang,H.E.Horng,_J.C.Hung,Y.C.)。我们使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole,CDI)将Fe3O4磁性纳米颗粒上Dextran-40中的羟基活化,然后加入亲和素avidin(图14)使活化的羟基与avidin中的氨基反应,通过这种共价偶联使avidin固定在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,得到NP-avidin复合物。将生物素化DNA探针(biotin-DNA)与无关DNA混合,加入NP-avidin,37 ℃作用1小时,然后收集Fe3O4磁性纳米颗粒,PBS洗涤三次,得到NP-avidin-biotin-DNA复合物,然后将复合物加入到目标DNA(target DNA,可以与biotin-DNA配对识别杂交)包被的ELISA免疫96孔中(图14),在37℃作用1小时,然后加入100μl显色液(配方:500μl的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.5),加入32μl的30%H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室温显色10min。加入50μl 2M H2SO4终止反应,450nm下检测光吸收值。NP-avidin与无关DNA混合检测作阴性对照。HRP-avidin作阳性对照,操作是先加入同样量的biotin-DNA然后加入HRP-avidin检测。
结果:同时将Fe3O4磁性纳米颗粒的分离(separation)与检测(detection)功能相结合,实现了Fe3O4磁性纳米颗粒分离物质的直接检测,结果显示Fe3O4磁性纳米颗粒“separation-detection”得到的光吸收值与在直接显色的实验相当(图15),表明Fe3O4磁性纳米颗粒的分离和检测功能可以同时得到应用。