CN110295160A - 一种微生物固定化小球及其制备方法与冷冻干燥方法和应用 - Google Patents

一种微生物固定化小球及其制备方法与冷冻干燥方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物固定化小球及其制备方法与冷冻干燥方法和应用，属于微生物污水处理领域。该微生物固定化小球的制备方法为：（1）将海藻酸钠加入水中，灭菌后添加二氧化硅搅拌均匀；（2）添加微生物菌悬液；（3）将混合液滴加入交联液中交联凝结成球。本发明的冷冻干燥方法为：将固定化小球与干燥剂混合后冷冻干燥。本发明以保障菌球活力稳定且能实现多次循环使用的冷冻干燥方法为前提，简化微生物小球制备方法（一种载体材料和一种辅料）以保证良好的传质性能，实现了菌球高降解性能和多次循环使用的有效结合。利用本发明的冷冻干燥方法，实现了菌球40次以上的循环利用且每个循环降解效率稳定，活力保存时间达4个月以上。

Description

一种微生物固定化小球及其制备方法与冷冻干燥方法和应用
技术领域
本发明属于微生物污水处理技术领域，具体涉及一种微生物固定化小球及其制备方法与冷冻干燥方法和应用。
背景技术
微生物污水处理技术因其较于化学法具有环境友好且节能高效的特点而被应用于各类工业废水，生活污水等的处理，但游离微生物用于污水处理存在几大问题：(1)在实际应用中容易流失，只能单次使用；(2)复杂多变的污染体系对微生物产生毒害作用，从而难以实现降解效率的稳定性；(3)外源添加入污水体系的强化接种很难竞争过土著微生物群落从而无法实现降解某类特定污染物的目的。这些问题共同促使研究者们找到一项简单有效且在实际应用中具有重大借鉴意义的降解菌降解性能强化辅助技术，即微生物固定化。
现有包埋固定化技术通常采用几种载体材料混合交联包埋，同时还添加有多种辅料，目的是为了提高菌球的机械强度和抗逆性以增加固定化小球的循环使用次数，这些方式虽然有一定程度上的加强效果，但是负面影响也显而易见，一方面增加了工艺的复杂性并且提高了工艺的制作成本，不利于工厂大规模实践；另一方面，机械强度越高的载体材料，例如聚乙烯醇，其传质性能越差，采用几种机械强度高的载体材料混合包埋，其降解效率远低于游离微生物的降解效率，因此也满足不了工厂对高降解效率的要求。综上，当前大多数包埋固定化技术无法兼具降解效率和循环使用两大目标。
为了保存菌球，使之在较长的储藏时间内依然保持降解活力，常用的方法包括喷雾干燥，鼓风干燥，流化床干燥等。这些干燥方法一般采用温度较高(80℃)的气流来去除水分，菌球活力有较大损失，同时对设备要求高，单次干燥量有限，干燥时间长，不能作为工厂预期中的理想干燥方法。
Cupriavidus oxalaticus属于贪铜菌，能有效利用苯酚作为唯一的碳源和能源物质，在胞内酶的催化作用下对苯酚实现开环降解，使苯酚污染物变成对环境无害的物质，常见的苯酚降解菌如不动杆菌，芽孢杆菌等苯酚降解浓度较小，浓度为1000mg/L甚至更高浓度的苯酚容易对菌体产生毒害作用,致使菌体裂解死亡,Cupriavidus oxalaticus相对而言有更高苯酚浓度的生长范围，游离菌的有效苯酚降解浓度达2000mg/L，固定化菌球的有效苯酚降解浓度达2500mg/L。
发明内容
为了克服现有技术无法兼具降解效率和循环使用两大目标的难点，本发明的目的在于提供一种微生物固定化小球及其制备方法与冷冻干燥方法和应用。该干燥方法可大规模干燥保存菌球，同时还能实现菌球多次循环使用，另外通过简化目前大多数复杂的固定化方法，最终形成了工艺简单，经济成本低廉，同时具备高降解效率的微生物包埋固定化小球的制备方法。两者分别负责降解效率和循环使用，相互结合，可解决上述两难之题。
该微生物固定化小球是以海藻酸钠交联氯化钙形成，辅以二氧化硅增加菌球机械强度，包埋贪铜菌Cupriavidus oxalaticus形成的固定化微生物凝胶小球。
本发明所提供的冷冻干燥方法除了实现菌球多次循环利用外，还能大规模干燥菌球，菌球活力损失较小，微生物活力保存时间长，存储4个月以上仍然维持降解活力。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案。
一种微生物固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠加入水中，高温蒸汽灭菌后添加二氧化硅，搅拌混合均匀得混合液；
(2)将微生物菌悬液加入步骤(1)所得的混合液中搅拌均匀得包埋液；
(3)将步骤(2)所得的包埋液加入氯化钙交联液中交联凝结成球，得到微生物固定化小球。
优选的，步骤(1)中所述海藻酸钠在混合液中的质量百分比为1％—5％。
优选的，步骤(1)中所述二氧化硅在混合液中的质量百分比为1％—2％。
优选的，步骤(1)中高温蒸气灭菌处理可以同时达到灭菌和海藻酸钠加热溶解的效果，加入的二氧化硅为唯一的添加剂，海藻酸钠是唯一的包埋载体材料，简便经济，同时保证了良好的传质性能以达到理想的降解效率。
优选的，步骤(2)中，所述微生物菌悬液的制备包括以下步骤：挑选经过划线活化的单菌加入LB培养基中扩大培养得到菌液，待菌液浓度为OD600为1—1.5时，取菌液离心后弃上清取菌体，然后用生理盐水将菌体重悬，得微生物菌悬液；其中所述单菌为苯酚降解菌贪铜菌(分类命名为Cupriavidus oxalaticus，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国.广东，保藏编号为GDMCC NO：60668，保藏日期为2019年6月3日)；所述离心转速为6000—10000rpm。
优选的，步骤(2)中，当微生物菌悬液生长OD600为1—1.5时，将微生物菌悬液加入步骤(1)所得的混合液中搅拌均匀得包埋液；添加微生物菌悬液的体积百分比为10％—50％。
优选的，步骤(3)中，所述氯化钙在氯化钙交联液中的质量百分比为0.5％—5％。
优选的，所述交联的时间为0.5h—1h。
由以上所述的制备方法制得的一种微生物固定化小球。
以上所述的固定化小球的冷冻干燥方法，包括以下步骤：
(1)将微生物固定化小球与干燥剂混合；
(2)将步骤(1)所得混合物置于冷冻条件下。
(3)将步骤(2)所得冷冻混合物取出以解冻干燥。
以上冷冻干燥方法的过程为：微生物固定化小球在冻融过程中释放出的水被干燥剂吸收，同时干燥剂与菌球发生二次交联反应，增加菌球的壁厚，从而增强其机械强度，实现多次循环利用的目标。
优选的，步骤(1)所述的干燥剂为无水氯化钙。
优选的，步骤(1)所述干燥剂与微生物固定化小球的质量比为1∶10—1∶5。
优选的，微生物固定化小球与干燥剂混合后需迅速冷冻。
优选的，步骤(2)中所述冷冻的温度为-20℃—0℃。
优选的，步骤(3)中所述解冻温度为25℃—30℃
优选的，步骤(3)中所述干燥时间为1h—2h。
优选的，将微生物固定化小球与干燥剂混合后将所得混合物用布包裹再置于盛有干燥剂的容器中然后冷冻；所述干燥剂填充满容器底部；所述的干燥剂为无水氯化钙。该步骤操作的目的是二次干燥菌球在冻干过程中释放出的水，此步骤在步骤(1)菌球与干燥剂混合干燥充分的前提下可以省略。
进一步优选的，所述布为渗透性好的纱布或者无纺布。
在冷冻干燥方法中，水含量越少，微生物活力越低，水份去除率为60％—70％时微生物活力保存较好，同时菌球的含水量也较大程度地被去除。
优选的，冷冻干燥处理条件即为菌球保存条件，冷冻干燥处理后如不取出即进入保存状态。
本发明的冷冻干燥方法在循环使用方面的核心思想为：中途对菌球进行干燥脱水处理。具体表现为：干燥后的固定化小球在循环使用过程中会重新吸水膨胀，必须在菌球溶胀破裂之前再次进行冷冻干燥脱水，单次冷冻干燥后可循环5—7次，根据菌球吸水情况需调整干燥剂与菌球的质量比，干燥时间，保持水份去除率为60％—70％的干燥效果。
以上的微生物固定化小球在处理苯酚废水中的应用。
以上的冷冻干燥方法在保存菌球活力，延长菌球使用期限中的应用。
本发明提供了一种冷冻干燥方法，在间歇脱水的指导思想下运用，实现了菌球达40次以上的循环利用，且每个循环保持稳定的降解效率；除此之外，该冷冻干燥方法在保存菌球活力方面具有显著优势，冷冻干燥后的菌球如不使用，继续冷冻保存4个月以上仍具有苯酚降解活力；由于对菌球采用该冷冻干燥方法可实现多次循环使用，因而不需要混合使用多种材料增加菌球机械强度来满足循环使用的要求，只采用一种添加剂二氧化硅和一种包埋载体材料海藻酸钠，将贪铜菌包埋制备贪铜菌凝胶小球。海藻酸钠具有原料价廉易得、无毒、网络孔隙大、传质阻力小、制备简单等优点，是一种常用的包埋材料，但也存在机械强度不足的问题，所以添加二氧化硅增加机械强度，按照此方法制备的菌球，工艺简单，具备良好的传质性能，保证了菌球降解效率的高效性。最后，因为具备对设备要求低，能大规模干燥菌球，提高干燥效率，经济高效等优点使之在工业应用领域具有巨大的潜在开发价值。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点:
1、本发明冷冻干燥菌球的方法，在间歇脱水的指导思想下运用，实现了菌球达40次以上的循环利用，且每个循环保持稳定的降解效率。
2、本发明的冷冻干燥方法，在保存菌球活力方面具有显著优势，冷冻干燥后的菌球如不使用，继续冷冻保存4个月以上仍具有稳定苯酚降解活力。
3、本发明由于对菌球采用冷冻干燥方法来实现循环使用，因而不需要混合使用多种材料增加菌球机械强度来满足循环使用的要求，只采用一种添加剂二氧化硅和一种包埋载体材料海藻酸钠，大大简化了工艺，保证了良好的传质性能，保证了菌球降解效率的高效性，且二者均来源广泛、价格低廉，对微生物无毒害，辅以造粒设备便可规模化生产。
4、本发明的冷冻干燥方法，对设备要求低，且能大规模干燥菌球，提高干燥效率，经济高效。
附图说明
图1a、图1b、图1c、图1d为Cupriavidus oxalaticus游离菌与固定化菌球在不同苯酚浓度对苯酚去除效率的曲线图；
图2a、图2b为固定化菌球在苯酚浓度为1000mg/L和500mg/L培养条件下的循环利用图；
图3a、图3b、图3c、图3d为固定化菌球在不同保存时间后的降解活力图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种微生物包埋固定化小球的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备贪铜菌Cupriavidus oxalaticus菌悬液：挑选经过划线活化的单菌加入LB培养基中扩大培养得到菌液，待菌液浓度OD600生长为1.5时，取菌液离心，离心转速为8000rpm，离心时间2min，收集菌体后无需清洗菌体，直接用生理盐水重悬得贪铜菌Cupriavidus oxalaticus菌悬液；
(2)所述LB培养基配方：将10g蛋白胨，5g酵母粉和10g NaCI搅拌混溶于1L水中，灭菌备用；
(3)制备菌体混合液：将3g海藻酸钠加入100ml水中，高温蒸汽灭菌后添加1.5g二氧化硅，搅拌混合均匀得混合液；
(4)制备菌体交联液：将0.5g氯化钙加入100ml水中，高温蒸气灭菌后备用；
(5)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球：将步骤(1)中贪铜菌Cupriavidus oxalaticus菌悬液以50％的比例加入步骤(3)的混合液中搅拌均匀得包埋液；将包埋液加入步骤(4)中氯化钙交联液中交联凝结0.5h成球，得到固定化Cupriavidusoxalaticus菌球。
一种菌球冷冻干燥方法，包括以下步骤：
(1)将固定化Cupriavidus oxalaticus菌球与无水氯化钙按质量比例10∶1混合；
(2)将混合物用纱布包裹在一起后置于底部盛有无水氯化钙的容器；
(3)迅速将容器置于-20℃冷冻1h。
(3)将容器置于28℃解冻2h。
实施例2
一种微生物包埋固定化小球的制备方法为:
(1)制备Cupriavidus oxalaticus菌悬液:与实施例1相同；
(2)制备菌体包埋液:混合液中海藻酸钠的体积百分比为1％,其他步骤与条件与
实施例1相同；
(3)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球:与实施例1相同。
实施例3
一种微生物包埋固定化小球的制备方法为:
(1)制备Cupriavidus oxalaticus菌悬液:与实施例1相同；
(2)制备菌体包埋液:混合液中海藻酸钠的体积百分比为5％,其他步骤与条件与
实施例1相同；
(3)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球:与实施例1相同。
实施例4
一种微生物包埋固定化小球的制备方法为:
(1)制备Cupriavidus oxalaticus菌悬液:与实施例1相同；
(2)制备菌体包埋液:混合液中菌液的体积百分比为10％,其他步骤与条件与
实施例1相同；
(3)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球:与实施例1相同。
实施例5
一种微生物包埋固定化小球的制备方法为:
(1)制备Cupriavidus oxalaticus菌悬液:与实施例1相同；
(2)制备菌体包埋液:混合液中菌液的体积百分比为30％,其他步骤与条件与实施例1相同；
(3)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球:与实施例1相同。
实施例6
一种微生物包埋固定化小球的制备方法为:
(1)制备Cupriavidus oxalaticus菌悬液:与实施例1相同；
(2)制备菌体包埋液:混合液中二氧化硅的w/v百分比为1％,其他步骤与条件与实施例1相同；
(3)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球:与实施例1相同。
实施例7
一种微生物包埋固定化小球的制备方法为:
(1)制备Cupriavidus oxalaticus菌悬液:与实施例1相同；
(2)制备菌体包埋液:混合液中二氧化硅的w/v百分比为2％,其他步骤与条件与实施例1相同；
(3)制备Cupriavidus oxalaticus包埋固定小球:与实施例1相同。
实施例8
一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法为：
(1)将干燥剂与微生物固定化小球按质量比1.5∶10混合；
(2)冷冻条件和解冻条件与实施例1相同。
实施例9
一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法为：
(1)将干燥剂与微生物固定化小球按质量比2∶10混合；
(2)冷冻条件和解冻条件与实施例1相同。
实施例10
一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法为：
(1)解冻时，菌球干燥时间为1h；
(2)干燥剂与菌球质量比和冷冻条件与实施例1相同。
实施例11
一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法为：
(1)解冻时，菌球干燥时间为1.5h；
(2)干燥剂与菌球质量比和冷冻条件与实施例1相同。
性能测试:
1、测定游离菌和固定化菌球在不同苯酚浓度下的苯酚去除效率,操作如下：
将无机盐培养基以50ml分装于16个锥形瓶，115℃高温灭菌后,添加苯酚依次配成培养基的苯酚终浓度为500mg，1500mg，2000mg，2500mg每个浓度两个变量，每个变量两个平行，游离菌按降解菌菌悬液占溶液体系体积百分比的50％投加游离的Cupriavidusoxalaticus降解菌菌悬液(实施例1培养的菌悬液)；固定化菌球则投加相同菌量的菌球，将锥形瓶放入摇床,于30℃、150r/min的条件下震荡培养；
于不同时间点取样测量残余苯酚浓度，测定苯酚浓度操作如下：
试剂配制：
缓冲溶液：将20g氯化铵溶于100ml氨水中，密塞置冰箱保存；
4-氨基安替比林溶液：将2g 4-氨基安替比林溶于水，转移到100ml容量瓶，定容后放置冰箱冷藏；
铁氰化钾溶液：将8g铁氰化钾溶于水，转移到100ml容量瓶，定容后放置冰箱冷藏；
取2ml培养液离心后从中取1ml加入50ml比色管中，加入去离子水补足到50ml刻度线，先加0.5ml缓冲溶液混匀，然后依次加1ml 4-氨基安替比林溶液和1ml铁氰化钾溶液，充分混匀后，密塞，静置10min，于吸光度510nm处测定吸光值，然后由标准曲线计算出培养液中剩余苯酚的浓度。
Cupriavidus oxalaticus游离菌与固定化菌球在不同苯酚浓度下的苯酚去除效率如图1a、图1b、图1c、图1d所示，纵轴c/C表示为剩余苯酚含量与苯酚总添加量的比值。当苯酚浓度为500mg/L，1500mg/L时，固定化菌球相比游离菌而言在培养前期具有更高的降解效率，而到培养后期，游离菌利用苯酚迅速增长，其降解效率也逐渐超过固定化菌球，苯酚降解效率表现出的前后不一致，一方面是因为凝胶性质的海藻酸钙对苯酚具有一定程度的吸附作用，另一方面是因为在培养后期，游离菌生长到对数期，苯酚含量迅速下降，而固定化菌球由于将贪铜菌限制在一定的空间范围，能供给的苯酚和氧有限，致使贪铜菌不能过快增长，因此后期游离菌的降解效率显著增加，比固定化菌球更快降解完所有苯酚。
当培养基中苯酚浓度为2000mg/L时，整个培养过程固定化菌球的降解效率均高于游离菌，固定化菌球在82h时苯酚降解完毕，而游离菌在近100小时培养后才降解完所有苯酚。苯酚浓度达到2000mg/L时，苯酚除了作为碳源，更是对贪铜菌产生了一种环境胁迫，导致游离菌无法正常增殖，在培养的前3天苯酚浓度无显著变化，而固定化菌球中贪铜菌被包埋于海藻酸钙，苯酚受到该物理介质的阻隔，贪铜菌生长环境周围始终保持局部较低的苯酚浓度，因而固定化菌球相比游离菌苯酚浓度更早发生显著改变，整个过程先完成所有苯酚的降解。
当苯酚浓度为2500mg/L时，游离菌无法有效降解完所有苯酚，固定化菌球完成全部苯酚降解时游离菌中苯酚含量无显著变化，这说明微生物的固定化操作能提高其对苯酚的耐受程度，有效降解更高浓度的苯酚。
游离菌与固定化菌球的苯酚降解效率对比试验说明，降解效率的高低是相对于环境而言的，游离菌的降解效率并非绝对高于固定化菌球，固定化菌球也不能绝对高于游离菌，但是微生物的固定化操作是处理污染的有效手段，在处理低浓度污染物时，保持与游离菌基本相当的降解效率，而处理高浓度污染物时，效率高且耐受范围广。
2、测定固定化菌球在苯酚浓度为1000mg/L和500mg/L培养条件下的循环利用情况，操作如下：
将实施例1制备并干燥后的的固定化小球等量加入苯酚浓度为1000mg/L和500mg/L的培养基中，摇床震荡培养，待培养基中苯酚完全降解完则记为一个循环，将固定化小球取出重新加入新的培养基，如此循环往复，在循环过程中，菌球会再次吸水膨胀(5-7个循环)，此时应将菌球重新进行冷冻干燥后再继续循环。
固定化菌球在苯酚浓度为1000mg/L和500mg/L培养条件下的循环利用情况如图2a、图2b所示，苯酚浓度为1000mg/L时，前10个循环苯酚降解效率稍微波动，一方面是因为菌球在初始循环过程中需要逐渐适应使菌体数量趋于稳定，另一方面由于干燥剂的存在，冷冻不及时，导致瞬时产热量大，部分菌体失活；后20个循环，随着冷冻干燥工艺条件趋于成熟，每个循环降解效率保持恒定，2天完成一个循环，每结束一个循环，菌球被取出进行冷冻干燥，之后再继续循环。
苯酚浓度为500mg/L时，1天完成一个循环，在前6个循环过程中，每结束一个循环，菌球被取出进行冷冻干燥，然后再继续循环；为了检测干燥后的菌球单次干燥能完成的循环数，从第7个循环始，中途不再冷冻干燥，菌球完成循环后被取出直接进入下一个循环，如图2b所示，菌球单次干燥后能耐受住7个循环，7个循环后菌球体积膨胀，必须重新冷冻干燥菌球；图2b中从15个循环之后，保持每3个循环干燥一次，所有的40个循环一直维持一天一个循环的稳定降解效率。
苯酚浓度为1000mg/L时，循环周期为2天，苯酚浓度为500mg/L时，循环周期为一天，干燥后的菌球活力稳定，从而降解效率稳定。
在循环过程中，所有的干燥处理时间均为一天，所以在图2a、图2b循环图中表现为循环周期长短的差异性，而循环周期出现差异之处则为干燥处理时间。
3、测定固定化菌球在不同保存时间后的降解活力，操作如下：
将相同批次的菌球冷冻干燥，等分4份后分别加入苯酚浓度为500mg/L的培养基中摇瓶培养至第一个循环结束，然后取出进行冷冻干燥后分别储存1、2、3、4个月，相隔一月取出一份加入苯酚浓度为500mg/L的培养基中，摇床震荡培养，一天后取样测定培养基中苯酚浓度，完成一个循环后取出直接进行下一个循环直至菌球破裂。
固定化菌球在保存时间分别为1，2，3，4月后的降解活力情况如图3a、图3b、图3c、图3d所示，图3a、图3b、图3c、图3d分别表示1月，2月，3月，4月。在进入冷冻保藏之前，菌球一天均完成第一个循环，图3a、图3b、图3c、图3d在降解效率方面，只在第一个循环上产生差异，保存时间为2月，3月时需要约28小时才能完成第一个循环，保存时间为1月，4月时24小时完成第一个循环，之后图3a、图3b、图3c、图3d循环周期均为24小时；图3a、图3b、图3c、图3d在循环次数方面，图3a、图3b、图3c的循环极限为6次，图3d的循环极限为5次，这也与之前的实验结果(5-7次)吻合。图3a、图3b、图3c、图3d的实验结果表明冷冻干燥方法可以有效保存固定化菌球，连续4个月的储藏仍具有稳定的苯酚降解活力。
4、对实施例1—实施例7制备的固定化微生物小球进行苯酚降解效率测试
无机盐培养基115℃高温灭菌后,添加苯酚配成培养基的苯酚终浓度为500mg/L以用于各种不同种类固定化菌球苯酚降解实验，于不同时间点取样测量残余苯酚浓度确定苯酚完全降解所需的时间。
表1
由表1可以看出，在包埋材料海藻酸钠的浓度范围为1％—5％和辅助剂的浓度范围为1％—2％内，菌球对相同浓度的苯酚降解速率基本相同，而随着菌液添加量增大，苯酚完全降解所需的时间越短，降解效率越高。但根据循环过程中菌球的形态变化，当海藻酸钠和二氧化硅取较高浓度时，菌球的机械强度更好。
5、对实例1、实施例8和实例9进行干燥效率测试
将干燥剂与菌球按照各实例中比例混合之后进行冷冻干燥实验，28℃干燥2h后测量水分去除率W，其中W＝(菌球湿重-菌球干重)/菌球湿重。
表2
干燥剂∶菌球(1∶10) 干燥剂∶菌球(1.5∶10) 干燥剂∶菌球(2∶10)
W(％) 70％ 70％ 71.5％
由表2可以看出，在干燥剂与菌球质量之比为1∶10—1∶5的范围内，干燥效率基本相同，保持对水分的去除效率为70％，这是由于菌球与干燥剂混合后被置于含有干燥剂的环境中，两者之间发生了第二次干燥作用，所以最终表现为干燥效率的一致性。
6、将干燥剂与菌球按照质量比1∶10混合后进行冷冻干燥实验，28℃下分别干燥1h，1.5h，2h后测量水分去除率W，其中W＝(菌球湿重-菌球干重)/菌球湿重
表3
干燥时间(1h) 干燥时间(1.5h) 干燥时间(2h)
W(％) 53％ 62％ 70％
由表3可以看出，在干燥时间为1-2h范围内，随着干燥时间的延长，水分去除率越高，干燥2小时后水分去除率达到70％，在理想水分去除效率60％—70％范围内，此时微生物活力保存较好，同时菌球的含水量也较大程度地被去除，不宜再继续干燥。

Claims (10)

1.一种微生物固定化小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠加入水中，灭菌后添加二氧化硅，搅拌混合均匀得混合液；
(2)将微生物菌悬液加入步骤(1)所得的混合液中搅拌均匀得包埋液；
(3)将步骤(2)所得的包埋液加入氯化钙交联液中交联凝结成球，得到微生物固定化小球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述海藻酸钠在混合液中的质量百分比为1％—5％，二氧化硅在混合液中的质量百分比为1％—2％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微生物菌悬液的制备包括以下步骤：挑选经过划线活化的单菌加入LB培养基中扩大培养得到菌液，待菌液浓度OD600为1—1.5时，取菌液离心后弃上清取菌体，然后用生理盐水将菌体重悬，得微生物菌悬液；其中所述单菌为苯酚降解菌贪铜菌Cupriavidus oxalaticus；所述微生物菌悬液添加到步骤(1)混合液中的体积百分比为10％—50％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氯化钙在氯化钙交联液中的质量百分比为0.5％—5％；所述交联的时间为0.5h—1h。
5.由权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的一种微生物固定化小球。
6.权利要求5所述的一种微生物固定化小球在处理苯酚废水中的应用。
7.权利要求5所述的一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将微生物固定化小球与干燥剂混合；
(2)将步骤(1)所得混合物置于冷冻条件下。
(3)将步骤(2)所得冷冻混合物取出以解冻干燥。
8.根据权利要求7所述的一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(1)所述的干燥剂为无水氯化钙；所述干燥剂与微生物固定化小球的质量比为1∶10—1∶5；微生物固定化小球与干燥剂混合后需迅速冷冻。
9.根据权利要求7所述的一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(2)中所述冷冻的温度为-20℃—0℃；所述冷冻的时间为1h以上；步骤(3)中所述解冻条件为25℃—30℃，干燥时间为1-2h。
10.根据权利要求7所述的一种微生物固定化小球的冷冻干燥方法，其特征在于，将微生物固定化小球与干燥剂混合后将所得混合物用布包裹再置于盛有干燥剂的容器中然后冷冻；所述干燥剂填充满容器底部；所述的干燥剂为无水氯化钙；所述布为渗透性好的纱布或者无纺布。
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