CN109060787A - 一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法。本方法包括以下步骤：步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。本发明先成功制备了纳米酶使用液，并将其用作TMB‑H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制纳米酶催化TMB‑H2O2的显色作用，根据四环素含量和显色作用强弱的关系建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于纳米酶检测四环素类抗生素 的方法。
背景技术
酶是存在生命体中的一类具有催化活性的生物大分子，具有催化效率高、 专一性强、作用条件温和等特点。然而，天然酶易变性失活、提纯困难、价格 昂贵、储藏和使用不便、成本高，这些缺点促使研究工作者寻求具有天然酶催 化功能的人工模拟酶物质来满足实际需要。纳米材料从尺寸、形状以及表面电 荷来说，与天然酶具有一定的相似之处。2007年，Yan课题组首次发现磁性Fe3O4纳米粒子具有内在类似辣根过氧化物酶的催化活性，提出了氧化铁纳米颗粒模 拟酶的概念。近年来，基于纳米材料的模拟酶(nanozymes，纳米酶)被誉为新一 代的人工模拟酶。相对于天然酶，纳米酶对酸、碱、温度的稳定性好，而且反 应活性较高及廉价易得等优点，已在免疫分析、癌症诊断、环境污染物降解、 纳米载药、尤其是比色生物传感等多个领域引起了人们的广泛关注。
基于纳米酶的比色生物传感的原理是将物质的检测转化为颜色的变化从而 达到裸眼检测的目的，具有制备方法简单、成本低廉、实用性强等优点。Wang 及Qu课题组分别详尽评述了有关纳米酶的最新研究进展。在综述中分类总结了 可用于比色生物传感的纳米酶：金属氧化物纳米颗粒如CeO2、Fe3O4、Co3O4、 CuO、MnO2、V2O5等；贵金属纳米材料如Au、Pt及复合金属纳米材料等；碳 基纳米材料如富勒烯、石墨烯、碳纳米管及其它纳米材料等。从中我们可知， 目前基于纳米酶的比色生物传感在生物医学分析和环境监测等分析化学研究领 域已取得了巨大的成功。金属-有机骨架材料(metal-organic frameworks，MOF) 是利用有机配体与金属离子间的络合作用自组装形成的多孔有机－无机杂化材 料。MOF具有高度有序的孔结构、孔尺寸可控、超大比表面积、暴露的金属位 点、规则的晶体形状等优点，可克服传统纳米酶的一些不足，是有望用作纳米 酶的潜在理想纳米材料。
四环素类药物(Tetracyclines)因其广谱、价格便宜等因素，在兽医临床中 被广泛使用，此外，由于四环素类药物在促进禽畜生长，提高饲料利用率方面 有很好的作用而被广泛用作饲料添加剂，尤其是一些养殖户滥用、超范围使用 必然导致其在禽畜产品中过量残留从而影响禽畜产品的质量安全，在使用过程 中大部分抗生素以原药和代谢产物的形式进入环境，并可能通过食物链对生态 环境产生毒害作用。目前我国关于此类药物的检测主要采用液相色谱－质谱/质 谱、高效液相色谱法、ROSA法以及放射受体分析法等，这些方法有的设备昂贵， 有的操作步骤繁琐，难以在基层中推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于纳米酶检测四环素类抗生素 的方法，为四环素类抗生素分子分析提供一种灵敏度高、选择性好、经济简便 的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于纳米酶检测 四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：
步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；
步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇 匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫 酸终止反应。
本发明的有益效果在于：本发明成功制备了纳米酶使用液，并将其用作 TMB-H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@纳米酶催化 TMB-H2O2的显色作用，根据四环素含量和显色作用强弱的关系建立起一种快速 测定四环素族抗生素的方法，数据显示：该方法线性关系及精密度良好。用于 实际样品的检测，方法检出限为0.035-0.043μg，回收率在90.9％～95.6％。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的Fe3O4的XRD图；
图2为本发明具体实施方式的Fe3O4磁性微球的红外光谱图；
图3为本发明具体实施方式的Fe3O4磁性微球的SEM图；
图4为本发明具体实施方式的Fe3O4磁性微球的TEM图；
图5为本发明具体实施方式的4种抗生素的显色反应速率
图6为本发明具体实施方式的不同的显色液体积对显色的影响；
图7为本发明具体实施方式的不同体积的H2O2对显色的影响；
图8为本发明具体实施方式的不同梯度金霉素的显色扫描；
图9为本发明具体实施方式的4种抗生素的反应曲线。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并 配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于:制备得到的纳米酶使用液用作TMB-H2O2反应的 催化剂，利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@纳米酶催化TMB-H2O2的显色作 用，建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法。
一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：
步骤1、制备纳米酶使用液；
利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微 球，制得纳米酶使用液；
步骤2、纳米酶检测四环素类抗生素；
于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加 入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止 反应。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明成功制备了纳米酶使用 液，并将其用作TMB-H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@ 纳米酶催化TMB-H2O2的显色作用，根据四环素含量和显色作用强弱的关系建 立起一种快速测定四环素族抗生素的方法，数据显示：该方法线性关系及精密 度良好。用于实际样品的检测，方法检出限为0.035-0.043μg，回收率在90.9％～ 95.6％。
进一步的，所述步骤1制备纳米酶使用液具体如下：
利用水热法合成Fe3O4磁性微球，称取0.5gFe3O4磁性微球并加入 100mL0.1mol/L乙酸缓冲液超声分散1min，得到5mg/mL的储备液，于4℃暗处 保存，临用前用乙酸缓冲液稀释储备液至0.5mg/mL即得纳米酶使用液。
进一步的，所述步骤1中水热法合成Fe3O4磁性微球的方法如下：
称取0.6gFeCl3·6H2O加入20mL乙二醇溶解，加入1.5g乙酸钠，用力搅 拌30min，200℃保温30h，通过外加磁铁分离沉淀物，得到的磁性微球用纯水 和乙醇洗涤多次，真空干燥6h，即制得Fe3O4磁性微球。
进一步的，所述步骤2纳米酶检测四环素类抗生素具体如下：
移取100μL纳米酶使用液，加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入 1mLTMB显色液，0.8mL100mmol/LH2O2，混匀后于47℃孵育1小时后加入 0.5mL2mol/L硫酸终止反应。
进一步的，所述乙酸缓冲液的pH为4。
实施例1
1实验部分
1.1仪器和试剂
UV2700分光光度计，(岛津中国)，FEI Tecnai G20型高分辨透射电镜(美 国FEI公司)，S4800冷场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)，MPMS-XL-7 超导干涉量子仪(美国Quantum Design公司)，GENESIS能谱仪(美国EDAX 公司)，D8Advance粉末X射线衍射仪(德国布鲁克)，Milli-Q超纯水系统(美 国Millipore公司)。
无水乙醇、醋酸钠(西陇化工股份有限公司)；三氯化铁、乙二醇、色谱级 甲醇、乙腈、丙酮(上海国药集团化学试剂有限公司)；TMB显色液(宿迁袁氏 生物有限公司)；实验用水由Milli-Q超纯水系统提供。本实验中用到的4种四 环素类标准品为有证标准品：四环素(tetracycline，TC)、强力霉素(Doxitard， DOX)、金霉素(chlortetracycline，CTC)、土霉素(oxytetracycline，OTC)。
1.2材料的合成
利用水热法合成Fe3O4磁性微球：称取0.6gFeCl 3·6H 2O加入20mL乙 二醇溶解，加入1.5g乙酸钠，用力搅拌30min，200℃保温30h，外磁铁分离， 用纯水和乙醇洗涤数次，所得产物在暗处真空干燥6h，称取0.5g Fe3O4磁性纳 米微球用100mL0.1M乙酸缓冲液(pH4.0)分散后超声1min，得到5mg/mL的 储备液，于4℃暗处保存。临用前用缓冲液稀释至0.5mg/mL得到纳米酶使用液。
1.3四种四环素类抗生素标准曲线配制
分别移取1.0mL四种四环素类抗生素标准溶液(100mg/mL)至10mL管中， 用超纯水定容至刻度，得到10mg/mL的标准工作液。
1.4显色过程
首先移取100μL纳米酶使用液至10mL管中，分别加入不同体积的四环素 标准工作液，振荡摇匀，加入1mLTMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)显色 液，0.8mL100mM H2O2，混匀后于47℃孵育1小时后加入0.5mL2M硫酸终止 反应，用超纯水定容至刻度后于451nm测定。
2结果与讨论
2.1材料表征
2.1.1 XRD
用X-射线粉末衍射仪对所制备的Fe3O4纳米粒子进行分析。由图1可知， 制备的Fe3O4纳米粒子均出现了Fe3O4的6个特征峰，分别对应Fe3O4的(220)、 (331)、(400)、(422)、(511)和(440)特征晶面，表示在特定条件下形成了 Fe3O4纳米粒子。
2.1.2 FIR
图2是Fe3O4@磁性微球的红外光谱图。图中561cm-1是Fe3O4的特征吸收 峰，说明合成Fe3O4纳米晶体。
2.1.3SEM
图3是Fe3O4磁性微球的SEM图。从图3中可以看出，Fe3O4为球形颗粒， 分散均匀。从图3中明显看到磁性微球表面不规则的沟壑，该沟壑增加了纳米 粒子吸附反应体系的表面积，从图可见粒子分散性良好。
2.1.4 TEM
图4是Fe3O4磁性微球的TEM图，可以看出Fe3O4(4A)为圆球形，颗粒 均匀且分散性好。
2.2酶反应条件的优化
根据文献得知该酶-TMB-H2O2最佳显色反应温度在47℃，在此条件下优化 了反应时间、反应试剂比例。
2.2.1反应时间
移取100μL纳米酶使用液至10mL管中，分别加入200μL的四环素标准 工作液，振荡摇匀，加入1mLTMB显色液，0.8mL100mM H2O2，混匀后于47℃ 孵育，在不同时间取出后加入0.5mL2M硫酸终止反应，用超纯水定容至刻度后 于451nm测定，结果见图5，可见，在给定的时间内，显色强度随时间增加， 60分钟后显色反应速率明显变缓，因此，选择显色时间为60分钟。
2.2.3反应试剂比例
移取100μL纳米酶使用液至10mL管中，分别加入200μL的四环素标准 工作液，振荡摇匀，加入不同体积的TMB显色液和100mM H2O2，混匀后于47℃ 孵育，在60分钟取出后加入0.5mL2M硫酸终止反应，用超纯水定容至刻度后 于451nm测定，结果见图6、图7，由图可见在1mL H2O2时，显色最佳的TMB 体积为1.2ml，而在1mlTMB时，最佳的H2O2体积为0.8Ml。综合考虑TMB和 H2O2的比例为1mL：0.8mL为最佳。
2.2.4显色反应灵敏度
图8显示H2O2-TMB、金霉素-H2O2-TMB、纳米酶-H2O2-TMB、纳米酶-金 霉素-H2O2-TMB的显色效果，可见纳米酶对H2O2-TMB显色的催化作用以及四 环素对纳米酶的封闭作用。
1.H2O2-TMB；2.H2O2-TMB-CTC；3.H2O2-TMB-Fe3O4@；4.H2O2-TMB- Fe3O4@-0.2μgCTC；5.H2O2-TMB-Fe3O4@-0.4μgCTC； 6.H2O2-TMB-Fe3O4@-0.6μgCTC；7.H2O2-TMB-Fe3O4@-0.8μgCTC； 8.H2O2-TMB-Fe3O4@-1.0μgCTC；9.H2O2-TMB-Fe3O4@-1.6μgCTC。
2.2.5显色线性
图9为4种四环素类抗生素在纳米酶催化体系中的显色曲线，以吸光度最 小分度值的10倍分别计算出4种四环素类抗生素的定量限，见表1。
表1采用纳米酶检测4种抗生素的线性方程及定量限
| 线性方程 | R2 | 定量限μg | |
| 四环素 | y＝-0.2313x+0.8568 | 0.987 | 0.043 |
| 土霉素 | y＝-0.2536x+0.8497 | 0.993 | 0.039 |
| 金霉素 | y＝-0.2484x+0.8565 | 0.991 | 0.040 |
| 强力霉素 | y＝-0.2833x+0.8483 | 0.991 | 0.035 |
2.3和目前实验室常用方法比较结果如表2：
表2.将本法和其他实验室常用方法进行比较
| Method | liner，mg/L | Detection limit，μg | references |
| Electrochemical(OTC) | 0.01-0.6 | 0.01 | 15 |
| HPLC(OTC) | 0.05-2.0 | 0.008 | 11 |
| HPLC/MS/MS | - | 0.0008 | 10 |
| Colorimetric TC | 0.2-2 | 0.043 | this work |
| OTC | 0.2-2 | 0.039 | |
| CTC | 0.2-2 | 0.04 | |
| DOX | 0.2-2 | 0.035 |
2.4方法的应用
从市场购买3种抗生素的片剂，用水溶解后稀释至合适浓度，加入一定浓 度标准品计算回收率，见表3。
表3.采用本法检测四环素的回收率
| 名称 | 标示值g | 测定值g | 添加水平g | 回收率％ |
| 四环素 | 0.125 | 0.120 | 0.1 | 95.6 |
| 土霉素 | 0.25 | 0.23 | 0.2 | 92.4 |
| 强力霉素 | 0.1 | 0.094 | 0.1 | 90.9 |
综上所述，本发明提供的基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，灵敏度 高、选择性好、经济简便。
本发明先成功制备了纳米酶使用液，并将其用作TMB-H2O2反应的催化剂， 利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@纳米酶催化TMB-H2O2的显色作用，根据 四环素含量和显色作用强弱的关系建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法， 数据显示：该方法线性关系及精密度良好。用于实际样品的检测，方法检出限 为0.035-0.043μg，回收率在90.9％～95.6％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术 领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；
步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。
2.根据权利要求1所述的基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述步骤1具体如下：
利用水热法合成Fe3O4磁性微球，称取0.5gFe3O4磁性微球并加入100mL0.1mol/L乙酸缓冲液超声分散1min，得到5mg/mL的储备液，于4℃暗处保存，临用前用乙酸缓冲液稀释储备液至0.5mg/mL即得纳米酶使用液。
3.根据权利要求1或2任一项所述的基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述步骤1中水热法合成Fe3O4磁性微球的方法如下：
称取0.6gFeCl3·6H2O加入20mL乙二醇溶解，加入1.5g乙酸钠，用力搅拌30min，200℃保温30h，通过外加磁铁分离沉淀物，得到的磁性微球用纯水和乙醇洗涤多次，真空干燥6h，即制得Fe3O4磁性微球。
4.根据权利要求1所述的基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述步骤2具体如下：
移取100μL纳米酶使用液，加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入1mLTMB显色液，0.8mL100mmol/LH2O2，混匀后于47℃孵育1小时后加入0.5mL2mol/L硫酸终止反应。
5.根据权利要求1所述的基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述乙酸缓冲液的pH为4。
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