JP6529440B2 - 膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性細胞の懸濁及びクラスタリング - Google Patents

膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性細胞の懸濁及びクラスタリング Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許第６１／７４７，７９９号（２０１２年１２月３１日出願）及び米国仮特許第６１／９６２，１５８号（２０１３年１１月１日）に対する優先権を主張し、これらの出願の両方は、その全体が参照によって組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、凝集した細胞クラスタにおいて、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及び他の多能性細胞を調製することを含む、細胞分化の分野にある。一態様では、本発明は、多能性幹細胞のクラスタを生成し、膵臓内胚葉、膵内分泌前駆細胞、及び単一ホルモン膵内分泌細胞への分化のために、懸濁培養系内でそれらを維持する方法を開示する。
Ｉ型真性糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、インスリン産生細胞、又は移植に適したβ細胞の供給源の開発に興味の焦点が当てられている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は内胚葉の前領域を特定し、ＣＤＸ１、２、及び４は後半分を特定する。
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ、異なった中胚葉組織に近接させる。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−β、レチノイン酸（「ＲＡ」）、及びＢＭＰリガンド、並びにこれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは、推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を阻害することが報告されている（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１２：１２１５〜１２２０）。
特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより、分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ１の非常に高い発現及びＣＤＸ２並びにＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織において高く発現し、ＣＤＸ２の発現は腸組織において高い。
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。
膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、膵臓内胚葉の分化から生じる外分泌組織及び内分泌組織の両方を含有する。
Ｄ'Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５、２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。報告によると、マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれらの膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び同第７，５３４，６０８号）。
Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１、１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１、６０：２３９〜２４７）は、有意に膵内分泌細胞の数を増すために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９、２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５：２５８〜２６５）。
多能性幹細胞などの前駆細胞を培養するためのプロトコルの改良において、大きな進歩がなされた。国際出願第ＷＯ２００７／０２６３５３号（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．）は、二次元の培養系における、未分化の状態でのヒト胚性幹細胞の維持を開示する。Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．、２００６（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：１８５−７）は、マトリックス上でのヒト胚性幹細胞の培養のためのＴｅＳＲ１画定培地を開示する。米国特許出願公開第２００７／０１５５０１３号（Ａｋａｉｋｅ ｅｔ ａｌ．）は、多能性幹細胞に接着するキャリアを使用して懸濁液中で多能性幹細胞を成長させる方法を開示し、米国特許出願公開第２００９／００２９４６２号（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．）は、マイクロキャリア又は細胞封入を使用して懸濁液中で多能性幹細胞を増大させる方法を開示する。国際出願公開第ＷＯ ２００８／０１５６８２号（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．）は、基質接着を欠く培養条件下で、懸濁培養系内でヒト胚性幹細胞を増大させ、維持する方法を開示する。
米国特許出願公開第２００８／０１５９９９４号（Ｍａｎｔａｌａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）は、三次元の培養系においてアルギン酸ビーズ内に封入されたヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示する。
これらの前進にも関わらず、三次元の培養系において、機能性の内分泌細胞に分化し得る多能性幹細胞を成功して培養する方法のための、必要性が依然として残っている。
上記の概要及び本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより深い理解がなされるであろう。本発明を説明する目的のため、図面は本発明の各実施形態を示している。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない点は理解されるべきである。
実施例１に従う、引き上げ直後（左手パネル）及び非接着性静的培養系内での２４時間後（右手パネル）の、ヒト胚性幹（「ｈＥＳ」）細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。引き上げ後の細胞（左手パネル）は、それぞれの断片が細胞の塊からなる、約２０〜３０マイクロメートルの平均断片直径を有する、単層の断片に類似した。非接着性静的培養系内で２４時間後、細胞はクラスタ様の構成を取った。 実施例１に従う、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ１培地を含有する１２５ｍＬスピナフラスコ内での４日間の培養後の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＸＣＲ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１についてのフローサイトメトリーの結果を示す。細胞は、分化のマーカーであるＣＸＣＲ４の発現はほとんど呈さなかったが、多能性（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のマーカーについて高い発現を呈した。 ステージ１の終了時の分化の７２及び９６時間後の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。図１ｃにおいて可視であるのは、７２時間後で４×倍率（左手パネル）、９６時間後で４×倍率（中央パネル）、９６時間後で１０×倍率（右手パネル）の、疎性の細胞凝集体である。 マーカーＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、及びＣＤ９９についての、ステージ１分化終了時の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞のフローサイトメトリー結果を示す（実施例１を参照されたい）。図１ｄに示すように、多能性のためのマーカーであるＣＤ９の発現はほぼ除去された一方で、胚体内胚葉分化のマーカー、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）及びＣＤ９９の発現はかなり高かった。 未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時の、多能性と関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子の発現の、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）結果を示す（実施例１を参照されたい）。ステージ１の終了時の細胞は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比して、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現において劇的な減少を、及び胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（ＣＥＲ１）、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）において大きな増加を示した。 細胞が胚体内胚葉から膵臓内胚葉に更に分化した際の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す（実施例１を参照されたい）。分化がステージ２、１日目（上部左手パネル）からステージ２、３日目（上部右手パネル）、ステージ３、４日目（下部左手パネル）、及びステージ４、１日目（下部右手パネル）へ進行するにつれて、細胞及び細胞クラスタに対する明白な形態的変化が可視である。 実施例２に従う、ＥＤＴＡ処理後、攪拌された懸濁培養系内で２日間の培養後、及び分化培養系への遷移前の、多能性及び分化と関連付けられているマーカーについての、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。データは、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど示さなかったが、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）について高い発現を示した。 実施例２に従う、スピナフラスコ内で成長させたステージ１、３日目の細胞、並びにスピナフラスコ又は三角フラスコ内で成長させたステージ２、２日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞に分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の顕微鏡写真を示す。懸濁液分化培養系は、球状凝集体の、実質的に均一かつ同質の細胞の集団を形成した。 多能性及び内胚葉分化の細胞表面マーカーについての、ステージ１の終了時の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。図２ｃにおいて可視であるように、多能性のためのマーカーであるＣＤ９の発現はほぼ除去された一方で、胚体内胚葉分化のマーカーであるＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現はかなり高かった。 未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時の、多能性と関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子の発現の、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す（実施例２を参照されたい）。図２ｄは、多能性遺伝子（ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における減少、及び胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（「ＣＥＲ１」）、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す。 実施例２に従う、スピナフラスコ又は三角フラスコ内での懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉細胞へと分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びクロマグラニン（Chromagranin））のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要とされる転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、並びに両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ示さず）及びクロモグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。 実施例２に従う、スピナフラスコ又は三角フラスコ内での懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉細胞へと更に分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の、分化と関連付けられている選択された遺伝子の発現の、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。データを、ＷＡ０１ ｈＥＳ細胞における発現と比較する。ＲＴ−ＰＣＲ結果は、膵臓前駆体遺伝子の高いレベルの発現を示す。 Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）での処理に続いて静的培養系から引き上げられた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。図３ａに示すように、細胞は表面から小さな凝集体として除去された。 Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）での処理に続いて静的培養系から引き上げられ、その後懸濁培養系内で３日間増大させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図３ｂにおいて可視であるのは、球状凝集体の、実質的に均一かつ同質の細胞クラスタの集団の形成である。 Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）での処理に続いて静的培養系から引き上げられ、その後懸濁培養系内で３日間増大させ、その後Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離を使用して連続的に継代培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞のクラスタの顕微鏡写真を示す。 分化の異なるステージで指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示す。図４ａにおいて可視であるのは、各分化ステージでの細胞の顕微鏡写真である。 異なる分化ステージで指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４、ＣＤ５６、及びＰＤＸ１）のフローサイトメトリーの結果を示す（分化開始後の時間）。ステージ４、４日目の分化プロセスの終了時、高い百分率の細胞は、ＰＤＸ１発現について陽性であった。 ＴｈｅｒａＣｙｔｅデバイス内に封入された分化した細胞を移植した、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの非空腹時血糖レベルを示す。 分化培養系への遷移前の、多能性及び分化と関連付けられているマーカーについての、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。図５ａに示すように、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。 ステージ１中の３つの異なる供給設定の、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４及びＣＤ９９（分化のマーカー）、並びにＣＤ９（多能性マーカー）の、細胞の位相差画像及びフローサイトメトリーデータを示す。試験された条件は以下の通りであった：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、膵臓内胚葉形態を呈する分化した細胞の位相差画像を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。 以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。 条件Ａ（分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化した細胞を埋め込んだ、ＳＣＩＤ−ＢｇマウスにおけるＣ−ペプチドの発現を示す。各ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜下に、５００万個の細胞を埋め込んだ。図５ｆに示すように、埋め込みの１２週目後までに、ヒトＣ−ペプチドは、１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣ−ペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった。 条件Ａ（分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化した細胞の前及び後投与（例えば、埋め込み）された、選択されたＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対する、グルコース処理の影響を示す。図５ｇに示すように、グルコース処理は、空腹状態で平均０．９３ｎｇ／ｍＬから供給状態で２．３９ｎｇ／ｍＬへの、循環するヒトＣ−ペプチドにおける有意な増加を誘導した。 条件Ａ（分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化した細胞を投与されたＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対する、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与（すなわち、ＳＴＺ誘導糖尿病）の影響を示す。図５ｈから明白であるように、機能的ＧＳＩＳコンピテント組織（すなわち、細胞を投与されているもの）の移植片を有する動物は、真性糖尿病を発症した未処理の対照とは異なり、正常の血糖レベルを維持した。 分化前にＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。 様々な分化ステージでＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。 アクチビンＡ（ＡＡ）及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内の平板（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡ平板）上で、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）で、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内の平板（ＭＣＸ／ＧＤＦ８平板）で、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で成長させ、分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に対する、分化の日数の関数としての、細胞計数（細胞／ｃｍ2）を示す。 アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内の平板（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡ平板）上で、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）で、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内の平板（ＭＣＸ／ＧＤＦ８平板）で、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で成長させ、分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に対する、分化の日数の関数としての、細胞計数（細胞／ｍＬ）を示す。 ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとしての、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ；又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、マイクロキャリア培養系又は平面培養系上で成長させた、細胞の分化の第１のステージのフローサイトメトリー結果を示す。 それぞれのマーカー（ＣＸＣＲ４及びＣＤ９）の完全発現としての、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ；又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、マイクロキャリア培養系又は平面培養系上で成長させた、細胞の分化の第１のステージのフローサイトメトリー結果を示す。 （ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ；又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、懸濁培養系内で、平面培養系上又はマイクロキャリアビーズ上での成長によって分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の分化と関連付けられている選択された遺伝子の発現の、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。 ステージ１、１日目からステージ４、３日目までの、実施例７のプロトコルに従って分化した細胞についての、バイオリアクターにおける様々な分化ステージでの細胞計数を示す。細胞計数を、画像に基づくサイトメター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））によって決定される、細胞１００万個／ｍｌとして示す。 実施例７の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。 実施例７の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。 実施例７の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、平均バイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。 多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、実施例７のプロトコルに従って分化したステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す。 胚体内胚葉と関連付けられている選択遺伝子を含有する胚体内胚葉（「ＤＥ」）アレイの、ステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照されたい）。 多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照されたい）。 ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照されたい）。 未分化のステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ＣＤ９、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の、蛍光活性細胞分別（ＦＡＣＳ）の結果を示す（実施例７を参照されたい）。結果をまた、表８に示す。 実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１６は、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現における穏やかな増加、並びに指向された分化の前のステージ０プロセス中のＧＡＴＡ２発現における≧１００×の増加を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１７は、指向された分化の前のステージ０プロセス中のＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、及びＦＧＦ４発現における≧１００×の増加を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１８は、ステージ１、１日目の細胞と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１９は、ステージ１、１日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１８及び１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００×の増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００×の増加などの、遺伝子発現パターンにおける有意な変化を図示する。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１８は、ステージ１、１日目の細胞と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１９は、ステージ１、１日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１８及び１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００×の増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００×の増加などの、遺伝子発現パターンにおける有意な変化を図示する。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２０は、ステージ１、３日目の細胞の、多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２１は、ステージ１、３日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、３日目の細胞の、ＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４としても知られる）、及びＣＤ９９のＦＡＣＳの結果を示す。分化の開始時点でＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団（図１５）から、ステージ１の終了時点でＣＸＣＲ４発現細胞（細胞の９８．３％がＣＸＣＲ４陽性、±１．９標準偏差）の均質な集団（図２２）へのほぼ完全な遷移が観察された。 実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ１、３日目、ステージ２、１日目、及びステージ２、３日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図２３は、ステージ２、１及び３日目でのＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方で、ステージ１の３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）が、ステージ２の終了時点までに低減した発現を示したことを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ２、１日目の細胞及びステージ２、３日目の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、前腸遺伝子ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の遺伝子発現を示す。図２４に示すように、これらの遺伝子の発現は増加した。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ３の培地内で成長させたステージ３、３日目の細胞（表７）の、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、クロモグラニン、ＮＫＸ２．２、及びＳＯＸ２のＦＡＣＳの結果を示す。図２５に示すように細胞は、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現によって測定される（９０．９％±１１．９標準偏差の陽性ＰＤＸ１、及び９９．２％±０．６標準偏差の陽性ＦＯＸＡ２）、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。 実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ３、１日目及びステージ３、３日目の細胞の、ステージ４と関連付けられている選択遺伝子を含有するステージ４アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図２６は、これらの細胞が、一般的に膵臓内で発現する、増加したレベルの遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主を呈することを図示する。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を示す。図２７に示すように、ステージ４、３日目、細胞は高いレベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５標準偏差の陽性クロモグラニン）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１について５８．３％±９．７標準偏差で陽性）との混合と一貫した発現パターンを更に発展させた。 実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ３、３日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞の、ステージ４と関連付けられている選択遺伝子を含有するステージ４アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図２８は、一般的に膵臓内で発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の増加した発現レベルを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す。特に、図２９は、３Ｌスケールで異なる種材料ロットから生成した、膵臓前駆体の平均ＦＡＣＳ発現パターンを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す。ステージ４、３日目の細胞における分化の前に、細胞を増大させて、ＩＳＭを形成し、その後、その両方を２％のＢＳＡで補助した、カスタムの自家培地「ＩＨ３」又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）のいずれか内で、ステージ０で成長させた。ＩＨ３培地内で成長させた細胞は「ＩＨ３−Ｐ成長細胞」であり、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）内で成長させた細胞は「ＥＺ８成長細胞」である。異なる培地内で成長させた細胞間での発現パターンにおける有意な差は、観察されなかった。 ステージ０で異なるｐＨレベルで予め成長させた、ステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す（実施例７を参照されたい）。ステージ４、３日目の細胞プロファイルにおける有意な変化は観察されなかった。 抗フォームＣで処理しなかったステージ４、３日目の細胞、及び抗フォームＣ乳剤（９４ｐｐｍ）で処理したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を比較する（実施例７を参照されたい）。抗フォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ８０１１）は、ステージ４、３日目の細胞のプロファイルに影響を与えることは観察されなかった。 実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す（実施例８を参照されたい）。図３３に示すように、バイオリアクターからの細胞は、多能性の遺伝子特徴（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、分化の遺伝子特徴の最小限の誘導を示したか、又はそれを全く示さなかった（ＡＦＰ及びＦＯＸＡ２：＜５０倍の増加；ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、ＭＩＸＬ１、及びＴ：＜１０倍の増加した発現）。 実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す（実施例８を参照されたい）。図３４は、分化開始の２４時間後の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す（実施例８を参照されたい）。図３５は、分化開始の７２時間後の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ａ）は、ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、及びＣＤＸ２の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。 実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｂ）は、ＧＡＳＴ、ＨＡＮＤ１、ＨＨＥＸ、及びＨＮＦ４ａの遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。 実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｃ）は、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＯＳＲ１、及びＰＤＸ１の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。 実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｄ）は、ＰＲＯＸ１、ＰＦＴ１ａ、ＳＯＸ１７、及びＳＯＸ２の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。 実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｅ）は、ＳＯＸ９の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。 実施例８のプロトコルに従う分化のステージ４、３日目の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３７に示すように、ステージ３、３日目での分化の終了時点で、細胞は、ＰＤＸ１（＞１×１０6倍の誘導）及び他の膵臓遺伝子（ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴの＞１０００倍の誘導）の高い発現レベル、並びに未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比較して、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失を特徴とする膵臓前駆細胞に分化している。 実施例８に従う、分化プロトコル中の毎日の細胞計数を示す。特に、図３８は、プロセス日数の関数としての細胞密度を示す。図３８は、ｐＨ ６．８及び７．２で実行した２度のリアクター施行（ＰＲＤ１２０５及びＰＲＤ１２０７）の、分化プロトコルの細胞計数を示す。比較のために、細胞ドリフトの細胞計数もまた示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。図３９（ａ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５Ｍ又は１０Ｍのステージ４、３日目の細胞の埋め込み後の、Ｃ−ペプチドレベルを時間の関数として示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。図３９（ｂ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５Ｍ又は１０Ｍのステージ４、３日目の細胞の埋め込み後の動物における非空腹時グルコースレベルを示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。図３９（ｃ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、予め冷凍保存したステージ４、３日目の細胞の埋め込み後に産生されたＣ−ペプチドレベルを時間の関数（埋め込み後の週）として示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。。図３９（ｄ）は、解凍直後（０日目）又は解凍の１日後（１日目）に埋め込まれる、一度も凍結保存しなかった／新鮮な腎臓移植片ステージ４、３日目の細胞、又は凍結保存されたステージ４、３日目の細胞によって処理したマウスのＣ−ペプチドレベルを比較する。 Ａ〜Ｄは、ステージ１、１日目に、ＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８（図４０Ａ）；ＭＣＸのみ（図４０Ｂ）；ＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡ（図４０Ｃ）；並びにＷＮＴ３Ａのみ（図４０Ｄ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。これらの図は、懸濁培養系内で、分化の１日目のＴＧＦ−β族員の不在での、３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞を処理する際に得られる、それに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。 Ａ〜Ｄは、ステージ１、１日目に様々な量のＭＣＸで処理した、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、ステージ１、１日目に、４μＭのＭＣＸ（図４１Ａ）；３μＭのＭＣＸ（図４１Ｂ）；２μＭのＭＣＸ（図４１Ｃ）；及び１．５μＭのＭＣＸ（図４１Ｄ）で細胞を処理した。 Ａ〜Ｂは、実施例１１のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養系内の培地交換頻度の役割を示す。図４２Ａは、ステージ１で完全な培地交換して、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図４２Ｂは、３日目の培地交換なしで、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。データは、懸濁培養系内で、分化の３日目に培地交換を受ける培養系（図４２Ａ）が、３日目に培地交換を受けなかった培養系（図４２Ｂ）に相当する効率を有する胚体内胚葉をもたらしたことを示唆する。 Ａ〜Ｂは、実施例１２のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養系内のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）の役割を示す。細胞を、ステージ１に、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）で補助した培地（図４３Ａ）、あるいはＧｌｕｔａｍａｘ（商標）又はいかなるグルタミン（０ＭのＧｌｕｔａｍａｘ（商標））も含まない培地（図４３Ｂ）内で培養した。データは、懸濁培養系内で、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）の添加が、胚体内胚葉が生成される効率に影響を及ぼさないようであることを示唆する。 Ａ〜Ｄは、実施例１３のプロトコルに従って分化した細胞に対する、様々な量の重炭酸ナトリウムの影響を示す。図４４Ａ及び図４４Ｂは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ａ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｂ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図４４Ｃ及び図４４Ｄは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ｃ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｄ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化した細胞の分化の関数としての、細胞密度の毎日の細胞計数を示す。細胞計数を、画像に基づくサイトメター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））を使用して得た。 実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。 実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。 実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。 実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１〜３日目及びステージ１、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの遺伝子発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１〜３日目；ステージ１、１日目〜３日目；及びステージ２、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの遺伝子発現を示す。 ステージ０の、実施例１４のプロトコルに従って分化する前の細胞の、多能性と関連付けられているマーカー（ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のＦＡＣＳの結果を示す。特に、図５１は、多能性と関連付けられているマーカーの高い発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従ってステージ１の終了まで分化した細胞の胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；及びステージ２、３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の遺伝子発現を示す。図５３は、前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現における増加を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ２、１日目〜３日目及びステージ３、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＨＮＦ４Ａ、ＮＫＸ２−２、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、及びＰＦＴ１Ａの遺伝子発現を示す。図５４に示すように、ＰＤＸ１の発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと６０倍増加した。 実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ３、１〜３日目及びステージ４、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、特定の遺伝子の遺伝子発現を示す。特に、図５５の上部パネルは、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＡＲＸ、ＣＤＸ２、ＣＨＧＡ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＡＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、及びＭＡＦＢの遺伝子発現を示す。図５５の下部パネルは、ＭＡＦＢ、ＭＵＣＳ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ６−１、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＰＯＵＳＦ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＳＴ、及びＺｌＣ１の遺伝子発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化した細胞の、ステージ終了時の顕微鏡写真を示す。図５６において可視であるのは、ステージ０での、及びステージ１〜４の分化の終了時点での、細胞クラスタの代表的な顕微鏡写真（４×）である。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＡＦＰ（図５７）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤ９９（図５８）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤ９（図５９）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤＨ１（図６０）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤＨ２（図６１））。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤＸ２（図６２）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＥＲ１（図６３）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＸＣＲ４（図６４）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示すＦＧＦ１７（図６５）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＦＧＦ４（図６６）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＦＯＸＡ（図６７）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＡＤＰＨ（図６８）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＡＴＡ４（図６９）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＡＴＡ６（図７０）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＳＣ（図７１） 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＫＩＴ（図７２）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＭＩＸＬ１（図７３）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＭＮＸ１（図７４）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＮＡＮＯＧ（図７５）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＯＴＸ２（図７６）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＰＯＵＦ５Ｆ１（図７７）；。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＳＯＸ１７（図７８）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＳＯＸ７（図７９）。 以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：Ｔ（図８０）。 実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の百分率を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルに従って分化した細胞クラスタに対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。左手パネルは、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＧ２／Ｍにおける細胞の百分率を示す。特に、左手パネルは、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。一組のデータにおいて、これらのクラスタをまた、ＥＤＵで処理した。図８２の右手パネルは、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間、ＥＤＵ陽性の細胞％を示す。 実施例１５のプロトコルにおいて使用される、一般的な操作パラメーターを示す。 実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、細胞のＥＤＵ取り込みの量を示す。特に、図８４は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理した、ＥＤＵインキュベートした細胞クラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の百分率を示す。特に、図８５は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＳ相における細胞の百分率を示す。特に、図８６は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＳ相における細胞の百分率を示す。特に、図８７は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ａは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、及びＣＤＨ２の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。 未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す図８８Ａは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＣＸＤ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、及びＦＧＦ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。 未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｃは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ６の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。 未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｄは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、及びＭＮＸ１の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。 未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。 未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｆは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＳＯＸ７及びＴの遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図８９に示すように、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図８９の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図８９の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図９０に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９０の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９０の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図９１に示すように、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図９１の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９１の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 ＦＡＣＳによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で３日間培養した、ＦＡＣＳのＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のタンパク質発現パターンを示す。特に、図９２の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４の発現パターンを示す。図９２の右パネル、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のタンパク質発現パターンを示す。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図９３に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９３の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９３の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 実施形態１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で分化した細胞の顕微鏡写真を示す。図９４に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９４の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目での、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９４の右手パネルは、分化の１０日間後に臍組織細胞（ＵＴＣ ＩＰＳＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。 実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で分化した細胞の顕微鏡写真を示す。図９５に示すように、細胞は神経細胞系に向かって分化した。特に、図９５の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目での、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９５の右手パネルは、分化の１０日間後に臍組織細胞（ＵＴＣ ｉＰＳＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。
本出願は、凝集した細胞クラスタにおいて、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及び他の多能性細胞の調製に向けられる。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明若しくは例示する下記の小項目に分割する。
定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を産生することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へと生体外で分化するそれらの能力を特徴とする。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。
幹細胞は、それらの発生上の潜在性によって分類される。「細胞培養系」又は「培養」は、一般的には、生体から取得され、制御条件下で成長する（「培養系内」又は「培養される」）細胞を指す。初代細胞培養系は、最初の継代培養の前に、生物（複数可）から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養系である。細胞は、細胞の増殖及び／又は分裂のうちの１つ又は両方を亢進する条件下で、成長培地内に定置されると培養系内で増大して、より大きな細胞集団をもたらす。細胞を培養系内で増大させる場合、細胞増殖の速度は、細胞の数が倍加するために必要とされる時間の量によってしばしば測定される（倍加時間と称する）。
「増大」は、本明細書で使用される場合、培養によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上などだけ、及びこれらの百分率以内のレベルだけ、多能性幹細胞の数を増加させるプロセスである。単一の多能性幹細胞か得られ得る多能性幹細胞は、多能性幹細胞の増殖能力に依存することが理解される。多能性幹細胞の増殖能力は、細胞の倍加時間、すなわち、細胞が培養系内で有糸分裂を受けるために必要とされる時間、及び多能性幹細胞が未分化の状態で維持され得る期間、つまり各継代培養の間の日数を乗じた、複製される継代培養の数に等しい期間、によって計算され得る。
分化は、特殊化されていない（「分化決定されていない」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞又は分化誘導された細胞とは、細胞の系統内でより特化した（「拘束された」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「分化決定された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。「脱分化」とは、細胞が細胞の系統内においてより特殊化（又は分化決定）していない位置へと戻る過程のことを指す。本明細書で使用される場合、細胞の系統は、細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来したか、及びどの細胞を生じさせることができるかを定義する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を定置するものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
「マーカー」は、本明細書で使用される場合、対象の細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現とは、未分化細胞と比較して、陽性マーカーのレベルの増加、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
本明細書で使用される場合、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」、又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。特に、ＦＡＣＳによる陽性は通常２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％未満である。ＰＣＲによる陽性は通常３４周期（Ｃｔｓ）未満であるが、ＰＣＲによる陰性は通常３４．５周期を超える。
本明細書で使用される場合、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書において互換的に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を指す。
本明細書で使用される場合、「懸濁培養系」は、表面に接着するよりもむしろ、培地内で懸濁された細胞の培養系、単一細胞、又はクラスタを指す。
本明細書で使用される場合「血清を含まない」は、ヒト又は動物血清を欠くことを指す。したがって、血清を含まない培養培地は、血清又は血清の部分を含まない。
細胞培養系内で、多能性幹細胞の機能的膵内分泌細胞への分化を複製する試みにおいて、分化プロセスは、しばしばいくつかの連続したステージを通して進行していると見なされる。本明細書で使用される場合、様々なステージは、培養時間、及び本明細書に含まれる実施例において説明される試薬によって定義される。
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する：ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（ＨＮＦ３β）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ケルベロス、ＯＴＸ２、ブラキュリ(短尾奇形)、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。胚体内胚葉細胞のマーカー特徴は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７を含む。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７のそれらの発現を特徴とする。更に、細胞がステージ１に留まることが可能な時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。
「膵内分泌細胞」は、本明細書で使用される場合、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチド。これらのホルモンに加えて、膵内分泌細胞のマーカー特徴は、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６のうちの１つ以上を含む。β細胞のマーカーを特徴発現する膵内分泌細胞は、インスリン及び以下転写因子のうちの少なくとも１つの、それらの発現を特徴とする：ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６。
本明細書では、「ｄ１」、「ｄ １」、及び「１日目」；「ｄ２」、「ｄ ２」、及び「２日目」；「ｄ３」、「ｄ ３」、及び「３日目」などは互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。
「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般に見出される糖である、デキストロースを指す。
膵内分泌前駆細胞において発現されるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を識別する「ＮｅｕｒｏＤ」及び「ＮｅｕｒｏＤ１」は、本明細書で互換的に使用される。
「ＬＤＮ」及び「ＬＤＮ−１９３１８９」は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）からＳＴＥＭＯＬＥＣＵＬＥ（商標）の商標で入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤である、（（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン，塩酸；ＤＭ−３１８９））を指す。
多能性幹細胞の単離、増大、及び培養
多能性幹細胞は、指定されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体のうちの１つ以上を発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）。生体外での多能性幹細胞の分化は、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１発現の損失をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、典型的に、アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ））により説明されているように、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、その後基質としてＶｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｒｅｄを使用して現像することにより検出され得る。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、典型的には、ＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％のパラホルムアルデヒドを使用して固定し、その後これらの３つの胚葉からの細胞型の証拠について組織学的に検査することによって確認され得る。あるいは、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞が正倍数体であり、全てのヒト染色体が存在し、かつ目立った異常がないことを意味する、「正常な核型」を有する細胞を得ることが望ましい。多能性細胞は、種々のフィーダー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質でコーティングされた容器を用いることによって、簡単に増大し得る。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ））のような明確な培地との組み合わせで、化学的に明確な表面を、細胞の常用増大のために使用してよい。
本発明のいくつかの実施形態の方法に従う懸濁培養系内での培養は、細胞の生存及び増殖を促進するが、分化を制限する細胞密度で培養管内に多能性幹細胞を播種することによって達成される。典型的に、細胞の未分化を維持する播種密度が使用される。幹細胞の単一の細胞懸濁液が播種され得るものの、細胞の小さなクラスタが有利であり得ることが理解されるであろう。
懸濁培養系内にある間、十分かつ一定の栄養素及び成長因子の供給を有する多能性幹細胞を提供するために、培養培地は、毎日、又は１〜５日おきなどの所定の計画で交換又は再供給され得る。多能性幹細胞の大きなクラスタは、細胞分化を引き起こし得るため、大きな多能性幹細胞の凝集体を回避するための手段が取られ得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、形成された多能性幹細胞クラスタは、例えば、２〜７日おきに解離され、単一細胞又は細胞の小さな塊は追加の培養管内に分割される（すなわち、継代培養される）か、又は同一の培養管内に保持され、交換又は追加の培養培地で処理される。
遠心分離から生じる多能性幹細胞のペレットを含む、大きな多能性幹細胞の塊は、酵素的消化及び／又は機械的解離のうちの１つ、又は両方に供され得る。多能性幹細胞の塊の酵素的消化は、ＩＶ型コラゲナーゼ、ディスパーゼ（登録商標）、又はアキュターゼ（登録商標）などの酵素に塊を供することによって実行され得る。大きな多能性幹細胞の塊の機械的解離は、塊を所定のサイズに破断するように設計されたデバイスを使用して実行され得る。更に又はあるいは、機械的解離は、針若しくはピペットを使用して手動で実行され得る。
本発明のいくつかの実施形態の方法に従う、懸濁内で多能性幹細胞を培養するために使用される培養管は、その中で培養される多能性幹細胞が、そのような表面に接着又は結合することができないように設計された内部表面を有する任意の組織培養管（例えば、多能性幹細胞を培養するために好適な純度等級を有するもの）であり得る（例えば、表面への結合又は接着を防ぐために非組織培養処理した管）。好ましくは、測定可能な培養系を得るために、本発明のいくつかの実施形態に従う培養は、温度、撹拌、ｐＨ、及び酸素などの培養パラメーターが、好適なデバイスを使用して自動的に監視され、制御される、制御された培養系（好ましくは、コンピュータ制御された培養系）を使用して達成される。所望の培養パラメーターが決定されると、系は、多能性幹細胞の増大及び分化を増すために必要とされる培養パラメーターの自動調整のために設定され得る。
多能性幹細胞は、複数の継代培養にかけて、それらの増殖性、多能性能力、及び核型安定性を維持しながら、動的条件下（すなわち、多能性幹細胞が懸濁培養系内にある間一定の運動に供される条件下）、又は非動的条件下（すなわち、静的培養）で培養され得る。
多能性幹細胞の非動的培養について、多能性幹細胞は、コーティングされた又はされていない、ペトリ皿、Ｔフラスコ、ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、又はＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＵＮＣ）内で培養され得る。多能性幹細胞の動的培養について、多能性幹細胞は、スピナフラスコ又は三角フラスコ、ステンレス鋼、ガラス又は単一使用プラスチック振とう器又は攪拌タンク管などの好適な管内で培養され得る。培養管は、制御ユニットに接続され、従って制御された培養系を呈し得る。培養管（例えば、スピナフラスコ又は三角フラスコ）は、連続的に又は断続的に撹拌され得る。好ましくは、培養した容器は、懸濁液中の多能性幹細胞を維持するために十分に撹拌される。
多能性幹細胞は、成長及び増大を促進するために十分な栄養素及び環境的刺激を提供する、任意の培地内で培養され得る。好適な培地は、Ｅ８、ＩＨ３、及びｍＴｅｓＲ１、又はＴｅｓＲ２を含む。培地は、栄養素供給を再充填し、細胞副産物を除去するために、定期的に変更され得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、培養培地は毎日変更される。
多能性幹細胞の供給源
本発明の方法において、任意の多能性幹細胞が使用され得る。使用され得る多能性幹細胞の例示的な型は、典型的には、妊娠約１０〜１２週よりも前であるが、必須ではない、妊娠中の任意の時期に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織、又は胎児組織などを含む、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株を含む。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））などである。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。
また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２等の多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体性細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、２０１１、１２：１６５〜１８５）。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。同様に好適なのは、例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ（Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．））などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又は例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）において開示される細胞などの成人ヒト体性細胞に由来する細胞である。本発明における使用のために好適な多能性幹細胞は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）；Ｍａｈｅｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１〜１０６，２００８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）；及び米国特許出願公開第２０１１−０１０４８０５号に記載される方法に従って誘導され得る。多能性幹細胞の他の供給源は、誘導された多能性細胞（ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６）を含む。本発明の方法における使用のために好適な細胞の他の供給源は、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖生物を含む。一実施形態において、臍帯組織由来細胞は米国特許第７，５１０，８７３号の方法を使用して得られ得、その開示の全体は、それが細胞の単離及び特性評価に関連するために、参照によって組み込まれる。別の実施形態において、胎盤組織由来細胞は、米国出願公開第２００５／００５８６３１号の方法を使用して得られ得、その開示の全体は、それが細胞の単離及び特性評価に関連するために、参照によって組み込まれる。別の実施形態において、羊水由来細胞は、米国出願公開第２００７／０１２２９０３号の方法を使用して得られ得、その開示の全体は、それが細胞の単離及び特性評価に関連するために、参照によって組み込まれる。
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞マーカーは、例えば、以下１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は全て）の発現を含む：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１。一実施形態において、本発明の方法における使用のために好適な多能性幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化のマーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４としても知られる）の発現を欠く。別の実施形態において、本発明の方法における使用のために好適な多能性幹細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される、ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のうちの１つ以上（例えば、１、２、又は全て）を発現する。
例示的な多能性幹細胞は、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む。一実施形態において、多能性幹細胞は、例えば、Ｈ１ ｈＥＳ細胞などのヒト胚性幹細胞である。代替の実施形態において、非胚性起源の多能性幹細胞が使用され得る。
多能性幹細胞から膵臓内胚葉系統のマーカー特徴を発現する細胞の分化
多能性幹細胞の増大
本発明は、以下に記載される実施形態のいくつかにおいて、幹細胞の単離及び培養、特に動的懸濁培養系において多能性を保持する幹細胞クラスタの培養に関する。多能性細胞クラスタは、分化して、機能的β細胞を産生し得る。
本発明の方法において使用される多能性幹細胞は、好ましくは、所望の終点に向けた分化の前に、動的懸濁培養系内で増大される。有利なことに、多能性幹細胞は、多能性を損失することなく、好適な培地内の懸濁液中で細胞のクラスタとして培養され、増大され得ることが発見されている。そのような培養は、多能性の損失を防ぐために、細胞又は細胞クラスタが移動させられ続ける、動的懸濁培養系内で生じ得る。有用な動的懸濁培養系は、攪拌、振とう、再循環、又は培地を通したガスのバブリングなどを介して、培養系の内容物を撹拌するための手段を備えた系を含む。そのような撹拌は、増大を亢進し、早期分化を防ぐための細胞クラスタの十分な運動が維持される限り、断続的又は連続的であり得る。好ましくは、撹拌は、特定の速度での羽根車回転などを介する連続的攪拌を含む。羽根車は、円形又は平坦な底部を有し得る。羽根車の攪拌速度は、クラスタが懸濁液中で維持され、沈殿が最小化されるようなものであるべきである。更に、羽根車ブレードの角度は、沈殿を回避するための細胞及びクラスタの上方運動を補助するために、調整され得る。更に、羽根車の型、角度、及び回転速度は全て、細胞及びクラスタが均一なコロイド懸濁液のようなものであるように調整され得る。
多能性幹細胞クラスタの懸濁培養及び増大は、使い捨て可能なプラスチック、再利用可能なプラスチック、ステンレス鋼又はガラス管、例えば、スピナフラスコ又は三角フラスコなどの適した動的培養系に、静的培養した幹細胞を移動することによって達成され得る。例えば、接着性静的環境、すなわち、平板又は皿表面において培養した幹細胞は、まずキレート剤又は酵素で処理することによって表面から除去され得る。好適な酵素は、Ｉ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）の商標名で販売される商業的に入手可能な製剤を含むが、これに限定されない。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、コラーゲン分解性又はタンパク質分解性酵素（甲殻類から単離される）を含み、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない、細胞離解溶液である。したがって、一実施形態において、酵素は、コラーゲン分解性酵素及び／又はタンパク質分解性酵素、あるいはコラーゲン分解性及びタンパク質分解性酵素を含む細胞離解溶液である。好適なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸ＥＤＴＡを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞培養系は、好ましくは、群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるまで、しかし培養系表面からの群体の完全な離解の前に、酵素又はキレート剤と共にインキュベートされる。一実施形態において、細胞培養系は、室温でインキュベートされる。一実施形態において、細胞は、２０℃を超える、２５℃を超える、３０℃を超える、３５℃を超える室温で、約２０℃〜約４０℃の間、約２５℃〜約４０℃の間、約３０℃〜約４０℃の間の温度、例えば、約３７℃で、インキュベートされる。一実施形態において、細胞は、少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０分間、例えば、約１〜約３０分間の間、約５〜約３０分間の間、約１０〜約２５分間の間、約１５〜約２５分間の間、例えば、約２０分間、インキュベートされる。一実施形態において、本方法は、処理の後に細胞培養系から酵素又はキレート剤を除去する工程を含む。一実施形態において、細胞培養系は、酵素又はキレート剤の除去の後、１度又は２度以上洗浄される。一実施形態において、細胞培養系は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ））などの適した培養培地で洗浄される。一実施形態において、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２，Ａｘｘｏｒａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＬＸ−２７０−３３３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤は、約１〜約１００μＭ、約１〜９０μＭ、約１〜約８０μＭ、約１〜約７０μＭ、約１〜約６０μＭ、約１〜約５０μＭ、約１〜約４０μＭ、約１〜約３０μＭ、約１〜約２０μＭ、約１〜約１５μＭ、約１〜約１０μＭ、又は約１０μＭの濃度であり得る。一実施形態において、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤は、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、又は少なくとも１０μＭ添加される。細胞は、スクレーパ又はゴム製ポリスマンで静的培養系の表面から引き上げられる。培地及び細胞は、ガラスピペット又は他の好適な手段を使用して動的培養系に移動され得る。好ましい実施形態において、動的培養系内の培地は、毎日変更される。
本発明は、一実施形態において、三次元の懸濁培養系内で多能性幹細胞を培養し、増大させる方法を提供する。特に、本方法は、これらの多能性幹細胞の凝集した細胞クラスタを形成することによる、多能性幹細胞の培養及び増大を提供する。細胞クラスタは、細胞を培養する前の、酵素（例えば、中性プロテアーゼ、例えば、ディスパーゼ（登録商標））又はキレート剤での多能性幹細胞培養系の処理の結果として、形成し得る。細胞は、好ましくは、攪拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養され得る。一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞のそのようなクラスタから、膵臓内胚葉系統のマーカー特徴を発現する細胞の形成を更に提供する。
好ましくは、細胞クラスタは、凝集した多能性幹細胞である。凝集した幹細胞は、１つ以上の多能性のマーカー、例えば、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、１つ以上の分化のマーカーの発現、例えば、ＣＸＣＲ４の発現を欠く。一実施形態において、凝集した幹細胞は、多能性のマーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、分化のマーカーＣＸＣＲ４の発現を欠く。
一実施形態は、懸濁培養系内で多能性幹細胞を細胞クラスタとして培養する方法である。細胞クラスタは、動的攪拌又は振とうされる懸濁培養系において培養された、凝集した多能性幹細胞である。細胞クラスタは、中性プロテアーゼ、例えば、ディスパーゼなどの酵素を細胞引き上げ剤として使用して、平面接着培養系から攪拌又は振とうされる懸濁培養系へと移動され得る。例示的な好適な酵素は、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を含むが、これに限定されない。細胞は、攪拌又は振とうされる懸濁培養系において、特に攪拌される懸濁培養系において、多能性を維持する。
本発明の別の実施形態は、懸濁培養系内で多能性幹細胞を細胞クラスタとして培養する方法であって、細胞クラスタが、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養系から移動され、攪拌又は振とうされる懸濁培養系において培養された、凝集した多能性幹細胞である、方法である。細胞クラスタは、攪拌又は振とうされる懸濁培養系において、特に攪拌される（動的に撹拌される）懸濁培養系において、多能性を維持する。
本発明の別の実施形態は、懸濁培養系内で多能性幹細胞を細胞クラスタとして培養する方法であって、細胞クラスタが、酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用して平面接着培養系から移動され、攪拌（動的）又は振とうされる懸濁培養系において培養された、凝集した多能性幹細胞である、方法である。細胞クラスタは、動的に撹拌される懸濁培養系において多能性を維持する。
本発明の細胞クラスタは、心性細胞などの中胚葉細胞、神経細胞などの外胚葉細胞、単一ホルモン陽性細胞、又は膵臓内胚葉細胞に分化し得る。本方法は、分化、例えば、膵臓内胚葉細胞の膵臓前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞への分化を更に含み得る。別の実施形態において、膵臓前駆細胞は、β細胞転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現を特徴とする。
一実施形態において、分化の工程は、懸濁培養系において少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１９６時間以上、好ましくは、約４８時間〜約７２時間の後に実行される。分化は、実施例において記載されるもののような、培地成分のステージ式進行を使用して実行され得る（例えば、表Ａ、並びに表１ａ及び１ｃを参照されたい）。
好ましい一実施形態において、三次元の細胞クラスタは、平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集した細胞クラスタに増大させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞のクラスタを平面接着培養系から動的懸濁培養系へと移動することと、によって産生される。更に好ましい一実施形態は、平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集した細胞クラスタに増大させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞のクラスタを平面接着培養系から動的懸濁培養系へと移動することと、動的撹拌される懸濁培養系において多能性細胞クラスタを分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、によって、動的に撹拌される懸濁培養系において多能性幹細胞を増大させ、分化させる方法である。
別の実施形態は、膵臓前駆細胞へと分化した、増大した多能性幹細胞クラスタの懸濁液から調製された分化した幹細胞を含む、移植可能な幹細胞由来の細胞産物である。より特に、移植可能な幹細胞由来の産物は、平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集した細胞クラスタに増大させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞のクラスタを平面接着培養系から動的懸濁培養系へと移動することと、動的に撹拌される懸濁培養系において多能性細胞クラスタを分化させることと、によって産生される。移植可能な幹細胞由来の細胞産物は、好ましくは、糖尿病を治療するために使用される。
別の実施形態において、本方法は、生体内での、機能的膵内分泌細胞への更なる成熟のための、糖尿病の動物内への移植を含む。
別の実施形態は、平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させることと、酵素を使用して、多能性幹細胞を平面接着培養系から除去することと、静的培養系内で、多能性幹細胞をマイクロキャリアに接着させることと、動的に撹拌される懸濁培養系において多能性細胞を増大させることと、動的に撹拌される懸濁培養系において多能性細胞を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、を含む、懸濁培養系において多能性幹細胞を増大させ、分化させる方法である。
マイクロキャリアは、接着細胞、特にマイクロキャリアについて、当該技術分野において既知の任意の形態であり得る。マイクロキャリアは、天然又は合成的に誘導される材料からなり得る。例は、コラーゲン系マイクロキャリア、デキストラン系マイクロキャリア、又はセルロース系マイクロキャリアを含む。例えば、マイクロキャリアビーズは、表面に結合して、マイクロキャリアに対して正に荷電した表面を提供するカチオントリメチルアンモニウムを有する、修飾ポリスチレンビーズであり得る。ビーズ直径は、約９０〜約２００μｍ、あるいは約１００〜約１９０μｍ、あるいは約１１０〜約１８０μｍ、あるいは約１２５〜１７５μｍの範囲の直径であり得る。マイクロキャリアビーズはまた、架橋されたデキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層であり得る。マイクロキャリアビーズは、ガラス、セラミックス、ポリマー（ポリスチレンなど）、又は金属であり得る。更に、マイクロキャリアは、シリコン又はコラーゲンなどのタンパク質などでコーティングされても、又はコーティングされなくてもよい。更なる態様において、マイクロキャリアは、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチン、及びコラーゲンを含むが、これに限定されない、マイクロキャリアへの細胞の結合を増す、及びマイクロキャリアからの細胞の放出を増す化合物から構成されてもよく、あるいはそれらでコーティングされてもよい。実施例は、低レベルの生物学的に関連する電気を産生する、亜鉛及び銅の微粒子ガルバーニ電気連結を有するマイクロキャリア、又は常磁性カルシウムアルギン酸マイクロキャリアなどの、常磁性のマイクロキャリアなどの、微小電流を有するマイクロキャリアを更に含む。
いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉細胞の集団は、多能性細胞クラスタの工程式分化によって得られる。いくつかの実施形態において、多能性細胞はヒト胚性多能性幹細胞である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明は、動的懸濁培養系内でステージ３〜５の細胞を培養することを含む、多能性細胞を分化させる段階的な方法に関する。いくつかの実施形態において、生成される膵臓内胚葉集団は、生体内での、機能的膵内分泌細胞への更なる成熟のために、糖尿病の動物内に移植される。本発明はまた、本発明の方法における使用のための系又はキットを提供する。
本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な細胞又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって得られる細胞又は細胞の集団を提供する。
本発明は、治療の方法を提供する。特に、本発明は、糖尿病を罹患しているか、あるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。
本発明はまた、治療の方法における使用のために、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。特に、本発明は、糖尿病を罹患しているか、あるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者の治療の方法における使用のために、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。糖尿病は、１型又は２型糖尿病であり得る。
一実施形態において、治療の方法は、本発明の方法によって得られる、又は取得可能な細胞を患者に埋め込むことを含む。
一実施形態において、治療の方法は、生体外で、多能性幹細胞をステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、又はステージ５の細胞に分化させることと、例えば、本明細書に記載するように、分化した細胞を患者内に埋め込むことと、を含む。
一実施形態において、本方法は、例えば、本明細書に記載するように、多能性幹細胞を分化させる工程の前に、多能性幹細胞を培養する工程を更に含む。
一実施形態において、本方法は、埋め込みの工程の後に、生体内で細胞を分化させる工程を更に含む。
一実施形態において、患者は哺乳類、好ましくはヒトである。
一実施形態において、細胞は、分散した細胞として埋め込まれる、又は肝門脈内に注入され得るクラスタへと形成され得る。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば、肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
生体内に埋め込まれた細胞の更なる分化、生存又は活性を増すために、成長因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で（in situ）で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の成長因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。
埋め込みに使用される細胞の量は、患者の状態及び治療に対する反応を含む、いくつかの様々な因子に依存し、当業者により決定され得る。
一実施形態において、治療の方法は、埋め込み前に、細胞を三次元の支持体内に取り込むことを更に含む。細胞は、患者に埋め込む前に、生体外でこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、生体外で更に培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。
本発明の特定の実施形態において、以下の１つ以上が本発明の方法において使用され得る。
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込む
ものとする。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に
より限定されるものではない。
本出願は、例えば以下の発明を提供する。
[１] 三次元の細胞クラスタを産生する方法であって、
ａ．平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させる工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を凝集した細胞クラスタに増大させる工程と、
ｃ．酵素又はキレート剤を使用して、前記多能性幹細胞のクラスタを、前記平面接着培養系から動的懸濁培養系に移動する工程と、を含み、
三次元の細胞クラスタが形成される、方法。
[２] 前記細胞クラスタが、中性プロテアーゼ又はアキュターゼから選択される酵素を使用して、平面接着培養系から前記懸濁培養系に移動される、[１]に記載の方法。
[３] 前記酵素が、中性プロテアーゼである、[２]に記載の方法。
[４] 前記細胞のクラスタが、多能性を維持する、[１]に記載の方法。
[５] 前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、[１]に記載の方法。
[６] 前記細胞が、Ｈ１ ｈＥＳである、[５]に記載の方法。
[７] 前記凝集した細胞が、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、ＣＸＣＲ４の発現を欠く、[１に記載の方法。
[８] 前記細胞クラスタが、キレート剤を使用して、平面接着培養系から前記懸濁培養系に移動される、[１]に記載の方法。
[９] 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、[８]に記載の方法。
[１０] 動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増大させ、分化させる方法であって、
ａ．平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させることと、
ｂ．前記多能性幹細胞を凝集した細胞クラスタに増大させることと、
ｃ．酵素又はキレート剤を使用して、前記多能性幹細胞のクラスタを、前記平面接着培養系から動的懸濁培養系に移動することと、
ｄ．動的に撹拌される懸濁培養系内で前記細胞クラスタを維持することであって、前記幹細胞クラスタが、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、ＣＸＣＲ４の発現を欠く、維持することと、
ｅ．動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性細胞クラスタを分化させて、膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は心筋細胞前駆細胞集団を生成することと、を含む、方法。
[１１] 前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、[１０]に記載の方法。
[１２] 前記方法が、β細胞転写因子を発現する膵臓前駆細胞を生成する、[１０]に記載の方法。
[１３] 前記転写因子が、ＰＤＸ１及び／又はＮＫＸ６．１である、[１０]に記載の方法。
[１４] [１０]に記載の方法によって産生される、前記分化した膵臓前駆細胞の集団を含む、移植可能な幹細胞由来の細胞産物。
[１５] 凝集した多能性幹細胞クラスタの分化のためのバイオリアクター培養系であって、
懸濁培地内で維持される多能性幹細胞クラスタであって、前記幹細胞クラスタが、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、ＣＸＣＲ４の発現を欠く、多能性幹細胞クラスタと、
ガラス攪拌懸濁バイオリアクターと、
分化培地と、
温度、ｐＨ、及び酸素を調節するための制御と、を含む、バイオリアクター培養系。
[１６] 前記懸濁培地が、ｍＴｅＳＲ培地である、[１５]に記載のバイオリアクター培養系。
[１７] 動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増大させ、分化させる方法であって、
ａ．平面接着培養系で多能性幹細胞を成長させる工程と、
ｂ．酵素を使用して、前記多能性幹細胞を前記平面接着培養系から除去する工程と、
ｃ．前記多能性幹細胞を静的培養物内のマイクロキャリアに接着させる工程と、
ｄ．前記マイクロキャリアに接着される前記多能性細胞を、動的に撹拌される懸濁培養系内で増大させる工程と、
ｅ．動的に撹拌される懸濁培養系内の前記多能性細胞を、膵臓前駆細胞集団に分化させる工程と、を含む、方法。
[１８] 前記動的撹拌される懸濁培養系が、スピナフラスコを含む、[１７]に記載の方法。
[１９] インスリンを産生する膵臓細胞を産生するための方法であって、前記インスリン産生細胞が、懸濁培養系内で多能性幹細胞から産生され、前記多能性幹細胞が、懸濁培養系内で凝集体として培養される、方法。
[２０] 前記懸濁分化環境が、およそ無酸素〜周囲の約３０％の酸素範囲、０．１％〜約２％の範囲内の脂質、又はこれらの組み合わせを含む、[１９]に記載の方法。
[２１] 前記細胞が、約１１ｍＭ未満のグルコースの存在下で懸濁培養系内にある、[１９]に記載の方法。
[２２] 前記細胞が、約２５ｍＭを超えるグルコースの存在下で懸濁培養系内にある、[１９]に記載の方法。
[２３] 平面又は接着培養系から多能性細胞の懸濁培養を開始するための非酵素的方法であって、移動される前記細胞の前記多能性が維持され、前記平面培養物をキレート剤で処理することを含む、方法。
[２４] 分化のために十分な条件下で、多能性細胞を凝集した細胞クラスタとして培養することを含む、ブラキュリの誘導を増加させるための方法。
[２５] 細胞周期のＧ０／Ｇ１相における細胞の百分率を増加させるための方法であって、前記方法が、小分子を使用して、多能性細胞を凝集した細胞クラスタとして培養して、多能性状態からの分化を誘導することを含む、方法。
[２６] 前記小分子が、ＭＣＸである、[２５]に記載の方法。
[２７] １８〜３０時間以内の胚体内胚葉を通して、懸濁培養系内で多能性細胞を分化させるための方法であって、前記培養培地が、アクチビンＡ、ＷＮＴ３Ａ、又はいかなるＴＧＦβ族も含まず、前記方法が、少なくとも１つの小分子を含む培養培地を含む、方法。
[２８] 前記小分子が、ＭＣＸである、[２７]に記載の方法。
[２９] 懸濁培養系内の細胞を胚体内胚葉に分化させる方法であって、前記培養培地が、ＭＣＸ及びＧＤＦ８、又はＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡを含む、方法。
[３０] 無酸素を誘導することによって分化させるために、閉鎖系懸濁培養系内の多能性細胞の分化を指向する方法。
[３１] 懸濁培養系内の細胞の、膵臓運命への分化を指向する方法であって、前記培養培地が、ノギンを含まない、方法。
[３２] 前記培養培地が、プロテインキナーゼＣ作動薬、ＴＰＰＢ、又はこれらの組み合わせを含有する、[３１]に記載の方法。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に図示される。
（実施例１）
ディスパーゼ／中性プロテアーゼでの、細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁及びクラスタリング
継代培養４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を、ＰＢＳ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１度洗浄し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃ １１３３０（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））内で、Ｄｉｓｐａｓｅ（商標）（中性プロテアーゼ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ ＬＬＣ， Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｄ４８１８（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））の１ｍｇ／ｍＬの溶液で処理した。群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるが、培養系表面からの群体の完全な離解の前まで細胞を、３７℃で１５〜２５分間インキュベートした。その後、ディスパーゼを除去し、１０μＭのＹ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＬＸ−２７０−３３３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ））培地で、培養皿を２度洗浄した。その後、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を、５ｍＬ／６０ｃｍ2で培養皿に添加し、スクラッパー又はゴム製ポリスマンで表面から細胞を引き上げた。その後、ガラスピペットを使用して、培地及び細胞を５０ｍＬの円錐チューブに移動し、クラスタを０．９Ｎ（９０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心分離した。
遠心分離の後、培地を吸引し、細胞を静かに再懸濁し、全平面培養系のうち、２２５〜２４０ｃｍ２につき１０μＭのＹ−２７６３２を含有する１２ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（１つのＴ２２５フラスコ又は４枚の１０ｃｍ皿に等しい、約９０００万個の細胞）内で短時間微粉化した。その後、１０μＭのＹ−２７６３２を有する、２ｍＬ／ウェルの新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｕｌｔｕｒｅ ６ウェルの皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔａｌｏｇ＃３４７１（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））に細胞懸濁液を移動（１ｍＬ／ウェル）した。この様式で引き上げた細胞は、引き上げた断片の平均直径がおよそ２０〜３０マイクロメートル（図１ａ）で、それぞれが細胞の塊からなり、単層の断片に類似した。これらの単層断片を、懸濁液中で２時間インキュベート（インキュベーション時間は、０．５〜４時間の範囲であり得る）し、この時点で断片の凝集体を観察した。その後、１０ｍＬのガラスピペットで凝集体を短時間微粉化し、低結合平板において一晩インキュベートした（凝集体は、懸濁液中に直接進行し得る）（凝集体はまた、非処理の細胞培養系プラスチック及び標準組織培養処理したプラスチック内でインキュベートされ得る）。
一晩のインキュベーション（１８〜２４時間）後、５０ｒｐｍ（３０〜８０＋ｒｐｍの範囲であり得る）で攪拌される、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する、１２５ｍＬのスピナフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ４５００−１２５（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ））に細胞及び培地を直接移動して、約７５ｍＬの最終体積を作製した。培地を４日間毎日変更した。培養系内に置いてから４日後に多能性を決定し、フローサイトメトリー結果は、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示したが、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど示さなかった。図１ｂを参照されたい。これらのデータは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞を、細胞クラスタとして、ディスパーゼを細胞引き上げ剤として懸濁培養系形式からうまく移動させ、攪拌される（動的）懸濁培養系において多能性を維持し得ることを実証する。本実施例はまた、同等の結果で、平板及び三角フラスコを有する攪拌される懸濁系よりもむしろ、振とうされる系において実行され得る。
懸濁培養系内に置いてから４日間後（分化はまた、凝集体の形成の２４〜１２０時間後に開始し、好ましくは、分化の開始前に２〜３日間培養し得る）、培地成分のステージ式進行で多能性細胞凝集体を分化させて、細胞の膵臓運命の形成を誘導した。凝集体の分化のために、スピナ撹拌を６５ｒｐｍの速度に上げた。培地及び成分を、表１ａに示す。
ステージ１の終了時の試料に、フローサイトメトリー及びＰＣＲを施行した。懸濁液分化培養系は、ステージ１（図１ｃ）で、疎性の凝集体の、均一かつ均質な細胞の集団を形成し、多能性のマーカー（ＣＤ９）の発現はほぼ除去されたが、胚体内胚葉分化のマーカーはかなり高く、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）について９７．２％陽性、及びＣＤ９９について９７．３％陽性であった（図１ｄ）。これらの結果は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比して、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、並びに胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果と相関した（図１ｅ）。
その後、ＴＧＦ−β族員、ＧＤＦ８を除去し、ＦＧＦ７を培地に添加することによって、胚体内胚葉クラスタを原始前腸に更に分化させた。ＦＧＦ７での３日間の培養後、高いグルコース（２５ｍＭ）及び低濃度の脂質に富むウシ血清アルブミン（Albumax）を含有する培地、又は比較的低いグルコース濃度（８ｍＭ）及び２％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する培地のいずれかへの、オールトランスレチノイン酸の添加によって、膵臓ＰＤＸ１発現運命にクラスタを分化させた。これらの培地への成分の添加の詳細を、表１ａに列記する。分化の終了時で、膵臓前駆細胞のマーカーの発現について、試料を分析した。いずれかの条件、すなわち、フローサイトメトリーによって測定される、グルコース＋２％のＦＡＦ−ＢＳＡ（Ａ）又は高いグルコース＋０．１％のＡｌｂｕｍａｘ（Ｂ）で分化させたクラスタは、機能的β細胞のために必要とされる転写因子である高レベルのＮＫＸ６．１、及び高レベルの内分泌膵臓マーカー（シナプトフィジン及びクロモグラニンなど）を発現することが観察された（表１ｂ）。これらの結果は、条件Ａ及びＢ両方からの試料内で発現した、高レベルの複数の膵臓前駆体遺伝子を示す、ＲＴ−ＰＣＲ結果と一貫した（データ図示せず）。
それらが胚体内胚葉（ＤＥ）（図１ｃ）から原始前腸への、及び膵臓内胚葉（図１ｆ）への分化を通して進行した際の、細胞クラスタの典型的な形態は、細胞及び細胞クラスタに対する可視の形態的な変化を実証した。典型的に、多能性クラスタは、位相差顕微鏡法では高密度かつ暗く見え、その後、細胞がステージ２において原始前腸へと進行するにつれて外観がより疎性になる。この形態は、続くオールトランスレチノイン酸処理を逆転させ、クラスタは、平滑なクラスタ境界を有して、更に高密度かつ均一になる。
ステージ４を通して条件Ｂに従って分化させた細胞を、ＡＬＫ５阻害剤を含有するステージ５培地内で更に５日間保持した（表１ｃを参照されたい）。培養系におけるこの追加の成熟は、内分泌マーカー発現：ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、及びＰＣＳＫ１における有意な増加をもたらした。その後、ＩＡＣＵＣ承認済研究プロトコルに従って、細胞クラスタをＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜内に埋め込み、マウスを２０週間観察して、空腹／供給でＣ−ペプチドを２〜４週間毎に測定した。埋め込みの４週間後、２０時間の空腹、及びその後グルコース刺激の後、Ｃ−ペプチドは検出可能ではなかった。６週目までに、５匹中２匹の陽性マウスがいくらかの（０．０８７ ＆ ０．１３７ｎｇ／ｍＬ）ヒトＣ−ペプチドを示し、１０週目までに、５匹中５匹のマウスがＣ−ペプチドに対して陽性（０．０８５〜０．２９１ｎｇ／ｍＬ）であった。１６週目で、２０時間の空腹及びグルコース刺激の後、４匹のマウス全て（４／４）がＣ−ペプチド発現に対して陽性（０．３７７〜３．６２７ｎｇ／ｍＬ）であった。
これらの結果は、多能性細胞凝集体が形成され、その後、懸濁培養系内で、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のようなβ細胞転写因子の発現を特徴とする膵臓前駆細胞集団に分化し得ることを示す。更に、生体内に埋め込んで、成熟させた分化した細胞クラスタは、生理学的に適したレベルでのグルコースチャレンジに反応して、インスリンを発現した。
（実施例２）
ＥＤＴＡでの、細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁及びクラスタリング
継代培養４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を、ＰＢＳ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１度洗浄し、非酵素的細胞引き上げ／継代培養剤であるＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で処理した。細胞を、室温で８分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡを除去し、１〜２分以上（９〜１０分間の全ＥＤＴＡ露出）の後、１０μＭのＹ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＬＸ−２７０−３３３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で平板を濯ぎ、ガラスピペットを使用して、除去された細胞を５０ｍＬの円錐チューブ内に回収した。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で平板の濯ぎを更にもう１度実行し、除去された細胞と共に貯留した。室温での９〜１０分間のＥＤＴＡへの露出の後、いくつかの細胞は平板上に留まり、引き上げられた細胞は、単一の細胞懸濁液に完全には脱凝集されなかったことに留意すること。代わりに、表面から小さな凝集体として細胞を除去した。その後、ガラスピペットを使用して、培地及び細胞を５０ｍＬの円錐チューブに移動し、細胞計数を実行した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ−Ｃｈｅｍｅｔｅｃ，Ｃａｔ＃ＹＣ−Ｔ１００（Ｄｅｎｍａｒｋ））。必要に応じて、１０μＭのＹ−２７６３２を含有する追加のｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を添加して、１００〜１５０万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度を作製した。
クラスタは疎性に凝集され、ペレットに遠心分離し、ピペットで再懸濁すると単一の細胞に解離するため、細胞を遠心分離しなかった。代わりに、チューブ内の培地及び細胞を、均一な懸濁が形成されるまで静かに渦流した。所望の場合、更に、ＥＤＴＡ処理の期間を延長し、細胞をほぼ単一の細胞懸濁液にしてもよい。その後、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内に、ガラスピペットを使用して、３ｍＬ／ウェルで、２枚の非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に細胞懸濁液を移動した。細胞を懸濁液中で２時間インキュベートし、この時点で懸濁液を観察した。その後、ガラスピペットでの静かなピぺッティングによって凝集体を微粉化して、大きな凝集体を破壊し、均質、均一なクラスタ懸濁液を作製し、その後撹乱せずに一晩インキュベートした。
その後、１８〜２４時間後、細胞及び培地を、５０ｍＬの円錐チューブ内で０．９Ｎ（９０ｇ）（ｒｃｆ）で３分間沈降させた。使用済みの培地上清を放棄し、新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１内で細胞凝集体を懸濁させ、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で、５５ｒｐｍで攪拌されるスピナフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔａｌｏｇ＃４５００−１２５（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ））に懸濁液を移動した。培地を２日間毎日変更した。攪拌される懸濁培養系内に置いてから２日後、分化培養系への遷移前に多能性を決定した。ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー結果を、散布プロット形式で図２ａに示す。これらのデータは、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示すが、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど又は全く示さない。これらの結果は、Ｈ１ ｈＥＳ細胞が、非酵素的引き上げ方法を使用して、平面接着培養系形式から懸濁培養系へと移動され、動的撹拌される懸濁培養系において多能性を維持し得ることを示す。
懸濁培養系に置いてから２日後、培地成分のステージ式進行で多能性細胞凝集体を分化させて、細胞の膵臓運命の形成を誘導した。スピナ撹拌を、５５ｒｐｍの速度に維持した。培地及び成分を表２ａに示す。
ステージ１の終了時の試料に、フローサイトメトリー及びＰＣＲを施行した。懸濁液分化培養系は、ステージ１（図２ｂ）で、疎性の凝集体の、均一かつ均質な細胞の集団を形成し、多能性のマーカー（ＣＤ９）の発現はほぼ除去されたが、胚体内胚葉分化のマーカーであるＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）はかなり高く、３つのスピナフラスコにわたって、９５．９％±１．８標準偏差（図２ｃ）であった。これらの結果は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比して、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、並びに胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果と相関した（図２ｄ）。
その後、スピナフラスコからの胚体内胚葉クラスタを貯留し、別のスピナフラスコ又は三角フラスコ（振とうされる撹拌系）のいずれかに分配し、ＧＤＦ８を除去し、培地にＦＧＦ７を添加することによって、原始前腸への更なる分化を指向した。ＦＧＦ７での３日間の培養後、比較的低いグルコース濃度（８ｍＭ）及び２％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する培地のいずれかへの、オールトランスレチノイン酸の添加によって、クラスタを膵臓ＰＤＸ１発現運命に分化させた。これらの培地への成分の添加の詳細を、表２ａに列記する。分化の終了時で、膵臓前駆細胞のマーカーの発現について、試料を分析した。フローサイトメトリーを使用して、機能的β細胞のために必要とされる転写因子である、高レベルのＮＫＸ６．１、並びにシナプトフィジン及びクロモグラニンなどの高レベルの内分泌膵臓マーカー（表２ｂ及び図２ｅ）が、両方の懸濁形式で観察された。これらの結果は、スピナフラスコ形式又は三角フラスコ形式で生成した試料内で発現した、非常に類似した高レベルの複数の膵臓前駆体遺伝子を示すＲＴ−ＰＣＲ結果と一貫した（図２ｆ）。
これらの結果は、多能性細胞凝集体が形成され、その後、攪拌される系又は振とうされる懸濁系を含む複数の懸濁培養系形式の懸濁培養系内で分化して、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のようなβ細胞転写因子の発現を特徴とする膵臓前駆細胞集団を生成し得ることを実証する。
（実施例３）
細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の、懸濁クラスタリング及び連続的懸濁継代培養
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした組織培養処理したポリスチレン上で成長させた、継代培養４０での、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を、ＰＢＳ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２度洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（１部のＰＢＳ対１部のＡｃｃｕｔａｓｅ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））の半強度の溶液で処理した。細胞を、室温で３分半インキュベートした。（Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、コラーゲン分解性及びタンパク質分解性酵素（甲殻類から単離される）からなる細胞離解溶液であり、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない）。その後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を除去し、更に３分後（６分半の全アキュターゼ露出）、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で平板を濯ぎ、ガラスピペットを使用して、除去された細胞を５０ｍＬの円錐チューブ内に回収した。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で平板の濯ぎを更にもう１度実行し、除去された細胞と共に貯留した。いくつかの細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）への露出後に平板上に留まり、引き上げられた細胞は、単一の細胞懸濁液に完全には脱凝集されなかった。むしろ、表面から小さな凝集体として細胞を除去した（図３ａ）。その後、ガラスピペットを使用して、培地及び細胞を５０ｍＬの円錐チューブに移動し、細胞計数を実行した。必要に応じて、１０μＭのＹ−２７６３２を含有する追加のｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を添加して、１００〜１５０万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度を作製した。
クラスタは疎性に凝集され、ペレットに遠心分離し、ピペットで再懸濁すると単一の細胞に解離するため、細胞を遠心分離しなかった。代わりに、チューブ内の培地及び細胞を、均一な懸濁が形成されるまで静かに渦流した。その後、ガラスピペットで、３ｍＬ／ウェルで、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内の超低結合培養系６ウェルの皿に細胞懸濁液を移動した。細胞を懸濁液中で９０分間インキュベートし、この時点で懸濁液を観察した。その後、凝集体を短時間微粉化し、５５ｒｐｍで攪拌される２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する１２５ｍＬのスピナフラスコに直接移動した（全最終体積は、約７５ｍＬであった）。培地を３日間毎日変更し、培養系内に置いてから３日目に多能性を決定した。クラスタの位相差顕微鏡画像は、静的懸濁培養系内に置いてから９０分後に形成され、培養系内で３日間にわたって増大した、クラスタの均一、球状集団を示す（図３ｂ）。懸濁培養系内に置いてから３日目の終了時点で、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４のフローサイトメトリー結果によって、細胞を多能性についてアッセイした。細胞は、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）の高い発現を維持したが、分化のマーカーであるＣＸＣＲ４の発現はほとんどなかった（表３）。これらのデータは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞が、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）などの酵素的引き上げ方法を使用して、平面接着培養系形式から懸濁培養系へと移動され、動的撹拌される懸濁培養系において多能性を維持し得ることを示す。
その後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離を使用して、更に２０回の継代培養のために、多能性クラスタを連続的に継代培養した。各継代培養で、５０００万個の細胞を５０ｍＬの円錐チューブ内で２分間重力沈殿させ、ＰＢＳで２度洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）の添加の２及び４分後にチューブを静かに渦流させる３７℃の水浴内で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）の半強度の溶液で処理した。６分間のインキュベーションの後、細胞ペレットを撹乱せずに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）をチューブから吸引した。その後、細胞を更に３分間インキュベートした（９分間の全Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）露出）。その後、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でチューブを濯ぎ、ガラスピペットを使用して２度微粉化し、７０マイクロメートルの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｃａｔ＃３５２３５０（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に懸濁された細胞を通過させた。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で、チューブの２度の追加の濯ぎを実行し、細胞ストレーナを通過させた。
チューブ内の培地及び細胞を、均一な懸濁液が形成されるまで静かに渦流した。その後、ガラスピペットで、３ｍＬ／ウェルで、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内の超低結合培養系６ウェルの皿に細胞懸濁液を移動し、懸濁液中で２時間インキュベートし（０〜２８時間試験）、この時点で、培地の８０ｍＬの最終体積で、ガラススピナフラスコに凝集体を移動した。あるいは、細胞懸濁液を、５５ｒｐｍで撹拌されるスピナフラスコ内、又は４０ｒｐｍで振とうされる三角フラスコ内に直接定置してもよく、培地の８０ｍＬの最終体積で、攪拌される懸濁液（図３ｃ）内でクラスタが形成された。
この連続的継代培養方法を使用して、各継代培養でおよそ１：３の分割比で、細胞を２０回継代培養した。フローサイトメトリーによって、各継代培養で多能性を測定し、染色体１２及び１７について、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを使用して、核型を決定した。２つの染色体は、ｈＥＳ細胞内で潜在的に不安定であると特定される。ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー結果を散布プロット形式で示し、多能性のマーカーの高い発現を示し、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現をほとんど又は全く示さなかった一方で、染色体１２及び１７のＦＩＳＨアッセイは、正常な複製数を示した。これらのデータは、非哺乳類、酵素的細胞解離方法である、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用する所定の連続的継代培養で、懸濁培養系内でＨ１ ｈＥＳ細胞が維持され得、２０回の継代培養にわたって、最初の入力細胞につき１×１０9細胞を生成する動的撹拌される懸濁培養系において多能性及び安定な核型を維持することを示す。（ＥＤＴＡもまた、６回の継代培養のこの連続的懸濁液のために使用され得る）。
（実施例４）
懸濁培養したヒト胚性の指向された分化
細胞株Ｈ１の幹細胞
継代培養４０での、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用して平面接着培養系から引き上げ、懸濁培養系形式に移動した。実施例３に記載される方法を使用する３０回の継代培養のために、動的撹拌される懸濁培養系において細胞を維持した。
表３に示すように、最初の２０回の継代培養を通して多能性を確認し、フローサイトメトリーによって測定される、安定な高レベルの多能性マーカーは培養を通して維持された。多能性を確認し、糖尿病の治療のための細胞供給源を提供するそれらの能力を実証するために、正常な膵臓発達を繰り返すことを意図した、モルフォゲン又は成長因子を含有する異なる培地の工程式進行を通して、動的撹拌される懸濁培養系において細胞を膵臓前駆体に分化させた。このプロセスは、高いＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現を特徴とする膵臓前駆細胞集団を生じさせる。これらの細胞が移植される際、それらは、グルコースに反応してインスリンを分泌し、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおいて正常血糖を維持することができる、機能性グルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟した。これについては、図４Ｃ及び表４Ｃを参照されたい。
これらの膵臓前駆細胞を生成するために、１６回の継代培養のために動的撹拌される懸濁培養系において増大させ、維持した、Ｈ１ヒト胚性幹細胞を、実施例３に記載される方法を使用して、分化させた。要約すると、細胞を３０回の継代培養分増大させ、これらの継代培養のうちの最初の２０回を多能性について試験した。１６回目の継代培養で細胞を分化させた。クラスタ形式の多能性細胞を、４℃で３時間、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地からＦＢＣ溶液（表４ａ）へと移動した。その後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ−ＤＣＵ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）制御ユニットによって調節される、３リットルのガラス懸濁バイオリアクターに細胞クラスタを移動し、表４ｂに従って、５５万個の細胞／ｍＬで、分化培地内で懸濁した。細胞を、温度、ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）を調節された、閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター（Ｆｅｒｍｐｒｏｂｅ ｐＨ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ２２５ｍｍ，Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｆ−６３５、及びｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ Ｏｘｙｐｒｏｂｅ １２ｍｍ Ｓｅｎｓｏｒ，ｍｏｄｅｌ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ−１４５ ｆｒｏｍ Ｂｒｏａｄｌｅｙ Ｊａｍｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））内で１４日間維持した。
施行を通して、≦１．６リットルの全培地体積内のＣＯ2流量の調節によって、培地の重炭酸塩レベルを３．６４ｇ／Ｌに維持し、ｐＨをｐＨ ７．４に維持した。Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ制御システムの制御の下、ステージ１について２０％の溶存酸素目標値、及びステージ２以降について３０％の溶存酸素目標値で、１５０ｃｃ／分の一定のガス流量で、ＣＯ2、空気、及びＯ2でバイオリアクターヘッドスペースを連続的に灌流した。溶存酸素内容物に反応して酸素流量を調節し、ＣＯ2流量をｐＨに反応して調節した。電熱ジャケットによって、施行を通して温度を３７℃に維持した。施行の開始時点で、各培地交換（１回の交換につき、培地の９３％を除去）について、羽根車（７０ｒｐｍで動作する３インチステンレス鋼ピッチブレード羽根車）を停止し、閉鎖された系を維持するために、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ溶接機を使用する、Ｃ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングに接続したバイオリアクター内の蠕動ポンプによって、ディップチューブを通して、培地を除去するか、又は添加した。分化の各ステージの終了時点で、細胞／クラスタの画像を撮影し、フローサイトメトリー試料を回収し、ステージ１、３日目、及びステージ２の終了の３日後でのＣＸＣＲ４発現についてアッセイした（図４ａ）。分化の開始（表３、継代培養１６）時点で、ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団からＣＸＣＲ４発現（細胞の９８．５％がＣＸＣＲ４陽性、図４ｂ）細胞の集団へのほぼ完全な集団遷移が観察された。その後、ステージ２の終了の３日後、これらの細胞をほぼＣＸＣＲ４陰性状態に遷移し（細胞の７．０％がＣＸＣＲ４陽性）、ステージ３の終了時点までに、細胞はほとんど完全にＣＤ５６陽性状態に遷移した。ステージ４の４日目の分化プロセスの終了時点で、細胞はＰＤＸ１発現について８８．５％陽性（図４ｂ）であり、膵内分泌細胞（３３．５％クロモグラニン陽性）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１について６５．７％陽性）との混合物と一貫した発現パターンを示した。このステージ特異的マーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓細胞への効率的なステージ式分化を示す。分化プロセスの終了時点で、２７７万個の細胞／ｍＬが生成され（１．５リットルで４１億個の細胞）、入力されたそれぞれのｈＥＳ細胞につき５個の分化した細胞の、総質量の増大を示した。
施行の終了時点で、遠心分離及び洗浄のために５００ｍＬを除去し、生着、成熟、及び機能の動物モデルにおいて試験した。残りの１０００ｍＬの細胞懸濁液を、ｋ−Ｓｅｐ４００ｓｙｓｔｅｍ（ｋ−Ｓｅｐ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ））内で処理して、完全に閉ループ系において細胞産物を洗浄、濾過、及び濃縮した。細胞産物を、１リットルの開始体積から、４１００万個の細胞／ｍＬの最終濃度の５０ｍＬの濃縮された細胞に濃縮した。その後、自動化バイアル充填機（Ｆｉｌｌ−Ｉｔ，ＴＡＰ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ ＵＫ））を使用して、１．２ｍＬの充填体積を有する２４のバイアル内に、これらの濃縮された細胞を分注し、液体窒素冷凍庫内に定置することによって凍結した。
洗浄され、標準遠心分離によって濃縮された５００ｍＬの分化した細胞を、腎臓被膜下に直接定置するか、又は皮下に埋め込まれた免疫保護マクロ封入デバイス（Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ（商標）（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））内に定置するかのいずれかで、１匹のＳＣＩＤ−Ｂｇマウスにつき５００万個の細胞の用量で移植した（１つの条件につき、６体の動物）。埋め込みの１２週目後までに、埋め込まれた細胞は、空腹及びその後の供給に反応して、ＥＬＩＳＡ（ヒトＣ−ペプチドカスタムＥＬＩＳＡ Ｍｅｒｃｏｄｉａ ｃａｔ＃ １０−１１４１−０１）によって検出される、有意なレベルの循環ヒトＣ−ペプチド（＞０．１ｎｇ／ｍＬ）を発現し、１６〜２０週目までに、動物は１ｎｇ／ｍＬを超える循環Ｃ−ペプチドを有した（表４ｃ）。
埋め込みの２７週間（１９０日間）後に、デバイス封入された免疫保護移植片を有する２体の動物を、単一の高用量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）でそれぞれ処理して、全ての内因性マウスβ島細胞を選択的に殺し、糖尿病を誘導した（２５０ｍｇ／Ｋｇ）。対照動物において真性糖尿病を誘導するために十分なＳＴＺ処理の以後２週間、移植された動物の血糖レベルは、正常範囲（＜１５０ｍｇ／ｄＬ）内に留まった。その後、埋め込み後の２９週目かつＳＴＺ投与の２週間後、２匹の動物をグルコース感受性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）について試験し、グルコース投与に反応する循環ヒトＣ−ペプチドにおける著しい増加を示した。更に、埋め込みの２０９日間（２９．５週間）後に移植片のそれぞれを除去した時、動物の血糖レベルは＞５００ｍｇ／ｄＬへと劇的に増加した。
これらの結果は、糖尿病を治療するためのヒト胚性幹細胞由来の細胞産物が、増大及び分化された幹細胞の懸濁液から調製され得ることを実証する。産物は、測定可能な、攪拌される、閉ループバイオリアクター系において生成され得、商業的ｃＧＭＰ製造のために必要とされる、細胞産物は閉ループ洗浄及び濃度で処理され得る。このヒト胚性幹細胞由来の細胞産物は、血糖、及び細胞治療の除去時の糖尿病の状態への回帰を調節する能力である、ＧＳＩＳ応答能に示されるような、広く使用される糖尿病の動物モデルにおける糖尿病を治療し得る。
a ＵＳＰ＝米国薬局方
b ＮＦ＝薬局方
c ＦＣＣ＝食品化学物質規格集
d ＮＡ＝該当なし
e ＡＣＳ＝米国化学会

（用語：時間０＝新しいステージの第１の供給；時間２４、４８、又は９６時間＝新しいステージ培地後の時間）
（実施例５）
細胞株Ｈ１の接着性培養したヒト胚性幹細胞の、懸濁形式での指向された分化
継代培養４１での、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養系から引き上げ、実施例２に記載される方法を使用して懸濁培養系形式に移動した。
図５ａに示すフローサイトメトリーによって細胞凝集体の多能性を測定し、細胞が高度に多能性であることを示す、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６１、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。その後、正常な膵臓発達のモルフォゲン駆動体を繰り返すことを意図した、小分子及び成長因子を含有する異なる培地の工程式進行を通して、動的に撹拌される懸濁培養系においてこれらの多能性細胞を膵臓前駆体に分化させた。このプロセスは、膵臓細胞転写因子、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現を特徴とする膵臓前駆細胞集団を産生する。これらの細胞が移植される際、それらは、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおける高血糖を補正し得る機能性グルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟する。
膵臓前駆細胞集団を生成するために、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地内で維持されたクラスタ形式の多能性細胞を、制御装置で調整された温度、ｐＨ、及び溶存酸素を有する、０．２リットルのガラス攪拌される懸濁液バイオリアクター（Ｄａｓｇｉｐ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＲ０２００（Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ））に移動した。多能性細胞クラスタを、バイオリアクター内で２日間培養した。その時点（ステージ１、０日目）で、表５ａに従う分化培地内で約７０万個の細胞／ｍＬで、細胞凝集体が懸濁されるにつれて、培地を交換し、分化を開始させた。その後、細胞をこの閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター内で１４日間維持した。分化を通して、０．３リットルの全体積内のＣＯ2流量の調節によって、培地の重炭酸塩レベルを３．６４ｇ／Ｌに維持し、ｐＨを７．４に維持した。５リットル／時間の一定のガス流量の下、３０％の溶存酸素目標値でのＤａｓｇｉｐ制御システムの制御の下、バイオリアクターヘッドスペースにＣＯ2及び空気を散布した。空気流量を溶存酸素内容物に反応して調節し、ＣＯ2流量をｐＨに反応して調節した。

施行を通して温度を３７℃に維持した。施行の開始時点で、各培地交換（１回の交換につき、培地の９５％を除去）について、閉鎖された系を維持するために、羽根車を停止し、蠕動ポンプによって、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ溶接機を使用する、Ｃ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングに接続したバイオリアクターディップチューブを通して、培地を除去し、その後添加した。
ステージ１において、いくつかの異なる供給設定を試験した：（ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。
プロセスの開始、中間、及び終了時点での細胞計数を、各リアクターについて表５ｂに列記するように取得した。ステージ１の終了時点で、フローサイトメトリーによるタンパク質発現パターンについて、細胞を試料採取した。条件Ａ（分化開始の２４時間後に胚体内胚葉に培地変更、以降４８時間培地変更無し）において分化した細胞が、分化のマーカー（ＣＤ９９及びＣＸＣＲ４）の誘導、並びに多能性マーカー発現（ＣＤ９）の低減によって測定される、最良の結果を示した（図５ｂ）。胚体内胚葉形成の終了時点での、ＣＤ９のより低い発現との組み合わせでのＣＸＣＲ４及びＣＤ９９のより高い発現は、膵臓遺伝子のより高い発現、及び分化のより後での代替の器官運命を示す遺伝子のより低い発現と相関した（図５ｄ及び図５ｅ（図５ｅ１〜５ｅ４））。特に、分化の第１のステージを通して培地を変更しないこと、又はステージ１においてバルク供給形式でグルコースを培地に添加することのいずれか又は両方は、４つのステージの分化の終了時点での非常に異なる凝集体形態と相関する、ステージ１の終了時のより低いＣＸＣＲ４レベルをもたらした（図５ｃ）。特に、条件Ｂ及びＣは、ステージ４の終了時点で、フローサイトメトリーによって測定される、より低い膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びＣＨＧＡ）、並びに非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）のより高い発現を有した（図５ｄ及び表５ｂ）。条件Ａは、条件Ｃよりも膵臓遺伝子の有意に高い発現を示し、条件ＢはＡ及びＣの中間であったため、これらの発見はｑＲＴ−ＰＣＲ（図５ｅ（図５ｅ１〜５ｅ４））によって実証された。更に、条件Ｃは、例えば、ＣＤＸ２、ＡＦＰ、及びアルブミン（図５ｅ（図５ｅ１〜５ｅ４））などの、代替の非膵臓運命を示す有意により高いレベルの遺伝子を発現した。これらのデータは、ＤＥ形成の最後の４８時間に培地変更なしで生成される、均質かつ高いＣＸＣＲ４を発現する胚体内胚葉（ＤＥ）が、高純度の膵臓内胚葉集団に変換することができることを示す。
４つのステージの分化の終了時点で、条件Ａに従って分化した細胞をバイオリアクターから除去し、０．１％のＦＡＦ−ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ１３１培地で洗浄し、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ。各マウスに、５００万個の細胞を直接腎臓被膜下に移植した。埋め込み後４週間毎に、採血を実行し、血糖及びＣ−ペプチドを測定した。埋め込みの１２週目後までに、ヒトＣ−ペプチドは、ＥＬＩＳＡによって、１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣ−ペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった（図５ｆ）。埋め込み後２０週目で、空腹、及びその後供給状態の動物においてＣ−ペプチドを測定した。グルコース処理は、空腹状態において０．９３ｎｇ／ｍＬから、供給状態において２．３９ｎｇ／ｍＬへの、循環ヒトＣ−ペプチドにおける有意な増加を誘導し（図５ｇ）、これは、移植された細胞が機能性ＧＳＩＳコンピテント組織へと成熟したことを示す。更に、動物にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与（マウスβ細胞は、ヒトβ細胞と比較して、より感受性であり、ＳＴＺによって優先的に破壊される）を与えて、糖尿病の状態を誘導した際、機能性ＧＳＩＳコンピテント組織の移植片を有する動物は、真性糖尿病を発症した未処理の対照とは異なり、正常の血糖レベルを維持した（図５ｈ）。これらの結果は、ｈＥＳ分化した細胞移植片を有する動物が、機能性膵臓組織移植片によって、ＳＴＺ誘導糖尿病から保護されたことを実証する。
（実施例６）
細胞株Ｈ１のマイクロキャリア接着性培養したヒト胚性幹細胞の、懸濁形式での指向された分化
Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ（Ｃ３）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｃ３２７５）を、１５ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）を含有する、２０ｍＬの体積のシリコンコーティングされたガラスシンチレーションバイアル内に、４００ｍｇのビーズを４〜２４時間浸漬することによって、培養のために調製した。（Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３は、架橋されたデキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層からなる。）Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３上の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼを含む、様々なプロテアーゼにより消化されやすく、最大限の細胞の生存性、機能、及び完全性を維持しながら、細胞をマイクロキャリアから除去するための性能を提供する。
浸漬後、ビーズを加圧滅菌し、無菌ＤＰＢＳで濯ぎ、１０μＭのＹ２７６３２で補助したマウス胚性繊維芽細胞調湿培地（ＭＥＦ−ＣＭ）内で再懸濁した。その後、１２５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇガラススピナフラスコに、１００ｍｇのビーズ／フラスコの密度でビーズを移動した。Ｙ２７６３２と共にビーズ及びＭＥＦ−ＣＭを含有するスピナを、３７℃の加湿した５％のＣＯ２インキュベーター内で少なくとも６０分間均衡化した。
継代培養４４での、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を、ＴｒｙｐＬＥを使用して平面接着培養系から引き上げた（３７℃で８分間インキュベーションして、単一細胞懸濁液を形成）。その後、細胞を洗浄し、Ｙ２７６３２を有するＭＥＦ−ＣＭ内で懸濁し、１１００万個のｈＥＳ細胞を、静的（静止）インキュベーション期間中６時間、ビーズに接着させた。その後、Ｙ２７６３２を有するＭＥＦ−ＣＭをスピナフラスコに添加して、７５ｍＬの最終培地体積を作製し、細胞及びビーズをガラススピナフラスコ内で５０ｒｐｍの羽根車速度で撹拌した。ＭＥＦ−ＣＭの毎日５０ｍＬの培地交換をしながら、この様式で細胞を５日間成長させた。培養系内に置いてから５日後、フラスコは５３×１０６個の細胞（±１２×１０６標準偏差）を含有した。対照として、１００万個のＨ１ ｈＥＳ細胞もまた、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：３０希釈でコーティングされた、６ウェルの組織培養系ポリスチレン皿に播種し、ＭＥＦ−ＣＭの毎日の培地変更を維持した。
多能性培養系内に置いてから５日後、その後これらの細胞は、正常な膵臓発達モルフォゲンを繰り返すことを意図した、小分子及び／又は成長因子のうちの１つ又は両方を含有する異なる培地の工程式進行を通して、動的撹拌される懸濁培養系において膵臓前駆体に分化した。２つの培地製剤を、正常な膵臓発達を繰り返すための方法として試験した；アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを使用して、ＤＥを形成したもの、並びにＧＤＦ８を有するＭＣＸ化合物を使用して、ＤＥを形成したもの（それぞれ、表６ａ及び６ｂ）。培地を毎日変更し、ＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーによって試料を特性評価して、細胞特性を決定した。マイクロキャリア上の細胞の位相差画像を撮影し、細胞の分化が開始する前の、多能性培養系としての細胞形態の経時変化を、図６ａに示す。培養分化を示す経時変化を、図６ｂに示す。実験を通して様々な時点で細胞計数をまた取得し、平面培養系内又は懸濁されるマイクロキャリア培養系内のいずれかの培地製剤についての、表面積の関数（図６ｃ中、細胞／ｃｍ2）又は培地体積（図６ｄ中、細胞／ｍＬ）として結果を示した。
プロセスを通した様々な点で、フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲによって細胞を特性評価した。分化の第１のステージのフローサイトメトリーの結果、胚体内胚葉の形成を、ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとして図６ｅに示し、結果をまた、各マーカーの完全発現として図６ｆに表現する。結果は、全ての条件において、ＣＸＣＲ４発現の利得、及び多能性表面マーカー、ＣＤ９の損失によって定義されるように、実質的に大多数の細胞が胚体内胚葉を形成することを示す。更に、胚体内胚葉のより効率的な形成が、ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア＞ＭＣＸ／ＧＤＦ８平面＞ＷＮＴ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア＞ＷＮＴ３Ａ／ＡＡ平面からの処理の順位で生じる。ＭＣＸ／ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（Ｃｅｒ１）、グースコイド、及びＦＧＦ１７（図６ｇ）のより低い発現を示すため、細胞に対する、培地に特異的な影響はないようであるが、全ての処理条件が、胚体内胚葉遺伝子；ＣＤ９９、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＫＩＴ、及びＳＯＸ１７の類似した発現レベルを示す（図６ｇ及び表６ｃ）。これらのプロセスは、膵臓細胞転写因子、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現を特徴とする膵臓前駆細胞集団を生成する。これらの細胞が移植される際、それらは、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおける高血糖を補正し得る機能性グルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟する。
本実施例において使用される場合、ＭＣＸ化合物は、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６−〜．１〜８，１２．〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ｎｏｎ−ａｅｎ−１６−オンであり、これは以下の式（式１）を有する：
上記のＭＣＸ化合物の代わりに、他の環式アニリンピリジノトリアジンもまた使用され得る。そのような化合物は、１４−メチル−３，５，７，１４，１８，２４，２８−ヘプタアザテトラシクロ［２０．３．１．１〜２，６〜．−１〜８，１２〜］オクタコサ−１（２６），２（２８），３，５，８（２７），９，１１，２２，２４−ノナエン−１７−ｏｎ−ｅ、及び５−クロロ−１，８，１０，１２，１６，２２，２６，３２−オクタアザペンタシクロ［２４．２．２．１〜３，７〜−１〜９，１３〜．１〜１４，１８〜］トリトリアコンタ−３（３３），４，６，９（３２），１０−，１２，１４（３１），１５，１７−ノナエン−２３−オンを含むが、これに限定されない。これらの化合物を、以下に示す（式２及び式３）：
例示的な好適な化合物は、米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号に開示され、それはＭＣＸ化合物、関連する環式アニリンピリジノトリアジン、及びそれらの合成物に関連するため、その開示の全体が組み込まれる。
（実施例７）
Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞株のサブクローン、ＷＢ０１０６を本実施例のために使用した。ＷＢ０１０６を、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で、ＤＤＬ−１３と称するＨ１株種材料から誘導した。Ｈ１株のＷＢ０１０６サブクローンを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基質上のｍＴＥＳＲ１（商標）培地内に継代培養２３で解凍した、ＤＤＬ−１３バイアルから誘導し、その後ＥＤＴＡを使用して継代培養した。ＷＢ０１０６を継代培養２８で凍結し、正常な核型（ＦＩＳＨ及びＧバンド）、膵臓前駆細胞に分化する能力、並びにクラスタを形成し、懸濁培養系内で増大するコンピテンシーに基づいて、これらの研究のために選択した。
その後、Ｔ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））内のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の基質上の培地内にＷＢ０１０６ ＷＣＢバイアルを解凍し、第１の継代培養で、細胞を複数のＴ２２５フラスコ内に増大させた。第２の継代培養で、単一の２−Ｌａｙｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）（ＣＳ２）を播種するために、複数のＴ２２５フラスコからの細胞を組み合わせ、使用した。ＣＳ２が７０％コンフルエントになると、Ｃ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングアセンブリキャップは、隣接するポンプチュービングと共に培地ポートに結合して、系を閉鎖する。Ｃ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングによって系が閉鎖した後、Ｔｅｒｕｍｏ溶接機を介して袋又はボトルを溶接し、蠕動ポンプを使用して液体体積（培地、ＰＢＳ-/-、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、又は懸濁される細胞）を移動した。
細胞をＣＳ２から引き上げるために、細胞をＰＢＳ−／−で１度洗浄し、その後ＰＢＳ−／−で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。その後、アキュターゼ（登録商標）を除去し、酵素溶液の適用の３分後、細胞の引き上げを促進するために、ＣＳ２を叩打した。２％のＢＳＡで補助し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する培地のボトルを、ＣＳ２内にポンプ送達して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯ぎ、非活性化し、その後濯ぎ液を回収した。第２の濯ぎ液体積を添加し、回収し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。その後、２００ｍＬ中の２．０〜２．５×１０８個の細胞を、１層の細胞ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）内に移動し、加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２時間インキュベートした。２つのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培地ポート間に結合したポンプチュービングを有する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングの閉ループを使用して、蠕動ポンプによって、細胞懸濁液を７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。ガス交換を可能にするために、閉ループチュービングを無菌０．２マイクロメートル濾過器と交換して、加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内で、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）を３７℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション（１２〜２２時間、最適１８時間）の後、細胞ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）内の細胞は、円形の多能性細胞の球状凝集体（クラスタ）を形成した。

懸濁される細胞クラスタを含有する２％のＢＳＡで補助した培地を、２％のＢＳＡで補助し、５５〜６５ｒｐｍで維持した０．４リットルの新鮮な培地と共に、細胞ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）から１リットルの使い捨て可能なスピナフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））へと移動した。移動の２４時間後、１リットルの使い捨て可能なスピナフラスコを加湿、５％のＣＯ2インキュベーターから除去し、クラスタを５〜１０分間沈殿させた。その後、管内に２００ｍＬが残るまで培地を吸引し、その後４００ｍＬの追加の新鮮な培養培地をスピナフラスコに添加した。このプロセスを２日目（移動の４８時間後）の終了時に反復した。
３日目の終了時点（ＣＳ２からスピナフラスコへの移動の７２時間後）で、継代培養及び更なる増大のために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理で細胞クラスタを解離した。１リットルの使い捨て可能なスピナフラスコを加湿、５％のＣＯ２インキュベーターから除去することによって、継代培養プロセスを開始した。細胞の均質な懸濁液を維持するために、バイオセーフティーキャビネット内のスピナ平板上にフラスコを定置した。細胞懸濁液を、１００ｍＬのピペットによってスピナフラスコから除去し、４つの１７５ｍＬの円錐ポリカーボネートチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ−Ｎａｌｇｅｎｅ（Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ））間に均一に分配し、０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。細胞ペレットを撹乱せずに、使用済みの培地を吸引した。その後、カルシウム又はマグネシウムを有さない、２５ｍＬのＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ−／−）を各チューブに添加し、細胞を円錐チューブ内に組み合わせ、０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。ＤＰＢＳ−／−を円錐チューブから吸引し、３０ｍＬの５０％のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）／５０％のＤＰＢＳ−／−溶液をチューブに添加した。細胞クラスタをピペットで１〜３度上下移動させ、その後断続的に４分間渦流し、その後０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを撹乱せずに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を可能な限り完全に吸引し、細胞懸濁液が均一な乳白色であるように見えるまで、円錐チューブを３〜５分間、連続的かつ静かに叩打した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する２％のＢＳＡで補助した１０ｍＬの培地を細胞懸濁液に添加し、２〜４度微粉化して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を非活性化した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する２％のＢＳＡで補助した９０ｍＬの培地を細胞に添加して、懸濁液を４０マイクロメートルの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に通過させた。
ＮＣ−１００ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で、濾過した細胞懸濁液の１００ｍＬの体積における細胞密度を決定し、追加の培地を添加して、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する２％のＢＳＡで補助した培地内で１×１０６個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度を生じさせた。その後、２２５ｍＬ（２億２５００万個の細胞）の細胞懸濁液を１リットルの使い捨て可能なスピナフラスコに移動し、加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内で撹拌せずに１時間インキュベートした。その後、フラスコをインキュベーターから除去し、バイオセーフティーキャビネット内のスピナ平板上で、１００ｒｐｍで１〜３分間撹拌した。細胞懸濁液が混合する間、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する２％のＢＳＡで補助した追加の２２５ｍＬの培地を細胞懸濁液に添加した。その後、加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内にスピナフラスコを３０分間戻した。その後、フラスコをインキュベーターから除去し、バイオセーフティーキャビネット内のスピナ平板上で、１００ｒｐｍで１〜３分間撹拌した。細胞懸濁液が混合する間、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する２％のＢＳＡで補助した追加の１５０ｍＬの培地を、細胞懸濁液に添加して、６００ｍＬの最終体積を生じさせ、フラスコをインキュベーター内の攪拌される懸濁液に戻した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）解離の２４及び４８時間後の両方で、細胞クラスタをフラスコの底部に５〜１０分間沈殿させた。いかなるクラスタ損失をも確実に最小化するために、４００ｍＬの使用済みの培地を吸引によってフラスコから除去し、新鮮な培地と交換した。このプロセスを使用して、Ｈ１細胞を基質上の接着培養系から細胞クラスタとしての懸濁培養系へと変換した。
最初のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理から７２時間後、細胞クラスタ解離及びスピナフラスコ播種（継代培養）のプロセスを反復して、複数の継代培養（試験範囲：１〜１０継代培養）のために細胞を懸濁液中で維持した。上記のプロセスを、最初の２４時間後、培地を除去せず、２００ｍＬの新鮮な培地を添加するという例外で続けた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離の４８時間後、フラスコの底部にクラスタを５〜１０分間沈殿させ、６００ｍＬを吸引し、４００ｍＬの新しい培地をフラスコに添加した。
その後、これらの懸濁液で継代培養し、培養した細胞を、将来の使用のために凍結保存し、保管した。凍結保存のための懸濁増大細胞を調製するために、細胞を４０マイクロメートルの細胞ストレーナに通過させることを除いて、懸濁継代培養について上記するように、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で細胞クラスタを解離した。各１リットルの使い捨て可能なフラスコから生成した、１００ｍＬの細胞懸濁液の細胞計数を決定した。その後、細胞懸濁液を組み合わせ、０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを撹乱せずに、遠心管からの培地を可能な限り完全に除去した。その後、寒冷（＜４℃）ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０を滴下式様式で添加して、１ｍＬにつき１億５０００万個の細胞の最終濃度を達成し、１．８ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ凍結バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））又は１５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉ凍結袋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））への移動中、細胞溶液を氷浴内で保持した。
その後、以下の制御された速度の冷凍庫内で、懸濁液増大細胞をバイアル内で、高密度で凍結した。室を４℃に予冷し、試料バイアル温度が６℃に達するまで、温度を保持した。その後、試料が−７℃に達するまで、室温度を２℃／分で下げた。試料バイアルが−７℃に達すると、室が−４５℃に達するまで、室を２０℃／分で冷却した。その後、室温度が−２５℃に達するまで、室温度を１０℃／分で短時間上昇させ、その後試料バイアルが−４５℃に達するまで、室を０．８℃／分で更に冷却した。その後、室が−１６０℃に達するまで、室温度を３５℃／分で冷却した。その後、室温度を−１６０℃で少なくとも１０分間保持した後、バイアルをガス相液体窒素貯蔵庫に移動した。
攪拌されるタンクバイオリアクターを接種するために、高密度凍結維持された細胞を、液体窒素貯蔵庫から取り出し、解凍し、閉鎖された３リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ（Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を播種するために使用した。４〜５のバイアルを、ガス相液体窒素貯蔵庫から除去し、３７℃の水浴内に１０５秒間直接定置した。その後、２ｍＬのガラスピペットを使用して、解凍されたバイアル内容物を５０ｍＬの円錐チューブへと移動した。その後、２％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２で補助した９ｍＬの培地（ＩＨ３又はＥ８（商標））をチューブ内に滴下式の様式で添加した。その後、細胞を０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。チューブからの上清を吸引し、２％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２で補助した１０ｍＬの新鮮な培地（ＩＨ３又はＥ８（商標））を添加し、細胞を含有する体積を培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８，Ｓａｎｉｓｕｒｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））内にピペットで移動した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−ｆｌｅｘチュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプ送達した。多能性幹細胞接種の調製のために、バイオリアクターを１．５Ｌの培地（２％のＢＳＡで補助したＩＨ３又はＥ８（商標）、及び１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２）で調製し、３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで攪拌し、ＣＯ２によって、３０％の溶存酸素目標値（ＣＯ２、空気、Ｏ２、及びＮ２を調節）で６．８〜７．１ｐＨに調節した。接種の直後、細胞計数のためにバイオリアクターを試料採取し、培地体積を必要に応じて調整して、０．２２５×１０６個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度を生じさせた。
攪拌されるタンクバイオリアクター内に接種された細胞は、連続的に攪拌されるタンク内で細胞クラスタを形成し、それらをリアクター内の多能性培地（２％のＢＳＡで補助したＩＨ３又はＥ８）内で合計３日間維持した。１〜１．３リットルの使用済みの培地を除去し、１．５リットルの新しい培地を添加する際に部分的な培地交換を接種の２４時間後に実行しながら、培地を毎日変更した。接種の４８時間後、１．５〜１．８リットルの使用済みの培地を除去し、１．５リットルの新しい培地を添加した。接種の７２時間後、＞９０％の使用済みの培地を除去し、分化培地を添加することによって、多能性細胞分化を開始させた（表７）。
段階的分化プロセスが開始すると、温度（３７℃）、ｐＨ（分化について７．４）、並びに溶存酸素（ステージ１について１０％のＤＯ目標値、及び他の時は常に３０％のＤＯ目標値、ＣＯ2、Ｏ2、Ｎ2、及び空気を調節）について調節された、閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を１２日間以上維持した。分化プロセスを通して、各培地交換で、培地除去前にディップチューブを介して羽根車を５〜２０分間停止して、クラスタを沈殿させた。バイオリアクター内の培地を除去するか、又は蠕動ポンプによって、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ溶接機を使用してＣ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングに接続したディップチューブを通して、閉鎖されたボトル又は袋に／から添加して、閉鎖された系を維持した。羽根車を完全に水浸させるために十分な培地が管に添加されると、羽根車及び加熱器に再度電圧を印加した。
バイオリアクタープロセスを監視するために、細胞クラスタを含有する培地の試料を、毎日採取して、細胞数及び生存性（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ）を図７に示すように決定した。０．２２５×１０6個の生細胞／ｍＬの接種材料が増大して、ステージ４、３日目で平均０．９２×１０6個の生細胞／ｍＬを生成したように、プロセス中、一般的な細胞の増大が観察された。バイオリアクター接種、並びに多能性細胞クラスタリング、及び培養系中で、細胞を酸性目標値（ｐＨ ７．０〜６．８）で維持することによって、ステージ４、３日目での平均細胞排出量は、平均１．３×１０6個の細胞／ｍＬへと増加した（図７）。
毎日の計数に加えて、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によってバイオリアクター培地試料を分析した。リアクター目標値につき、ステージ０における培地のｐＨは、ほとんどの培養培地に一般的である７．４の恒常性標準ｐＨと比較して、酸性であること、及びリアクター培地ｐＨは、細胞代謝の結果としてステージ０を通して下降することが観察された（図８）。これらの結果は、分化の６日目の終了まで、増加する乳酸濃度及び減少するグルコースレベルの傾向と相関した（図９及び１０）。共に、これらのデータは、リアクター内の細胞が、ステージ０及び最初の２つの分化ステージ（１〜６日目）を通して最も急速に成長し、グルコース消費性であることを示す。しかしながら、ステージ３以降、ステージ３での細胞数のピーク、それに続くステージ４にわたる細胞密度の下降に相関して、リアクター内の細胞代謝（低減した乳酸レベル及び増加したグルコースレベル）は下降した。
ステージに特異的なｐＨ及び代謝の変化が、ｍＲＮＡ発現パターンのステージ変化に一致するかどうかを決定するために。多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、腸管（ＧＴ）、又はステージ４（Ｓ４）を指定した、４つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ（商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））を使用して、バイオリアクター細胞試料の試験を実行し、結果を、対照としての歴史的な未分化のＨ１（ＷＢ０１０６）ｈＥＳ細胞試料と比較して、全ての施行及びアレイにわたって発現を標準化した。
これらのアレイを使用して、分化の各ステージについて遺伝子発現を決定した。バイオリアクター内に解凍された種材料細胞は、ステージ０、１日目及びステージ０、３日目（バイオリアクター接種の２４及び７２時間後：図１１、１２、１３、及び１４）で未分化の遺伝子発現パターンを示すこともまた観察された。これらの結果は、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の高い発現レベル、並びにＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４の不在を示すフローサイトメトリー結果と良く相関した（図１５及び表８）。遺伝子発現のフローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、共に留意された安定な多能性状態と一貫した、多能性の遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ、及びＺＦＰ４２）の堅固かつ安定な発現パターンを示したものの、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現における穏やかではあるが可変の増加、並びに指向された分化前のステージ０プロセス中のいくつかの試料における、ＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、及びＧＡＴＡ２の≧１００×の増加に留意すべきである。（図１６及び１７）。
ステージ０の完了時点で（リアクター接種の７２時間後）、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する分化培地（表７）内に細胞を移動した。この培地変更の２４時間後、ＦＯＸＡ２発現の約７００×の増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現の１０００×の増加などの、遺伝子発現パターンにおける有意な変化が留意された（図１８及び１９）。これらの増加した発現レベルは、細胞が中内胚葉運命を通して遷移したことを示した。ＣＤＸ２レベルが、未分化の細胞に対して、ステージ１、１日目に上昇したこと（発現対対照において４７０×の増加）もまた留意されたが、これは、発現の一過性の増加であり、ＣＤＸ２レベルはステージ１、１日目からステージ１、３日目まで９４％低下し、分化の誘導前に観察されたものに相当するレベルに戻った（図１４、１９、及び２１）。
ＤＥ分化培地への露出の７２時間後、ＣＸＣＲ４レベルがピークに達し、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７が歴史的対照に対して＞１０００×で発現したため、細胞は、胚体内胚葉への特異化と一貫したプロファイルを発現した。胚体内胚葉と一貫して、遺伝子ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴが、ステージ１、１日目に観察された上昇したレベルから低下したこともまた留意された（図２０及び２１）。
ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現における変化は、フローサイトメトリーによって観察された結果と相関した。分化の開始時点でＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団（図１５）から、ステージ１の終了時点でＣＸＣＲ４発現細胞（細胞の９８．３％がＣＸＣＲ４陽性、±１．９標準偏差）の均質な集団（図２２）へのほぼ完全な遷移もまた見られた。
胚体内胚葉形成（ステージ１）の完了に続いて、原始前腸形成（ステージ２）を誘導するために使用されるモルフォゲンである、ＦＧＦ７を含有するものに培地を変更した。原始前腸の形成と一貫して、ステージ２、１日目及び３日目のＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルは増加したが、ステージ１の３日目に高レベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）は、ステージ２の終了時点までに低減した発現を示した（図２３）。前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現は、増加した（図２４）。
細胞をステージ２培地内で７２時間培養した後、培養系をステージ３培地に交換した（表７）。この培地に置くと、細胞は、図２５に示す、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現によって測定される内胚葉膵臓系統（９０．９％±１１．９標準偏差のＰＤＸ１陽性、及び９９．２％±０．６標準偏差のＦＯＸＡ２陽性）と一貫したマーカーを発現した。これらの結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子発現について分析される試料からのデータによって確認した。ＰＤＸ１の遺伝子発現は、ステージ２、３日目の終了時点（３８，０００×対Ｈ１）からステージ３、１日目の終了時点（２００，０００×対Ｈ１）までの２４時間で５倍増加し、ステージ３、３日目（４３５，０００×対Ｈ１）の４８時間後に再度倍加した。これらのデータは、細胞が膵臓運命に特異化していたことを示す（図２６）。この観察は、図２６に示すような、膵臓において一般的に発現する、遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主の増加したレベルによって更に支持された。更に、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１の発現（対照の２〜１０％、又はｑＲＴ−ＰＣＲによる３２〜３７の試料Ｃｔｓ）が非常に低い、又は全く無いこと、及び内胚葉系統の他のマーカー、ＡＦＰ、ＡＬＢ、及びＣＤＸ２−の高い発現レベルもまた見られ、これは、比較的可塑性の腸管運命から膵臓運命への、バイオリアクター内の細胞集団の特異化及び遷移を更に示す。
図２７に示すように、ステージ４、３日目の分化プロセスの終了時点で、細胞は、高レベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５標準偏差の陽性クロモグラニン）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１について５８．３％±９．７標準偏差で陽性）との混合物と一貫した発現パターンを更に発達させた。このステージ特異的マーカーの発現パターンは、多能性集団から膵臓前駆細胞への、効率的ステージ式分化を示した。フローサイトメトリーで観察された結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲからのデータで更に確認した。膵臓内で一般的に発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主は全て、増加した発現レベルを示す。（図２８）。
図２７で観察された発現パターンは、異なる種材料、ステージ０培地、ステージ０培地のｐＨ、及び消泡剤の使用などの複数のプロセス変数が試験される際、複数の施行にわたって一貫していた。種材料の複数の供給源を試験し、それぞれが、＞９０％のＦＯＸＡ２、＞７５％のＰＤＸ１、及び＞５０％のＮＫＸ６．１で、膵臓内胚葉運命を効率的に生成した（図２９）。更に、ステージ０で、２％のＢＳＡで補助した「ＩＨ３」と称するカスタムの自家培地内、又は２％のＢＳＡで補助した商業的に入手可能な培地：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）内で細胞を成長させる際、バイオリアクター産物の発現パターンにおける有意な差はないことが留意された（図３０）。ステージ０培養におけるｐＨの役割を検査した際、ステージ０で、比較的低いｐＨ（６．８）で成長させた細胞が、平均の施行（図７）と比較して、バイオリアクターにおける増大を増加させたが、ステージ４、３日目の細胞プロファイルには有意な変化はなかった（図３１）ことが留意された。更に、９４百万分率での抗フォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ８０１１）の使用は、散布することによって、産生される泡を低減することが見られたが、ステージ０の終了時点からステージ４、３日目の細胞を通した細胞のプロファイルに影響を与えるようではなかった（表９及び図３２）。
各バイオリアクター分化の終了時点で、産物細胞を凍結保存した。３．６３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有するＭＣＤＢ１３１内、又は３．６３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、グルコース（８ｍＭ最終）、及び１×Ｇｌｕｔａｍａｘを有するＭＣＤＢ１３１内で細胞を洗浄し、その後２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のＸｅｎｏを含まないＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する、５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる寒冷（＜４℃）凍結保存培地に移動した。その後、最大１５分間の周囲温度で、凍結保存培地内で細胞クラスタを維持する冷却プロファイルを使用して、制御された速度の冷凍庫（ＣＲＦ）内で細胞を凍結し、４℃の温度に４５分間下げ、更に２．００℃／分で−７．０℃（試料）まで下げた。その後、試料を素早く冷却し、室の温度を２５．０℃／分の速度で−４５．０℃まで下げた。その後、室の温度を１０．０℃／分で−２５．０℃（室）まで増加させることによって、補償増加を提供した。その後、温度が−４０．０℃に達するまで、試料を０．２℃／分で冷却した。その後、室を３５．０℃／分の速度で−１６０℃まで冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ施行の停止時、試料をガス相液体窒素貯蔵コンテナに移動した。
蒸気相液体窒素貯蔵庫から取り出し、バイアルを３７℃の水浴に移動することによって、細胞を解凍し得る。氷の結晶がバイアル内に留まるまで、水浴内で２分間未満、バイアルを静かに渦流した。その後、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移動し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、滴下式で２分間かけて合計２０ｍＬの最終体積まで希釈した。その後、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって全細胞数を決定し、細胞懸濁液を超低結合培養皿に１時間移動した。その後、５０ｍＬの円錐内の培地から細胞を単離し、上清を除去し、分析又は生体内研究のために、ステージ４培地内で細胞を再懸濁した。
あるいは解凍後、バイアルに入れた細胞を空の１２５ｍＬのガラスＣｏｒｎｉｎｇ（商標）スピナフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））に移動し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを含有する１０ｍＬのＭＣＤＢ１３１培地を、滴下式様式でフラスコに添加した。その後、最終体積を同一の培地の８０ｍＬに調整した。全細胞数を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって決定し、細胞懸濁液を４０〜６５ｒｐｍで一晩（１２〜２８時間）攪拌した。その後、細胞を特性評価、又は生体内研究のために使用した。
材料：
・ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１、（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））
・ＰＢＳ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＬＸ−２７０−３３３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））
・ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
・ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ−（Ｃｈｅｍｅｔｅｃ，Ｃａｔ＃ＹＣ−Ｔ１００（Ｄｅｎｍａｒｋ））
・Ｎｏｎ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄ ６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））
・Ａｃｃｕｔａｓｅ、（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
・ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（Ｆｅｒｍｐｒｏｂｅ ｐＨ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ２２５ｍｍ，Ｍｏｄｅｌ＃ Ｆ−６３５、及びＤＯ Ｏｘｙｐｒｏｂｅ １２ｍｍ Ｓｅｎｓｏｒ，Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｄ−１４５ ｆｒｏｍ Ｂｒｏａｄｌｅｙ Ｊａｍｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
・免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
・Ｍｍ ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＰＥＰＴＩＤＥ ＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ ＣＡＴ＃１０−１１４１−０１）
・Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標），ＭＣＤＢ１３１、及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
・レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
・ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＭＣＸ（ＪＮＪ）
・ＦＧＦ７（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体アンタゴニスト）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）
・ＴＰＰＢ（プロテインキナーゼＣ活性薬）（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）
・ＭＣＤＢ １３１ Ｃｕｓｔ
（実施例８）
凍結維持されたバイオリアクター生成膵臓前駆体クラスタの成熟及び機能
各バイオリアクター研究のために十分な細胞を生成するために、Ｈ１ ｈＥＳ（ＷＢ０１０６）細胞の１つの継代培養３１マスター細胞バンクバイアルを解凍した。５つのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングされた２−Ｌａｙｅｒ ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）（ＣＳ２）を播種するために十分な細胞が生成されるまで、ＥＤＴＡ継代培養を使用して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上でのいくつかの継代培養のために、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地内で、接着性条件下で細胞を増大させた。ＣＳ２内で成長する接着性細胞が７０％コンフルエントになると、Ｃ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングアセンブリキャップを、隣接するポンプチュービングと共に、培地ポートに結合して、系を閉鎖した。系が閉鎖した後、Ｔｅｒｕｍｏ溶接機を介してＣ−ｆｌｅｘ（商標）で袋又はボトルを溶接し、蠕動ポンプを使用して全液体体積（培地、ＰＢＳ-/-、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、又は懸濁される細胞）を移動した。
細胞をＣＳ２から引き上げるために、カルシウム又はマグネシウムを含まない（ＰＢＳ−／−）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅで細胞を１度洗浄し、その後等分のＰＢＳ−／−で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。その後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）溶液を除去し、酵素溶液の適用の３分後、細胞の引き上げを促進するために、ＣＳ２を叩打した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）のボトルを、ＣＳ２内にポンプ送達して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯ぎ、非活性化し、その後濯ぎ液を回収した。第２の濯ぎ液体積を添加し、回収し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。２リットルの最終体積のＣＳ２から、１．６〜２．０×１０９個の細胞を回収した。１つの層につき、２．０〜２．５×１０８個の細胞を、４つのＣＳ２内又は８つの１層のＣｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）内に移動し、１つの層につき、２００ｍＬの体積で、加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２時間インキュベートした。
ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）培地ポート間に結合した、隣接するポンプチュービングを有する、Ｃ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングの閉ループを使用して、蠕動ポンプによって、細胞懸濁液を７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫを、加湿、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で一晩１８時間インキュベートした。その後、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋからの２リットルの細胞及び培地を貯留し、１リットルずつ、１つのバイオリアクターにつき、１．５リットルの新しいｍＴｅＳＲ（商標）培地と共に、２つの３リットルＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内に移動した。分化開始前に、バイオリアクター接種の２４時間後に完全な培地交換をして、細胞をｍＴｅＳＲ（商標）培地で更に２日間維持した。その後、表１０に記載するように分化を開始し、指向した。温度（３７℃）、ｐＨ（ドリフト、又はＣＯ２によって、多能性細胞について６．８又は７．２、及び分化について７．４に調節）、並びに溶存酸素（３０％のＤＯ目標値、ＣＯ２／空気を調節）について調節した、閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を合計１４又は１５日間（ｍＴｅＳＲ（商標）２日間＋段階的分化１２又は１３日間）維持した。各培地交換前に、羽根車を５〜２０分間停止して、クラスタを沈殿させた。培地を除去するか、又は蠕動ポンプによって、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ溶接機を使用してＣ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングに接続したディップチューブを通して添加して、閉鎖された系を維持した。羽根車を水浸するために十分な培地が添加されると、羽根車及びヒートジャケットに、再度電圧を印加した。
これらの方法を使用して、３リットルのリアクター内で２回の産生施行を開始した。第１のリアクター施行において、多能性培養培地の最初の２日間にわたって、２つの異なるｐＨ設定点を試験した。リアクター環境が、細胞の代謝活性のために経時的に酸化するにつれて、ｐＨがより低く「ドリフト」するように、リアクター１を、５％の固定ＣＯ２ガス注入速度で、ｐＨ ７．２に設定した。リアクター２を、ＣＯ２ガスレベルによって調節される、７．２のｐＨに設定した。第２のリアクター施行において、ＣＯ２ガスレベルによって調節される、ｐＨをリアクター１について６．８、及びリアクター２について７．２に設定した。
バイオリアクタープロセスを監視するために、分化の各ステージの終了時点で細胞クラスタを採取し、フローサイトメトリーによってアッセイした（ＰＲＤ１２０５、表１１；表１２）。分化の開始時点でＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、胚体内胚葉形成の完了時点でＣＸＣＲ４発現細胞（９６．９〜９８．１％の細胞がＣＸＣＲ４陽性）の均質な集団へのほぼ完全な遷移が観察された。
フローサイトメトリーによって観察された結果は、ｒｔ−ＰＣＲによって分析される、対合された試料からの結果と相関した。多能性から膵臓運命への段階的分化の遺伝子発現特徴について、プロセスを通して試料を試験した。指向された分化の開始前に、バイオリアクター細胞クラスタからのｍＲＮＡを、多能性又は早期分化運命と関連付けられている遺伝子のパネルについて、低密度アレイ上で試験した。
バイオリアクターからの細胞が、多能性の遺伝子特徴（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、未分化のＨ１対照と比較して、分化の遺伝子特徴の最小限の誘導を示したか、又はそれを全く示さなかった（ＡＦＰ、及びＦＯＸＡ２：＜５０倍の増加；ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、ＭＩＸＬ１、及びＴ：＜１０倍の増加した発現）ことが観察された（図３３）。しかしながら、細胞がステージ１、１日目の分化培地に接触すると、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、及びブラキュリ（Ｔ）発現のレベルが、未分化のＨ１ ｈＥＳ細胞よりも１００〜１０００倍多く増加するように、遺伝子発現パターンは劇的に変化した（図３４）。ステージ１、３日目（胚体内胚葉の形成）の終了時点までに、ＣＤ９、ＣＤＸ２、ＦＧＦ４、ＭＩＸＬ１、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、及びブラキュリ（Ｔ）は、ステージ１、１日目と比較して、発現が減少した一方で、ＣＤ９９、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＫＩＴ、ＯＴＸ、又はＳＯＸ１７などの特徴的胚体内胚葉遺伝子の発現は、ピークに達した（図３５）。
ステージ１の終了時点で、ＧＤＦ８を含有するものから、ＦＧＦ７を含有するものへと細胞培養培地を変更した。いくつかの異なる遺伝子発現パターンが留意された：ステージ２にわたる、特定の遺伝子（ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、ＨＨＥＸ、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ９）の発現の増加、発現の減少（ＨＡＮＤ１及びＳＯＸ１７）、期間中安定した高い発現（ＨＮＦ４α）、又は発現がほとんど／全く無し（ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ａ）（図３６ａ〜ｅ）。中胚葉（ＨＡＮＤ１及びＳＯＸ１７）のマーカーが減少したため、これらのパターンは、リアクター内の細胞が、前腸（ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ９）発現になっていたことを示した。しかしながら、ステージ２の終了時点までに、細胞はより成熟した腸又は膵臓運命（ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ａ）にまだ特異化していなかった。
ステージ３の終了時点までに、細胞は、ｍＲＮＡ対未分化の対照（図３６）の＞１００，０００倍の増加、及びフローサイトメトリーによる、ＰＤＸ１を発現する７６〜９８％の細胞（表１１）によって実証される、ＰＤＸ１発現によって測定される、膵臓系統に特異化していた。膵臓（ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１ａ、及びＳＯＸ９）、並びにＡＦＰ及びＣＤＸ２などの腸の他の遺伝子の誘導もまた観察され、これは細胞がより成熟した運命への特異化を開始したことを示す。
ステージ４の３又は４日目の分化プロセスの終了時点までに、細胞は、表１１及び１２に示すように、膵内分泌細胞（４７〜５４％クロモグラニン陽性）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１について３３〜５２％陽性）との混合物と一貫した発現パターンを示した。このステージ特異的マーカー発現パターンは、多能性集団から、ＰＤＸ１（＞１×１０6倍の誘導）及び他の膵臓遺伝子（ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴの＞１０００倍の誘導）の高い発現レベル、並びに未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比較して、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失を特徴とする膵臓前駆細胞への効率的なステージ式分化を示した（図３７）。
分化プロセスの終了時点で、０．０８〜０．４５×１０6個の細胞／ｍＬが生成された（図３８：毎日の細胞計数）。その後、このプロセスで生成された細胞を、凍結維持するか、あるいはＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、又は腎臓被膜下に定置して、動物の皮下に直接埋め込んだ。細胞を凍結保存するために、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のＸｅｎｏを含まないＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳを含む、５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる凍結保存培地（最終濃度２５ｍＭ）にそれらを移動した。細胞クラスタが周囲温度で、凍結保存培地内で懸濁されると、１５分間以内に凍結バイアルを制御された速度の冷凍庫（ＣＲＦ）内に移動した。その後、室の温度を４℃に４５分間下げ、更に２．００℃／分ずつ−７．０℃（試料）まで下げた。その後、試料を素早く冷却し、室の温度を２５．０℃／分の速度で−４５．０℃まで下げた。その後、室の温度を１０．０℃／分で−２５．０℃（室）まで増加させることによって、補償増加を提供した。その後、温度が−４０．０℃に達するまで、試料を０．２℃／分で冷却した。その後、室を３５．０℃／分の速度で−１６０℃まで冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ施行の停止時、試料をガス相液体窒素貯蔵コンテナに移動した。
ガス相液体窒素内で細胞を保管した後、貯蔵庫から取り出し、３７℃の水浴に移動することによって、細胞を解凍した。氷の結晶がバイアル内に留まるまで、水浴内で２分間未満、バイアルを静かに渦流した。その後、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移動し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、滴下式で２分間かけて合計２０ｍＬの最終体積まで希釈した。その後、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって全細胞数を決定し、細胞懸濁液を超低結合培養皿に１時間移動した。その後、５０ｍＬの円錐内の培地から細胞を単離し、上清を除去し、ステージ４培地内で細胞を再懸濁した。その後、細胞を、動物内に、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して皮下に、又は腎臓被膜下に埋め込むか、あるいは細胞を超低結合培養皿内で一晩インキュベートしてから、動物内に埋め込むかのいずれかにした。
動物を、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の凍結保存しなかった膵臓前駆細胞で、又は細胞の腎臓被膜下への定置を指向することによって処理した動物は、成熟して、１６週目までに１ｎｇ／ｍＬ以上のＣ−ペプチドを発現し、埋め込みの２０週間後までに２ｎｇ／ｍＬのＣ−ペプチドに達した（図３９ａ及び３９ｄ）。更に、ＳＴＺで処理して、宿主β−細胞機能をアブレーションした際、移植された動物は、移植片が除去されるまで正常血糖を維持し、これは、移植片が、単一の高用量のＳＴＺによって誘導される糖尿病から動物を保護するためにコンピテントであったことを示す（図３９ｂ）。
このパターンはまた、凍結保存された細胞で処理した動物においても観察された。解凍後１時間培養した、凍結保存された膵臓前駆細胞（１２０７Ｂ）を有する腎臓被膜の移植片によって処理した動物は、１６及び２０週目でそれぞれ平均０．５６ｎｇ／ｍＬ及び１．０９ｎｇ／ｍＬのＣ−ペプチドを有した一方で、解凍後一晩培養した細胞（１２０７Ｃ）は、１６及び２０週目でそれぞれ平均０．８１ｎｇ／ｍＬ及び１．３５ｎｇ／ｍＬのＣ−ペプチドを有した（図３９ｄ）。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の凍結保存された膵臓前駆細胞で処理した動物は、１６週間目までに１ｎｇ／ｍＬを超えるＣ−ペプチドを有し、凍結保存しなかった対照と類似して、ＳＴＺ処理の１週間後に治療的レベルのＣ−ペプチドを発現することができた（０．９８ｎｇ／ｍＬ、図３９ｃ）。これらの結果は、動物モデルにおいて試験される際、凍結保存された膵臓前駆細胞が、凍結保存しなかった対照と同等に機能し得ることを示す。
注：
・上記の表１０における基本培地は、ステージ１〜５でＧｌｕｔａｍａｘが補助において使用されない際、任意で５ｍＭのグルコースを含み得る。
・任意で、上記に示す表におけるステージ４でＣｙｐｉ（［１００ｎＭ］）が添加され得る。
攪拌されるタンクバイオリアクター内で細胞凝集体が受ける剪断応力の計算
３リットルのＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内で、７０ｒｐｍの撹拌速度で混合される、２．７リットルのＤＡＳＧＩＰ攪拌懸濁バイオリアクター内で細胞凝集体が受ける剪断応力を決定した。剪断応力値を計算するために、以下に述べる想定がなされた。
想定：
１．細胞凝集体上に課される最大剪断応力は、乱流渦の結果ではない
２．細胞凝集体上に課される最大剪断応力は、凝集体間、又は凝集体−羽根車間の衝突の結果ではない
３．バッフル（すなわち、ディップチューブ、及びプローブ）により課される剪断応力は、これらの計算においては言及されていない
本明細書の計算の目的のために、以下に列記する用語及び物理的パラメーターを使用する
列記される培地及びバイオリアクターパラメーターを、以下の式に適用した。
式：
レイノルズ数：
凝集体上の最大剪断応力（Ｃｈｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ １９９０）
消散される動力（ε）１単位質量につき
消費される動力（Ｐ）
動力数計算は、バッフルされない攪拌されるタンクのために、Ｎａｇａｔａ（１９７５）によって導き出された実験的相関性に基づいた。
２．７ＬのＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内で、７０ｒｐｍの撹拌速度で細胞凝集体上に課される、少なくとも２．５ｄｙｎ／ｃｍ2の最大剪断力を計算した。クラスタの最外層を含む細胞は、最も高いレベルの剪断応力を受ける。これらの剪断応力値は、述べた想定に高く依存する。
（実施例９）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養系内でのＭＣＸ／ＧＤＦ８の役割
三角／振とう器フラスコ内、スピナフラスコ内、あるいは２％の脂肪酸を含まないＢＳＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ（ＩＡ））、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ））、追加の２．５ｍＭのグルコース（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ）、及び１：５０，０００の貯蔵濃度のＩＴＳ−Ｘ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ５１５０００５６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ））で補助した、３．６４ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び５．５ｍＭのグルコース（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ａ１３０５１ＤＪ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ））を含有するＭＣＤＢ−１３１培地内の、コーティングされない超低結合、又は非組織培養処理した６ウェルの平板内で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からのクラスタを、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で播種した。本出願の目的のために、この様式で補助したＭＣＤＢ−１３１培地を、「ステージ１基本培地」と称することとする。この培地内のクラスタを、分化の第１日目に３μＭのＭＣＸ（ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願第１２／４９４，７８９号；その全体が本明細書に参照によって組み込まれる）及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は３μＭのＭＣＸのみ、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみで処理した。２日目に、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡのいずれかで補助したステージ１基本培地に細胞を移動した。フローサイトメトリー、ＰＣＲ、及びウエスタンプロット分析のために、ゼロ（基本培地＋補助の添加の直前）から分化開始の７２時間後までの範囲の様々な時点で試料を回収した。
フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカー、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の百分率を測定することによって、各条件下で、胚体内胚葉が生成される効率を、分化の３日後に決定した。データ（図４０ａ〜ｄのＦＡＣＳプロットに示し、表１３に要約する）は、懸濁培養系内で、分化の１日目の、ＴＧＦ−β族員の不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞を処理する際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。
（実施例１０）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養系内でのＭＣＸ化合物濃縮物の用量反応
三角／振とう器フラスコ、又はスピナフラスコ内で、実施例９に記載のステージ１基本培地内で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からのクラスタを、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で播種した。クラスタを、分化の１日目に、１．５、２、３、又は４μＭのＭＣＸを含有するステージ１基本培地で、及び２日目に、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１基本培地で処理した。３日目には培地交換を実行しなかった。分化の３日目の終了時点で、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析のために試料を回収した。
その後、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカー、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の百分率を測定することによって、胚体内胚葉が生成される効率を決定した。データ（図４１Ａ〜ＤのＦＡＣＳプロットに示し、表１４に要約する）は、懸濁培養系内で、２μＭ未満の濃度でのＭＣＸの添加が、次第により少ない胚体内胚葉陽性細胞（ＣＸＣＲ４陽性細胞のより低い百分率、及びＣＤ９陽性細胞のより高い百分率によって証明される）をもたらすことを示す。更に、４μＭを超える濃度で、ＭＣＸは、細胞に対して有害な影響を呈し、これは細胞の生存性の減少をもたらす。しかしながら、ＢＳＡ濃度を増加させることによって、ＭＣＸの影響は、≧４マイクロモルの濃度が使用され得るように、調節され得る。逆に言うと、より低いＢＳＡ濃度と共に使用される際、≦１．５マイクロモルの濃度が、胚体内胚葉を生成するために使用され得る。
（実施例１１）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養系内の培地交換頻度の役割
三角／振とう器フラスコ、又はスピナフラスコ内で、実施例９に記載のステージ１基本培地内で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からのクラスタを、０．２５×１０＾６〜２×１０＾６個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で播種した。クラスタを、分化の１日目に、３μＭのＭＣＸを含有するステージ１基本培地で、及び２日目に、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１基本培地で処理した。対照培養系は、３日目に培地交換を受けた；別個の管に対して、３日目には培地交換を実行しなかった。分化の３日目の終了時点で、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析のために試料を回収した。
その後、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカー、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の百分率を測定することによって、各条件下で、胚体内胚葉が生成される効率を、決定した。結果を、図４２Ａ＆ＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１５に要約する。
（実施例１２）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養系内でのＧｌｕｔａｍａｘ（商標）の使用
三角／振とう器フラスコ、又はスピナフラスコ内で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からのクラスタを、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で播種した。
胚体内胚葉の生成のために、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）補助が必要とされるのかどうかを決定するために、分化の１日目に３μＭのＭＣＸで、及び２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１基本培地で補助した、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）を加えるか又は加えない、ステージ１基本培地（実施例９に記載）内でクラスタを懸濁することによって、実施例を実行した。３日目には培地交換を実行しなかった。分化の３日目の終了時点で、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析のために試料を回収した。
フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカー、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の百分率を測定することによって、各条件下で、胚体内胚葉が生成される効率を、決定した。データ及び結果を、図４３Ａ＆ＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１６に要約する。
（実施例１３）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養系内での重炭酸ナトリウム濃縮物の役割
三角／振とう器フラスコ、又はスピナフラスコ内で、実施例９に記載するステージ１基本培地（３．６４ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを含有）内、又は２．４３ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを含有する修飾ステージ１基本培地内のいずれかで、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からのクラスタを、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で播種した。実施例１２に記載するように、ＭＣＸ及びＧＤＦ−８を含有するステージ１基本培地で、クラスタを処理した。分化の３日目の終了時点で、フローサイトメトリーのために試料を回収した。分化の各日における、位相差画像もまた撮像した。
その後、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカー、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の百分率を測定することによって、胚体内胚葉が生成される効率を決定した。データを、図４４Ａ＆ＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１７に要約する。懸濁培養系内で、最低２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムレベルは、細胞が３．６４ｇ／Ｌを含有する培地内で分化した際（平均で９７．３５％の細胞がＣＸＣＲ４を発現）よりも、胚体内胚葉を非効率的に生成（平均で８７．４％の細胞がＣＸＣＲ４を発現）するようである。更に、ステージ１の終了時点で、位相差顕微鏡法によって観察される重炭酸塩レベルの差が、クラスタ形態の差と相関したことが観察された（図４４Ｃ＆Ｄ）。また、高い重炭酸塩レベル下で分化した細胞は、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸塩中で分化した細胞よりも、疎性のクラスタを形成することが留意された。
（実施例１４）
測定可能なバイオリアクタープロセスにおける、ヒト誘導多能性幹細胞からの膵臓前駆体クラスタの生成
細胞治療は、一用量につき、大量（＞１０8）の細胞を必要とする。この実施例は、現在の細胞治療製造の慣行で可能であるものよりも、３〜５桁大きい誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）集団を分化させることができるプロセスを実証する。
この実施例において、ｉＰＳ細胞株を使用した−ＵＴＣ（米国特許出願第１３／３３０，９３１号において既に記載されている臍組織細胞に由来。「フットプリント」のない様式で、プラスミドトランスフェクションを使用して、細胞をマウス胚性フィーダー細胞上に誘導し、継代培養１５で凍結維持した。
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）提供のＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｅ８（商標））内のヒト組み換えラミニン（ｈｒＬａｍｉｎｉｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＬＮ−５２１ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｌａｍｉｎａ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））上で供給源材料バイアルを直接解凍することによって、これらの凍結保存された細胞から一連の細胞バンクを生成して、自家種材料を生成した。この解凍され、増大した材料を、「前前マスター細胞バンク」（前前ＭＣＢ）と称し、これは将来のバンクのための種材料としての役割を果たした。その後、前前ＭＣＢの３連続の細胞バンクを生成した−前ＭＣＢ、ＭＣＢ、及び活動細胞バンク（ＷＣＢ）である。その後、１つのＷＣＢバイアルを解凍し、Ｅ８（商標）内での３継代培養のためのＥＤＴＡ継代培養を使用して、ｈｒＬａｍｉｎｉｎ上で増大させた。細胞を、まず解凍物からＴ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））内へと播種し、その後複数のＴ２２５フラスコ内に継代培養した。その後、複数のＴ２２５フラスコを継代培養し、組み合わせて、単一の１−Ｌａｙｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）（ＣＳ１）を播種した。ＣＳ１内の細胞がコンフルエントになると、細胞をＰＢＳ−／−で１度洗浄し、ＰＢＳ−／−で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。その後、アキュターゼを除去し、酵素溶液の適用の３分後、細胞の引き上げを促進するために、ＣＳ１を叩打した。２％のＢＳＡで補助し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有するＥ８（商標）を、ＣＳ１に添加して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯いで非活性化した。その後、濯ぎ液を回収し、第２の濯ぎ液体積を添加し、回収し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。
２％のＢＳＡで補助し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する培地内で、１リットルの使い捨て可能なスピナフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））に、２２５ｍＬリットル中１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で細胞を移動した。加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内で、静的懸濁液中で細胞を６０分間クラスタ化させ、５５〜６５ｒｐｍで５分間撹拌し、２％のＢＳＡで補助し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する２２５ｍＬの追加の培地を添加した。静的培養系内で、細胞を更に３０分間沈殿させ、その後２％のＢＳＡで補助し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ-２７６３２を含有する１５０ｍＬの追加の培地をスピナフラスコに添加した。その後、加湿、５％のＣＯ２インキュベーター内で、細胞を５０〜７０ｒｐｍで連続的に攪拌した。スピナフラスコをインキュベーターから取り出した２４時間後、クラスタを５〜１０分間沈殿させた。その後、管内に２００ｍＬが残るまで培地を吸引し、その後４００ｍＬの追加の新鮮な培養培地をスピナフラスコに添加した。このプロセスを２日目（移動の４８時間後）の終了時に反復した。
その後、最初のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理から７２時間後、細胞クラスタ解離及びスピナフラスコ播種（継代培養）のプロセスを反復して、複数の継代培養（試験範囲：１〜１０継代培養）のために細胞を懸濁液中で維持した。
このプロセスを使用して、基質上の接着培養系から細胞クラスタとしての懸濁培養系へと、ＵＴＣ ｉＰＳ細胞を変換し、その後懸濁液中で増大させた。その後、これらの懸濁液で継代培養及び培養した細胞を、凍結保存し、後の使用のために保管した。凍結保存のための懸濁増大細胞クラスタを調製するために、細胞を４０マイクロメートルの細胞ストレーナに通過させることを除いて、上記するように、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で細胞クラスタを解離した。その後、各１リットルの使い捨て可能なフラスコからの細胞を計数し、必要に応じて組み合わせ、０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを撹乱せずに、上清を可能な限り完全に除去した。その後、寒冷（＜４℃）ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０を滴下式様式で添加して、１ｍＬにつき１億５０００万個の細胞の最終濃度を達成し、１．８ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ凍結バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））又は１５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉ凍結袋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））への移動中、細胞溶液を氷浴内で保持した。
その後、以下の制御された速度の冷凍庫内で、懸濁液増大細胞をバイアル内で、高密度で凍結した。室を４℃に予冷し、試料バイアル温度が６℃に達するまで、温度を保持した。その後、試料が−７℃に達するまで、室の温度を２℃／分で減少させた。試料バイアルが−７℃に達すると、室が−４５℃に達するまで、室を２０℃／分で冷却した。その後、室温度が−２５℃に達するまで、室温度を１０℃／分で短時間上昇させ、その後試料バイアルが−４５℃に達するまで、室を０．８℃／分で更に冷却した。その後、室が−１６０℃に達するまで、室温度を３５℃／分で冷却した。その後、室温度を−１６０℃で少なくとも１０分間保持した後、バイアルをガス相液体窒素貯蔵庫に移動した。
攪拌されるタンクバイオリアクターを接種するために、高密度凍結維持された細胞を、液体窒素貯蔵庫から取り出し、解凍し、閉鎖された０．２リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ（Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を播種するために使用した。凍結バイアルを、ガス相液体窒素貯蔵庫から除去し、３７℃の水浴内に１０５秒間直接定置した。その後、２ｍＬのガラスピペットを使用して、解凍されたバイアル内容物を５０ｍＬの円錐チューブへと移動した。その後、２％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ２７６３２で補助した９ｍＬのＥ８をチューブ内に滴下式の様式で添加した。その後、細胞を０．８〜２Ｎ（８０〜２００ｒｃｆ）で５分間遠心分離した。その後、上清をチューブから吸引し、２％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ２７６３２で補助した１０ｍＬの新しいＥ８を添加した。細胞を含有するこの体積を培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８，Ｓａｎｉｓｕｒｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））内にピペットで移動し、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−ｆｌｅｘチュービング溶接を介して、バイオリアクター内にボトル内容物を直接ポンプ送達した。多能性幹細胞接種の調製のために、バイオリアクターを、２％のＢＳＡ、及び１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ２７６３２で補助した０．１５ＬのＥ８で調製し、３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで攪拌し、ＣＯ2によって、３０％の溶存酸素目標値（ＣＯ2、空気、Ｏ2、及びＮ2を調節）で６．８〜７．１ｐＨに調節した。接種の直後、細胞計数のためにバイオリアクターを試料採取し、培地体積を必要に応じて調整して、０．２２５×１０6個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度を生じさせた。
攪拌されるタンクバイオリアクター内に接種された細胞は、連続的に攪拌されるタンク内で細胞クラスタを形成した。接種の後、リアクター内の、２％のＢＳＡで補助したＥ８培地内で細胞クラスタを３日間維持した。培地を毎日変更した；接種の２４時間後、９０％の使用済みの培地を除去し、０．１５リットルの新しい培地を添加した。接種の４８時間後、９０％の使用済みの培地を除去し、０．１５リットルの新しい培地を添加した。接種の７２時間後、＞９０％の使用済みの培地を除去し、分化培地を添加することによって、多能性細胞分化を開始させた（表１８）。
段階的分化プロセスが開始すると、温度（３７℃）、ｐＨ（分化について７．４）、並びに溶存酸素（ステージ１について１０％のＤＯ目標値、及び他の時は常に３０％のＤＯ目標値、ＣＯ2、Ｏ2、Ｎ2、及び空気を調節）について調節された、閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を１２日間以上維持した。分化プロセスを通して、各培地交換で、培地除去前にディップチューブを介して羽根車を５〜２０分間停止して、クラスタを沈殿させた。バイオリアクター内の培地を除去するか、又は蠕動ポンプによって、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ溶接機を使用してＣ−ｆｌｅｘ（商標）チュービングに接続したディップチューブを通して、閉鎖されたボトル又は袋に／から添加して、閉鎖された系を維持した。羽根車を完全に水浸させるために十分な培地が管に添加されると、羽根車及び加熱器に再度電圧を印加した。
バイオリアクタープロセスを監視するために、細胞クラスタを含有する培地の試料を、毎日採取して、細胞数及び生存性（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ）を図４５に示すように決定した。０．２２５×１０6個の生細胞／ｍＬの接種材料が増大して、ステージ４、３日目で０．６５×１０6個の生細胞／ｍＬを生成したように、プロセス中、一般的な細胞の増大が観察された。
毎日の計数に加えて、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によってバイオリアクター培地試料を分析した。ステージ０（ｐＨ ６．８）でのリアクター目標値につき、ステージ０における培地のｐＨは、ステージ０を通して酸性（ｐＨ ６．８）であることが観察された（図４６）。ステージ０での酸性目標値は、比較的低い乳酸で、細胞の代謝活性を低減するようであり、ステージ０培地における高いグルコースレベルが観察された。細胞がステージ３の終了までの分化を開始すると、細胞は、培地内のほぼ全てのグルコース（図４７）を消費し、高レベルの乳酸（図４８）を生成した。更に、ステージ１及び２にわたって細胞密度の増加が観察された（図４５）。
ｐＨ及び代謝のステージ特異的な変化が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるｍＲＮＡ発現パターンのステージ変化と一致するかどうかを決定するために、以下を行った。多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、腸管（ＧＴ）、又はステージ４（Ｓ４）を指定した、４つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙを使用した（Ｌｉｆｅ（商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。全ての施行及びアレイにわたる発現を標準化するための対照としての、未分化のＵＴＣｉＰＳ細胞試料と対比した倍数の差として結果を示す。
これらのアレイを使用して、分化の各ステージで遺伝子発現を決定した。その後、バイオリアクター内に解凍された種材料細胞が、ステージ０、１、２、及び３日目で、未分化の遺伝子発現パターンを示すことが観察された（バイオリアクター接種の２４、４８、及び７２時間後：図４９及び５０）。これらの結果は、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の高い発現レベル、並びにＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４の不在を示すフローサイトメトリー結果と良く相関した（図５１）。これらのフローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲデータは、安定な多能性状態と一貫した、多能性の遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ、及びＺＦＰ４２）の堅固かつ安定な発現パターンを示し、分化中に特徴的に発現する遺伝子（ＣＤ９９、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、ＨＮＦ４α、ＫＩＴ、ＭＮＸ１、ＭＩＸＬ１、ＰＲＤＭ１、ＰＴＨＲ１Ｒ、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、Ｔ、ＴＭＰＲＳＳ２、及びＶＷＦ）の発現を示さなかった。
ステージ０の完了時点で（リアクター接種の７２時間後）、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する分化培地（表１８）内に細胞を移動した。この培地変更の２４時間後、ＦＯＸＡ２、ＨＡＮＤ２、ＰＲＤＭ１、ＰＴＨ１Ｒ、及びＳＯＸ１７発現の＞１０×の増加、ＣＥＲ１、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、及びＭＮＸ１の＞１００×の増加、並びにＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現＞１０００×の増加などの、遺伝子発現パターン（図４９及び５０未分化の対照と対比した発現量）の有意な変化が留意された。これらの増加した発現レベルは、細胞が中内胚葉運命を通して遷移したことを示した。ＣＤＸ２レベルが、未分化の細胞に対して、ステージ１、１日目に上昇した（対照と対比した発現において２７００×の増加）こともまた留意されたが、これは、発現の一過性の増加であり、ＣＤＸ２レベルは、ステージ１、３日目までに、分化の誘導前に観察されたものに相当するレベルまで９７％低下した（図４９及び５０未分化の対照と対比した発現量）。
ステージ１分化培地への露出の７２時間後、ＣＸＣＲ４レベルが歴史的対照に対して約４００×でピークに達し、ＦＯＸＡ２が対照に対して１３６×で発現し、ＳＯＸ１７が歴史的対照に対して４７０，０００×で発現したため、細胞は、胚体内胚葉への特異化と一貫したプロファイルを発現した。胚体内胚葉と一貫して、ステージ１の終了時点での（３日目）ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現が、ステージ１、１日目で観察された上昇したレベルから低下したこともまた留意された（図４９及び５０未分化の対照と対比した発現量）。
ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現におけるこれらの変化は、フローサイトメトリーによって観察された結果と相関した。分化の開始時点でＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団（図５１）から、ステージ１の終了時点でＣＸＣＲ４発現細胞（細胞の９８．６％がＣＸＣＲ４陽性）の均質な集団（図５２）へのほぼ完全な遷移もまた見られた（図５２）。
胚体内胚葉形成（ステージ１）の完了に続いて、原始前腸形成を誘導するために使用されるモルフォゲンである、ＦＧＦ７を含有するものに培地を変更した。原始前腸の形成と一貫して、ステージ２、１及び３日目でのＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方で、ステージ１、３日目に高レベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）がステージ２の終了時点までに低減した発現を示した（図５０及び５３未分化の対照と対比した発現量）。前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現は増加した（図５３未分化の対照と対比した発現量）。
細胞をステージ２培地内で７２時間培養した後、培養系をステージ３培地に交換した（表１８）。この培地内に置くと、細胞は、遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定される、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。ＰＤＸ１の遺伝子発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと６０倍増加した。これらのデータは、細胞が膵臓運命に特異化していたことを示す（図５４）。この観察を支持するのは、図５４及び５５に示すような、膵臓内で一般的に発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主の未分化の対照と対比した、増加した発現レベルである。興味深いことに、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現がないこと（ｑＲＴ−ＰＣＲによる３７の試料Ｃｔｓ）、並びに内胚葉系統ＡＦＰ、ＡＬＢ、及びＣＤＸ２の他のマーカーの高い発現レベルが観察された。これは、バイオリアクター内の細胞集団が、まず比較的可塑性の腸管運命に分化し、その後膵臓運命に更に分化したことを示す（図５４及び５５）。
４つのステージ分化プロセスの終了時点で、細胞は、高レベルのＰＤＸ１（ＦＡＣＳによる９５．６％陽性、ｑＲＴ−ＰＣＲによる対照に対して約１，０００，０００倍の誘導）及びＦＯＸＡ２（ＦＡＣＳによる９９．５％陽性）発現を保持した。細胞は、膵臓前駆細胞（ＦＡＣＳによる、ＮＫＸ６．１について３９．２％陽性）及び膵内分泌細胞の集団（ＰＡＸ６について９．４％陽性クロモグラニンについて１２．４％陽性、ＮＫＸ２．２について１５．２％陽性；全てＦＡＣＳによる）と一貫した発現パターンを示した。このステージ特異的マーカーの発現パターンは、多能性集団から膵臓前駆細胞への、効率的ステージ式分化を示した。フローサイトメトリーで観察されたこれらの結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。膵臓内で一般的に発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主が、全てステージ４、３日目に増加した発現レベルを有することもまた留意された。（図５５）。参考のために、各ステージの終了時点での、細胞クラスタの代表的な顕微鏡写真（４×）を図５６に示す。
材料：
・ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１、（ＷＡ０１ｃｅｌｌｓ、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））
・ＰＢＳ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＬＸ−２７０−３３３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））
・ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
・ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ−（Ｃｈｅｍｅｔｅｃ，Ｃａｔ＃ＹＣ−Ｔ１００（Ｄｅｎｍａｒｋ））
・Ｎｏｎ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄ ６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
・ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（Ｆｅｒｍｐｒｏｂｅ ｐＨ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ２２５ｍｍ，Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｆ−６３５、及びＤＯ Ｏｘｙｐｒｏｂｅ １２ｍｍ Ｓｅｎｓｏｒ，Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｄ−１４５ ｆｒｏｍ Ｂｒｏａｄｌｅｙ Ｊａｍｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
・免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
・ヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ ＣＡＴ＃ １０−１１４１−０１）
・Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標），ＭＣＤＢ１３１、及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
・レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
・ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＭＣＸ（ＪＮＪ）
・ＦＧＦ７（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体アンタゴニスト）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）
・ＴＰＰＢ（プロテインキナーゼＣ活性薬）（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）
（実施例１５）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養系内でのＭＣＸ／ＧＤＦ８の細胞周期調節剤としての役割
三角振とう器フラスコ内の、２％の脂肪酸を含まないＢＳＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ（ＩＡ））、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ））、追加の２．５ｍＭのグルコース（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ）、及び１：５０，０００の貯蔵濃度のＩＴＳ−Ｘ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ５１５０００５６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ））で補助した、３．６４ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び５．５ｍＭのグルコース（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３０５１ＤＪ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ））を含有するＭＣＤＢ−１３１培地内で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からのクラスタを、０．５×１０6個の細胞／ｍＬで播種した。本実施例の目的のために、この様式で補助したＭＣＤＢ−１３１培地を、ステージ１基本培地又は「無溶媒」培地と称することとする。ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（米国特許出願第１２／４９４，７８９号；その全体が本明細書に参照によって組み込まれる）を、「ＭＣＸ」と称する。
分化の第１日目に６つの条件のうちの１つでクラスタを処理した：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。
それぞれの条件の培地を、分化開始の２４及び４８時間後に変更した。これらの時間に、条件１、２、３、及び４の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８で補助した新鮮なステージ１基本培地に変更した一方で、条件５及び６の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで補助した新鮮なステージ１基本培地に変更した。
分化開始の１時間前、及び分化開始（「時間０」と称する）の５、２３、２９、４７、又は７１時間後、非組織培養処理した６ウェルの皿に懸濁試料を移動し、ＥＤＵ（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で１時間インキュベートした。その後、ＥＤＵでインキュベートした細胞を、分化開始の０、６、２４、３０、４８、又は７２時間後の時間に、フローサイトメトリーによって評価して、細胞周期のＧ０／Ｇ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍステージにおける細胞の百分率を測定した（図８１〜８７）。
このプロトコルに従って、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍステージにおける細胞の百分率の有意な差が観察され（図８２〜８７）、ＭＣＸ及びＭＣＸ＋ＧＤＦ８処理した細胞は、他の４つの処理条件と比較して、ＥＤＵの取り込みにおいてほぼ４０％の低減を有することが留意された（図８１）。ＥＤＵ取り込みにおけるこの低減は、ＭＣＸ＋ＧＤＦ８処理した試料からのＧ０／Ｇ１細胞の３８％の増加、及びＭＣＸのみで処理した細胞のＧ０／Ｇ１細胞の５４％の増加と一致した。分化開始の６時間後の、ＥＤＵ取り込み及びＧ０／Ｇ１への増加した遷移に対するこれらの変化は、ＧＤＦ８、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、又は無溶媒培地で処理した細胞においては観察されなかった。むしろ、ＧＤＦ８、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、又は無溶媒培地で処理した細胞は、図８１及び８２に示すように、ＥＤＵ取り込みを有する細胞の百分率（平均、４８．１％、標準偏差±１．２）における最小限の低減、及び分化開始の６時間後のＧ０／Ｇ１内の細胞の数において、平均１３％の減少（標準偏差、±５％）を実証した。
プロセスにおいて、他の処理条件と比較した、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞のＧ０／Ｇ１値間の散布度で、後に類似した差が観察された。時間０の３０時間後、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞が、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、又は無溶媒培地で処理した細胞と比較して、Ｇ０／Ｇ１において、４３〜４５％より少ない細胞を有していた。ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞の７１．９〜７５．５％が細胞周期のＧ０／Ｇ１にあった一方で、ＧＤＦ８で処理した細胞の４８．５％、ＷＮＴ３Ａで処理した細胞の５５．８％、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡで処理した細胞の５７．７％、又は無溶媒培地で処理した細胞の４９％がＧ０／Ｇ１にあったため、Ｇ０／Ｇ１細胞の百分率間のこのギャップは、分化開始の４８時間後で保持された。ＥＤＵ取り込み及びＧ０／Ｇ１プロファイルにおいて観察された差に加えて、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＷＮＴ３Ａ＋アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、又は無溶媒培地で処理した細胞と比較して、時間０の３０及び４８時間後に、１５〜３３％多い、細胞周期のＳ相にある細胞を有した（図８４及び８５）。
データ（図５７〜８０及び８８ａ〜ｆに示す、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、キット、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、及びＴの遺伝子発現）は、懸濁培養系内での、分化の第１日目の、ＴＧＦ−β族員、ＧＤＦ８有り又は無しでのＭＣＸの添加が、胚体内胚葉形成の終了時点での遺伝子発現によって測定される、細胞を１日目に２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで処理する際に得られるものに相当する胚体内胚葉を生成したことを示した。しかしながら、胚体内胚葉形成のプロセスを通して観察される細胞周期の差と一貫して、遺伝子発現における中間差が見られた。ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した試料において、遺伝子Ｔ（ブラキュリ）、ＧＡＴＡ４、及びＣＤＸ２が、分化の最初の２４時間以内にＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ又は他の３つの試験された条件で処理した細胞よりも、実質的に高いレベルで誘導された（図８８ｂ、ｃ、及びｄ）。逆に言うと、多能性の遺伝子（ＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現は、開始細胞集団又は他の４つの試験された条件と比較すると、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した試料において２４時間目までに劇的に低減した（図８８ｅ）。ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７などの遺伝子の発現の誘導の規模は、他の４つの試験された条件と比較すると、分化開始の２４時間後でＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８試料においてかなり低かったが、４８時間までには、全ての試料が同等のレベルでＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７を発現した。（図８８ｃ及びｅ）。
（実施例１６）
測定可能な懸濁分化プロセスを使用する、外胚葉組織及び中胚葉組織の生成
本実施例は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の増大及び分化の両方をして、外胚葉組織又は中胚葉組織の生成のための測定可能な製造プロセスを達成することができるプロセスを実証する。
２つの細胞株を懸濁増大させて、これらの研究のための種材料を提供した：Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞株−ＷＢ０１０６のサブクローン、及び臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株である。先行する実施例において記載するように、懸濁増大した細胞を、制御された速度の冷凍庫内で、高密度で凍結し、その後解凍して、閉鎖された３リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ（Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））又は使い捨て可能な３リットルの単一使用バイオリアクター（Ｍｏｂｉｕｓ，ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に０．２２５×１０6個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度で接種した。攪拌されるタンクバイオリアクター内に接種された細胞は、連続的に攪拌されるタンク内で細胞クラスタを形成し、それらをリアクター内の多能性培地（２％のＢＳＡで補助したＥ８（商標））内で合計３日間維持した。接種の７２時間後、それらのそれぞれの分化培地（表１９）内のプラスチック製使い捨て可能な三角フラスコ（ＰＥＴＧ １２５ｍＬフラスコ、Ｃａｔ＃４１１２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ））に細胞クラスタを移動することによって、多能性細胞分化を開始させて、中胚葉／心性組織（１）又は外胚葉／神経組織（２）を形成した。
段階的分化プロセスが開始すると、振とう器プラットホーム（ＭＡＸＱ ４１６ｈｐ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ））上の加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で、１００ｒｐｍで、細胞を十（１０）日間維持した。分化開始の１日目、３日目、５日目、及び７日後、表１９に記載されるように作製したフラスコ内の培地を新鮮な培地に交換した。ｑＲＴ−ＰＣＲ試料を、参考のために分化の開始前に、その後分化の開始の３、５、７、及び１０日後に取得した。
ｍＲＮＡ発現パターンにおける外胚葉又は中胚葉の特異的な変化が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出され得るかどうかを決定するために、多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、及びステージ６（Ｓ６）を指定した、３つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ（商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用し、結果を、発現を標準化するための対照としての適した未分化の多能性幹細胞試料と比較した。
これらのアレイを使用して、外胚葉（図８９）又は中胚葉（図９０）分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを決定した。いずれかの条件下で振とう器フラスコ内で分化した細胞が、３日目〜１０日目からの延長した培養系に対して、多能性アレイによって測定される、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＴＤＧＦ１、及びＺＦＰ４２などの多能性の遺伝子の、低減した多能性遺伝子発現を実証することが観察された。ＣＸＣＲ４の発現は、外胚葉又は中胚葉のいずれかに分化したｈＥＳ又はｉＰＳ細胞からの試料において増加した。これらの結果は、分化の遺伝子特徴の高い発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲデータと相関した。外胚葉分化培地で処理した細胞は、分化開始の３〜１０日後のｑＲＴ−ＰＣＲによって、増加したレベルのＡＲＸ、ＮＥＵＲＯＤ、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ６（＞１００倍）、及びＺＩＣ１（＞１０００倍）を発現した（図９１）。これらのデータを、ＦＡＣＳアレイによって確認し、それは、外胚葉運命への分化開始を開始してから三（３）日後、ｉＰＳＣ及びｈＥＳ細胞の両方が、ＳＯＸ２（多能性及び神経幹細胞の両方のために必要とされる遺伝子）の高い発現を維持したが、ＰＡＸ６発現（神経及び内分泌分化の遺伝子）を獲得した一方で、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４（多能性のために必要とされる遺伝子）の発現を喪失したことを示す（図９２）。
中胚葉分化培地で処理した細胞における類似した分化の動力学もまた、観察された。多能性遺伝子発現が分化の１０日目（図９０）にわたって低下するにつれて、３日目で早期、一過性の中内胚葉運命（ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＣＫＩＴ、及びＶＷＦ）の遺伝子特徴について、早期誘導が観察され、これらの遺伝子発現レベルは、１０日目までにほぼ基準まで下降した（図９３）。分化開始の３、５、７、及び１０日後の、特徴的中胚葉遺伝子の発現が、早期かつ増加する遺伝子発現を示すこともまた観察された（図９３中、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ６、ＨＮＦ４α、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、及びＳＯＸ１７）。ｉＰＳ及びｈＥＳ細胞試料の両方において、遺伝子誘導の同一のパターンを観察したが、これは、分化プロセスが指向されたものであり、天然状態において自然発生的ではないことを示す。
ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察されたこれらの変化は、位相差顕微鏡法及びクラスタの免疫染色した凍結切片によって観察された結果と相関した。中胚葉分化した懸濁培養系に置いてから１０日目までに、１０個中約１個のクラスタが、自然発生的に「拍動」を開始したが、これは、細胞が心筋組織に分化したことを示唆する（図９４、左パネル、１０日目、白色棒）。いくつかのクラスタの染色した断面は、筋肉形成を示す、線条の、端から端までのβ−チューブリン染色パターンを示した（図９４、右パネル）。
中胚葉に分化したクラスタ（図９４）と比較して、外胚葉運命に分化したクラスタ（図９５、左パネル）について、著しく異なる形態的なパターンが観察された。外胚葉分化を通して、クラスタは、中胚葉運命に分化した細胞よりも、大きくかつ高密度であり、外胚葉分化した細胞は、より少ない全βチューブリンを発現した。βチューブリンを確かに発現したこれらの細胞は、より樹枝状のパターンの、ニューロンの染色（図９５、右パネル、白矢印）特徴を示した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳデータと組み合わせて、これらの結果は、懸濁液中でバンクされ、増大される細胞が、懸濁培養系内で、指向され、再現可能な様式で中胚葉運命又は外胚葉運命に分化し得ることを示す。
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順、及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び図示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
表２０
材料：
ヒト臍帯組織由来細胞（米国特許第７，５１０，８７３号に開示）
誘導可能多能性幹細胞
単為生殖生物
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１、（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））
ＰＢＳ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ １４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＡＬＸ−２７０−３３３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））
ＥＤＴＡ、（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ−（Ｃｈｅｍｅｔｅｃ，Ｃａｔ＃ＹＣ−Ｔ１００（Ｄｅｎｍａｒｋ））
非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））
アキュターゼ、（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２６０４−０１３（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））
ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（Ｆｅｒｍｐｒｏｂｅ ｐＨ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ２２５ｍｍ，Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｆ−６３５、及びＤＯ Ｏｘｙｐｒｏｂｅ １２ｍｍ Ｓｅｎｓｏｒ，Ｍｏｄｅｌ ＃ Ｄ−１４５ ｆｒｏｍ Ｂｒｏａｄｌｅｙ Ｊａｍｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）（Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
ヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ ＣＡＴ＃ １０−１１４１−０１）
Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、ＭＣＤＢ１３１、及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＭＣＸ（ＪＮＪ）
ＩＷＰ−４（ＷＮＴ３阻害剤）Ｓｔｅｍｇｅｎｔ
ＭＣＤＢ１３１培地
ＭＣＤＢ１３１培地（カスタム化）−ＮａＣＯ3レベルを３．６４ｇ／Ｌに上昇させるために修飾

Claims (13)

  1. ブラキュリ遺伝子の発現を増加させる方法であって、
    平板接着培養において多能性幹細胞を凝集した細胞クラスターに増大させる工程、
    酵素又はキレート剤を使用して、前記凝集した細胞クラスターを単一の細胞に脱凝集させずに、前記凝集した細胞クラスターを取り出す工程、
    前記凝集した細胞クラスターを再懸濁し、低結合平板において一晩インキュベートする工程、および
    環式アニリンピリジノトリアジンで補充された培地中の動的懸濁培養において前記多能性幹細胞を凝集した細胞クラスターとして培養する工程
    を含む、方法。
  2. 多能性細胞を分化させるための方法であって、
    平板接着培養において多能性幹細胞を凝集した細胞クラスターに増大させる工程、
    酵素又はキレート剤を使用して、前記凝集した細胞クラスターを単一の細胞に脱凝集させずに、前記凝集した細胞クラスターを取り出す工程、
    前記細胞クラスターを再懸濁し、低結合平板において一晩インキュベートする工程、および
    前記多能性細胞を、凝集した細胞クラスターとして、動的懸濁培養において１８〜３０時間の期間内に胚体内胚葉細胞へと分化させる工程であって、前記培地が、アクチビンＡ、ＷＮＴ３Ａ、又はいかなるＴＧＦβ族も含まず、環式アニリンピリジノトリアジンで補充されたものである工程
    を含む、方法。
  3. 前記培地がさらにＧＤＦ８で補充されている、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記環式アニリンピリジノトリアジンが１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６−〜．１〜８，１２．〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノン−アエン−１６−オンである、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記環式アニリンピリジノトリアジンが１４−メチル−３，５，７，１４，１８，２４，２８−ヘプタアザテトラシクロ［２０．３．１．１〜２，６〜．−１〜８，１２〜］オクタコサ−１（２６），２（２８），３，５，８（２７），９，１１，２２，２４−ノナエン−１７−オン、
    又は５−クロロ−１，８，１０，１２，１６，２２，２６，３２−オクタアザペンタシクロ［２４．２．２．１〜３，７〜−１〜９，１３〜．１〜１４，１８〜］トリトリアコンタ−３（３３），４，６，９（３２），１０−，１２，１４（３１），１５，１７−ノナエン−２３−オンである、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記環式アニリンピリジノトリアジンを１μＭ〜５μＭ含む、請求項４または５に記載の方法。
  7. 多能性幹細胞の凝集クラスターを胚体内胚葉に分化させる方法であって、
    平板接着培養において多能性幹細胞を凝集した細胞クラスターに増大させる工程、
    酵素又はキレート剤を使用して、前記凝集した細胞クラスターを単一の細胞に脱凝集させずに、前記凝集した細胞クラスターを取り出す工程、
    前記凝集した細胞クラスターを再懸濁し、低結合平板において一晩インキュベートする工程、および
    前記多能性幹細胞を、環式アニリンピリジノトリアジン及びＧＤＦ８で補充された培地中で動的懸濁培養において培養する工程であって、前記環式アニリンピリジノトリアジンが１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６−〜．１〜８，１２．〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノン−アエン−１６−オンである工程
    を含む、方法。
  8. ブラキュリ遺伝子の促進を増加させる、請求項７に記載の方法。
  9. 細胞周期のＧ０／Ｇ１相における細胞の百分率を増加させる、請求項７に記載の方法。
  10. 懸濁培養がマイクロキャリアを含む、請求項１、２及び７のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１、２及び７のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記培養培地が１ｍＭ〜８ｍＭのグルコースで補充されている、請求項１、２及び７のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記培養培地がＩＴＳ−Ｘで補充されている、請求項１、２及び７のいずれか一項に記載の方法。
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