JPH08510380A - 新規方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １個またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し；ビーズ内の生細胞の増殖に十分な時間、増殖を支持する培地中でビーズ内の細胞をインキュベーションし；次いで、ビーズ内の細胞の異なる属性に関連した物理的特性に関して、ビーズまたはビーズに近接する部分を非侵入的かつ物理的に試験する工程からなる、異なる属性を有する微生物を識別する方法。該方法を実施するための種々の装置を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規方法および装置 本発明は、微生物のスクリーニングの新規方法、および該方法を実施するため の新規装置に関する。 醗酵等の微生物学の分野において、例えば、生細胞と死細胞を区別し、あるい は有用代謝物の生産レベルを確認するような、異なる属性を有する細胞を区別す るために、あるいは類似の属性を有する細胞を確認するために微生物培養物をス クリーニングすることがしばしば必要となる。かかるスクリーニングが特に重要 である１の分野は、変異原放射線照射または薬剤による細胞の変異を必要とする 微生物細胞系の開発が行われているバイオテクノロジーである。微生物培養物が 変異原に曝露された後、対象とする変異を検出するために培養物をスクリーニン グすることが必要である。無益な変異に対する有益な変異の割合が非常に低く、 通常はスクリーニングすべき細胞数が非常に多いので、迅速かつ効果的な、理想 的には自動化された方法が、スクリーニングをできるかぎり可能にするために提 供される必要がある。 自動細胞スクリーニング装置は知られているが、現在のところ、これらは１年 につき比較的少数の培養物をスクリーニングできるに過ぎず、スクリーニング速 度の向上が必要である。 本発明者らは、新規な改良された微生物スクリーニング方法およびこの方法を 実施するための装置を開発した。 本発明の第１の態様によれば、異なる属性を有する微生物を識別する方法は、 以下の工程： １種またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し； ビーズ内で生細胞が増殖するに十分な時間、増殖を支持する培地中でビーズ内 の細胞をインキュベーションし； 次いで、ビーズ内の細胞の異なる属性に関連した物理的特性に関してビーズま たはビーズに近接した部分を非侵入的かつ物理的に試験することからなる。 本明細書における「細胞」なる用語は、細菌細胞、動物または植物細胞、真菌 または細菌胞子（分生子を含む）、微生物プロトプラストおよび菌糸断片を包含 する。適当な細胞の例は、ペニシリウム・クリソゲヌム（Penicillium crysogen um）およびストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus） の胞子を包含する。 最適には、本発明方法はさらなるインキュベーション後、さらなる工程または 選択された属性を有する細胞を含むビーズをかかる細胞を含まないビーズから分 離する工程、例えば、増殖した生細胞を含むビーズを死細胞を含むビーズから分 離する工程、またはあるタイプの細胞を含むビーズを別のタイプの細胞を含むビ ーズから分離する工程、あるいは生存率および／または増殖のレベルの程度が異 なる細胞を含むビーズを分離する工程を行う。次いで、生細胞を大規模に培養し 増殖させる工程がその後に続き、さらに、次いで、増殖した細胞をいくつかの有 用な特徴に関して試験および／またはスクリーニングする工程が続いてもよい。 最後に大規模培養を行ってもよい。 例えば、細胞は真菌または微生物の胞子であってもよい。本発明方法は、特に 、変異原に曝露された後であって、次いで行われる抗生物質のごとき細胞生産物 の分泌のような有用性に関するスクリーニングの前の生細胞のスクリーニングに 適する。 好ましくは、単一細胞を各ビーズに封入する。 ポリマービーズ中への単一細胞の封入法は知られている。適当には、ポリマー ビーズはアルギン酸ポリマーのビーズ、特にアルギン酸カルシウムのビーズであ る。１の適当な封入法は、細胞を希釈され（例えば１〜５％、適当には約２〜３ ％）、好ましくは滅菌されたアルギン酸ナトリウム溶液中に懸濁し、次いで、こ の懸濁液を希釈され（例えば、０.０５Ｍ〜１Ｍ、適当には約１Ｍ）、好ましく は、滅菌された塩化カルシウム溶液と混合するものである。適当には、細胞懸濁 液を滅菌塩化カルシウム溶液に、例えば注射針を用いて滴下することにより混合 を行い、アルギン酸カルシウムポリマーが沈降ビーズとなるようにする。最初の 細胞懸濁濃度に基づいて適当な希釈率を選択することにより、滴下工程で得られ た各液滴の体積が、平均して多くとも１個の生細胞を含むような体積とし、この ようにして製造された各ビーズが多くとも１個の生細胞を含むようにする。適当 なビーズ直径は３ｍｍ±１ｍｍ、例えば、約３ｍｍの直径である。したがって、 適当な細胞希釈率は、１Ｌあたり１〜４ｘ１０⁴個、例えば１Ｌあたり２.５ｘ１ ０⁴個である。 さらに塩化カルシウム溶液に浸漬、例えば、ビーズが形成された溶液中にその まま浸漬すること、および／または、より高濃度、例えば、０.５〜１.５Ｍ、適 当には１.０Ｍの塩化カルシウム溶液に浸漬することにより、ビーズを固化させ ることができる。さらに増殖が起こるように、あるいはビーズ中にバイオマスを 閉じ込めておくために、より高濃度のアルギン酸溶液を用いてビーズを調製して もよい。次いで、適当には溶解しているカルシウムが実質的になくなるまでビー ズを水洗する。所望により、例えばさらにアルギン酸を沈着させることにより、 ビーズを被覆してもよい。 かかるビーズは多孔性であり、便利には、増殖を支持する培地中にあるビーズ 中の細胞のインキュベーションを、対象とする細胞に適する培地にビーズを懸濁 し、当業者に明らかな温度、圧力、通気等の適当なインキュベーション条件に置 くことにより行うことができる。強固なビーズを得るためには、カルシウムを捕 捉ないしはカルシウム交換する化合物またはイオン、例えば、クエン酸カリウム もしくはナトリウムを含まない培地を用いるのが望ましい。 適当には、培地は、ビーズ中の細胞の増殖を促進することがわかっている培地 のごとき、希釈された一定の培地である。適当な増殖を支持する培地は、窒素源 として酵母エキスを含有する２％ラクトースを主成分とする培地、および基本的 窒素溶液、例えば、炭素源として澱粉のかわりにラクトースを用いるクエク（Ku ek）,アプライド・マイクロバイアル・バイオテクノロジー（Appl.Microbial Bi otechnol.）（１９９１年）,第３５巻,４６６〜４７０頁に記載された培地に由 来する培地である。もう１つの適当な培地は、Ｌ−アスパラギン、デキストリン 、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＭｇＳＯ₄および微量元素を含有する培地である。他の適当な培 地は窯業者に明らかであろう。増殖のための時間は、細胞に関する 知識から当業者に明らかであるか、あるいは実験的に、例えば、下記の一連の物 理学的試験により容易に決定することができる。 通常は、この段階に終わりに、ビーズの中には、全く空のビーズあるいは死細 胞のみを含むビーズ、および１個またはそれ以上の生細胞を含むビーズ（死細胞 も含んでいる）が存在するであろう。通常は、１個またはそれ以上の生細胞を含 むビーズが最も興味深いものであり、しばしば生細胞は実質的な細胞の生育およ び増殖の証拠となる。 増殖した生細胞を含むビーズ中のバイオマスの割合が大きい結果として、死細 胞のみを含むビーズは、その物理学的特性が増殖した生細胞を含むビーズとは異 なる。また、増殖した生細胞は、その生存率または増殖のレベルにおいて異なり 、このことにより、生細胞を含んでいるビーズ間におけるバイオマスの異なる割 合または分配が異なる。これらの相違は異なる物理学的特性においても明らかで ある。かかる物理的に異なった特性は試験において本質的に検出可能でありうる か、あるいは試験前に試験対象の物理的特徴を増強するためのある種の工程、例 えばビーズを化学染色等に付する必要があるかまたはそうすることが望ましいこ ともある。 ビーズの物理的特徴の相違は、ビーズに近接した部分、例えば、ビーズが懸濁 されている培地の物理特性の相違を生じる。 物理的特徴の相違は、目に見える特徴であるか、肉眼または拡大することによ り検知できるものであるか、あるいは適当にプログラムされたイメージプロセッ シング装置に接続されたビデオカメラで検知されうるものである。相違は、光透 過度、屈折率、色、偏光等のごとき光学的特性における相違であってもよい。相 違は、電気伝導率、電気容量、誘電率、マイクロ波、超音波または他の放射線の 透過性等のごとき他の物理的特徴であってもよい。ビーズに近接した部分の物理 的特徴の相違は、例えば、イオン濃度、ｐＨ等の相違であってもよく、ビーズが 懸濁されている周囲の培地の相違であってもよい。 標識、例えば、蛍光または放射線標識された成分を含有する増殖培地を使用す ることにより培養期間中に細胞に物理的特徴を導入し、次いで、標識の特徴につ いてビーズを試験することができる。 かかる特徴に関して非侵入的にビーズまたはその近接部分を試験する方法は知 られており、あるいは当業者に明らかである。一般的には、自動化しうる試験方 法が手動方法よりも好ましい。 さらなる工程または分離工程において、ビーズを手動で分離することができ、 より好ましくは、自動で分離することができる。分離後、所望によりさらなるイ ンキュベーション工程、例えば、生きたバイオマスの量を増加させるためのイン キュベーション工程を行ってもよい。 生細胞を培養し増殖させるさらなる工程において、例えば、マイクロタイター ウェル中で、上記の適当な培地中でビーズをインキュベーションすることができ る。該適当な培地は、さらに、ポリマービーズ材料のための可溶化剤、例えば、 アルギン酸カルシウムビーズの場合には、カザミノ酸溶液、クエン酸三ナトリウ ム、またはリン酸等のごときカルシウム隔離剤を含有していてもよい。ビーズの 可溶化によりバイオモマスへの十分な酸素の移動が可能になり、その結果、増殖 がビーズ中で継続し、最終的にはビーズから漏出する。便利には、生細胞を含ん でいる各ビーズを、例えばマイクロタイターウェル中で別個に培養し、例えば、 突然変異を用いる細胞系の開発の分野において、次いで行う有用性に関するスク リーニングのために個々の変異細胞を別々に培養できるようにする。 特に、本発明方法は、上記ビーズ中に細胞を封入することにより機械的装置に よりビーズを物理的に取り扱い分離することができ、その結果、該方法が自動化 され迅速なものとなりうる。 さらに本発明は、上記方法を実施することのできる装置を提供する。 したがって、 粒子または粒子に近接した部分の物理的特徴に基づいて非侵入的かつ物理的に 検出を行い、個々の粒子をクラス分けするのに適した検出手段に粒子を提供する ための手段； 該クラスの１つに属する粒子を別のクラスに属する粒子から物理的に分離する のに適した粒子配向手段、および； 該検出手段の出力に応じて粒子配向手段をコントロールするのに適したコント ロール手段 からなる、物理的に識別可能な粒子を分離するための装置が提供される。 適当には、装置において、粒子は流体の流れ中を検出手段まで輸送および／ま たは提供される。それゆえ、適当には、装置はさらにかかる流れを提供するため の手段、例えば、流体中に粒子を懸濁するための手段およびこの懸濁液を流すた めの手段からなる。かかる懸濁液は、上記の本発明方法において用いられる粒子 、特にポリマービーズを便利に取り扱うための担体を提供する。 上記インキュベーション工程から得られるビーズは、細胞を含まないかまたは 死細胞のみを含むこと、あるいは増殖した生細胞（１個またはそれ以上の死細胞 を含む可能性もある）を有することにより異なる。かかるビーズは上記の物理的 特徴において異なっていてもよい。 流体中に粒子を懸濁するための手段は、適当には、流体中の粒子懸濁液を入れ る容器からなる。粒子が上記ビーズであれば、適当には、流体は水または増殖を 支持する培地からなる。懸濁液容器はインキュベーション容器として作動するも のであってもよく、あるいは装置がインキュベーション後に粒子が導入される別 々の懸濁液容器からなっていてもよい。好ましくは、粒子の懸濁を維持するよう に流体を懸濁する。 検出手段は、ビーズ、粒子自身または隣接する懸濁流体に関する、上で説明し たようないくつかの適当な物理特性に応答する既知の検出手段からなっていても よい。 粒子の検出およびそのクラス分けを、粒子を検出し、かつ識別する単一の検出 ／識別装置により行ってもよく、あるいは粒子を検出し、次いで、個々に識別す る装置により行ってもよい。 検出手段は、本質的に粒子のクラスを識別できる手段であってもよく、あるい は、例えばコンピューターを用いてキャリブレーションまたはプログラミングし た後、そのようにすることのできる手段であってもよい。かかる手段は、例えば 、粒子をモニターし、ビデオのイメージを分析し粒子を識別するためのイメージ プ ロセッシング装置と共働するビデオカメラからなっていてもよい。さらに、最適 な流速および粒子の分離が達成されるように、かかるキャリブレーションまたは プログラミングが、粒子を検出手段に提供するための手段と連動していてもよい 。このコントロールは、その操作パラメーターの範囲内で、装置のオペレーター により、個々の目的のために個別にセットアップされてもよい。 粒子が光源と検出器の間を通過する場合の光透過度または屈折率により粒子を 検出するように設置された、あるいは光が検出器の所で屈折しうる位置に設置さ れた光検知器を伴う光源のごとき既知の光学的装置、もしくは粒子が視界に入っ た際に粒子を観察するビデオ顕微鏡カメラ、または粒子の存在を検出し粒子の光 学的特徴に基づいて粒子のクラスを識別できる光学的検出器からなる光学的な検 出手段が適当である。その間を粒子が通過した際の光透過度の変化に感応する光 検出器を対向面に設置した光源が適当である。典型的には、かかる光源は、可視 領域のスペクトルの光を放射しうるものであり、検出器はかかる放射に感応しう るものである。一般的には、増殖した生細胞のバイオマスを含むビーズは、細胞 を含まないビーズまたは生細胞を含まないビーズよりも光学的に透過度が低い。 粒子が上記ビーズである場合、検出手段により識別される２つのクラスは：細 胞を含まないかまたは死細胞のみを含むビーズ；および生きた増殖細胞を含むビ ーズである。識別されうる他の２つのクラスは、その生存率の程度またはその増 殖のレベルが異なる生細胞を含むビーズである。例えば、ビーズ中のバイオマス の不存在、存在、量または分配に基づいて、かかるクラスを識別することができ る。 １の具体例において、適当には、粒子を検出手段に提供するための方法は、粒 子懸濁液を１つまたはそれ以上の流れに分流させる手段であって、粒子を該流れ 中に一列に配列させ、流れを検出手段の近傍に配向させる手段からなる。 各粒子が一列に配列している流れに懸濁液を分流させるための手段は、適当に は、各開口端が流体中につかっており、内径が粒子直径よりもわずかに大きい、 すなわち、粒子直径に２倍より小、適当には粒子直径の１.５倍よりも小である 内径を有する１本またはそれ以上の管からなる。流れ管の開口端は、例えば、懸 濁液またはビーズが撹拌されている場合には懸濁液容器中のある位置にあっても よく、あるいは懸濁液容器中を移動可能であってもよい。知られた方法、例えば 、懸濁液を置換して流れ管中に送るようにさらなる流体を懸濁液容器に導入する ことにより、懸濁液をかかる流れ管中に流してもよく、あるいは陰圧（吸引）を 装置にかけてもよい。置換による方法が好ましい。流れ管中への懸濁液の流速が 実質的に一定であることを確認するのが望ましい。流れ管がなめらかにカーブし て粒子流れが流れ管における鋭角部分により妨げられないようにするのが望まし い。かかる流れ管中で、一定の流速の粒子の一連の流れ、および検出手段の動作 を容易にする粒子の一定の間隔が達成される。 上記のごとく、流れが流れ管中にある場合、検出手段は流れ管中にあってもよ く、あるいは管壁または管壁外にあってもよい。また、流れ管が懸濁液流れを検 出チャンバー、すなわち、検出手段の入ったチャンバー中に配向されるものであ ってもよい。便利には、検出手段が光学的検出手段である場合、あるいは放射の 透過性に依存する手段である場合、かかる手段は管壁外にあり、光または他の放 射線に対して透明な管壁の部位に接していてもよく、あるいは検出チャンバー内 にあってもよい。検出手段が電気的性質に依存する場合には、かかる手段は、管 内または管壁、もしくは管壁外、あるいは検出チャンバー内に設置された電気的 プローブからなっていてもよい。 流れ管中の粒子が検出され、粒子の属するクラスに識別された場合、通常は電 気信号である検出手段からの出力を用いて粒子配向手段を作動させて選択された クラスに基づいて粒子を物理的に分離することができる。流れが流れ管中にある 場合に用いることのできる種々の粒子配向手段は当業者に明らかである。 検出および識別手段の下流の好ましい粒子配向手段において、流れ管の開口端 が終了し、この開口端は粒子受けの導入口に対面し、粒子は流れ管の開口端から 粒子受けの導入口へと移動する。一方から他方への粒子の自由な通過を許可ある いは阻止するために、流れ管の開口端および／または導入口に流れ調節手段が設 置される。 例えば、流れ調節手段の１の具体例において、粒子受けの導入口および／また は流れ管の開口端が、互いに対面する位置関係にあったりなかったりするように 相対的に移動できるようになっていてもよく、その結果、それらが対面した位置 関係にある場合には粒子は流れ管から粒子受けへと通過するが、それらが対面し た位置関係にない場合には通過できない。また、流れ管の開口端および粒子受け 導入口が互いに固定された位置関係にあってもよく、さらに、それらの間を移動 可能なシャッターまたは迂回器が存在していてもよく、その結果、流れ管開口端 から粒子受け導入口への粒子の直接の通過を可能にするかまたは妨げることがで きる。他の形態のかかる流れ調節手段は当業者に明らかである。 適当には、例えば、対象細胞（例えば、生細胞）を含む上記ビーズの場合には 、対象粒子はこの様式で粒子受け中に入る。この好ましい形態の粒子配向手段は 、特に、付随して流れている流体から粒子が実質的に分離されるという利点を提 供する。 上記流れ管および粒子受けを有する好ましい形態の装置において、流れ管の開 口端および粒子受け導入口は、両方とも正の気圧の領域、例えば、それらを取り 囲む多岐管中の増大した気圧の領域にあり、粒子受けはより低い気圧の領域、例 えば、周囲の大気に対して開口した出口に連絡している。このようにして、粒子 受け導入口とその出口との間の気圧差は、粒子が導入口に入るのを促進し、粒子 を出口へと配向させることを助ける。便利なことに、周囲の多岐管は拒絶された 粒子を集めるのにも役立ち得る。 好ましい形態のかかる粒子受けは、固定された流れ管に対して移動可能な受け 、例えば、柔軟性のある、旋回する、蝶番式に動く、あるいは回転可能な管の形 状の受けである。 例えば、別の構成において、流れ管は、Ｙ字型に分岐していてもよく、あるい は、柄の部分に検出手段と選択された粒子を選択された枝へと流す分流手段を備 えたフォーク型の配置の管であって、懸濁液の流れが柄を通りフォークの先の方 へと流れる管であってもよい。 例えば、粒子が流れ管を下流へと進む場合、粒子を枝のうちの１本または別の 枝に配向させるための水平方向に適用される流体のパルスまたはゲート機構によ り、さらに所望により一定の流れによりまたはさらなる流体の添加により、流体 をフォークの１本の枝または別の枝へと迂回させる。例えば、もう１つの方法に おいて、一方のラインの流れを閉じてもう一方のラインを開ける慣用的なタイプ の２路バルブ配置により流体流れを迂回させてもよい。例えば、もう１つの方法 において、流体流れを可動スライドまたは回転可能な輪の上の異なる別個のコン パートメント中に迂回させてもよく、例えば、適当なフォークの枝に配向させて 集めることにより、そこからコンパートメント中の対象粒子を取り出してもよい 。 好ましくは、粒子受けは、受けた粒子を直接コレクターに配向させるための粒 子配向器に連結している。粒子受けが上記のような管の形状である場合、便利に は、粒子配向器は、受けの管につながる下流方向の伸長部分からなる。例えば、 伸長部分に沿った正の気圧の相違（例えば、流れ管の開口端および粒子受けを取 り囲む多岐管に適用される、伸長部分の開口端に対して正の気圧）により、管に 沿って粒子が配向される。多岐管と伸長部分の開口端（周囲の大気圧）との間の あまりに大きい気圧差を避けるのが望ましい。なぜなら、粒子はかかる圧力を伴 って現れ、その結果損傷を受けるか、または収集が困難になるからである。便利 には、粒子受けの開口端の下流および伸長部分の開口端の上流の伸長部分の領域 を、低真空の多岐管により取り囲んで過剰の流体を粒子から除去し、粒子の移動 に対する空気の流れの影響を減じ、粒子を減速するようにしてもよい。次いで、 伸長部分の開口端から現れる粒子を収集することができる。 上記粒子配向手段のそれぞれにおいて、粒子配向手段の機械的操作は検出手段 とリンクしていてもよく、その結果、対象粒子の配向が粒子の検出および粒子の クラスの識別に応答して行われる。適当には、検出後の遅延時間が計算されてか ら粒子配向手段の操作が行われ、その結果、流れ管中の流速に応じて粒子は下流 の粒子配向手段の近傍に移動する。流れ管および／または粒子受けを対面するよ うにあるいは対面しないように移動させる適当な機械的手段、またはシャッター または迂回器を作動させる適当な機械的手段は、当業者に明らかであり、例えば 、圧縮空気、電磁気学的ソレノイド、または別の形態の機械的連結である。 さらなる具体例において、適当には、例えば上記ビーズのような粒子を検出手 段に提供する手段は、粒子を把握するプローブまたは吸引プローブの形態の１個 またはそれ以上の検出プローブからなる。例えば、吸引プローブは、粒子直径よ りも小さい寸法の１個またはそれ以上の口を有する管状プローブからなり、各吸 引プローブは粒子近傍に存在することができ、吸引プローブの口へと粒子が吸引 され、少なくとも１個の粒子が各口に止まり実質的に口を綴じた恰好になるよう に大気圧以下の圧力が各吸引プローブに適用される。次いで、保持された粒子が 検出器に提供される。 適当には、各吸引プローブは、粒子直径よりも小さい内径を有する管であって 、その開口端が口を形成し、もう一方の開口端には陰圧が供給される。 便利には、プローブ自体が粒子近傍へと移動してもよく、口へと粒子を吸引す るように減圧状態が供給され、生じた圧力の変化により、口が粒子により閉じら れ、コントロールシステムにより感知される。 粒子近傍への吸引プローブの移動を多くの方法で行うことができる。１の具体 例において、懸濁液容器中の粒子懸濁液中にプローブを挿入するだけのものであ ってもよい。別の具体例において、上記と同様に、粒子懸濁液を１つまたはそれ 以上の流れに分流し、プローブを流れ中に挿入してもよい。かかる流れを、例え ば、１つまたはそれ以上の流路に懸濁液を流すことにより作り出してもよく、該 流路は、プローブ用アクセス穴を有するテーブルまたは流れ管である開いた流路 であってよい。 粒子がプローブに保持されると、プローブは検出手段の近傍へと移動され、各 粒子は検出手段に提供される。１個またはそれ以上の検出手段を用いて連続的に 各粒子に提供してもよく、あるいは十分な数の検出手段を用いて各粒子を同時に 検出手段に提供してもよい。上記検出手段を使用することができる。 口において粒子が検出され、粒子の属するクラスに識別されたら、通常は電気 信号である検出手段からの出力を用いて粒子配向手段を作動させて選択されたク ラスに基づき粒子を物理的に分離することができる。 便利には、粒子配向手段は、空気、水または試薬のごとき流体を口に供給して 粒子を保持している吸引を終了させることができる手段からなっていてもよい。 次いで、粒子は簡単に口から落ち、収集されることができる。 流路がテーブルの形態である場合、適当には、懸濁液を板に沿って流して粒子 の２次元的配列を形成してもよい。適当には、検出手段は、ビデオカメラおよび プログラムされた映像プロセッシング装置からなっていてもよく、ビデオカメラ は、所望の特徴を有する粒子、例えば、生細胞のバイオマスを含むビーズ、この ような性質を有していないビーズ、例えば、細胞を含んでいないかまたは死細胞 のみを含んでいるビーズを識別することができる。映像プロセッシング装置が、 粒子配向プローブをコントロールするコントロール装置とリンクしていてもよく 、該粒子配向プローブは、個々の選択粒子に向けられ、次いで、粒子の配列から 粒子を取り出し、それらを収集するものであってよい。かかるプローブは、上記 のような粒子を把握または吸引するプローブであってもよく、配列から粒子が拾 われ、吸引によりプローブに保持され、次いで、吸引をやめることにより解放さ れる。あるいはまた、かかるプローブが吹き出しプローブであって、空気のごと き流体のジェットまたはカーテンを粒子に向けて噴出し、粒子を配列から吹き飛 ばして収集される場所に置くものであってもよい。 対象でない粒子、例えば、細胞を含まないビーズまたは生細胞を含まないビー ズである場合には、上記装置から収集された粒子は簡単に処分され、また、対象 粒子である場合には、さらなる試験のために取っておかれるか、またはさらなる 適当な処理に付されることができる。生細胞を含むビーズ、例えば、変異処理後 に得られたビーズの場合には、慣用的には、これらはさらなる培養および増殖に 付されるであろう。細胞スクリーニング工程において、これらのビーズを、例え ば、マイクロタイタープレートのウェル中に集めることにより有用性のスクリー ニングのために培養してもよい。本発明装置においては、マイクロタイターウェ ル中のビーズの収集を、装置から、例えば、粒子配向装置からまたはプローブか らウェル中へとビーズを配向させ、次いで、配向装置、プローブおよびプレート に相対的なＸ−Ｙ移動を行わせ、プレートが一杯になるまで次のビーズを隣のウ ェルに落とすようにすることにより行うことができる。次いで、新しいウェルに 取り替えられ、ウェルが積み上げられるか、または／そして細胞増殖培地が入れ ら れる。このＸ−Ｙ移動、ウェル取り替えおよび積み上げ工程を、上記コントロー ル手段、例えば、コンピューターにリンクされた従来から知られた自動的手段に より行うことができる。 次いで、各ウェル中での細胞の増殖を、本質的には光度測定法による各ウェル 中のバイオマス量を分析のごとき慣用的手段によりモニターすることができる。 その後、やはり本質的には適当な分析試薬と生成物との反応のごとき慣用的な手 段により細胞増殖中の有用生成物の生産を分析することができる。 驚くべきことに、上記装置が自動細胞スクリーニングの速度を実質的に増大さ せうることが見いだされた。 したがって、さらに本発明は、異なる属性を有する細胞、例えば、生細胞と死 細胞、あるいは異なる程度の生存率または増殖レベルを有する細胞を識別する方 法であって、 培養物からの１個またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し； ビーズ内の生細胞の増殖にとり十分な時間、ビーズ内の細胞を増殖を支持する 培地中でインキュベーションし； 次いで、上記装置を用いて、選択された属性を有する増殖した生細胞のバイオ マスを含むビーズを細胞を含まないビーズまたは選択された属性を有しない細胞 を含むビーズから分離することからなる方法を提供する。 本発明装置および方法を、以下の図面を参照し、例のみを用いて説明する。 図１は、図式的に示した本発明装置全体の配置である。 図２は、図１の装置の別の構成の多岐管を示す。 図３は、図１の装置に用いる別の形態の粒子配向手段を示す。 図４は、さらに別の形態の粒子配向手段を示す。 図５は、さらに別の形態の粒子配向手段を示す。 図６は、さらに別の形態の粒子配向手段を示す。 １.ポリマービーズ中への細胞の封入 例えば、遠紫外光、ＮＴＧ、またはガンマ線照射に曝露することにより、一定 濃度のペニシリウム・クリソゲヌムまたはストレプトミセス・クラブリゲルスの 胞子を変異させる。次いで、一定体積の一定濃度の変異した胞子懸濁液を２.５ 〜３％アルギン酸ナトリウム滅菌溶液に添加する。胞子がアルギン酸ナトリウム 溶液中に均等に分散するまで、合わせた溶液をゆるやかに混合する。変異した胞 子の濃度および生存率を知ることにより、一定の体積のアルギン酸ナトリウムに 十分な胞子を添加することができ、その結果、最適数のアルギン酸カルシウムビ ーズが１個の生きた胞子を含むようになる。 蠕動ポンブを用いて、１リットルのアルギン酸ナトリウム／胞子懸濁液をシリ コンチューブを通して、注射針から、醗酵容器中の２.５リットルの０.１Ｍ塩化 カルシウム滅菌溶液中に送り出す。アルギン酸ナトリウム／胞子懸濁液が注射針 を通ると、液滴が形成され、次いで、塩化カルシウムと接触して硬化してアルギ ン酸カルシウムビーズになる。マグネチックスターラーおよび従輪を用いて塩化 カルシウム溶液をゆるやかに撹拌する。すべてのビーズが形成されたら、それら をさらに１時間放置して硬化工程を完了し、次いで、塩化カルシウム溶液を醗酵 装置から排出する。 この時点において、２.５リットルの１.０Ｍ塩化カルシウム溶液を添加してさ らに１時間ゆるやかに撹拌することにより、ビーズをさらに硬化させることがで きる。再度塩化カルシウム溶液を醗酵装置から排出する。適当には、ビーズを硬 化させ、塩化カルシウムを排出してからビーズを洗浄する。２リットルの滅菌脱 イオン水をポンプで醗酵装置に入れる。ビーズを２０分間撹拌し、次いで、水を 排出する。洗浄工程を５回繰り返すか、または洗液中のカルシウムが測定されな くなるまで洗浄工程を繰り返す。 最後の洗液を排出した後、２.５リットルの滅菌増殖培地をポンプで醗酵容器 中に入れる。１分間に０.５容器体積の流量で滅菌空気を送りながら、マグネチ ックスターラーおよび従輪を用いてビーズをゆるやかに撹拌する。胞子が発芽し 、ビーズ中での菌糸の成長が見えるまで、適当な温度、例えば、２６℃でビーズ を インキュベーションする。醗酵装置中のビーズが、増殖中心を持たないか、また は１個もしくはそれ以上の増殖中心を有するかを見ることが可能である。 適当な増殖培地の例は、培地１および培地２である。 培地１ リン酸水素二カリウム ０.０７ｇ リン酸二水素カリウム ０.１３ｇ 硫酸マグネシウム（７水和物） ０.２０ｇ 硫酸ナトリウム（１０水和物） ０.２０ｇ 硫酸鉄（II）（７水和物） ０.０２ｇ 硫酸マンガン（II） ０.０１ｇ 硫酸亜鉛（７水和物） ０.０２ｇ 硫酸銅（II）（５水和物） ０.０２ｇ Ｌ−グルタミン酸−ナトリウム塩 ０.５５ｇ 酵母エキス ０.５ｇ ラクトースＢＰ ２０.０ｇ 塩化カルシウム ３.６８ｇ 水 添加して１.０リットルとする これらの成分を撹拌しながら脱イオン蒸留水に添加する。ｐＨを５.５に調節 すべきである。脱イオン蒸留水で混合物を所定の体積とする。必要ならば、適当 な部分試料を調製する。１２１℃で１５分間オートクレーブすることにより培地 を滅菌すべきである。 培地２ Ｌ−アスパラキナーゼ １.０ｇ デキストリン ５.０ｇ リン酸水素二カリウム ０.５ｇ 硫酸マグネシウム ０.２ｇ Ｍ５Ｄ微量元素 １.０ｍｌ 水 添加して１.０リットルとする これらの成分を撹拌しなから脱イオン蒸留水に添加する。ｐＨを５.５に調節 すべきである。脱イオン蒸留水で混合物を所定の体積とする。必要ならば、適当 な部分試料を調製する。１２１℃で１５分間オートクレーブすることにより培地 を滅菌すべきである。 ２.装置の説明 図１を参照すると、本発明装置の全体が示されるが、主な特徴を明確にし強調 するために、スケールは正確でない。 装置は、水または増殖培地であってよい懸濁用流体（１０３）中の直径約３ｍ ｍのポリマービーズ（１０２）の懸濁液の入った約５リットル容の懸濁液容器（ １０１）からなる。ビーズ（１０２）は細胞を含まないかまたは死細胞を含むも の（１０２Ａ）であるか、あるいは、生細胞のバイオマスを含むもの（１０２Ｂ ）である。ビーズは上記１で説明したように増殖培地中に調製され、所望により 水洗工程に付されている。１リットルあたり約５００００〜８００００個のビー ズ濃度が典型的である。 流れ管（１０４）の開口端（１０４Ａ）の運動により懸濁液を撹拌することに より、ビーズ（１０２Ａ、１０２Ｂ）を懸濁液中に保つ。流れ管（１０４）の開 口端（１０４Ａ）の運動は、モーターおよび管に作用する機械的連結（１０５） によるものであってよく、例えば、管は、柔軟性のあるフイゴのシール（１０７ ） を介して容器（１０１）の蓋（１０６）を貫通していてもよい。 滅菌水の流れは、供給部（１０８）を通して導入され、その流量は調節器（１ ０９）によりコントロールされる。容器（１０１）に入る前に、水はフィルター （１１０）により滅菌濾過される。容器（１０１）中への水の導入により、ビー ズ懸濁液が流れ管（１０４）へと置換される。管内径はビーズ（１０２Ａ）１０ ２Ｂ）の直径よりもわずかに大きく、典型的には、内径３.５〜４.０ｍｍである 。容器（１０１）内において、管（１０４）はステンレス鋼製であり、容器（１ ０１）外部において、流れの観察ができるような透明なＰＶＣ製のなめらかに曲 がっている流れ管（１０４Ｂ）に接続されている。流入流速は１００〜７５０ｍ ｌ／分の範囲が典型的に用いられる。 流れ管（１０４Ｂ）は、多岐管（１１３）の上部（１１３Ａ）に設置された光 源（１１１）と光検出器（１１２）との間を通過する。光源（１１１）と光検出 器（１１２）との間において、流れ管（１０４Ｂ）は光学的に透明である。ビー ズ（１０２）の流れが光源（１１１）と光検出器（１１２）との間を通過する際 、検出器（１１２）からの電気信号に変化が生じ、ビーズ（１０２）が生細胞の 増殖による高比率のバイオマスを含む場合、その信号は、ビーズ（１０２Ａ）が 生細胞を含まないかまたは細胞を全く含まない場合に比べて変化する。検出器（ １１２）の出力は調節器（１１４）によりモニターされる。典型的には、流れ管 （１０４）中において約１７〜１３０ｃｍ／秒の流速が用いられる。流れ管（１ ０４）中のビーズ（１０２Ａ、１０２Ｂ）の間隔は、典型的には、０.５〜４.０ ｃｍである。流れ管（１０４Ａ）は多岐管（１１３）中の開口端（１０４Ｃ）に おいて終了する。調節器（１１７）のコントロール下のフィルター（１１６）に より濾過された滅菌空気を供給する空気導入口（１１５）を通して与えられる、 典型的には１〜２ｐｓｉのわずかに陽圧の内圧下に多岐管（１１３）が維持され る。過剰に空気は流出バルブ（１１８）を通して多岐管（１１３）から流出する 。 多岐管（１１３）内には、内径約４.０ｍｍの管状の粒子受け（１１９）があ る。これが伸長して配向管（１２０）を形成し、粒子受け（１１９）と配向管（ １ ２０）との間の連結は（１２１）において回転可能であり、その結果、粒子受け （１１９）が２種の終端位置（１１９）および（１１９Ａ）を占める。（１１９ ）の位置において、粒子受けの開口端は流れ管（１０４）の開口端（１０４Ｃ） に対面し、すなわち対面した位置関係にあり、一方、粒子受け（１１９）の開口 端（１１９Ａ）はこの位置関係にない。 それゆえ、操作にあたり、充填ビーズ（１０２Ｂ）が光源（１１１）と検出器 （１１２）との間を通過すると、モニターされた出力は、粒子受け（１１９）の 調節器（１２２）を作動させるために用いられる。該調節器（１２２）は、粒子 受け（１１９）を終端位置（１１９）に移動させるために粒子受け（１１９）に 機械的に連結しており、その結果、ビーズ（１０２Ｂ）は、流れ管（１０４）の 開口端（１０４Ｃ）から落下した場合に、粒子受け（１１９）の開口端中に落下 することができる。ビーズ（１０２Ｂ）が光源（１１１）と検出器（１１２）と の間を通過してからの電気的に計算された時間間隔をおいてこの動作が行われ、 その結果、ビーズ（１０２Ｂ）が流れ管（１０４）の開口端（１０４Ｃ）に到達 する直前に、粒子受け（１１９）の開口端が位置（１１９）に来る。粒子受け（ １１９）は、位置（１１９Ａ）に戻る前に、ビーズ（１０２Ｂ）を受け取るに十 分な時間位置（１１９）に保持される。典型的には、配向管（１１９）の調節器 （１２２）は、典型的には、圧縮空気ピストン（示さず）をコントロールするた めの電気で作動するソレノイド（示さず）である。時間の計算は、流れ管（１０ ４）中のビース（１０２Ａ）（１０２Ｂ）の速度および検出器（１１２）と流れ 管（１０４）の開口端（１０４Ｃ）との距離に基づく。特別には、調節器（１０ ９）を通って入って来る流速および管（１０４）の内径から、流れ管（１０４） 中のビーズ（１０２Ａ、１０２Ｂ）の速度を計算することができる。 空のビーズまたは生細胞を含まないビーズ（１０２Ａ）が光源（１１１）と検 出器（１１２）との間を通過すると、粒子受け（１１９）は位置（１１９Ａ）に 保持されるかまたは戻され、その結果、かかるビーズは多岐管（１１３）を通っ て、多岐管（１１３）底部のコレクター（１２４）中の過剰の培地（１２３）中 に集められ、そこからビーズがドレイン（１２５）を通って処分される。 ビーズ（１０２Ｂ）が粒子受け（１１９）に入った後、それらは多岐管中の正 の気圧によって柔軟性のある配向管（１２０）中へと送られる。配向管（１２０ ）の低い部分（１２０Ａ）は、多岐管（１２６）に入っているかまたは多岐管（ １２６）により取り囲まれている。調節器（１２８）によりコントロールされて いる減圧ライン（１２７）を通して典型的には１０ミリバールの減圧状態が多岐 管（１２６）によって与えられる。この減圧状態の適用は、ビーズ（１０２Ｂ） を減速し、かつ流体を除去してビーズ（１０２Ｂ）を乾燥させる。過剰の流体は 多岐管から容器（１２９）に集められ、そこから処分される。 配向管（１２０）の低い方の末端（１２０Ｂ）において、ビーズ（１０２Ｂ） が出現し、マイクロタイタープレート（１３０）のウェル（１３０）中に配列し て落下する。一般的に知られたタイプの調節および移動手段（示さず）によりマ イクロタイタープレート（１３１）が移動され、各ビーズ（１０２Ｂ）が低い方 の末端（１２０Ｂ）から落下すると空のウェル（１３０）がそれを受け取る。多 岐管（１１３）中の正の気圧および多岐管（１２６）に適用される減圧状態を調 節することにより、（１２０Ｂ）に出現する際のビーズ（１０２Ｂ）の速度を十 分に低下させて損傷を回避することができる。空気ライン（１１５）により適用 される圧力、流出口（１１８）からの流出速度、ライン（１２７）により適用さ れる減圧状態、およびライン（１０８）からの水の流入をバランスさせてビーズ を図示した方向へ流して、１６Ｂにおいてビーズ（１０２Ｂ）が十分に遅い速度 で出てウェル（１３０）に収集されるようにすることが重要である。装置のセッ トアップ中において、このことを容易に達成することができる。 プレート（１３１）の自動操作は、特別には、調節器（１１４）および（１２ ２）にリンクしており、充填ビーズ（１０２Ｂ）が検出器（１１２）により検出 された場合に、調節器（１１４）は粒子受け（１１９）を採取位置に向け、空の ウェル（１３０）がビーズ（１０２Ｂ）を受け取る準備をする。さらに調節器（ １１４）はプレート（１３１）のドライブ手段（示さず）にも指令を出して、ビ ーズ（１０２Ｂ）が検出器（１１２）近傍から受け取りウェル（１３０）に至る までの一定時間により計算した時間間隔後に、プレート（１３１）のドライブ 手段を動かす。その結果、ビーズ（１０２Ｂ）がウェル（１３０）中に来るとす ぐに、それが入ったウェルが配向管（１２０）の開口端（１２０Ｂ）から離れ、 新たなウェル（１３０）が開口端（１２０Ａ）の下に移動して次の充填ビーズ（ １０２Ｂ）を受け取る。プレート（１３１）に必要なＸ−Ｙモーションを与える ドライブ手段は当該分野において知られている。便利には、Ｘ方向の動きを開口 端（１２０Ｂ）に与え、Ｙ方向の動きをプレート（１３１）に与える。 ビースが検出器（１１２）を通過してから調節器（１２２）を作動させるまで の時間間隔を計算できるような電気的調節手段および装置に対する他の調節機能 は当業者に知られており、それらはマイクロプロセッサー（図示せず）からなっ ていてもよい。また、かかる調節手段は調節器（１０９）（１１７）（１２２） および１２８）ならびにマイクロタイタープレート（１３１）のＸ−Ｙモーショ ンを作動させる。 ３.別の多岐管の構成 図２には、図１の装置の、多岐管および付属部品の別の、好ましい構成を図式 的に示す。図１と共通した部品は図１に対応して番号づけしてある。一般的には 、図に２に示す多岐管および部品は、図１に示す対応する部品と同様である。 図２を参照すると、図１と同様に、流れ管（１０４Ｂ）は光源（１１１）と光 検出器（１１２）との間を通るが、この領域では流れ管（１０４）は水平に配置 されていることが異なる。流れ管（１０４Ｂ）は水平に多岐管に入り、開口端で 終了する。 多岐管（１１３）内には、内径約４.０ｍｍの管状の粒子受け（１１９）があ る。これが伸長して配向管（１２０）を形成し、粒子受け（１１９）と配向管（ １２０）との間の連結は（１２１）において回転可能であり、その結果、粒子受 け（１１９）が２種の終端位置（１１９）および（１１９Ａ）を占める。（１１ ９）の位置において、粒子受けの開口端は流れ管（１０４）の開口端（１０４Ｃ ）に対面し、すなわち対面した位置関係にあり、一方、粒子受け（１１９）の開 口端（１１９Ａ）はこの位置関係にない。 それゆえ、操作にあたり、充填ビーズ（１０２Ｂ）が光源（１１１）と検出器 （１１２）との間を通過する際、モニターされた出力は、粒子受け（１１９）の 調節器（１２２）を作動させるために用いられる。該調節器（１２２）は、粒子 受け（１１９）を終端位置（１１９）に移動させるために機械的に連結しており 、その結果、ビーズ（１０２Ｂ）は、流れ管（１０４）の開口端（１０４Ｃ）と 粒子受け（１１９）との間の狭い隙間を越えて粒子受け（１１９）の開口端中に 入る。ビーズ（１０２Ｂ）が光源（１１１）と検出器（１１２）との間を通過し てからの電気的に計算された時間間隔をおいてこの動作が行われ、その結果、ビ ーズ（１０２Ｂ）が流れ管（１０４）の開口端（１０４Ｃ）に到達する直前に、 粒子受け（１１９）の開口端が位置（１１９）に来る。粒子受け（１１９）は、 位置（１１９Ａ）に戻る前に、ビーズ（１０２Ｂ）を受け取るに十分な時間、位 置（１１９）に保持される。典型的には、配向管（１１９）の調節器（１２２） は、典型的には、圧縮空気ピストン（示さず）をコントロールするための電気で 作動するソレノイド（示さず）である。時間の計算は、流れ管（１０４）中のビ ーズ（１０２Ａ）（１０２Ｂ）の速度および検出器（１１２）と流れ管（１０４ ）の開口端（１０４Ｃ）との距離に基づく。特別には、調節器（１０９）を通っ て入って来る流速および管（１０４）の内径から、流れ管（１０４）中のビーズ （１０２Ａ、１０２Ｂ）の速度を計算することができる。 空のビーズまたは生細胞を含まないビーズ（１０２Ａ）が光源（１１１）と検 出器（１１２）との間を通過する際には、粒子受け（１１９）は位置（１１９Ａ ）に保持されるかまたは戻され、その結果、かかるビーズは多岐管（１１３）を 通って、多岐管（１１３）底部のコレクター（１２４）中の過剰の培地（１２３ ）中に集められ、そこからビーズがドレイン（１２５）を通って処分される。 ４.別の粒子配向手段 図３に、フォーク状流れ管からなる別の３種の粒子配向手段を示す。本発明装 置において、それらを用いて粒子を分離することができる。 図３Ａを参照すると、図１の装置の流れ管（１０４Ｂ）は、枝（３０１）およ び（３０２）を有する「Ｙ字」のフォーク型の管に別れている。「Ｙ字」の柄は 光源（１１１）と検出器（１１２）との間を通っている。分枝のすぐ上流に、流 体注入装置（３０３）および（３０４）があり、それらは互いに流れ管（１０４ ）において対面しており、「Ｙ字」の平面内にある。検出器（１１２）が、生細 胞のバイオマスを含むビーズ（１０２Ｂ）の存在を検出した場合、ビーズ（１０ ２Ｂ）が注入装置（３０３）のわずかに下流に来るのに十分な時間が経過した後 、注入装置（３０３）を通して水のパルスが適用されてビーズ（１０２Ｂ）を枝 （３０１）中に配向する。逆に、同様の動作により、ビーズ（１０２Ａ）は、注 入装置（３０４）からのパルスにより枝（３０２）中へ配向される。これらのパ ルスを、図１の調節器（１２２）と類似の調節器（図示せず）により作動するポ ンプ（図示せず）により供給してもよい。 枝（３０１）が伸長して配向管（図示せず、しかし図１の（１２０）と類似） を形成していてもよく、例えば、周囲に設置した減圧多岐管（図示せず、しかし 図１の（１２６）と同様の配置）により過剰の流体が除去された後、ビーズ（１ ０２Ｂ）をマイクロタイタープレートへと導くものてあってもよい。さらに、空 気をビーズ（１０２Ａ、１０２Ｂ）間に導入して「Ｙ字」管から間隔をおいて出 るようにしてもよい。図１のドレイン（１２５）と類似の処理システム（図示せ ず）中にビーズ（１０２Ａ）を送るように枝（３０２）を配置してもよい。 図３Ｂを参照すると、図１の流れ管（１０４）は、筒状バルブチャンバー（３ ０５）からなる２流路バルブ中に到達している。該筒状バルブチャンバー（３０ ５）は、その内部に、チャンバー（３０５）内で回転可能な適合バルブプラグ（ ３０６）を有し、さらに、流れ管（１０４）をフォークの２本の出口管（３０８ ）および（３０９）のいずれかに連絡せしめるカットアウトチャンネル（３０７ ）有している。流れ管（１０４）は、光源（１１１）と検出器（１１２） との間を通る。動作において、図２Ａの装置の検出器と同様に、検出器（１１２ ）が生細胞のバイオマスを含むビーズ（１０２Ｂ）を検出した場合、バルブプラ グ（３０６）はビーズ（１０２Ｂ）を出口管（３０８）に配向させるように回転 する。逆に、同様の動作において、図３Ｂの斜線を付した位置に流路（３０７） が来る位置にプラグ（３０６）を回転させることにより、空のビーズ（１０２Ａ ）が出口管（３０９）に配向される。出口管（３０８）および（３０９）が配向 管中に伸長し、図３Ａと同様な様式でビーズを処分するようになっていてもよい 。 図３Ｃを参照すると、配置および一般的動作は図３Ｂのものと同様であるが、 ２流路バルブ（３０５〜３０９）の代わりに筒状チャンバー（３１０）が存在す る。該筒状チャンバー（３１０）の内部には、一定数のくぼみを周上に有する適 合筒状プラグ（３１１）があり、プラグの回転により、フォークの出口管（３１ ３）（３１４）に連絡しうる。検出器が、生細胞のバイオマスを含むビーズ（１ ０２Ｂ）を検出した場合、プラグ（３１１）は適当な時間経過後、ビーズ（１０ ２Ｂ）を捕獲するように回転し、次いで、ビーズを出口管（３１３）に導入する ようにさらに回転することができる。 逆に、生細胞を含まないビーズ（１０２Ａ）は出口管（３１４）中に導入され る。出口管（３１３）および（３１４）が配向管内に伸長して、図３Ａと同様の 様式でビーズを処分するものであってもよい。 さらに、適当には、流体の流れは妨げられないように、チャンバー（３０５） （３１０）は、チャンバー壁（３０５）（３１０）とそのプラグとの間に周に沿 ったギャップ（３１５）を有している。 ４.装置のもう１つの形態 図４を参照すると、図１に対応する部品にはその番号を付してある。上記１記 載のごとく調製された、直径約３ｍｍのポリマービーズであって、空もしくは生 細胞を含まないビーズ（１０２Ａ）、または増殖した生細胞のバイオマスを含む ビーズ（１０２Ｂ）のいずれかの懸濁液（４０２）を入れた懸濁液容器（４０１ ）からなる本発明装置を示す。 該装置は、減圧ライン（４０４）に接続された吸引プローブ（４０３）である 多くの粒子配向プローブを有し、各プローブ（４０３）は減圧調節バルブ（４０ ５）を有する。図４Ａに示すように、プローブ（４０３）を懸濁液中（４０２） に挿入すると、ビーズ（１０２Ａ）および（１０２Ｂ）はプローブ開口端（４０ ３）に吸引され、プローブが懸濁液（４０２）から離れた場合、吸引によりプロ ーブ開口端（４０３）に接した位置に保持される。 図４Ｂに示すように、光源（図示せず）および光検出器からなるセンサー（４ ０６）に各プローブ（４０３）を供する。ビーズは光源と光検出器との間に位置 する。ビーズ（１０２Ａ）は光透過性がビーズ（１０２Ｂ）とは異なり、このこ とにより検出器（図示せず）から異なる電気信号が得られる。この異なる信号を 用いて、ビーズが保持されている吸引プローブ（４０３）中への空気の導入をバ ルブ（４０５）を通してコントロールする。その結果、これらのビーズはプロー ブ（４０３）から落下し、一方、吸引プローブ（４０３）中で減圧が維持される と、ビーズ（１０２Ｂ）はその位置で保持され、所定の位置で保持される。 図４Ｃに示すように、ただ１個のビーズ（１０２Ｂ）を保持した吸引プローブ （４０３）を、収集タンク（４０７）（別法として、プローブを静止させておい てタンクを移動させてもよい）上の位置に移動させることができる。バルブ（４ ０５）を通してビーズ（１０２Ｂ）を保持しているプローブ（４０３）中に空気 が送られる。その結果、ビーズ（１０２Ｂ）は増殖培地（４０８）の入ったタン ク（４０７）中に落下する。 別法として、マイクロタイタープレート（図示せず）を用いてビーズ（１０２ Ｂ）を収集してもよい。かかるプレートをプローブ（４０３）の真下に置き、プ ローブ（４０３）およびプレートに相対的なＸ−Ｙモーションを与え、ビーズ（ １０２Ｂ）を保持しているプローブ中（４０３）に適当に空気を導入すると、ビ ーズ（１０２Ｂ）はそれぞれマイクロタイタープレートのウェル中に落下する。 図４Ｄに示す付加的なさらなる工程において、吸引プローブ（４０３）をタン ク（４０７）中に再挿入してもよく、各プローブ開口端に接続されている多岐管 （４０４）を通して減圧することによりビーズ（１０２Ｂ）が吸引される。図４ Ｂを参照して上記方法と同様にして、各プローブ（４０３）開口端におけるビー ズの存在を、図４Ｅに示すセンサー（４０６）に供することによりチェックして もよい。次いで、バルブ（４０５）開き、空気をプローブ（４０３）中に導入す ることにより、プローブ（４０３）の開口端の真下にあるマイクロタイタープレ ート（図示せず）のウェル中にビーズ（１０２Ｂ）を落下させる。 図４Ｅを参照すると、ビーズ（１０２Ｂ）中での細胞増殖期間経過後、上記方 法と同様の方法でプローブ（４０３）を培地（４０８）中に再挿入し、そこから ビーズ（１０２Ｂ）を吸引プローブ（４０３）の開口端に取ることができる。次 いで、ビーズ（１０２Ｂ）を、ビーズ（１０２Ｂ）中でのバイオマス量の増加を 検知するセンサー（４０６）に供する。次いで、ビーズ（１０２Ｂ）を保持した プローブ（４０６）を、マイクロタイタープレート（１３１）中のウェル上の位 置に移動させ、図４Ｆに示すように、ビーズ（１０２）をウェル中に落下させる 。 図５を参照すると、図１に対応する部品にはその番号を付してある。本発明装 置は、上記１に記載したように調製されたビーズの２次元配列が乗っているテー ブル（５０１）からなる。ビーズは、細胞を含まないかもしくは生細胞（１０２ Ａ）を含まないビーズ（１０２Ａ）、または生細胞のバイオマスを含むビーズ（ １０２Ｂ）のいずれかである。 ビデオカメラ（５０２）をテーブル（５０１）上方に置き、ビーズ（１０２Ａ 、１０２Ｂ）の配列をモニターする。カメラ（５０２）はイメージプロセッシン グおよび調節装置（５０３）に接続されており、さらに減圧多岐管（図示せず） に連結された管である粒子配向プローブ（５０４）に接続されている。ビデオカ メラ（５０２）およびイメージプロセッシング装置（５０３）はビーズ（１０２ Ａ）および増殖細胞のバイオマスを含むビーズ（１０２Ｂ）の異なる外観を検知 する。プローブ（５０４）中の減圧状態はビーズ（１０２Ｂ）をプローブ（５０ ４）の開口端に引き付け、吸引によりその場にビーズを保持する。次いで、図４ Ｂに示すように、調節装置（５０３）は、ビーズ（１０２Ｂ）を伴うプローブ（ ５０４）をマイクロタイタープレート（１３１）の空のウェル（１３０）上に移 動させる。 プローブ（５０４）中への空気の導入は、ビーズ（１０２Ｂ）をウェル（１３０ ）中に落下させる。プローブ（５０４）およびマイクロタイタープレート（１３ １）に相対的なＸ−Ｙモーションを与えることにより、プレート（１３１）を移 動させて上記方法のごとく、新たな空のウェル（１３０）をプローブ（５０４） の真下に置いて新たなビーズ（１０２Ｂ）を受けるようにしてもよい。 図６を参照すると、図１に対応する部品にはその番号を付してある。本発明装 置は、上記１に記載したように調製されたビーズ（１０２Ａ）および（１０２Ｂ ）の２次元配列が乗っているテーブル（６０１）からなる。該ビーズは空のビー ズ（１０２Ａ）であるか生細胞のバイオマスを含むビーズ（１０２Ｂ）のいずれ かである。 図５と同様に、ビテオカメラ、イメージプロセッシングおよび調節装置の配列 を利用して、粒子配向プローブ（６０２）を対象とするビーズ（１０２Ｂ）に配 向する。プローブ（６０２）は、ビーズ（１０２Ｂ）に吹き出し空気の筒状カー テン（６０３）を配向し、このカーテン（６０３）はビーズ（１０２Ｂ）をプロ ーブ（６０２）近傍に保持する。次いで、調節手段（図示せず）により、プロー ブ（６０２）をビーズ（１０２Ｂ）が乗っているテーブル（６０１）の穴（６０ ４）の上の位置に移動させ、そこでビーズ（１０２Ｂ）を穴を通してマイクロタ イタープレート（１３１）のウェル（１３０）中に落下させる。テーブルおよび プレート（１３１）の相対的なＸ−Ｙモーションを与えることにより、プレート （１３１）を移動させて、上記工程を繰り返して新たな空のウェル（１３０）は 穴（６０４）の真下の位置に来るようにして新たなビーズ（１０２Ｂ）を受け取 るようにしてもよい。 ５.大規模な生細胞の培養および増殖 マイクロタイタープレート（１３１）のウェル（１３０）中て、増殖した生細 胞のバイオマスを含むビーズ（１０２Ｂ）を大規模に増殖させてより多くの増殖 細胞を試験用に得ることができる。上記１のごとき適当な培地であって、ポリマ ービーズ材料の可溶化剤（例えば、アルギン酸カルシウムのビーズの場合には、 カザミノ酸、クエン酸三ナトリウム、またはリン酸溶液のごときカルシウム捕捉 剤）を含有する培地をウェル中に導入することにより、このことが達成される。 最初に十分な培地を導入してビーズ（１０２Ｂ）が部分的にのみ浸るようにし、 酸素の移動を可能にする。ビーズ（１０２Ｂ）中での十分な細胞の増殖が起こり 、培地表面上のビーズ（１０２Ｂ）の一部分から増殖した細胞が噴出する。さら に培地をビーズ（１０２Ｂ）を覆うまで導入して細胞を増殖させる。次いで、さ らなる増殖が起こるにつれ、増殖がビーズの範囲を越えて培地中または培地表面 で起こるようになる。このような増殖が起こるまでの時間は細胞株により異なる であろうし、当業者により実験的に決定されうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ドレイク，デイビッド イギリス国ハートフォードシャー・エスジ ー８・６ディーピー、ロイストン、メルボ ルン（番地の表示なし） ケンブリッジ・ ラボラトリー、ピー・エイ・コンサルティ ング・グループ (72)発明者 アーリントン，スティーブン・エイドリア ン イギリス国エンフィールド・イーエヌ１・ ２キューワイ、ブッシュ・ヒル・パーク、 アンバーレイ・ロード31番 (72)発明者 ノーマンセル，イアン・デイビッド イギリス国ウエスト・サセックス・ビーエ ヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラ レンドン・ロード（番地の表示なし） ス ミスクライン・ビーチャム・ファーマシュ ーティカルズ (72)発明者 アディコット，ジョン・ケニス イギリス国ウエスト・サセックス・ビーエ ヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラ レンドン・ロード（番地の表示なし） ス ミスクライン・ビーチャム・ファーマシュ ーティカルズ (72)発明者 ディバース，モイラ・スローン イギリス国ウエスト・サセックス・ビーエ ヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラ レンドン・ロード（番地の表示なし） ス ミスクライン・ビーチャム・ファーマシュ ーティカルズ (72)発明者 ストボールド，ジョン・スペンサー イギリス国ウエスト・サセックス・ビーエ ヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラ レンドン・ロード（番地の表示なし） ス ミスクライン・ビーチャム・ファーマシュ ーティカルズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１個またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し； ビーズ内の生細胞の増殖に十分な時間、増殖を支持する培地中でビーズ内の細 胞をインキュベーションし； 次いで、ビーズ内の細胞の異なる属性に関連した物理的特性に関して、ビーズ またはビーズに近接する部分を非侵入的かつ物理的に試験する工程により特徴づ けられる、異なる属性を有する微生物を識別する方法。 ２．選択された属性を有する細胞を含むビーズをかかる細胞を含まないビーズ から分離するさらなる１工程または複数の工程により特徴づけられる請求項１記 載の方法。 ３．増殖した生細胞を含むビーズを生細胞を含まないビーズから分離するか、 １の形態の細胞を含むビーズを別の形態の細胞を含むビーズから分離するか、あ るいは生存率および／または増殖レベルの異なる細胞を含むビーズを分離するこ とにより特徴づけられる請求項１または２記載の方法。 ４．単一細胞が各ビーズ内に封入される請求項１、２または３記載の方法。 ５．ビーズがアルギン酸ポリマービーズ、特に、アルギン酸カルシウムビーズ であることにより特徴づけられる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法 。 ６．個々の粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）を非侵入的かつ物理的に検出し、 粒子または粒子に近接した部分の物理的特徴に基づいて識別してクラス分けする のに用いられる検出手段（１１１）、（１１２）、（４０６）、（５０２）に粒 子を提供するための手段（１０４）、（４０３）、（５０１）、（６０１）； 該クラスのうちの１のクラスの粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）を別のクラス の粒子から物理的に分離するのに用いられる粒子配向手段（１１９）、（３０３ ）、（３０４）、（３０５）、（３０６）、（３１０）、（３１１）、（４０３ ）、（５０４）、（６０２）、および； 該検出手段の出力に応答して粒子配向手段をコントロールするのに用いられる 調節手段（１２２） からなる、物理的に識別可能な粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）を分離するため の装置。 ７．粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）が、流体（１０３）の流れ中において、 検出手段に輸送および／または提供されることを特徴とする請求項６記載の装置 。 ８．流体中の粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）を懸濁するための手段からなる ことを特徴とする請求項７記載の装置。 ９．粒子を検出手段に提供する手段が、懸濁液を１つまたはそれ以上の流体の 流れに分流するための手段（１０４）であって、流れの中で粒子（１０２Ａ）、 （１０２Ｂ）がそれぞれ連続して処理され、かつ、流体の流れが検出手段（１１ １）、（１１２）の近傍へと配向されている手段であることを特徴とする請求項 ７または８記載の装置。 １０．粒子がそれぞれ連続して処理される流れに懸濁液を分流する手段が、粒 子直径の２倍未満の内径を有する１つまたはそれ以上の流れ管（１０４）からな ることを特徴とする請求項９記載の装置。 １１．検出および識別手段（１１１）、（１１２）の下流において、流れ管（ １０４）が開口端（１０４Ｃ）となって終了し、この開口端（１０４Ｃ）が粒子 受け（１１９）の導入口に対面しており、その結果、粒子（１０２Ｂ）が、流れ 管の開口端（１０４Ｃ）から開口端と導入口との間の間隙を越えて粒子受け（１ １９）の導入口の中に入るものであり、流れ管の開口端（１０４Ｃ）および／ま たは導入口に流れ調節手段（１２２）が設置されて流れ管の開口端（１０４Ｃ） から該導入口への粒子の通過を許可または阻止することを特徴とする請求項１０ 記載の装置。 １２．粒子受け（１１９）の導入口、および／または流れ管の開口端（１０４ Ｃ）が、互いに相対的に直面した位置関係および直面しない位置関係に移動可能 であり、その結果、それらが対面した位置関係にある場合には粒子（１０２Ｂ） が流れ管（１０４）から粒子受け（１１９）中へと通過できるが、対面した位置 関係にない場合には通過できないことを特徴とする請求項１１記載の装置。 １３．流れ管の開口端（１０４Ｃ）および粒子受け（１１９）の導入口がとも に正の気圧の領域（１１３）にあり、粒子受け（１１９）がより低い気圧の領域 （１２６）に連絡していることを特徴とする請求項１１または１２のいずれか１ 項に記載の装置。 １４．流れ管（１０４Ｂ）が「Ｙ字」に分枝しているか、さもなくばフォーク 状の管の配置であり、懸濁液の流れが柄の中をフォークに向かって流れ、この柄 の一部をモニターする検出手段（１１１）、（１１２）を備え、さらに柄の中を 移動する選択された粒子をフォークの選択された枝（３０１）、（３０２）、（ ３０８）、（３０９）、（３１３）、（３１４）に向かって流すための迂回手段 （３０３）、（３０４）、（３０５）、（３０６）、（３１０）、（３１１）が 装備されており、そのため上記枝のうちの１本またはそれ以上が粒子受けからな っていることを特徴とする請求項１０記載の装置。 １５．捕獲した粒子を収集装置へと配向させるために、粒子受け（１１９）が 粒子配向器（１２０）に連絡していることを特徴とする請求項１１ないし１４の いずれか１項に記載の装置。 １６．粒子配向器（１２０）が、粒子受けに至る下流への伸長部分からなり、 伸長部分（１２０）に沿った正の気圧の変化によって粒子が配向されうることを 特徴とする請求項１５記載の装置。 １７．粒子受け（１１９）の開口端の下流への伸長部分（１２０Ａ）および該 伸長部分の終端の上流の領域が、低真空の多岐管（１２６）により囲まれている ことを特徴とする請求項１６記載の装置。 １８．粒子を検出手段（４０６）に提供するための手段が、粒子を把握する形 態または粒子を吸引する形態の１つまたはそれ以上の粒子配向プローブ（４０３ ）からなることを特徴とする請求項６記載の装置。 １９．粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）がプレート（５０１）、（６０１）を 渡るように流されて、その結果、粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）の２次元配列 が形成され、選択された個々の粒子（１０２Ａ）、（１０２Ｂ）に向けられるこ とのできる粒子配向プローブ（５０４）、（６０２）を用いて粒子を配列から取 り、それらを収集（１３０）、（１３１）へと配向させることを特徴とする請求 項６記載の装置。 ２０．配向手段が光学的検出手段（１１１）、（１１２）、（５０２）である ことを特徴とする請求項６ないし１９のいずれか１項に記載の装置。 ２１．添付図面を参照して本明細書に実質的に記載された請求項６ないし２０ のいずれか１項に記載の装置。 ２２．培養した１個またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し； ビーズ内での増殖のための十分な時間、増殖を支持する培地中でビーズ内の細 胞をインキュベーションし； 次いで、請求項６ないし２１のいずれか１項に記載の装置を用いて、選択され た属性を有する増殖した生細胞を含むビーズを、空であるかまたは選択された属 性を有しない細胞を有するビーズから分離することを特徴とする、異なる属性を 有する細胞を識別するための方法。 ２３．添付図面を参照して本明細書に実質的に記載された請求項１ないし５、 または請求項２２のいずれか１項に記載の、異なる属性を有する細胞を識別する ための方法。