CN115046819A - 一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，包括：1)取土壤或底泥样品放入离心管中，称量离心管取样前后的重量，得到样品净重后，向离心管中加入Percoll溶液；2)轻微震荡后将离心管放入超声波清洗仪；3)待超声波清洗仪工作完成后取出离心管，放入离心机；4)待离心机运转完毕后取出离心管，轻微震荡后用滤网过滤上清液，取部分上清液至流式细胞管并运行流式细胞仪，利用流式细胞仪对上清液中的藻细胞进行藻种和藻密度的检测与统计分析，得出所需藻细胞种类与数量。本发明无需通过分离培养与分子分析技术，即可获得原生环境藻类群落的完整信息，具有成本低廉、操作简便、可重复性强、可直接快速分析等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法。
背景技术
藻细胞广泛分布于自然界，包括各种水体、土壤和其他环境中，底泥藻类是生态系统的物质循环和能量流动不可或缺的角色，部分藻种越冬休眠时会集中在底泥内，此时的藻细胞起到“种源”作用，待来年升温时底泥中的“种源”藻类会不断释放至水体中，易导致来年出现水华爆发等现象，直接或间接地影响水生生物生存及生态系统安全。掌握底泥中活体藻细胞的种类和数量，是开展藻类水华形成机理研究和水华防治技术研究工作开展的基础。
通常藻类生物量的统计方法有显微镜血球计数法、光合色素含量测定法、光密度值法及其他创新方法：
1)显微镜血球计数法采样及运输量大、沉降浓缩耗时长，需要科研人员连续观察多个视野，计数容易重复或遗漏，准确率、效率较低，对水平和经验要求较高；由于土壤/底泥中存在大量杂质，因此存在藻细胞镜检观察困难、计数难度大的问题。除镜检计数法外，诸如基于双向背景差分法的成像流式细胞粘连计数方法(王俊生,张红月.一种基于双向背景差分法的成像流式细胞粘连计数与活性检测方法、装置[P].辽宁省：CN113222969A,2021-08-06.)、基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法(何石轩,谢婉谊,方绍熙,王德强.基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法[P].重庆市：CN106442463B,2019-03-08.)等创新方法，对藻细胞的计数都会受到泥沙干扰。
2)光合色素含量测定法需经过抽滤、研磨、萃取、离心、比色测定等步骤，操作复杂，耗时长、效率低；该方法对藻生物量的统计可能受无活性的破损或死亡藻细胞及残留光合色素影响，无法准确统计土壤/底泥中具有活性的藻细胞数量；进行提取溶剂多为甲醇、乙醇、丙酮等对人体有毒害的有机溶剂。
3)光合色素在操作过程中易分解，容易产生误差；无法判定浮游植物的种类。光密度值法(苏文,孔繁翔,赵旭辉.一种铜绿微囊藻的快速计数方法[P].江苏：CN103276045A,2013-09-04.)适用于已知藻种的室内模拟实验，无法对藻类进行鉴定；泥土中提取藻类时携带部分泥沙，对紫外分光光度计数据有较大干扰，故此方法只能运用于水体中藻密度的检测。
土壤/底泥中的活体藻细胞难以统计的重要原因之一是活体藻细胞较难从土壤/底泥中进行充分分离。张呈祥等提出了一种通过超声波清洗原理将藻细胞从沉水植物等附着基质上分离，使藻细胞进入蒸馏水形成藻液并统计的方法(张呈祥,雷光春,裴洪翠.附着藻类分离取样装置、附着藻类含量计算系统及方法[P].北京市：CN111537678A,2020-08-14.)。该方法及其装置需使用抽滤装置，经室内实验尝试后发现此方法对土壤/底泥无法适用，大量泥沙堆积不仅容易堵塞滤膜与装置，更会使藻细胞在大压强作用下被破坏。
针对土壤/底泥中藻细胞的计数，目前使用的方法如下：
1)取一定量混匀的土壤/底泥样品，加入Percoll悬浮液与甲醛混合溶液，静置后用倒置荧光显微镜进行镜检分类并计数(邹万生,王智,刘良国,王文彬,石迎普.冲天湖底泥表层微囊藻休眠体复苏与菌群动态[J].生态学报,2017,37(19):6597-6606.)。该方法向样品中加入了甲醛溶液，使得藻细胞丧失活性，无法对藻细胞开展与生理生态特征相关的后续研究。
2)将采集的土壤/底泥样品风干后研磨，向样品中分别加入90％丙酮溶液与Tris缓冲液，静止8～10h后离心，将滤膜过滤于容量瓶中反复萃取3～4次后定容，通过荧光分析测定叶绿素与藻蓝素的含量，从而得出藻群落生物量(Chen,C.,Yang,Z.,Kong,F.,Zhang,M.,Yu,Y.,&Shi,X.(2016).Growth,physiochemical and antioxidant responses ofoverwintering benthic cyanobacteria to hydrogen peroxide.EnvironmentalPollution,219,649–655.https://doi.org/10.1016/j.envpol.2016.06.043)。该方法需对底泥样品进行研磨并加入丙酮等溶液，将使得藻细胞丧失活性，且操作复杂，所需时间较长。
3)土壤/底泥过0.2mm筛后再用25号浮游植物网过滤，向残留物样品中倒入蒸馏水，充分搅拌泥水混合物静置后取上清液，重复至少三次，提取藻细胞镜检(李阔宇,宋立荣,万能.底泥中微囊藻复苏和生长特性的研究[J].水生生物学报,2004(02):113-118.)。该方法仅通过向底泥中加入蒸馏水搅拌混合后静置取上清液，难以保证藻细胞从底泥中得到充分的提取和分离，检测结果误差较大。
4)向土壤/底泥样品倒入蒸馏水，充分搅拌泥水混合物后取上清液进行稀释与平板涂布，培养至藻落长出后进行计数(吴生才,陈伟民,高光.太湖冬季底泥中活体藻类的检测[J].湖泊科学,2003(04):339-344.)。该方法一方面仅通过向底泥中加入蒸馏水搅拌混合后静置取上清液，难以保证藻细胞从底泥中得到充分的提取和分离；另一方面，通过平板涂布法进行藻细胞的培养，耗时较长，培养操作复杂，而不同藻细胞生长速度与条件各不相同，培养后计数不能准确反映底泥中藻类实际的种群结构，只能证明底泥中存在活体藻细胞，具有较大局限性。
鉴于以上方法的弊端，本发明提出一种简洁高效准确的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，对于土壤/底泥藻类生物学与环境生态学研究具有重要意义。
发明内容
为克服藻细胞提取与计数方法的不足，本发明旨在提供一种一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，从土壤/底泥中完整分离提取出藻细胞，并保持其活性不被破坏，同时达到快速精确统计数量、判断藻类群落结构与丰度等目的。
本发明提供一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，包括以下步骤：
1)取混合均匀、无明显大型颗粒物及杂质的土壤或底泥样品放入离心管中，称量离心管取样前后的重量，得到样品净重后，向离心管中加入Percoll溶液；
2)轻微震荡后将离心管放入超声波清洗仪；
3)待超声波清洗仪工作完成后取出后离心管，放入离心机；
4)待离心机运转完毕后取出离心管，轻微震荡后用滤网过滤上清液，取部分液体至流式细胞管并运行流式细胞仪，利用流式细胞仪对上清液进行统计与分析，得出所需藻细胞种类与数量。
作为优选，步骤1)中，土壤或底泥的量为1～2mL，所需样品量少，显著减少了采集样品与运输的工作量，且可保证提取效率较高。
作为优选，步骤1)中所述Percoll溶液用量为5～10mL，浓度为15％～55％。Percoll分离液是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，不会穿过细胞膜，对细胞无毒害作用，不仅能够使完整活体藻细胞与泥沙分离，同时还能使其与受损藻细胞及其碎片分离。为保证活体藻细胞能充分分离至溶液中，Percoll溶液用量不宜过少，通过试验分析研究发现以5～10mL为宜；为确保藻细胞经离心之后依旧悬浮于上清液中，防止藻细胞离心时再次沉降至底部，Percoll溶液浓度也不宜偏低，以高于15％为宜，同时为减少材料消耗，浓度宜低于55％。
作为优选，步骤2)中所述超声波清洗仪设置超声时间为1～3min，功率为20～360W。超声可促使藻细胞从底泥上较好地分离，功率过小、时间过短无法使藻细胞分离完全；而功率过大、时间过长又会导致藻细胞受损破裂死亡，通过试验分析得出超声时间为1～3min，功率为20～360W条件下可以达到良好的分离效果。
作为优选，步骤3)中所述离心机设置离心时间为3～30min，转速为1000～6000r/min。离心可使泥沙等杂质快速沉降至底部，藻细胞停留于分离液中，离心时间、转速不宜过大，以防藻细胞重新降至底部或受力较大被破坏；离心时间、转速过小则无法起到很好的分离作用，泥沙悬浮量大会影响仪器的准确运行；具体离心时间及转速可根据泥沙沉降情况在所述离心时间和转速范围内进行选择。
作为优选，步骤4)中所述上清液取10～5000μL，流式细胞仪以慢速(10μL/min)运转1～5min。流式细胞仪运行计数1min即可得到所需数据，为确保数据更准确，可运行3～5min，同一样品测定3次以减小误差。
作为优选，步骤4)中所述滤网选用200～400目滤网，既可保证仪器不受损，也能保留样品中的藻细胞。
所述方法应用于藻类群落细胞检测领域，适用于土壤/底泥藻类分离提取、分类计数、群落特征分析，实验结果表明，较现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明首次提出一种对土壤/底泥藻类进行活体分离提取、分类计数的方法，特点是仅需少量样品与分离液，并通过加入Percoll分离液、超声、离心的简单操作，即可实现藻细胞从土壤/底泥中完整分离的效果，结合流式细胞仪，可进一步实现活体藻细胞的快速分类计数。通过大量的对比试验，得出了分离提取的最优工艺参数，以及快速分类计数的最优条件，并将二者有机结合，形成了一整套土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法；
2、与传统镜检计数法相比，本发明方法直接测定活体藻细胞的数量，根据流式细胞仪反映信号对其进行快速计数，操作简单，分离彻底，采样量少，减少人力物力的消耗，相同时间内测定样品数量及准确度大幅提升；
3、与光合色素含量测定法相比，本发明方法可快速统计活体藻细胞生物量、鉴定藻的种类、对其无损伤，耗时短、操作简便、效率高，所使用的试剂对人体无毒害；
4、与现有其他技术相比，本发明具有成本低廉、操作简便、可重复性强、可直接快速分析、细胞完整可进行后续实验等优点，无需分离培养与分子分析技术，即可获得原生环境藻类群落完整的相关信息。
附图说明
图1为本发明的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法的流程图；
图2为本发明提取藻细胞计数的流式细胞仪藻细胞荧光信号分布散点图。
具体实施方式
本发明公开了一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。所述的实施方式有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。实施本发明并不限于以下具体实施方式的记载，对于其中某些特定的技术参数和措施，本领域技术人员可以根据不同湖泊的地理位置和自然条件，进行等同或等效的替换或变化。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：武汉市后官湖底泥藻类分类鉴定与计数
所涉及区域为武汉市浅水湖泊后官湖，采用本发明的方法，对后官湖水域越冬水华蓝藻种源分离提取，进行数量、门类统计。
后官湖水域越冬水华蓝藻种源分离提取统计方法流程参见图1，包括以下步骤：
1)采样点分别采集三份平行样品，切取最上层2cm左右厚度的表层底泥移至密封袋中，将每份样品混合均匀。
2)按百分比两步稀释法配制40％Percoll分离液，先用一份1.5M的NaCl加九份Percoll原液得到100％Percoll分离液，再使用0.15M的NaCl稀释得到40％Percoll分离液。
3)流式细胞仪进行开机预热、质检，用已知门类的纯种藻液划定荧光信号的范围。
4)用电子天平称量10mL空离心管质量，取1mL混匀底泥样品放入离心管中(注意避开石块、杂草等杂物)，再次称量该离心管重量，得到样品净重并记录。继续向该离心管中加入9mL的40％Percoll分离液，轻微震荡，使泥样分散在分离液中并与之充分接触。
5)将离心管盖紧后放入超声波清洗仪，所使用的超声波清洗仪频率为40kHz，设置功率为80W，工作时间2min。
6)将超声后的样品放入离心机，设置相对离心力为3000r/min，离心时间8min，使泥沙沉至底部，藻细胞分离至分离液当中。
7)轻微震荡混匀上清液，过300目滤网，防止流式细胞仪堵塞。取1mL滤液于流式细胞管中，调取设置完毕参数的模板，运行流式细胞仪2min，同一样品检测三次求平均值，运行完毕后即可得到所需藻细胞的数量，测得底泥中蓝藻数量为5500个/mL，绿藻为26500个/mL。
实施例2：本发明所述方法与常规方法的对比
于实验室内进行模拟实验，取一定量湖泊底泥放入烧杯中，铝箔纸密封，将该烧杯及玻璃棒、小烧杯、移液枪头等其余实验所需用品置于高压灭菌锅，设置工作温度120℃，灭菌30min，确保底泥与实验用品中无活体藻细胞。待上述物品冷却至室温后，取一定量的灭菌后的底泥于小烧杯内，加入一定量已知浓度的藻液进行混合，得到已知藻细胞浓度为80000个/mL的泥样。考虑超声的功率、时间；分离液种类、浓度等因素设置正交实验，每个实验组取1mL上述泥样，5mL分离液于离心管内，进行相应处理，并对各实验组进行计数。
目前保持藻细胞活性并计数的常规方法为：向样品中加入蒸馏水，充分搅拌，反复提取三次，使用显微镜进行计数。因镜检对操作者要求较高，藻细胞浓度低时准确度低，故实验时使用流式细胞仪代替显微镜人工计数。经试验后证明该方法提取计算获得的藻细胞浓度为55140个/mL，根据已知藻细胞浓度为80000个/mL可得提取效率仅为69.30％，并且该方法有以下缺点：1.静置过程中细泥沙难以沉降，藻细胞提取不彻底，离心容易破坏其完整性；2.静置过程中藻细胞的种群结构易产生变化，如出现藻的繁殖、种间竞争等状况；3.泥沙较多的情况下使用流式细胞仪计数，不仅误差较大，同时也容易导致仪器堵塞；4.泥沙较多的情况下使用血球计数法观察难度较大，耗时较长，准确度低。
使用本发明提取计算得藻细胞浓度为72900个/mL，本发明方法提取效率可达91.12％。为证明本发明方法的优越性，将使用该方法的实验组再次通过上述常规方法进行提取，发现仅有极少数藻细胞残留。
对比本发明方法与常规方法结果，本发明能将藻细胞完整地从底泥中提取出来并依据门类准确计数，较目前统计数量的常见方法而言，本方法具有操作更简便、快速、误差小等优点，便于科研人员进行土壤/底泥藻类群落结构与丰度的分析研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下，技术人员还可以对该方法做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取混合均匀、无明显大型颗粒物及杂质的土壤或底泥样品放入离心管中，称量离心管取样前后的重量，得到样品净重后，向离心管中加入Percoll溶液；
2)轻微震荡后将离心管放入超声波清洗仪；
3)待超声波清洗仪工作完成后取出后离心管，放入离心机；
4)待离心机运转完毕后取出离心管，轻微震荡后用滤网过滤上清液，取部分液体至流式细胞管并运行流式细胞仪，利用流式细胞仪对上清液进行统计与分析，得出所需藻细胞种类与数量。
2.如权利要求1所述的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，其特征在于，步骤1)中土壤或底泥的量为1～2mL，所述Percoll溶液用量为5～10mL，浓度为15％～55％。
3.如权利要求1所述的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，其特征在于，步骤2)中所述超声波清洗仪设置超声时间为1～3min，功率为20～360W。
4.如权利要求1所述的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，其特征在于，步骤3)中所述离心机设置离心时间为3～30min，转速为1000～6000r/min。
5.如权利要求1所述的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，其特征在于，步骤4)中所述上清液取10～5000μL，流式细胞仪运转1～5min。
6.如权利要求1所述的土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，其特征在于，步骤4)中所述滤网选用200～400目滤网。
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