CN101289648B - 一种屎肠球菌微胶囊制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微胶囊制剂及其制备方法，属于微生物领域和制剂领域。一种微胶囊制剂，以海藻酸钠为囊材溶液、以CaCl₂溶液为固化剂，含有屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，屎肠球菌的保藏编号为CGMCC No.2516。本发明的优点在于采用前包被后发酵的方法，使菌体可继续在微胶囊微环境下增殖，细胞密度大小可控，并可达到比后包埋更高的微囊化菌体密度；前包埋方法大大减少了微囊化过程细胞的利用量，避免了后包埋过程由于受细胞密度影响而造成的微囊化效率和产率较低的不利因素，更易于得到形态和稳定性更好的微囊化产品。

Description

一种屎肠球菌微胶囊制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种屎肠球菌微胶囊制剂及其制备方法，更具体地说一种高活性的屎肠球菌(Enterococcus Faecium)及其微胶囊新剂型，属于微生物领域。

背景技术

屎肠球菌作为畜禽肠道土著菌群，对提高畜禽生长性能有显著效果。

屎肠球菌在生长过程中，不形成芽胞，抗逆性较差，在液体条件下难以长期保存。

实际应用中，在添加使用于配合颗粒饲料时，往往要经过高温加热制粒处理，导致产品的有效成分损失较大，产品的保质期也较短，限制了其大规模应用。而益生菌只有具备稳定的生理活性，才能发挥其益生作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一株高活性的屎肠球菌。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供一种屎肠球菌微胶囊制剂。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供这种微胶囊制剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株高活性的屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，其保藏编号为CGMCC No.2516。

所述的高活性的屎肠球菌用于制备饲料添加剂的用途。由于其活性较高，在加工过程中不易变质，生理活性稳定。

一种微胶囊制剂，以海藻酸钠为囊材溶液、以CaCl₂溶液为固化剂，含有屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，胶囊中活菌数为10⁹-10¹⁰个/ml湿胶囊。

所述屎肠球菌的保藏编号为CGMCC No.2516。

一种屎肠球菌微胶囊制剂的制备方法，包括下述步骤：

(1)囊材溶液的配制及灭菌：在搅拌下分批将海藻酸钠加入蒸馏水，制成透明胶液，灭菌，备用；海藻酸钠溶液的浓度为1-2％w/v，优选1.5％w/v。

(2)固化剂的配置及灭菌：用蒸馏水配成0.1-0.3mol/l CaCl₂溶液，灭菌，备用；

(3)屎肠球菌种子液培养：采用数生长期菌体作为包被用种子液；

(4)微胶囊制备：无菌条件下，将种子液加入到海藻酸钠溶液中，按1-3×10⁶个屎肠球菌/ml海藻酸钠的密度调配，充分搅匀后，吸取海藻酸钠的含菌混合胶液，用高压无菌气体经喷头喷入CaCl₂溶液中，均匀缓慢搅拌，固化15-25分钟，即得待培养微胶囊，胶囊直径为0.3-0.7mm；

(5)包被后发酵：将含有屎肠球菌的微胶囊入发酵液中，37℃，150rpm恒温培养，14-18小时，即得含高密度和高活性屎肠球菌的微胶囊产品。

所述灭菌是在115℃下灭菌20分钟。

所述屎肠球菌种子液培养的培养基为：葡萄糖10g/l，大豆蛋白胨5g/l，酵母浸膏2g/l，柠檬酸铵2g/l，乙酸钠5g/l，K₂HPO₄ 2g/l，吐温801ml，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，MnSO₄·4H₂O：0.2g/l。最佳培养条件为：37℃，150rpm转速，恒温培养。接种量为2.0×10⁶cfu/mL。

所述包被后发酵的活菌数可达2.0-3.5×10¹⁰cfu/mL湿胶囊。

本发明采用微胶囊包被益生菌能够很好保护其生理活性，发挥其益生功效。其优势表现在：①将益生菌通过微囊化转变成一种稳定的细粉颗粒(湿颗粒，可直接作为添加剂，随饮用水添加，也可根据需要制成干粉粒)，改变微生态制剂产品的形态，这种微胶囊产品具有良好的流动性和分散性，很容易与其它饲料混合均匀，便于运输、贮存和添加使用；②微生态制剂产品的耐酸性和热稳定性较差，但将其制成微胶囊产品后，由于微胶囊的保护，能够有效地防止菌体失活，提高微生态制剂产品的稳定性。采用肠溶性壁材后，还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用；③可将配伍禁忌的各种成分在同一产品中隔开。④使不溶于水的物质能均匀地分散在水溶性介质中。

本发明的创新点在于采用前包被后发酵的方法，使菌体可继续在微胶囊微环境下增殖，细胞密度大小可控，并可达到比后包埋更高的微囊化菌体密度；前包埋方法大大减少了微囊化过程细胞的利用量，避免了后包埋过程由于受细胞密度影响而造成的微囊化效率和产率较低的不利因素，更易于得到形态和稳定性更好的微囊化产品。

本发明的优点是：本发明筛选得到的屎肠球菌来源安全，生长速度快，在培养12小时处即达到平台期，菌体密度高可达，2.0×10¹⁰CFU/mL的高密度，能够代谢分泌对宿主健康有益的L-乳酸，且对常见的病原菌大肠杆菌K88、K99及金黄色葡萄球菌等具有抑制作用。适宜作为益生菌种继续开发。经过筛选得到高活性的屎肠球菌菌株，并采用微胶囊技术，将低密度屎肠球菌包裹在囊材中，继续发酵获得更高的菌体浓度，通过简单的分离，直接得到含有高密度屎肠球菌的微胶囊。制备微胶囊所用材料对畜禽均无毒副作用，且来源广，价格便宜。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本文公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为菌体增殖情况比较图。

图2-1和图2-2为代谢(葡萄糖消耗和乳酸生成)过程比较图。

图3为对典型病原菌的抑菌实验比较图。

图4-1为三种状态下生长曲线比较；图中free是未包被，MC1是单层包被海藻酸钠，MC2是双层包被壳聚糖胶囊。

图4-2为包被前后乳酸代谢曲线比较。

具体实施方式

实施例1：屎肠球菌的筛选与种子液制备

一.方法：

无菌操作获取出生婴儿粪便，稀释一定倍数，涂在特定培养基做成的平板上，培养24小时，得一定数量菌落，每个菌落作为一个被选目的菌株。在经生长曲线、代谢过程测定及病原菌抑制实验，选取生长活力及乳酸产量高，并抑菌效果显著的菌株作为最终目的菌株和用于包被的种子菌株。

二.屎肠球菌培养及其培养条件：

经单因素及正交实验确定所筛得屎肠球菌最佳培养基为：葡萄糖10g/l，大豆蛋白胨5g/l，酵母浸膏2g/l，柠檬酸铵2g/l，乙酸钠5g/l，K2HPO₄ 2g/l，吐温801ml，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，MnSO₄·4H₂O：0.2g/l。最佳培养条件为：37℃，150rpm转速，恒温培养，接种量为1％(约2×10⁶cfu/mL)。

三.结果

经BIOLOG鉴定，获得屎肠球菌一株。

实施例2：生物活性实验

一.方法

本实验室分离所得屎肠球菌与市售进口同类肠球菌及粪肠球菌生长、代谢及抑菌情况比较。

其中：

MLK：Enterococcos from improt probiotics，参比菌株，筛选自美国咪可乐乳膏剂。

Baby-1：Enterococcos faecalis(Obtaied by our lab)，屎肠球菌Baby-1。

Baby-2：Enterococcos faecium，粪肠球菌Baby-2。

1.生长、代谢及抑菌情况比较：

将活化两代的待测菌株以1％的接种量(约2×10⁶cfu/mL)接种于装有100mLMRS培养基的300mL三角瓶中，37℃，150rpm培养，每2小时取样，测定600nm处吸光值。以培养时间为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。

2.代谢(葡萄糖消耗和乳酸生成)过程比较：

生物传感仪分别测定菌体培养液中葡萄糖消耗量及乳酸产量。以培养时间为横坐标，相应的消耗量或产量为纵坐标，绘制代谢曲线。

3.对典型病原菌的抑菌实验比较：

制备厚度为4mm左右的MNA平板，并在平板上打孔(孔径5mm左右)，封底。将致病菌(血清型为k88、k99的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌)浓度为10⁶的菌悬液100μL涂布于该平板上，取实验菌株CGMCC No.2516的发酵液加满于孔中，37℃培养24h。测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。

二.结果

1.生长、代谢及抑菌情况比较：参阅图1所示，由图可见，本实验室所筛得菌株增殖速度、最大生物量(即菌体最终密度)都显著高于市售进口同类菌株。

2.代谢(葡萄糖消耗和乳酸生成)过程比较：参与图2所示，由图可知实验室所筛得菌株乳酸产率和产量均为最大，葡萄糖消耗无显著差别。

3.对典型病原菌的抑菌实验比较：参阅图3所示，由图可见，本实验室筛得菌株对于大肠杆菌的抑制效果与进口产品相比差别不大，但沙门氏菌的抑菌效果显著较高于其他两个菌株。

对菌种进行保藏，于2008年5月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，建议的分类名为屎肠球菌Enterococcus Faecium，保藏号为CGMCC No.2516。

实施例3：制备微胶囊制剂

一.材料：

囊材为海藻酸钠溶液，浓度为1.5g/l(1.5％w/v)。

固化剂为氯化钙(CaCl₂)水溶液，浓度为0.1mol/l。

屎肠球菌，保藏编号为CGMCC No.2516。

二.屎肠球菌微囊化工艺：

1.囊材溶液的配制及灭菌：在不断搅拌下分批将海藻酸钠加入蒸馏水，搅拌制成为透明胶液，115℃下灭菌20分钟，备用。

2.固化剂的配置及灭菌：用蒸馏水配成0.1mol/l溶液，115℃下灭菌20分钟，备用。

3.屎肠球菌种子液培养：采用实施例1所述培养基和培养条件，得对数生长期菌体作为包被用种子液。

4.微胶囊制备：无菌条件下，将种子液加入到海藻酸钠溶液中，按1-3×10⁶个屎肠球菌/ml海藻酸钠的密度调配，充分搅匀后，用注射器吸取混合胶液，用高压无菌气体经喷头喷入约300ml的CaCl₂溶液中，均匀缓慢搅拌，固化20分钟左右，即得待培养微胶囊，胶囊直径为0.3-0.7mm。

5.包被后发酵：将含有屎肠球菌的微胶囊入发酵液中，37℃，150rpm恒温培养，16小时左右，即得含高密度和高活性屎肠球菌的微胶囊产品，活菌数可达10¹⁰个/ml湿胶囊。

实施例4：微胶囊的测试

一.测定方法：

1.包被前后生长曲线比较

将未包被和微胶囊包被的样品，每个做三个平行在37℃150rpm培养，每2小时取一次样品，成膜微胶囊和成膜微胶囊包被取样后，以体积比1∶10的比例放入破囊液中，震荡破囊，以空囊破囊后的溶液为参比，测定OD600，以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。16h处取样涂抹平板计数。

2.微囊化屎肠球菌代谢曲线

用SBA-40C型生物传感仪酶法测定乳酸产量及葡萄糖消耗量。

3.耐胆汁能力监测

在MRS液体培养基添加0.4％(w/v)的猪胆盐，接种1％已活化的CGMCC No.2516，包被后微胶囊Bmc-1，37℃下培养，0h、1h、2h、3h取样，用无菌生理盐水按十倍系列稀释，平板菌落计数。

4.胃转运耐受能力监测

向装有已灭菌的MRS液体培养基的三角瓶中加入1％(w/v)的胃蛋白酶，混匀。以不添加胃蛋白酶的MRS培养基为对照，分别接种1％已活化的屎肠球菌CGMCCNo.2516及微囊化Bmc-1.37℃下培养，0h、1h、2h、3h取样，用无菌生理盐水按十倍系列稀释，平板菌落计数。

5.小肠转运耐受能力监测

向装有已灭菌的MRS液体培养基的三角瓶中加入1％(w/v)的胰蛋白酶，混匀。以不添加胰蛋白酶的MRS培养基为对照，分别接种1％已活化的屎肠球菌CGMCCNo.2516及微囊化胶囊mc.37℃下培养，0h、1h、2h、3h、4h取样，用无菌生理盐水按十倍系列稀释，平板菌落计数。

二.结果：

1.微囊化包被下的菌株CGMCC No.2516在短暂的延迟期后，迅速进入对数生长期，与未包被的生长曲线相比较，对数生长期，菌体比生长速率明显高于未包被的菌体生长。具备较大的最终生物量和较快的最大比生长速率。在16小时处平板计数，不包被的屎肠球菌CGMCC No.2516最终浓度可达2.0×10¹⁰CFU/mL。微胶囊的最终浓度可达3.65×10¹⁰CFU/mL。如图4-1。

2.包被后的菌体代谢乳酸的最终产量要稍高于未包被的游离细胞代谢乳酸的产量。微胶囊提供了较高的细胞密度，实现高密度培养，从而提高产物浓度，如图4-2。但葡萄糖消耗过程并无明显差别。

3.未包被的细胞在进入有胆盐的MRS培养基后，活菌数量在1小时内有大幅的下降，此后的两个小时内，菌数虽没有继续下降，但仅保持在一个较低水平的浓度，说明胆盐对屎肠球菌CGMCC No.2516的活性起到了一定的抑制作用。而微胶囊包被后的菌体本身就具备较高的菌体密度，在含胆汁的MRS培养基中，活菌数量几乎没有下降，整个过程保持了较好的活性。说明微胶囊包被菌体对胆汁具有良好的耐受能力。

4.研究了模拟胃蛋白酶和胰蛋白酶对菌体的转运耐受能力的影响。在低pH情况下，未包被的活菌数目有大幅下降，此后(2H)基本上维持在一个较低的水平。包被后细胞在低pH下活菌数目下降趋势相对缓慢，整体活菌数目要远高于未保护下的细胞。两种条件下活菌数分别下降了7.1×10⁹和1.32×10¹⁰。因此，微胶囊包被菌体对模拟胃液具有良好的耐受能力。综合模拟胃肠液实验结果可见，胃环境对菌体活性的影响较大，而肠部环境对菌体活性影响不大。因此，与普通游离条件相比，屎肠球菌在微胶囊包被后，可更大量通过胃部环境，进入肠部，从而更好的发挥其益生作用。

Claims (8)

1.一株高活性的屎肠球菌，其保藏编号为CGMCC No.2516。

2.权利要求1所述的高活性的屎肠球菌CGMCC No.2516用于制备饲料添加剂的用途。

3.一种屎肠球菌微胶囊制剂的制备方法，所述屎肠球菌的保藏编号为CGMCCNo.2516，其特征在于包括下述步骤：

(1)囊材溶液的配制及灭菌：在搅拌下分批将海藻酸钠加入蒸馏水，制成透明胶液，灭菌，备用；海藻酸钠溶液的浓度为1-2％w/v；

(2)固化剂的配置及灭菌：用蒸馏水配成0.1-0.3mol/lCaCl₂溶液，灭菌，备用；

(3)屎肠球菌种子液培养：采用数生长期菌体作为包被用种子液；

(4)微胶囊制备：无菌条件下，将种子液加入到海藻酸钠溶液中，按(1-3)×10⁶个屎肠球菌/ml海藻酸钠的密度调配，充分搅匀后，吸取海藻酸钠的含菌混合胶液，用高压无菌气体经喷头喷入CaCl₂溶液中，均匀缓慢搅拌，固化15-25分钟，即得待培养微胶囊，胶囊直径为0.3-0.7mm；

(5)包被后发酵：将含有屎肠球菌的微胶囊入发酵液中，37℃，150rpm恒温培养，14-18小时，即得含高密度和高活性屎肠球菌的微胶囊产品。

4.根据权利要求3所述的一种屎肠球菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述灭菌是在115℃下灭菌20分钟。

5.根据权利要求3所述的一种屎肠球菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述屎肠球菌种子液培养的培养基为：葡萄糖10g/l，大豆蛋白胨5g/l，酵母浸膏2g/l，柠檬酸铵2g/l，乙酸钠5g/l，K₂HPO₄2g/l，吐温801ml，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，MnSO₄·4H₂O：0.2g/l，所述步骤(3)屎肠球菌种子液培养的培养条件为：37℃，150rpm转速，恒温培养，接种量为2.0×10⁶cfu/mL。

6.根据权利要求3所述的一种屎肠球菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述包被后发酵的活菌数可达(2.0-3.5)×10¹⁰cfu/mL湿胶囊。

7.根据权利要求3所述的一种屎肠球菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠溶液的浓度为1.5％w/v。

8.一种微胶囊制剂，其特征在于：以海藻酸钠为囊材溶液、以CaCl₂溶液为固化剂，含有屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，胶囊中活菌数为10⁹-10¹⁰个/ml湿胶囊，所述屎肠球菌的保藏编号为CGMCC No.2516。

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