CN102870819A - 一种蛭弧菌消毒剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛭弧菌消毒剂及其制备方法和用途，具体的是一种噬菌蛭弧菌颗粒剂，属于微生物固定化领域。包括以下步骤：(1)蛭弧菌菌液的制备：将蛭弧菌菌种接种于大肠杆菌菌悬液中增殖培养，使蛭弧菌菌液浓度为1.0×10⁹CFU/mL-1.0×10¹³CFU/mL；(2)蛭弧菌包埋颗粒的制备：将蛭弧菌菌液与琼脂胶体溶液、戊二醛和花生油恒温搅拌30min，滴入到CaCl₂溶液中固化，冷冻干燥24h既得蛭弧菌颗粒剂。本发明采用包埋法和戊二醛交联法相结合的方式，制备一种活力和机械强度等更佳的噬菌蛭弧菌颗粒剂，经济、安全、保存时间长，可以用于水产养殖、畜禽养殖等多个行业。

Description

一种蛭弧菌消毒剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种微生物制剂，尤其还涉及其制备方法和用途，具体的是一种应用于养殖业消毒的噬菌蛭弧菌颗粒剂。

背景技术

噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)(以下简称蛭弧菌)是一种专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，研究指出，蛭弧菌在净化养殖水体水质、控制或减少水生动物疾病的发生与流行上效果显著。近年来，关于蛭弧菌应用在贝类、虾类、蟹类、鱼类等水产养殖中的研究也越来越多，这些研究都表明，在养殖过程中添加了蛭弧菌可以起到疾病防治、提高成活率、增长体重体长和净化养殖生态环境的效果。陈丽芸等研究发现，添加蛭弧菌后可以使大菱鲆红嘴病的发生率由10.17％降到0.93％，说明蛭弧菌能有效预防红嘴病的发生，另外，在治疗红嘴病方面，添加蛭弧菌后能100％治愈红嘴病。

因此，应用蛭弧菌防治水产动物细菌性病害和消毒具有良好的发展前景，然而，目前我国商品化的蛭弧菌制剂主要是水剂，还有少量的冻干粉剂，蛭弧菌水剂因保存时间短，质量不稳定以及运输不便等因素而影响了其使用效果，冻干粉剂也因生产成本高而在很大程度上限制了其应用，而微生物固定化法可将游离微生物定位于限定的空间区域，并保持活性，且能反复利用，尤其是包埋固定化法，因操作简单，在制备过程中对微生物活性影响小，制备的颗粒强度较高，更是深受微生态制剂研发人员的青睐。

固定化微生物技术是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。在微生物的固定化方法中，以包埋法最为常用。它的原理是将生物体细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络中，通过聚合作用或通过离子网络形成，或通过沉淀作用，或通过改变溶剂、温度、pH值使细胞截留。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄露，同时能让基质渗入和产物扩散出来。

包埋材料可以分为两大类：

(1)天然高分子多糖类，如海藻酸盐、琼脂、明胶等，其中以海藻酸钠和卡拉胶应用最多，它们具有固化方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点，但是它们抗微生物分解性能较差，机械强度低，但是可使用交联剂进行稳定化处理，但活力和传质性能又会下降。

(2)合成高分子化合物，如聚丙烯酞胺等。这类交联剂的突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定。但是聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。张小能等在《噬菌蛭弧菌颗粒剂制备条件的优化》中用海藻酸钠包埋法研究了噬菌蛭弧菌颗粒剂制备条件的优化，因为海藻酸钠价格较高，制得的蛭弧菌颗粒剂成本较高，不适合大规模工业化生产。

发明内容

本发明的所要解决的技术问题是提供一种成本较低，活力和机械强度等更佳的噬菌蛭弧菌颗粒剂。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种蛭弧菌颗粒剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)蛭弧菌菌液的制备：

将蛭弧菌菌种接种于100mL 1/10NB培养基中，同时加入100L的，于35℃-37℃温度下100r/min-800r/min下摇床振荡培养24h-48h，优化的，摇床振荡为500r/min，使蛭弧菌菌液浓度为1.0×10⁹CFU/mL-1.0×10¹³CFU/mL；

(2)蛭弧菌包埋颗粒的制备：

取质量分数为1％-10％浓度的琼脂胶体溶液和步骤(1)制得蛭弧菌菌液，体积比为20∶100-50∶100，放入搅拌器中，并加入花生油，花生油和琼脂胶体-蛭弧菌混合液的体积比为1∶100-5∶100；

搅拌器在30℃恒温搅拌30min，快速吸入无菌注射器中，滴入到质量分数为1％-10％的CaCl₂溶液中固化12h-24h，然后收集蛭弧菌固定化颗粒于-20℃-30℃条件下冷冻干燥24h既得蛭弧菌颗粒剂。

大肠杆菌菌悬液的的浓度为1.0×10⁶CFU/mL-1.0×10⁹CFU/mL。

琼脂胶体溶液也可以用明胶代替。

蛭弧菌包埋颗粒的制备中还加入戊二醛交联剂，体积分数为0.1％-1％。

蛭弧菌菌种为市场上销售的蛭弧菌制剂，经增殖、纯化，保存备用。大肠杆菌菌悬液为常规微生物实验制得。

本发明的有益效果是：采用琼脂胶体溶液、明胶溶液包埋法和戊二醛交联法相结合的方式，制备一种活力和机械强度等更佳的噬菌蛭弧菌颗粒剂，经济安全、保存时间长，可以用于水产养殖、畜禽养殖等多个行业。

具体实施方式

实施例1

(1)蛭弧菌菌液的制备：

将蛭弧菌菌种接种于100mL 1/10NB培养基中，同时加入100L浓度为1.0×10⁶CFU/mL大肠杆菌菌悬液，于35℃温度下100r/min下摇床振荡培养48h，菌落总数检测蛭弧菌菌液浓度为1.0×109CFU/mL。

(2)蛭弧菌包埋颗粒的制备：

取100g琼脂粉，用灭菌蒸馏水制备质量分数为1％浓度的琼脂胶体溶液，取步骤(1)制得蛭弧菌菌液混合，两者体积比为20∶100，放入搅拌器中，并加入花生油，花生油和琼脂胶体-蛭弧菌混合液的体积比为1∶100，加入戊二醛交联剂，使溶液中戊二醛体积分数为0.1％。

搅拌器在30℃恒温搅拌30min，快速吸入无菌注射器中，滴入到质量分数为1％的CaCl₂溶液中固化12h，然后收集蛭弧菌固定化颗粒于-20℃条件下冷冻干燥24h既得蛭弧菌颗粒剂。

实施例2

(1)蛭弧菌菌液的制备：

将蛭弧菌菌种接种于100mL 1/10NB培养基中，同时加入100L浓度为1.0×109CFU/mL大肠杆菌菌悬液，于35℃温度下800r/min下摇床振荡培养48h，菌落总数检测蛭弧菌菌液浓度为1.0×10¹³CFU/mL。

(2)蛭弧菌包埋颗粒的制备：

取1000g琼脂粉，用灭菌蒸馏水制备质量分数为10％浓度的琼脂胶体溶液，取步骤(1)制得蛭弧菌菌液混合，两者体积比为50∶100，放入搅拌器中，并加入花生油，花生油和琼脂胶体-蛭弧菌混合液的体积比为5∶100，加入戊二醛交联剂，使溶液中戊二醛体积分数为1％。

搅拌器在30℃恒温搅拌30min，快速吸入无菌注射器中，滴入到质量分数为10％的CaCl2溶液中固化24h，然后收集蛭弧菌固定化颗粒于-30℃条件下冷冻干燥24h既得蛭弧菌颗粒剂。

实施例3

(1)蛭弧菌菌液的制备：

将蛭弧菌菌种接种于100mL1/10NB培养基中，同时加入100L浓度为1.0×10⁹CFU/mL大肠杆菌菌悬液，于35℃温度下500r/min下摇床振荡培养48h，菌落总数检测蛭弧菌菌液浓度为1.0×10¹³CFU/mL。

(2)蛭弧菌包埋颗粒的制备：

取500g琼脂粉，用灭菌蒸馏水制备质量分数为5％浓度的琼脂胶体溶液，取步骤(1)制得蛭弧菌菌液混合，两者体积比为30∶100，放入搅拌器中，并加入花生油，花生油和琼脂胶体-蛭弧菌混合液的体积比为3∶100，加入戊二醛交联剂，使溶液中戊二醛体积分数为0.5％。

搅拌器在30℃恒温搅拌30min，快速吸入无菌注射器中，滴入到质量分数为5％的CaCl₂溶液中固化24h，然后收集蛭弧菌固定化颗粒于-30℃条件下冷冻干燥24h既得蛭弧菌颗粒剂。

Claims (6)

1.一种蛭弧菌消毒剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)蛭弧菌菌液的制备：

将蛭弧菌菌种接种于100mL1/10NB培养基中，同时加入100L的大肠杆菌菌悬液，于35℃-37℃温度下100r/min-800r/min下摇床振荡培养24h-48h，使蛭弧菌菌液浓度为1.0×10⁹CFU/mL-1.0×10¹³CFU/mL；

(2)蛭弧菌包埋颗粒的制备：

取质量分数为1％-10％浓度的琼脂胶体溶液和步骤(1)制得蛭弧菌菌液，体积比为20∶100-50∶100，放入搅拌器中，并加入花生油和交联剂，花生油和琼脂胶体-蛭弧菌混合液的体积比为1∶100-5∶100；

搅拌器在30℃恒温搅拌30min，快速吸入无菌注射器中，滴入到质量分数为1％-10％的CaCl2溶液中固化12h-24h，然后收集蛭弧菌固定化颗粒于-20℃-30℃条件下冷冻干燥24h既得蛭弧菌颗粒剂。

2.根据权利要求1所述的蛭弧菌颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述交联剂为戊二醛，戊二醛的体积分数为0.1％-1％。

3.根据权利要求1所述的蛭弧菌颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述蛭弧菌菌液的制备中以500r/min摇床振荡培养。

4.根据权利要求1所述的蛭弧菌颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌菌悬液的的浓度为1.0×10⁶CFU/mL-1.0×10⁹CFU/mL。

5.一种按照权利要求1制备的蛭弧菌颗粒剂，为白色固体颗粒。

6.一种按照权利要求1制备的蛭弧菌颗粒剂的用途，可以用于水产养殖、畜禽养殖等环境的消毒。