CN108866036A - 一种具有抗菌功能的级联酶反应微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗菌功能的级联酶反应微球及其制备方法。该方法是将葡萄糖氧化酶和血红蛋白一起溶解到氯化锰溶液中，在搅拌的条件下，迅速加入碳酸钠溶液，得到同时包埋酶和蛋白质的碳酸锰粒子，在粒子表面组装聚电解质多层膜，通过戊二醛交联稳定粒子结构，加入乙二胺四乙酸钠溶液去除碳酸锰模板，从而得到具有级联酶反应功能的微球，该微球可以利用葡萄糖通过级联酶反应生成高活性的羟基自由基，具有很好的抗菌性能。本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，得到的具有酶级联反应功能的微球具有良好的稳定性和杀死耐药菌等特点，具有良好应用前景。

Description

一种具有抗菌功能的级联酶反应微球及其制备方法
技术领域
本发明属于抗菌微纳米材料制备领域，涉及一种具有抗菌功能的级联酶反应微球及其制备方法。
背景介绍
酶反应器泛指将酶负载到微纳结构的容器中，比如微胶囊、介孔粒子、聚合物囊泡、聚合物微球和微凝胶等，从而实现微纳容器中的酶催化反应，相比于自由酶具有更好的稳定性和更高的催化活性。酶反应器按尺寸大小可大致分为纳米酶反应器和微米酶反应器，按照反应步数可以分为单步酶反应器和级联酶反应器。酶反应器在生物医学领域有着广泛应用，比如癌症治疗、细胞和细胞器模拟、刺激响应药物释放等。在众多制备酶反应器的方法中，模板法简单有效，特别是采用碳酸盐模板，其对酶和蛋白质的包埋率很高，而且可同时负载多种酶或蛋白质，最后得到的微球稳定性好。单步酶反应器往往需要外加底物才能发挥作用，而通过设计级联的酶催化反应，就可以利用人体内的物质来进行两步或者多步反应来实现特定的生物医学应用。
目前已经有相当数量的微纳酶反应器用于癌症治疗、细胞功能模拟以及药物释放等领域，但在抗菌领域比较少见。细菌感染是人类目前所面临的严峻挑战，虽然抗生素的发现已经帮助人类有效地对抗细菌，但是伴随着抗生素的使用，细菌在不断进化，各种各样的耐药菌不断出现，比如目前常见的耐甲氧西林金黄葡萄球菌，每年仍然有很多生命因此失去。此外，细菌容易生长形成细菌生物膜，细菌生物膜一旦形成就很难被抗生素和人体免疫系统清除，同时会产生偏酸性的环境，而人体内葡萄糖也会促进细菌的生长和生物膜的形成。为此，制备一种级联酶反应器，利用人体内的葡萄糖在细菌感染造成的低pH值条件下通过级联酶催化反应生成能有效杀菌的物质，比如活性氧，这样就可以选择性的实现对细菌的清除和抑制生物膜的形成。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗菌功能的级联酶反应微球及其制备方法。
本发明中制备具有抗菌功能的级联酶反应微球的方法包括以下步骤：
1)配制等浓度的氯化锰溶液和碳酸钠溶液，将葡萄糖氧化酶(GOx)和血红蛋白(Hb)溶于氯化锰溶液中，最终氯化锰溶液中GOx和Hb的总浓度为1～10mg/mL，GOx和Hb的质量比为1:5；在高速搅拌下，迅速加入与氯化锰溶液等体积的碳酸钠溶液，1min后停止搅拌，从而得到包埋有GOx和Hb的碳酸锰粒子，离心去除上清液，并用去离子水洗涤粒子多次；
2)取步骤1)所得的碳酸锰粒子分散于去离子水中制成浓度为20mg/mL的悬浮液,离心去除上清液，加入浓度为1～2mg/mL的聚阳离子溶液，震荡10～20min，离心去除上清液，加入去离子水洗涤粒子多次；然后加入浓度为1～2mg/mL的聚阴离子溶液，震荡10～20min，离心去除上清液，用去离子水洗涤粒子多次，得到表面为聚阴离子的粒子；所述的碳酸锰粒子悬浮液、聚阳离子溶液及聚阴离子溶液为等体积；
3)将步骤2)所得的粒子分散到质量浓度为0.025％的戊二醛溶液中，震荡至少1h，离心去除上清液，并用去离子水洗涤多次；
4)将步骤3)所得的粒子分散到1mg/mL的甘氨酸溶液中，震荡至少1h，离心去除上清液，并用去离子水洗涤多次；
5)将步骤4)所得的粒子分散到0.2mol/L乙二胺四乙酸钠溶液中，震荡20～30min，离心去除上清液，并用EDTA溶液洗涤多次，再用去离子水洗涤多次，去除碳酸锰模板得到具有抗菌功能的级联酶反应微球。
上述技术方案中，所述的聚阳离子是来源于聚烯丙基胺盐酸盐、聚二烯丙基二甲基季铵盐、壳聚糖、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。
所述的聚阴离子是来源于聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸、硫酸肝素、透明质酸或硫酸葡聚糖。
步骤1)中所述的高速搅拌是指转速为600-1000rpm。
本发明的原理是：葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖转化成双氧水，细菌感染的过程会产生一个酸性的微环境，在此环境下血红蛋白可以作为一种芬顿反应试剂，利用双氧水高效反应产生羟基自由基，羟基自由基具有非常高的氧化能力，会对细菌的磷脂、蛋白质以及DNA等生物大分子进行氧化，从而达到杀死细菌的目的。
本发明的有益效果在于：
原料来源广泛，制备过程简单可控，可以放大规模；选择不同的聚电解质组装到微粒表面可以调控微粒的表面性质；可以在细菌感染导致的酸性环境下利用无毒的葡萄糖高效产生羟基自由基杀灭细菌，而在正常的中性pH值下反应活性较低，对正常细胞的伤害较小；产生的羟基自由基对耐药菌也具有很强的杀伤作用，在预防细菌感染方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1a)是包埋有葡萄糖氧化酶和血红蛋白的碳酸锰粒子的扫描电镜照片，b)是去除碳酸锰后得到的级联酶反应微球的扫描电镜照片。
图2a)是微球的级联酶反应活性与pH值的关系，b)是微球的级联酶反应活性与温度的关系。
图3是利用一种特异性检测羟基自由基的试剂对苯二甲酸检测该级联酶反应微球在酸性和中性两个条件下的羟基自由基的生成，微球浓度为100μg/mL，葡萄糖浓度为1mmol/L，对苯二甲酸的浓度为4mmol/L，反应时间为40min。
图4是级联酶反应微球与耐甲氧西林金黄葡萄球菌共培养24h后，通过稀释涂板计数测定细菌数量。以失活的葡萄糖氧化酶(dGOx)通过同样流程制备的粒子作为对照。培养基中葡萄糖浓度为12.5mmol/L，微球的浓度为0.6,1.2,1.8,2.4,3.0,3.6μg/mL，耐甲氧西林金黄葡萄球菌的初始浓度为106cfu/mL。
图5是耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌膜结晶紫染色照片a)不加微球，b)加微球。培养基中葡萄糖浓度为12.5mmol/L，微球浓度为2.4μg/mL，耐甲氧西林金黄葡萄球菌的初始浓度为106cfu/mL，培养时间为48h。
图6是耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌膜扫描电镜照片a)不加微球，b)加微球。培养基中葡萄糖浓度为12.5mmol/L，微球浓度为2.4μg/mL，耐甲氧西林金黄葡萄球菌的初始浓度为106cfu/mL，培养时间为48h。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
1)配制0.25mol/L氯化锰溶液和0.22mol/L碳酸钠溶液，将GOx和Hb溶于2mL氯化锰溶液中，GOx与Hb的质量比为1:5，二者在氯化锰溶液中的总浓度为7.5mg/mL。在1000rpm的搅拌下，迅速加入2mL的碳酸钠溶液，1min后停止搅拌，从而得到同时包埋有GOx和Hb的碳酸锰粒子，离心去除上清，并用水洗涤3次，扫描电镜见图1a)。
2)取2mL步骤1)所得的碳酸锰粒子悬浮液(浓度为20mg/mL),离心去除上清，加入2mL浓度为1mg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)溶液，震荡10min，离心去除上清，加入水洗涤粒子3次；然后加入2mL浓度为1mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液，震荡10min，离心去除上清，用水洗涤粒子3次，得到表面为PSS的粒子。
3)将步骤2)所得的粒子分散到2mL 0.025％的戊二醛溶液中，震荡1h，离心去除上清，并用水洗涤3次。
4)将步骤3)所得的粒子分散到2mL 1mg/mL的甘氨酸溶液中，震荡1h，离心去除上清，并用水洗涤3次。
5)将步骤4)所得的粒子分散到2mL 0.2mol/L乙二胺四乙酸钠溶液中，震荡30min，离心去除上清，并用乙二胺四乙酸钠溶液洗涤2次，离心去除上清，并用水洗涤3次，最终得到级联酶反应微球，扫描电镜照片见图1b)。利用一种特异性检测羟基自由基的试剂对苯二甲酸来检测该微球在酸性和中性条件下生成羟基自由基的情况见图3。为检测该微球抗菌性能，将其与耐甲氧西林金黄葡萄球菌共培养24h后，通过稀释涂板计数测定细菌数量，以失活的葡萄糖氧化酶(dGOx)通过同样流程制备的粒子作为对照，抗菌结果见图4。为检测该微球抑制菌膜形成的作用，将微球与耐甲氧西林金黄葡萄球菌共培养48h，结晶紫染色结果见图5b，扫描电镜图片见图6b，以不加微球为空白，其结晶紫染色结果见图5a，扫描电镜图片见图6a。
实施例2
步骤同实施例1，但在步骤2)中用聚乙烯亚胺代替PAH，用聚丙烯酸代替PSS。
实施例3
步骤同实施例1，但在步骤2)中用聚赖氨酸代替PAH，用透明质酸代替PSS。

Claims (5)

1.一种具有抗菌功能的级联酶反应微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配制等浓度的氯化锰溶液和碳酸钠溶液，将葡萄糖氧化酶(GOx)和血红蛋白(Hb)溶于氯化锰溶液中，最终氯化锰溶液中GOx和Hb的总浓度为1～10mg/mL，GOx和Hb的质量比为1:5；在高速搅拌下，迅速加入与氯化锰溶液等体积的碳酸钠溶液，1min后停止搅拌，从而得到包埋有GOx和Hb的碳酸锰粒子，离心去除上清液，并用去离子水洗涤粒子多次；
2)取步骤1)所得的碳酸锰粒子分散于去离子水中制成浓度为20mg/mL的悬浮液,离心去除上清液，加入浓度为1～2mg/mL的聚阳离子溶液，震荡10～20min，离心去除上清液，加入去离子水洗涤粒子多次；然后加入浓度为1～2mg/mL的聚阴离子溶液，震荡10～20min，离心去除上清液，用去离子水洗涤粒子多次，得到表面为聚阴离子的粒子；所述的碳酸锰粒子悬浮液、聚阳离子溶液及聚阴离子溶液为等体积；
3)将步骤2)所得的粒子分散到质量浓度为0.025％的戊二醛溶液中，震荡至少1h，离心去除上清液，并用去离子水洗涤多次；
4)将步骤3)所得的粒子分散到1mg/mL的甘氨酸溶液中，震荡至少1h，离心去除上清液，并用去离子水洗涤多次；
5)将步骤4)所得的粒子分散到0.2mol/L乙二胺四乙酸钠溶液中，震荡20～30min，离心去除上清液，并用EDTA溶液洗涤多次，再用去离子水洗涤多次，去除碳酸锰模板得到具有抗菌功能的级联酶反应微球。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗菌功能的级联酶反应微球的制备方法，其特征在于，所述的聚阳离子是来源于聚烯丙基胺盐酸盐、聚二烯丙基二甲基季铵盐、壳聚糖、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗菌功能的级联酶反应微球的制备方法，其特征在于，所述的聚阴离子是来源于聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸、硫酸肝素、透明质酸或硫酸葡聚糖。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗菌功能的级联酶反应微球的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的高速搅拌是指转速为600-1000rpm。
5.一种具有抗菌功能的级联酶反应微球，其特征在于，采用如权利要求1-4任一项所述的方法制备而成。
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