CN117305291A - 一种生物抗病产品的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种生物抗病产品的制备，微胶囊菌球由菌悬液、甘油、海藻酸钠以及氯化钙制备形成，制备过程包括，步骤S1.1，离心反应；步骤S1.2，共混反应；步骤S1.3，交联反应；步骤S1.4，包埋合格率检测。本发明通过利用海藻酸钠与氯化钙包埋病原菌或有益菌形成微胶囊菌球，延长菌体保存时间，保证微胶囊菌球包覆膜的机械强度不但足以保护菌球内部菌体的生物活性，而且适合进行抗病性检测时菌球内部菌体能够及时流出，进而保障抗病性测试的成功率，通过对同一批次的微胶囊菌球进行包埋合格率检测，并根据包覆膜厚度调整氯化钙溶液的浓度或海藻酸钠溶液的浓度，优化包埋固化方法，提高微胶囊菌球的生产合格率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种生物抗病产品的制备和应用。
背景技术
在农业领域，微生物抗病技术已经逐步应用广泛；微生物抗病技术核心在于发现抗病菌种，难点在于如何展现和评价发现的菌种具有抗病性；通常在研究抗病菌种时候，研发人员会采用“平板对峙法”来判断和评价菌种对病原菌是否具有抗病性，以及抗病性的大小，即抑制率，然而常用的抗病对峙方法不但对操作环境及培养条件的要求非常苛刻，需要生物专业人员，在超净台的无菌环境，专业操作，需要培养箱，设定温度，培养菌种，且准备时间长，存放时间短：病原菌和有益菌落、菌饼都要提前3-7天准备，且存放不超过1周时间，因此，亟需一种具有直观化、科普化、方便化以及省时化特点的生物抗病产品，以满足市场应用需求。
中国专利公开号：CN112980691A，公开了一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法，其技术点是先采用梯度稀释法与划线纯化法获得细菌菌株并进行纯化，然后采用点接法和平板对峙培养法初筛出拮抗细菌，最后采用改良的平板对峙培养法和十字定位法，测量菌落半径和抑菌带的大小；由此可见，现有的抗病对峙方法仍然需要生物专业人员，在超净台的无菌环境，专业操作，使抗病性检测方法很难走出实验室，让大众看到抗病效果，因此，为了避免常规抗病对峙方法对操作环境及培养条件的苛刻要求，本发明利用海藻酸钠与氯化钙包埋病原菌或有益菌形成微胶囊菌球，使病原菌或有益菌与外部环境隔绝以保持其生物活性的同时，染菌风险、抑制生长风险以及操作复杂度均显著降低，甚至在产品的使用上外行也能够轻松成功操作，其稳定、高效、便携的特点适合生物抗病产品的推广、工业化生产及多场景应用。
发明内容
为此，本发明提供一种生物抗病产品的制备和应用，用以克服现有技术中的由于常规抗病对峙方法对操作环境及培养条件的苛刻要求，使病原菌或有益菌难以长期保存，导致生物抗病产品适用性低的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种生物抗病产品的制备和应用，包括，
进一步地，包括制备病原菌微胶囊、有益菌微胶囊以及培养基，其中，制备病原菌微胶囊和有益菌微胶囊包括，
步骤S1.1，对病原菌进行物理粉碎后与甘油调匀着色，有益菌菌液离心浓缩后，取菌泥直接与甘油调匀，形成菌悬液；
在步骤S1.2中，将海藻酸钠溶液与菌悬液进行物理共混，得到菌体-海藻酸钠胶状液并进行储存；
步骤S1.3，在预设压力条件下抽出所述储料器中的菌体-海藻酸钠胶状液作为待处理菌液，使其通过花洒器并以预设降落高度注入至搅拌状态下的氯化钙溶液中进行交联反应，以在空气中固化形成微球，以及对微球进行包埋处理形成包覆在微球表面的薄膜，过滤清洗后，得到微胶囊菌球；
步骤S1.4，对一批次的微胶囊菌球进行包埋合格率检测，随机选取预设抽取个数的微胶囊菌球作为待检测样品，通过对待检测样品的实时厚度值与标准厚度值的差值与标准厚度差值进行比对，以及对任一待检测样品的实时厚度值与标准厚度值进行比对，确定该批次的微胶囊菌球的包埋合格率，并将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以确定是否对包埋固化参数进行调整。
进一步地，在步骤S1.1中，在步骤S1.1中，在预设离心条件下分别对病原菌和有益菌进行物理粉碎，粉碎后的病原菌加入甘油进行混合调匀，再加入色素使其着色，获得病原菌菌悬液，粉碎后的有益菌配置为有益菌菌液进行离心浓缩，分离出有益菌菌泥直接加入甘油调匀，获得有益菌菌悬液。
进一步地，所述步骤S1.2中，通过将海藻酸钠溶解于去离子水中，并进行加热搅拌，以配置预设第一浓度的海藻酸钠溶液，将所述海藻酸钠溶液定量加入所述各菌悬液进行搅拌，混匀后静置得到菌体-海藻酸钠胶状液，将菌体-海藻酸钠胶状液转移至储料器进行储存。
进一步地，所述步骤S1.3中，在预设压力条件下抽出所述储料器中的菌体-海藻酸钠胶状液作为待处理菌液，并使其通过花洒器以微球形态经过预设降落高度注入至搅拌状态下的预设第二浓度的氯化钙溶液中，以预设反应时长进行旋转交联，以对菌体进行包埋处理形成包覆在微球表面的薄膜，过滤清洗后，得到微胶囊菌球。
进一步地，所述步骤S1.4中，设定标准厚度差值，对任意一批次的微胶囊菌球进行包埋合格率检测，通过红外检测仪获取各待检测样品的海藻酸钙盐膜的实时厚度值，计算任一待检测样品的实时厚度值与标准厚度值的差值的绝对值，得到该待检测样品的实时厚度差值，并根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定，若实时厚度差值大于标准厚度差值，判定该待检测样品不合格，将该待检测样品的实时厚度值与标准厚度值进行对比，以确定该待检测样品的包埋固化层的厚度状态。
进一步地，设定标准厚度值，在判定实时厚度差值大于标准厚度差值时，获取该待检测样品的实时厚度值并与标准厚度值进行对比，以对该待检测样品进行标记。
进一步地，设定标准包埋合格率，计算合格样品数目占待检测样品总数目的百分比，得到该批次微胶囊菌球的实时包埋合格率，并根据标准包埋合格率对实时包埋合格率进行对比，
若实时包埋合格率小于标准包埋合格率，通过称重筛选出不合格的微胶囊菌球，并将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以选择对包埋固化参数条件的调节方式。
进一步地，在判定实时包埋合格率小于标准包埋合格率时，将实时厚度值小于标准厚度值的微胶囊菌球标记为待处理菌球，将实时厚度值大于标准厚度值的微胶囊菌球标记为待回收菌球，将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，
若待处理菌球的数目大于待回收菌球，则将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以第一修正反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作，若判定该待处理菌球不合格，则对预设第二浓度进行调整；
若待处理菌球的数目等于待回收菌球，则对预设第二浓度与预设第一浓度均进行调整，将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以预设反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作；
若待处理菌球的数目小于待回收菌球，则将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以第二修正反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作，若判定该待处理菌球不合格，则对预设第一浓度进行调整。
进一步地，制备培养基包括，
步骤S2.1,LB培养基，加水稀释，预设灭菌条件下进行灭菌，得到无菌培养液；
步骤S2.2，预设转移温度下将无菌培养液倒入培养皿，培养皿直径为7厘米；
步骤S2.3，待培养皿中的培养液凝固后，得到培养基，其用保鲜膜包好备用，两个一组。
本发明还提供所述制备的微胶囊菌球与所述培养基在生物抗病检测中的应用，所述制备的微胶囊菌球与所述培养基作为生物抗病产品在平板对峙法中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，通过对病原菌和有益菌进行包埋处理，并进行颜色区分，包括将病原菌或有益菌粉碎并使用甘油调匀着色后与海藻酸钠混匀，再通过氯化钙与海藻酸钠交联反应及过滤分离，形成薄膜包覆的球状细菌颗粒，经过去离子水清洗得到微胶囊菌球；即为了避免常规抗病对峙方法对操作环境及培养条件的苛刻要求，通过制备微胶囊菌球，使胶囊内菌数长达8个月未曾下降，延长了对菌种的保存时长，随时取用，增加了使用的便捷性，且由于一个微胶囊菌球内的菌数达到亿级以上，远远高于常规单个菌落，即具备生物量优势，避免进行对峙试验时出现染菌风险，而微胶囊的组分又包括强保水剂海藻酸钠，不但能够与病原菌或有益菌形成菌体-海藻酸钠胶状液，使其以微珠形态在氯化钙溶液中发生离子交换反应，形成包覆在微胶囊表面的膜结构，而且能够保护培养细胞不易脱水，保护菌种的活性功能，进而提高了产品的检测性能及应用潜力。
进一步地，通过将菌悬液与海藻酸钠溶液充分混合均匀，为下一步利用海藻酸钠与氯化钙反应形成薄膜以对菌体进行包埋处理提供受体条件的同时，由于海藻酸钠分子结构中的羟基能够保护菌体不易失水，保障了菌体的生物活性。
进一步地，通过利用海藻酸钠与氯化钙的离子交换反应生成海藻酸钙盐，使其包覆在待处理菌液微球液滴表面形成一层薄膜，通过定时滤出菌球，并用去离子水清洗多余的海藻酸钙盐，避免海藻酸钠与氯化钙的持续进行离子交换反应生成更多的海藻酸钙盐，导致形成的膜厚度增加，保障抗病性测试有效开展，即形成一层薄膜，不但能够密封包裹内部的菌体，而且使其具有球体软弹的特性，因此能够在进行抗病性试验时，使膜内部的菌体快速释放生长，达到监测及评价细菌的对抗效果，且由于海藻酸钠的保水特性，延长了对菌种的保存时长，使胶囊内菌数长达8个月未曾下降，进行抗病性试验的成功率显著增加，对抗效果明显，其中，用6个月以内的珠子效果最好。
进一步地，通过对待检测样品的实时厚度值进行检测，并与设定的标准厚度值进行对比，筛选出经过包埋固化处理的不合格样品与合格样品，即根据包埋处理形成海藻酸钙盐的厚度，将包覆膜厚度较大及较小的样品筛选出，以确定该批次的产品的包埋合格率，将根据包覆膜厚度调整氯化钙溶液的浓度或海藻酸钠溶液的浓度，使下一批次的微胶囊菌球的规格满足要求，保证微胶囊菌球包覆膜的机械强度不但足以保护菌球内部菌体的生物活性，而且适合进行抗病性检测时菌球内部菌体能够及时流出，进而保障抗病性测试的成功率。
进一步地，通过将不合格样品的实时膜厚度与标准膜厚度进行对比，以对不合格样品的膜厚度进行分析，若判定实时厚度值小于标准厚度值，表示该微胶囊球菌的包埋固化处理不充分，可能是由于氯化钙浓度低导致微珠中的海藻酸根离子对钙离子的捕捉能力低，也可能是由于交联时间短导致微珠中的海藻酸根离子与钙离子未能充分结合形成海藻酸钙盐，若判定实时厚度值大于标准厚度值，表示该微胶囊球菌的包埋固化处理强度过高，可能是由于交联时间长导致钙离子与微珠中的海藻酸根离子持续反应积累了更多的海藻酸钙盐，使膜厚度增加，也可能是由于海藻酸钠溶液的浓度过高，使利用海藻酸钠对微球包埋处理形成的膜厚度明显增加，通过对不合格样品依次称重，筛选出增重不明显的样品，即膜厚度小于标准厚度值的样品，再次注入氯化钙溶液中进行包埋处理，减少材料浪费且操作简单。
进一步地，通过对待检测样品中的待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，分析该批次微胶囊菌球膜厚度形成情况，若待处理菌球的数目大于待回收菌球，表示该批次微胶囊菌球膜厚度值普遍较小，则先通过延长交联反应时长的调整方式对包埋处理进行优化，若这种调整方式无效，则通过增大氯化钙溶液的浓度，使海藻酸根离子与钙离子结合生成的海藻酸钙以增加膜厚度，若待处理菌球的数目小于待回收菌球，表示该批次微胶囊菌球膜厚度值普遍较大，则先通过减小交联反应时长对包埋处理进行优化，若有效，直接简便地优化包埋处理方法，若无效，则通过减小海藻酸钠溶液的浓度，减小菌球的固化程度，精准优化包埋方法，提高微胶囊菌球的生产合格率，若判定待处理菌球的数目等于待回收菌球，表示该批次微胶囊菌球膜厚度值差异大，无法简单通过改变反应时间达到优化方法的效果，直接对各浓度条件进行调整，优化包埋处理方法。
附图说明
图1为本发明实施例微胶囊菌球的制备流程图；
图2为本发明实施例培养基的制备流程图；
图3为本发明实施例包埋合格率检测的逻辑流程图；
图4为本发明实施例包埋固化装置的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1与图2所示，图1为本发明实施例微胶囊菌球的制备流程图，图2为本发明实施例培养基的制备流程图，本发明公布了一种生物抗病产品的制备方法，包括，制备病原菌微胶囊、有益菌微胶囊以及培养基，
其中，微胶囊菌球由菌悬液、甘油、海藻酸钠以及氯化钙制备形成，制备过程包括四步，第一步，离心反应，病原菌与甘油调匀着色，有益菌直接与甘油调匀，形成菌悬液；第二步，共混反应，菌悬液与海藻酸钠混匀得到菌体-海藻酸钠胶状液，第三步，交联反应，海藻酸钠与氯化钙进行离子交换反应形成薄膜，第四步，包埋合格率检测，计算待检测样品的包埋合格率，并对待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以确定是否对包埋固化参数进行调整，包括，
步骤S1.1，对病原菌进行物理粉碎后与甘油调匀着色，有益菌菌液离心浓缩后，取菌泥直接与甘油调匀，形成菌悬液；
在步骤S1.2中，将海藻酸钠溶液与菌悬液进行物理共混，得到菌体-海藻酸钠胶状液并进行储存；
步骤S1.3，在预设压力条件下抽出所述储料器中的菌体-海藻酸钠胶状液作为待处理菌液，使其通过花洒器并以预设降落高度注入至搅拌状态下的氯化钙溶液中进行交联反应，以在空气中固化形成微球，以及对微球进行包埋处理形成包覆在微球表面的薄膜，过滤清洗后，得到微胶囊菌球；
步骤S1.4，对同一批次的微胶囊菌球进行包埋合格率检测，随机选取预设抽取个数的微胶囊菌球作为待检测样品，通过对待检测样品的实时厚度值与标准厚度值的差值与标准厚度差值进行比对，以及对任一待检测样品的实时厚度值与标准厚度值进行比对，确定该批次的微胶囊菌球的包埋合格率，并将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以确定是否对包埋固化参数进行调整。
制备培养基包括，
步骤S2.1,LB培养基，加水稀释，预设灭菌条件下进行灭菌，得到无菌培养液；
步骤S2.2，预设转移温度下将无菌培养液倒入培养皿，培养皿直径为7厘米；
步骤S2.3，待培养皿中的培养液凝固后，得到培养基，其用保鲜膜包好备用，两个一组；
其中，预设灭菌条件包括灭菌温度121℃以及灭菌时间30分钟，预设转移温度为40℃；
在本实施例中，通过对病原菌和有益菌进行包埋处理，并进行颜色区分，包括将病原菌或有益菌粉碎并使用甘油调匀着色后与海藻酸钠混匀，再通过氯化钙与海藻酸钠交联反应及过滤分离，形成薄膜包覆的球状细菌颗粒，经过去离子水清洗得到微胶囊菌球；即为了避免常规抗病对峙方法对操作环境及培养条件的苛刻要求，通过制备微胶囊菌球，使胶囊内菌数长达8个月未曾下降，延长了对菌种的保存时长，随时取用，增加了使用的便捷性，且由于一个微胶囊菌球内的菌数达到亿级以上，远远高于常规单个菌落，即具备生物量优势，避免进行对峙试验时出现染菌风险，而微胶囊的组分又包括强保水剂海藻酸钠，不但能够与病原菌或有益菌形成菌体-海藻酸钠胶状液，使其以微珠形态在氯化钙溶液中发生离子交换反应，形成包覆在微胶囊表面的膜结构，而且能够保护培养细胞不易脱水，保护菌种的活性功能，进而提高了产品的检测性能及应用潜力；通过对同一批次的微胶囊菌球作为待检测样品进行包埋合格率检测，并根据包覆膜厚度调整氯化钙溶液的浓度或海藻酸钠溶液的浓度，保证微胶囊菌球包覆膜的机械强度不但足以保护菌球内部菌体的生物活性，而且适合进行抗病性检测时菌球内部菌体能够及时流出，进而保障抗病性测试的成功率。
具体而言，在步骤S1.1中，在步骤S1.1中，在预设离心条件下分别对病原菌和有益菌进行物理粉碎，粉碎后的病原菌加入甘油进行混合调匀，再加入色素使其着色，获得病原菌菌悬液，粉碎后的有益菌配置为有益菌菌液进行离心浓缩，分离出有益菌菌泥直接加入甘油调匀，获得有益菌菌悬液。
在本实施例中的预设离心条件包括预设离心转速与预设离心时间，预设离心转速设置在8000-10000rpm之间，预设离心时间设置在8-15分钟之间，预设离心条件的设定值还可以根据实际菌种的特性适应调整，即若转速越高，时间可以越短，反之转速越低，时间越长，只要能够利用物理分离技术使菌体与水相明显分层，保证菌体从水相中分离出来即可，甘油的浓度为30％。
通过对菌液离心处理，实现菌体的浓缩与水相的分离，例如，10mL的菌液，组成成分包括5％的营养物质，94％的水以及接近1％的菌体，在高速离心作用下，培养基和菌体的固相与水的液相发生分离，固相处于下层，液相水处于上层，倒出液相，直接获取固相，即得到浓缩菌泥，操作简单。
具体而言，在步骤S1.2中，将海藻酸钠溶解于去离子水中，并进行加热搅拌，得到预设第一浓度的海藻酸钠溶液，将所述海藻酸钠溶液定量加入所述各菌悬液进行搅拌，混匀后静置得到菌体-海藻酸钠胶状液，将菌体-海藻酸钠胶状液转移至储料器进行储存；
本实施例中预设第一浓度为海藻酸钠溶液的浓度，约为3.3％，由3克海藻酸钠溶解于90ML去离子水中得到，菌体-海藻酸钠胶状液浓度约为11％，由菌悬液与去离子水的体积比为1:9配置得到，搅拌时间为10分钟，静置时间为10分钟。
通过将菌悬液与海藻酸钠溶液充分混合均匀，为下一步利用海藻酸钠与氯化钙反应形成薄膜以对菌体进行包埋处理提供受体条件的同时，由于海藻酸钠分子结构中的羟基能够保护菌体不易失水，保障了菌体的生物活性。
具体而言，在步骤S1.3中，在预设压力条件下抽出所述储料器中的菌体-海藻酸钠胶状液作为待处理菌液，并使其通过花洒器以微球形态经过预设降落高度注入至搅拌状态下的预设第二浓度的氯化钙溶液中，以预设反应时长进行旋转交联，以对菌体进行包埋处理形成包覆在微球表面的薄膜，过滤并用去离子水清洗后，得到微胶囊菌球，塑封保存，4℃保存。
其中，预设第二浓度为配置的CaCl2溶液的浓度，配置为5％。
本实施例中的预设压力条件包括预设抽取压力与预设喷洒压力，预设抽取压力设定值与储料器设备尺寸、配套的管路特性以及菌液浓度有关，可以设置为0.5MPa，预设喷洒压力与配套的管路特性、花洒出口的孔径以及孔的数量有关，需保证菌液以液滴形态注入氯化钙溶液，设定的预设喷洒压力应在0.1-0.2MPa之间，并根据实际的菌液喷洒状态适应选择，其中，花洒的孔径可调决定球的直径大小，花洒的孔数目决定单位小时的产量；设定的预设降落高度为花洒器距离氯化钙液面30-60厘米，使液滴出来在空气中降落30-60厘米，成球，落入氯化钙液体，迅速表面钙化成膜，这样设计成球率高，不拖尾。
氯化钙溶液保持磁力搅拌状态，转速可调，以保证钙化成膜过程中，球体不沾连；氯化钙溶液的体积需保证单批次盛载的微球量，体积与盛载的微球数量成正比，且氯化钙液体可以回收反复利用。
通过利用海藻酸钠与氯化钙的离子交换反应生成海藻酸钙盐，使其包覆在待处理菌液微球液滴表面形成一层薄膜，通过定时滤出菌球，并用去离子水清洗多余的海藻酸钙盐，避免海藻酸钠与氯化钙的持续进行离子交换反应生成更多的海藻酸钙盐，导致形成的膜厚度增加，保障抗病性测试有效开展，即形成一层薄膜，不但能够密封包裹内部的菌体，而且使其具有球体软弹的特性，因此能够在进行抗病性试验时，使膜内部的菌体快速释放生长，达到监测及评价细菌的对抗效果，且由于海藻酸钠的保水特性，延长了对菌种的保存时长，使胶囊内菌数长达8个月未曾下降，进行抗病性试验的成功率显著增加，对抗效果明显，其中，用6个月以内的珠子效果最好。
本实施例中采用的喷头花洒的可替换方式为用注射器吸取菌体-海藻酸钠液，水平挤入5％的CaCl2溶液，使其以预设反应时长进行旋转交联，形成球状；滤出小球，并用去离子水清洗，得到微胶囊菌球，塑封保存，4℃保存；
其中，预设反应时长设置为3小时，保障菌球在CaCl2溶液中进行固化后形成的膜厚度在标准厚度范围内；
参阅图3所示，其为本发明实施例包埋合格率检测的逻辑流程图，其中，
具体而言，在步骤S1.4中，设定预设抽样个数与标准厚度差值，以预设抽样个数随机选取同一批次的微胶囊菌球作为待检测样品进行包埋合格检测，通过红外检测仪依次获取各待检测样品的海藻酸钙盐膜的实时厚度值，计算任一待检测样品的实时厚度值与标准厚度值的差值的绝对值，得到该待检测样品的实时厚度差值，并根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定，
若实时厚度差值小于等于标准厚度差值，判定该待检测样品合格，将对下一待检测样品进行包埋合格检测；
若实时厚度差值大于标准厚度差值，判定该待检测样品不合格，将该待检测样品的实时厚度值与标准厚度值进行对比，以确定该待检测样品的包埋固化层的厚度。
本实施例中的预设抽样个数表示设定的检测样本数量，设定值随着实际生产量的增大而增大，一般地，设定的预设抽样个数为一批次生产量的2％-5％，并根据实际生产量适应选择，且需随机抽取样本，以确保样本具有代表性及减小抽样误差，从而确保抽样结果的可靠性与精确性。
设定的标准厚度差值表示允许的对微珠包埋后形成的实际膜厚度与设定的标准膜厚度的偏差值，设定值与菌体的特性、花洒的孔径及目标微胶囊菌球的尺寸适应设定，需保障膜的机械结构能够保护菌球内菌液的生物活性的同时，使进行抗病性测试时菌球内的菌液能够及时轻松流出，一般地，设置在10nm-20nm之间，并根据实际菌体类型与设定的标准膜厚度适应选择。
通过对待检测样品的实时厚度值进行检测，并与设定的标准厚度值进行对比，筛选出经过包埋固化处理的不合格样品与合格样品，即根据包埋处理形成海藻酸钙盐的厚度，将包覆膜厚度较大及较小的样品筛选出，以确定该批次的产品的包埋合格率，将根据包覆膜厚度调整氯化钙溶液的浓度或海藻酸钠溶液的浓度，使下一批次的微胶囊菌球的规格满足要求，保证微胶囊菌球包覆膜的机械强度不但足以保护菌球内部菌体的生物活性，而且适合进行抗病性检测时菌球内部菌体能够及时流出，进而保障抗病性测试的成功率。
具体而言，设定标准厚度值，在判定实时厚度差值大于标准厚度差值时，获取该待检测样品的实时厚度值并与标准厚度值进行对比，
若实时厚度值小于标准厚度值，将该待检测样品标记为待处理菌球，以继续注入氯化钙溶液中进行交联反应，并确定是否对预设第二浓度进行调整；
若实时厚度值大于标准厚度值，将该待检测样品标记为待回收菌球。
标准厚度值表示设定的微胶囊菌球表面固化形成的海藻酸钙盐的标准模厚度，设定值取决于菌体的类型、花洒的孔径以及包埋处理的制备条件，一般地，标准厚度值设置在20nm-90nm之间，需根据实际菌体的类型适应选择。
通过将不合格样品的实时膜厚度与标准膜厚度进行对比，以对不合格样品的膜厚度进行分析，若判定实时厚度值小于标准厚度值，表示该微胶囊球菌的包埋固化处理不充分，可能是由于氯化钙浓度低导致微珠中的海藻酸根离子对钙离子的捕捉能力低，也可能是由于交联时间短导致微珠中的海藻酸根离子与钙离子未能充分结合形成海藻酸钙盐，若判定实时厚度值大于标准厚度值，表示该微胶囊球菌的包埋固化处理强度过高，可能是由于交联时间长导致钙离子与微珠中的海藻酸根离子持续反应积累了更多的海藻酸钙盐，使膜厚度增加，也可能是由于海藻酸钠溶液的浓度过高，使利用海藻酸钠对微球包埋处理形成的膜厚度明显增加，通过对不合格样品依次称重，筛选出增重不明显的样品，即膜厚度小于标准厚度值的样品，再次注入氯化钙溶液中进行包埋处理，减少材料浪费且操作简单。
具体而言，设定标准包埋合格率，计算合格样品数目占待检测样品总数目的百分比，得到该批次微胶囊菌球的实时包埋合格率，并根据标准包埋合格率对实时包埋合格率进行对比，
若实时包埋合格率小于标准包埋合格率，通过称重筛选出该批次剩余微胶囊菌球中不合格的菌球，并将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以选择对包埋固化参数条件的调节方式；
若实时包埋合格率大于等于标准包埋合格率，不对包埋固化参数条件进行调整，将获取实时包埋合格率，若不为一，则通过称重筛选出该批次微胶囊菌球中合格的菌球进行储存，并将实时厚度值小于标准厚度值的微胶囊菌球标记为待处理菌球，将实时厚度值大于标准厚度值的微胶囊菌球标记为待回收菌球，将所述待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以预设反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作；
将实时厚度值大于标准厚度值的微胶囊菌球进行回收处理。
其中，包埋固化参数条件包括预设第一浓度、预设第二浓度以及预设反应时长，该批次微胶囊菌球包括待检测样品及剩余微胶囊菌球。
在本实施例中设定的标准包埋合格率表示通过包埋固化装置制备的同一批次中的微胶囊菌球标准合格率，设定值与菌体的种类、大小以及装置涉及的设备型号有关，一般地，设置在70％-90％之间，还需根据实际生产情况适应选择。
具体而言，在判定实时包埋合格率小于标准包埋合格率时，获取待处理菌球的数目及待回收菌球的数目，将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，
若待处理菌球的数目大于待回收菌球，则将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以第一修正反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作，若判定该待处理菌球不合格，则对预设第二浓度进行调整；
若待处理菌球的数目等于待回收菌球，则对预设第二浓度与预设第一浓度均进行调整，将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以预设反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作；
若待处理菌球的数目小于待回收菌球，则将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以第二修正反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作，若判定该待处理菌球不合格，则对预设第一浓度进行调整；
其中，Cb1’＝Cb1×[1-(Hs-Hb)/Hs],Cb2’＝Cb2×[1-(Hb-Hs)/Hs],Tc’＝Tc×[1+(Hb-Hs)/Hs]，Tc”＝Tc×[1-(Hb-Hs)/Hs]，Cb1表示设定的预设第一浓度，Cb1’表示调整后的预设第一浓度，Cb2表示设定的预设第二浓度，Tc表示预设反应时长，Cb2’表示调整后的预设第二浓度，Tc’表示调整后的第一修正反应时长，Tc”表示调整后的第二修正反应时长，Hs表示红外监测仪检测的该待检测样品的实时厚度值，Hb表示设定的标准厚度值。
通过对待检测样品中的待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，分析该批次微胶囊菌球膜厚度形成情况，若待处理菌球的数目大于待回收菌球，表示该批次微胶囊菌球膜厚度值普遍较小，则先通过延长交联反应时长的调整方式对包埋处理进行优化，若这种调整方式无效，则通过增大氯化钙溶液的浓度，使海藻酸根离子与钙离子结合生成的海藻酸钙以增加膜厚度，若待处理菌球的数目小于待回收菌球，表示该批次微胶囊菌球膜厚度值普遍较大，则先通过减小交联反应时长对包埋处理进行优化，若有效，直接简便地优化包埋处理方法，若无效，则通过减小海藻酸钠溶液的浓度，减小菌球的固化程度，精准优化包埋方法，提高微胶囊菌球的生产合格率，若判定待处理菌球的数目等于待回收菌球，表示该批次微胶囊菌球膜厚度值差异大，无法简单通过改变反应时间达到优化方法的效果，直接对各浓度条件进行调整，优化包埋处理方法。
参阅图4所示，其为本发明实施例包埋固化装置的结构示意图，包括，储料器1、花洒器2、花洒喷头201、出口202、压力泵3以及反应器4，其中，
具体而言，包埋处理装置包括用以储存所述菌体-海藻酸钠胶状液的储料器1、设置有花洒喷头201的花洒器2、设置在所述储料器1与所述花洒器之间的压力泵3以及用以盛装所述氯化钙溶液的反应器4，所述压力泵用以抽取所述菌体-海藻酸钠胶状液，所述花洒喷头上设置有若干孔径可调节的出口202，用以将菌体-海藻酸钠胶状液以微珠形态注入所述反应器进行交联反应。
通过包埋处理装置利用海藻酸钠对菌体进行包埋处理形成具有膜结构的微胶囊菌球，使菌体隔绝外部环境，从而制备出能够长期维持生物活性的菌球，便于保存的同时，抗病性测试时能够及时释放菌体，以保证测试有效，进而增加测试成功率。
本实施例中的生物抗病产品还包括辅助配件，用于与制得的微胶囊和培养基配套使用，辅助配件包括用以储存微胶囊菌球的若干储存管，用于分开夹取病原菌球及有益菌球的两个镊子，一次性手套，封口膜、外部总装盒子以及操作指南，其中，储存罐密闭且具有透气性，使用一次性手套能够降低染菌率，封口膜用于密封培养基，保持培养环境的水分。
在本实施例中的抗病对峙方法是先取1-3粒病原菌珠子放在一个培养基中间，取同等数量的珠子放在另一个培养基的中间，然后用有益菌株围绕该病原菌珠放置一圈，观察并检测病原菌的生长情况，如果病原菌生长长度变化不大，说明有益菌对病原菌的生长产生抑制作用，即有益菌有抑菌功效，若直接将制备好的微胶囊菌球在生活环境中参与试验，且非专业人士操作，同样能达到监测及评价细菌的抑菌效果。
在本实施例中，通过对常规抗病对峙方法的改进，即首先将病原菌和有益菌做成菌球，使其都能延长保存期至3个月-6个月，随用随取，便捷性明显提高，其次，优化了抗病性试验操作，即降低了对操作环境即操作技能的苛刻要求，甚至试验操作方法具有的简便直观性使外行大众容易看会学会，实验测试的成功率相较于常规抗病对峙方法也明显增加，形成一个应用于生物抗病检测的特有产品，即包括病原菌微胶囊、有益菌微胶囊、培养基，以及辅助配件的微生物抗病直观体验套装，该产品由于其稳定、高效、便携的特点不仅适合推广及工业化生产，且应用多种场景，例如，研发人员可以使用这套装备，验证自己研发的菌，是否对病原菌具有抑制功能；消费者可以通过这套装备，直观的看到和预知，自己购买的菌剂产品是否具有抗病效果；学校、幼儿园等教育机构，可以通过本套装备，演示微生物抗病过程，直观的展现效果，提高教学、科普的趣味性以及直观性。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物抗病产品的制备，其特征在于，包括制备病原菌微胶囊、有益菌微胶囊以及培养基，其中，制备病原菌微胶囊和有益菌微胶囊包括，
步骤S1.1，对病原菌进行物理粉碎后与甘油调匀着色，有益菌菌液离心浓缩后，取菌泥直接与甘油调匀，形成菌悬液；
在步骤S1.2中，将海藻酸钠溶液与菌悬液进行物理共混，得到菌体-海藻酸钠胶状液并进行储存；
步骤S1.3，在预设压力条件下抽出所述储料器中的菌体-海藻酸钠胶状液作为待处理菌液，使其通过花洒器并以预设降落高度注入至搅拌状态下的氯化钙溶液中进行交联反应，以在空气中固化形成微球，以及对微球进行包埋处理形成包覆在微球表面的薄膜，过滤清洗后，得到微胶囊菌球；
步骤S1.4，对一批次的微胶囊菌球进行包埋合格率检测，随机选取预设抽取个数的微胶囊菌球作为待检测样品，通过计算待检测样品的实时厚度值与标准厚度值的差值并与标准厚度差值进行比对，以及对任一待检测样品的实时厚度值与标准厚度值进行比对，确定该批次的微胶囊菌球的包埋合格率，并将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以确定是否对包埋固化参数进行调整。
2.根据权利要求1所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，在步骤S1.1中，在预设离心条件下分别对病原菌和有益菌进行物理粉碎，粉碎后的病原菌加入甘油进行混合调匀，再加入色素使其着色，获得病原菌菌悬液，粉碎后的有益菌配置为有益菌菌液进行离心浓缩，分离出有益菌菌泥直接加入甘油调匀，获得有益菌菌悬液。
3.根据权利要求1所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，在所述步骤S1.2中，通过将海藻酸钠溶解于去离子水中，并进行加热搅拌，以配置预设第一浓度的海藻酸钠溶液，将所述海藻酸钠溶液定量加入所述各菌悬液进行搅拌，混匀后静置得到菌体-海藻酸钠胶状液，将菌体-海藻酸钠胶状液转移至储料器进行储存。
4.根据权利要求1所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，在所述步骤S1.3中，在预设压力条件下抽出所述储料器中的菌体-海藻酸钠胶状液作为待处理菌液，并使其通过花洒器以微球形态经过预设降落高度注入至搅拌状态下的预设第二浓度的氯化钙溶液中，以预设反应时长进行旋转交联，以对菌体进行包埋处理形成包覆在微球表面的薄膜，过滤清洗后，得到微胶囊菌球。
5.根据权利要求1所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，在所述步骤S1.4中，设定标准厚度差值，对任意一批次的微胶囊菌球进行包埋合格率检测，通过红外检测仪获取各待检测样品的海藻酸钙盐膜的实时厚度值，计算任一待检测样品的实时厚度值与标准厚度值的差值的绝对值，得到该待检测样品的实时厚度差值，并根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定，若实时厚度差值大于标准厚度差值，判定该待检测样品不合格，将该待检测样品的实时厚度值与标准厚度值进行对比，以确定该待检测样品的包埋固化层的厚度状态。
6.根据权利要求5所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，设定标准厚度值，在判定实时厚度差值大于标准厚度差值时，获取该待检测样品的实时厚度值并与标准厚度值进行对比，以对该待检测样品进行标记。
7.根据权利要求6所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，设定标准包埋合格率，计算合格样品数目占待检测样品总数目的百分比，得到该批次微胶囊菌球的实时包埋合格率，并根据标准包埋合格率对实时包埋合格率进行对比，
若实时包埋合格率小于标准包埋合格率，通过称重筛选出不合格的微胶囊菌球，并将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，以选择对包埋固化参数条件的调节方式。
8.根据权利要求7所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，在判定实时包埋合格率小于标准包埋合格率时，将实时厚度值小于标准厚度值的微胶囊菌球标记为待处理菌球，将实时厚度值大于标准厚度值的微胶囊菌球标记为待回收菌球，将待处理菌球的数目与待回收菌球的数目进行比对，
若待处理菌球的数目大于待回收菌球，则将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以第一修正反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作，若判定该待处理菌球不合格，则对预设第二浓度进行调整；
若待处理菌球的数目等于待回收菌球，则对预设第二浓度与预设第一浓度均进行调整，将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以预设反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作；
若待处理菌球的数目小于待回收菌球，则将待处理菌球继续注入氯化钙溶液中以第二修正反应时长进行交联反应，并重复上述根据标准厚度差值对实时厚度差值进行判定的操作，若判定该待处理菌球不合格，则对预设第一浓度进行调整。
9.根据权利要求1所述的生物抗病产品的制备，其特征在于，制备培养基包括，
步骤S2.1,LB培养基，加水稀释，预设灭菌条件下进行灭菌，得到无菌培养液；
步骤S2.2，预设转移温度下将无菌培养液倒入培养皿，培养皿直径为7厘米；
步骤S2.3，待培养皿中的培养液凝固后，得到培养基，其用保鲜膜包好备用，两个一组。
10.根据权利要求1所述制备的微胶囊菌球与所述培养基应用于生物抗病检测，其特征在于，所述制备的微胶囊菌球与所述培养基作为生物抗病产品在平板对峙法中应用。
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