CN107496449A - 一种具有止血、杀菌功能的纳米酶止血剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有止血、杀菌功能的纳米酶止血剂及其应用。其中纳米酶颗粒会引起伤口血液中的血小板及红细胞聚集，产生凝血的效果；同时，修饰在纳米酶表面的催化剂，可以催化血液中的成分产生过氧化物如H2O2。由此原理，可实现对伤口中的致病菌的杀灭，预防伤口感染。这种双功能的纳米酶止血剂能够实现大批量生产、成本低。本发明的纳米酶止血剂作为新型抗菌止血剂的应用，具有巨大的社会效益和经济效益，也具有良好的应用前景。

Description

一种具有止血、杀菌功能的纳米酶止血剂及其应用
技术领域
本发明属于纳米生物医学、纳米技术和生物医药器械的交叉领域。特别地，本发明属于纳米材料的医学应用。具体的说，提供一种止血抗菌剂，应用于创伤性伤口的止血抗菌治疗。
技术背景
失血和伤口感染是在突发性事件、意外事故以及战争中导致人员重大伤亡的主要原因。失血会直接造成伤员的昏迷、休克，是造成人体受机械性损伤后死亡的最常见原因之一[1]。而伤口感染是刀伤、挫伤、火器伤等创伤性伤口最严重的并发症之一。伤口感染会造成创口的愈合及修复困难，乃至无法修复，甚至截肢。伤口的及时止血和抗菌是创伤性伤口的治疗领域所亟需解决的一个难题[2]。
临床上常用的止血材料为止血纱布、止血纤维及止血绷带。这些材料存在以下几个问题：(1)止血耗时长，对重度出血症状效果差；(2)易于伤口黏连，而不易换药；(3)不具有抗菌的能力[3]。目前，国内外用于重度出血的急救止血产品较少，主要的产品是依赖于沸石分子筛超强的吸水能力而发展起来的快速止血产品，但是该类产品在吸水时会放出大量的热，产生明显的热灼伤[4]。同时，此类产品同样不具有抗菌效果。
据市场调查，目前我国每年用于临床的各类止血材料约为500吨，其中用于外科手术的止血材料约为200吨。用于各种创伤与外科手术的止血材料的国内市场约为400亿元/年，且年平均增长率达5％。如果能够占据其中1％的市场份额，年销售额就有4亿左右。面对世界70多亿人口的民用市场，止血材料具有巨大的经济效益。因此，开发出能够在止血的同时又有抗菌效果的止血剂，将具有巨大的社会效益和经济效益，并且具有良好的应用前景。
发明内容
在金属氧化物纳米颗粒的研究中，发明人发现，金属氧化物纳米颗粒的酶活性[5]，会催化底物过氧化氢产生羟基自由基[5,6]，能够杀灭多种细菌 [7]，具有此类酶活性的金属氧化物纳米颗粒因此被称为纳米酶。另外，发明人还发现，纳米酶具有止血的功能，进而本发明人开发了一种抗菌止血剂(图1)。
具体而言，本发明包括以下方面：
本发明的第一个方面涉及一种止血剂，其包含纳米酶
在优选的实施方案中，所述纳米酶被能够将血液中成分转变为过氧化物的催化剂修饰。
在优选的实施方案中，所述过氧化物为H2O2。
在优选的实施方案中，所述纳米酶是具有过氧化物酶活性的金属氧化物纳米颗粒。
在优选的实施方案中，所述纳米酶选自Fe3O4、Fe2O3、Co3O4、V2O5、MnO2、CeO2、CuO纳米颗粒或其组合。
在更优选的实施方案中，所述纳米酶为Fe3O4纳米颗粒。
本发明的第二个方面涉及纳米酶在制备止血剂中的用途。
在优选的实施方案中，所述纳米酶被能够将血液中成分转变为过氧化物的催化剂修饰。
在优选的实施方案中，所述纳米酶是具有过氧化物酶活性的金属氧化物纳米颗粒。
在进一步优选的实施方案中，所述纳米酶选自Fe3O4、Fe2O3、Co3O4、V2O5、MnO2、CeO2、CuO纳米颗粒或其组合。
在更优选的实施方案中，所述纳米酶为Fe3O4纳米颗粒。
在优选的实施方案中，所述催化剂是酶。
在更优选的实施方案中，所述催化剂是葡萄糖氧化酶和/或尿酸氧化酶，相应地，所述血液中成分为葡萄糖和/或尿酸，对于催化剂的选择，显然不限于上述两种，对于本领域技术人员知晓的所有能够将存在于血液中 的成分转变产生过氧化物如过氧化氢的物质均可用于本发明。
在优选的实施方案中，所述催化剂以化学偶联方法修饰所述纳米酶。
在更优选的实施方案中，所述化学偶联方法使用偶联剂如NHS-EDC、戊二醛或硅烷。
本发明的第三个方面涉及本发明第一方面所述的止血剂在制备止血材料/药物中的用途，所述止血材料/药物在止血的同时抗菌。
在优选的实施方案中，所述菌包括细菌、真菌。
在优选的实施方案中，所述细菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌。
本发明的第四个方面涉及一种止血材料/药物，所述止血材料/药物包含所述第一方面所述止血剂，和任选地其他抗菌消炎类药用辅料。
在优选的实施方案中，所述抗菌消炎类药用辅料包括但不限于抗生素、合成抗菌药以及抗真菌药物。
在优选的实施方案中，所述止血材料/药物包括绷带、贴片、纱布。
本发明的止血剂制备方法简单，既具有快速止血功能，又有广谱杀菌功效，不会引起创口出放热而造成二次损伤，因此可以用于制备止血抗菌的敷料型药物。
本发明的止血剂还可以与其他药物组合，制成不同剂型，用于各种创伤的动静脉管出血的止血剂和抗菌，可以直接包覆在血管出血处或涂布在绷带上使用。
在以下附图和实施例中，重点以葡萄糖氧化酶和葡萄糖以及Fe3O4纳米酶的组合为例说明本发明的产品和方法的原理和效果，但其不以任何方式限制本发明的范围。
附图简述
以下附图中均以葡萄糖氧化酶和葡萄糖以及Fe3O4纳米酶的组合为例进行说明
图1本发明的止血剂的作用原理示意图。
图2对葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶及不同分子量壳聚糖修饰的Fe3O4纳米酶的电镜表征。
图3葡萄糖氧化酶修饰，没有改变金属氧化物纳米酶的止血特性；单纯的 纳米酶比壳聚糖修饰的金属氧化物纳米酶具有更强的凝血能力。
图4本发明的止血剂在葡萄糖存在的条件下，可以有效的杀灭大肠杆菌及铜绿假单胞杆菌，而不加葡萄糖基本上不抑制大肠杆菌及铜绿假单胞杆菌的生长。
图5止血抗菌绷带杀菌效果：将葡萄糖修饰的金属氧化物纳米酶涂布到绷带上，然后分别浸润葡萄糖和生理盐水；浸润有葡萄糖的绷带可以显著有效的抑制杀灭铜绿假单胞杆菌；而浸润有生理盐水的绷带则不具有这个功能。
具体实施方式
下面用实施例来具体说明本发明的内容，这些实施例不应理解为任何意义上的对本发明的限制。本发明人经过广泛而深入的研究，在实验室前期的工作(Gao et al.NatureNanotech.2007；Fan et al.Nature Nanotech.2012)和中国发明专利200610057413.9的基础上，利用金属氧化物纳米颗粒用于抗菌和止血。在此基础上，完成了本项发明。
实施例1聚丙烯酸(PAA)、壳聚糖修饰的Fe3O4纳米酶颗粒的合成及表征
在本实施例中，PAA修饰的Fe3O4纳米酶颗粒的合成采用的是水热法。具体如下：将3g FeCl3加入80mL乙二醇中混匀，充分溶解后，加入6g无水醋酸钠，0.6g PAA，充分混合30分钟，然后将样品放入反应釜中，200℃反应14个小时。冷却后，磁分离，乙醇清洗后，60℃烘干，分装保存。此方法合成的Fe3O4纳米酶表面为羧基修饰。
在本实施例中，壳聚糖修饰的Fe3O4纳米酶颗粒合成方法也为水热法。具体如下：3gFeCl3加入80mL乙二醇中混匀，充分溶解后，加入6g无水醋酸钠，1g不同分子量(低分子量、中分子量、高分子量)的壳聚糖，充分混合30分钟，然后将样品放入反应釜中，200℃反应14个小时。冷却后，磁分离，乙醇清洗后，60℃烘干，分装保存。
实施例2Fe3O4纳米酶颗粒的葡萄糖氧化酶修饰
在本实施例中，将葡萄糖氧化酶修饰到Fe3O4纳米酶表面采用的是NHS-EDC法。详述如下：5mg EDC和NHS溶解到1mL的去离子水中， 涡旋振荡。然后，将5mg上述合成的PAA修饰的Fe3O4纳米酶加到溶液体系中室温孵育30分钟。羧基活化的Fe3O4纳米酶颗粒通过磁富集的方法用去离子水洗两次，然后加入0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶。反应缓冲液为50mM，pH为6的醋酸钠溶液。反应体系涡旋振荡后，4℃孵育过夜。最后，葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶颗粒通过磁富集的方法用PBS洗两次，最后在PBS缓冲体系中保存。
经葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶颗粒及壳聚糖修饰的Fe3O4纳米酶纳米颗粒的表征是利用JEOL 2000FX 200kV的透射电子显微镜拍摄(图2)。
实施例3葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶颗粒的凝血效果及其与壳聚糖修饰的纳米酶的对比
壳聚糖现在已经被广泛的用作止血材料。在本实施例中，为了定量的对比单纯葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶的凝血能力，我们选择在合成过程中，即有壳聚糖修饰的Fe3O4纳米酶作为对照，同时为了比较葡萄糖氧化酶修饰是否影响Fe3O4纳米酶的凝血能力，选择不加任何修饰的Fe3O4纳米酶作为阳性对照。本实施例中，血液样本来源于实验小鼠C57BL/6。具体如下：新鲜采集的小鼠血液用柠檬酸抗凝剂抗凝。柠檬酸抗凝的原理主要是螯合血液中的Ca2+离子，因为在血液凝固的过程中需要钙离子的参与。待血液取好后，加入与柠檬酸等量的CaCl2复凝。在这个时候加入浓度梯度(0.1-0.5mg/mL)的不同类型的磁颗粒。不加磁颗粒的血液样本为血液本身能力凝血的对照。37℃反应10min后，发生凝血的血液样本会在试管底部形成明显的血块。然后用去离子水轻轻将没有凝固到血块中的红细胞洗出来。离心后，取上清。上清中含有未参加凝血反应的红细胞。然后将上清用去离子水稀释后，37℃溶血1小时。最后OD542读血红蛋白的吸光值。读值越高，表明凝血能力越低。反之，OD542读值越低，表明剩余的红细胞越少，凝血能力就越强。结果如图3所示，本发明人发现单纯葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶的凝血效果要优于壳聚糖修饰的Fe3O4纳米酶，同时葡萄糖氧化酶的修饰不影响Fe3O4纳米酶的凝血能力。
实施例4葡萄糖修饰的Fe3O4纳米酶颗粒对铜绿假单胞杆菌的杀伤
铜绿假单胞杆菌是造成伤口感染化脓的主要致病菌。在本实施例中， 申请人选择铜绿假单胞杆菌来评估葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶的杀菌效果。具体如下：将铜绿假单胞杆菌涂布到培养基上，在培养的同时，分别向培养基处滴加0.5mg Fe3O4纳米酶。然后向Fe3O4纳米酶颗粒部位分别涂布生理盐水及100mM的葡萄糖溶液，培养过夜。结果如图4所示，有葡萄糖存在的情况下，葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖产生过氧化氢。在Fe3O4纳米酶的催化作用下，过氧化氢分解产生羟基自由基，从而将铜绿假单胞杆菌杀死。而不含葡萄糖底物的时候，单纯的磁颗粒不具有杀菌的能力。
实施例5葡萄糖修饰的Fe3O4纳米酶绷带的杀菌效果
在本实施例中，发明人将葡萄糖氧化酶修饰的Fe3O4纳米酶吸附到医用纱布绷带上。然后，将绷带分别浸润生理盐水，及100mM的葡萄糖后，分别与铜绿假单胞杆菌共培养。结果如图5所示，在存在葡萄糖的前提下，绷带可以起到显著的杀菌功能。
实施例6对其他纳米材料和催化剂的类似研究
本发明人还对不同的纳米酶(包括Fe2O3、Co3O4、V2O5、MnO2、CeO2、CuO)与葡萄糖氧化酶进行组合，以及使用Fe3O4与尿酸氧化酶和相应的血液中成分进行测试，取得了与实施例2-4类似的结果。
实施例7使用不同偶联方法对止血杀菌的影响
本发明人还对如上文所述的不同的偶联方法进行测试，发现不同偶联方法对本发明的止血剂的效力没有影响。
实施例8对不同菌的杀菌效果研究
本发明人还对不同细菌、真菌进行了本发明的止血剂的效果研究，结果表明，由于本发明的原理中羟基自由基的广谱性，对不同细菌、真菌均具有不同程度的杀菌效果。
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Claims (10)

1.一种止血剂，其包含纳米酶。
2.根据权利要求1所述的止血剂，所述纳米酶被能够将血液中成分转变为过氧化物的催化剂修饰，所述过氧化物优选为H2O2。
3.根据权利要求1或2所述的止血剂，其中所述纳米酶是具有过氧化物酶活性的金属氧化物纳米颗粒，优选选自Fe3O4、Fe2O3、Co3O4、V2O5、MnO2、CeO2、CuO纳米颗粒或其组合，优选为Fe3O4纳米颗粒。
4.纳米酶在制备止血剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述纳米酶是具有过氧化物酶活性的金属氧化物纳米颗粒，优选选自Fe3O4、Fe2O3、Co3O4、V2O5、MnO2、CeO2、CuO纳米颗粒或其组合，优选为Fe3O4纳米颗粒，优选所述纳米酶被能够将血液中成分转变为过氧化物的催化剂修饰，所述过氧化物优选为H2O2。
6.根据权利要求2所述的止血剂，其中所述催化剂是酶，优选为葡萄糖氧化酶和/或尿酸氧化酶，相应地，所述血液中成分优选为葡萄糖和/或尿酸。
7.根据权利要求2所述的止血剂，其中所述催化剂以化学偶联方法修饰所述纳米酶，所述化学偶联方法使用偶联剂如NHS-EDC、戊二醛或硅烷。
8.权利要求2-3、6-7中任一项所述的止血剂在制备止血材料/药物中的用途，所述止血材料/药物在止血的同时抗菌。
9.一种止血材料/药物，所述止血材料/药物包含权利要求2-3、6-7中任一项所述的止血剂，和任选地其他抗菌消炎类药用辅料，所述抗菌消炎类药用辅料优选选自抗生素、合成抗菌药以及抗真菌药物或其组合。
10.根据权利要求9所述的止血材料/药物，所述止血材料/药物包括绷带、贴片、纱布。
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