JP5762979B2 - 膵ホルモン産生細胞の製造法 - Google Patents

Description

本発明は、膵ホルモン産生細胞の製造方法に関する。さらに本発明は、該方法により得られた膵ホルモン産生細胞、並びにそれを用いた医薬のスクリーニング方法及び医薬等に関する。

膵臓は、内分泌腺（内分泌細胞）と外分泌線（外分泌細胞）を有し、両分泌細胞で重要な役割を担っている器官である。外分泌細胞は主に膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する役割を果たしている。
内分泌細胞は膵ホルモンを分泌する役割を果たし、膵α細胞からグルカゴン、膵β細胞からインスリン、膵δ細胞からソマトスタチン、膵ポリペプチド（ＰＰ）細胞からＰＰが分泌されることが知られている。また、近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓の内分泌細胞からも分泌されることが報告されている。

インスリンは、ブドウ糖の利用、蛋白の合成、中性脂肪の形成及び貯蔵を促進し、血糖値を低下させ、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。グルカゴンは、肝糖原分解、糖新生作用などを介する血糖上昇ホルモンとしてインスリンと並び糖代謝調節機構において重要な役割を担っている。ソマトスタチンは、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現し、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制する。ＰＰは、食事に対応してランゲルハンス島の細胞から分泌されるホルモンであり、飽食因子として知られ、食物摂取や体重増加を低減させる働きがある。グレリンは食物摂取を刺激し、脂肪酸化を低下させることによって体重を増加させることが知られている。

糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治させることが難しい疾患である。糖尿病は、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）とＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。

ＩＩ型糖尿病は、インスリンに対し抵抗性をもつために発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣との関わりで問題となっている糖尿病である。ＩＩ型糖尿病は中高年で発病することが多く、糖尿病患者の多くはＩＩ型糖尿病を罹患している。

Ｉ型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によって膵β細胞（本明細書中、インスリン産生細胞と称することがある）が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる慢性疾患である。体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールでき、かつ、患者の負担を軽くできる治療法として、Ｉ型糖尿病患者に対する膵臓移植又は膵島移植が行われている。これらの治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植技術は十分に確立しているとは言えず、また移植可能な膵臓又は膵島が不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を回避するために、患者は免疫抑制剤を一生服用し続ける必要があり、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。

Ｉ型糖尿病について試みられている治療法の一つに、体外で患者由来の細胞からインスリン産生細胞自体を誘導し、誘導した該インスリン産生細胞を患者の生体内に移植する方法がある。この方法によれば患者自身の体内でインスリンを作り出すことができる。また、患者由来の細胞からインスリン産生細胞を誘導した場合には、患者由来の細胞であることから免疫拒絶反応の問題が解消される等、安全性の面でも有利である。

インスリン産生細胞を得る方法としては、胚性幹細胞（本明細書中、ＥＳ細胞と称することがある）を分化させる方法、人工多能性幹細胞（本明細書中、ｉＰＳ細胞と称することがある）を分化させる方法、患者の膵臓の組織幹細胞を分化させる方法、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる方法等が知られている。具体的には、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いてヒトＥＳ細胞から膵β細胞を分化誘導する方法（特許文献１、非特許文献１〜４）やヒトｉＰＳ細胞から膵β細胞を分化誘導する方法（非特許文献５）、ＥＳ細胞に、膵臓の発生に関わる重要な転写因子であり、インスリン産生細胞の発生、機能維持の役割も担っていることが知られているＰＤＸ１を導入して培養することによって効率よくインスリン産生細胞を分化誘導する方法（特許文献２〜３）、ホルモンを産生しない膵細胞を脱分化させて幹細胞にし、その幹細胞をアクチビンやＲＡを用いて分化誘導する方法（特許文献４）が知られている。

しかし、これらの方法によって得られるインスリン産生細胞は、正常な膵β細胞と比較してインスリン産生効率がかなり低く、機能的なインスリン産生細胞を効率的に得る方法の開発が依然として求められている。また、糖尿病治療等を行なうために十分な数の膵ホルモン産生細胞（インスリン産生細胞を含む）を得る方法の開発が求められている。

特開２００９−２２５６６１号公報 米国特許７５３４６０８号公報 特開２００６−０７５０２２号公報 ＷＯ０３／１０００２６号公報

Ｅ．Ｋｒｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ"，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４：４４３−４５２ Ｋ．Ａ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ"，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１１：１３９２−１４０１ Ｗ．Ｊｉａｎｇ，"Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ"，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：３３３−３４４ Ｊ．Ｈ．Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ"，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００７）５０：１２２８−１２３８ Ｒ．Ｍａｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ"，ＰＮＡＳ（２００９），ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．３７：１５７６８−１５７７３

本発明の目的は、膵ホルモン産生細胞をより効率的に製造する方法を提供することであり、より好ましくは幹細胞をより効率的に膵ホルモン産生細胞へと分化誘導することによって膵ホルモン産生細胞を多量に安定して製造することである。さらに本発明は、本発明の方法により得られた膵ホルモン産生細胞を用いた医薬のスクリーニング方法や医薬の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、段階的に分化誘導因子の種類及びその組合せを変えることによって、より効率的に幹細胞から膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させることが可能なことを見出し、さらに得られた膵ホルモン産生細胞の機能を確認して本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］幹細胞を、以下の工程（１）〜（４）に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造方法：
（１）幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程
（４）前記工程（３）で得られた細胞を培養する工程；
［２］工程（１）および（２）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンであり、工程（３）が、工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ’）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程である、上記［１］記載の製造方法；
［３］工程（４）が、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地中で実施される、上記［１］又は［２］記載の製造方法；
［４］幹細胞を、少なくともアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養することを特徴とする、内胚葉細胞の製造方法；
［５］アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、上記［４］記載の製造方法；
［６］内胚葉細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養することを特徴とする、膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法：
（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト
（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び
（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤；
［７］内胚葉細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む培地で培養することを特徴とする、膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法：
（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト
（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び
（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤；
［８］工程（３）における培地が、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法：
（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト
（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び
（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤；
［９］工程（１）におけるＧＳＫ３阻害剤が、
６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルである上記［１］〜［３］、［８］のいずれかに記載の製造方法；
［１０］工程（３）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が、
４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物である上記［１］〜［３］、［８］、［９］のいずれかに記載の製造方法；
［１１］工程（３）におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種が、ドーソモルフィン、またはＮｏｇｇｉｎである上記［１］〜［３］、［８］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法；
［１２］工程（３）における培地が、
レチノイン酸、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物、及びドーソモルフィンを含む、上記［１］〜［３］、［８］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法；
［１３］アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種が、フォルスコリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンまたはジブチルｃＡＭＰである、上記［３］、［８］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法；
［１４］ステロイドが、デキサメタゾンである、上記［３］、［８］〜［１３］のいずれかに記載の製造方法；
［１５］アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、または４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物である、上記［３］、［８］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法；
［１６］培地がニコチンアミドを含む、上記［３］、［８］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法；
［１７］幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒトの体性幹細胞である上記［１］〜［５］、［８］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法；
［１８］膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞、及びグレリン産生細胞からなる群より選択されるいずれかである上記［１］〜［５］、［８］〜［１７］のいずれかに記載の製造方法；
［１９］上記［１］〜［５］、［８］〜［１８］のいずれかに記載の製造方法で得られた膵ホルモン産生細胞を含む、医薬；
［２０］上記［６］または［７］記載の製造方法で得られた膵ホルモン産生前駆細胞を含む、医薬；
［２１］以下の工程（１）〜（４）からなる群より選択される何れか１種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法：
（１）幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程
（４）前記工程（３）で得られた細胞を培養する工程；
［２２］工程（１）および（２）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンであり、工程（３）が、工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ’）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、（ｃ）及びアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程である、上記［２１］記載のスクリーニング方法；
［２３］工程（４）が、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地中で実施される、上記［２１］又は［２２］記載のスクリーニング方法。

本発明によれば、より効率的に幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造することができる。本発明により製造された膵ホルモン産生細胞は、糖尿病等の膵ホルモン産生及び／又は分泌異常に起因する疾患の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニングに用いることができる。さらに、本発明の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞は、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができる。

各種の因子を用いてヒトｉＰＳ細胞からの分化誘導を開始し、最初の３日間における原始線条マーカー（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）と内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲで１日ごとに測定した結果を示す。分化誘導因子を何も添加しない場合（Ｃｔｒｌ）、アクチビンＡのみを３日間添加した場合（Ａｃｔ：比較例１）、アクチビンＡ（３日間）とＷｎｔ３ａ（最初の１日間のみ）を添加した場合（Ａｃｔ Ｗｎｔ：比較例２）、アクチビンＡ（３日間）とＣＨＩＲ９９０２１（最初の１日間のみ）を添加した場合（Ａｃｔ ＣＨＩＲ：実施例１）の各遺伝子の発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示した。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は分化誘導１日目にアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせで最も高値を示し、ＳＯＸ１７は分化誘導２〜３日目にアクチビンＡとＷｎｔ３ａあるいはＣＨＩＲ９９０２１との組み合わせで高値を示した。 図１の場合と同様の方法で３日間分化誘導したヒトｉＰＳ細胞に対し、抗ヒトＳＯＸ１７抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。ＳＯＸ１７陽性細胞の核はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、陰性の細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。アクチビンＡとＷｎｔ３ａ（比較例２）あるいはＣＨＩＲ９９０２１（実施例１）を組み合わせた場合にＳＯＸ１７陽性細胞が顕著に検出され、特にＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合（実施例１）に最もＳＯＸ１７陽性細胞の割合が高かった。 ヒトｉＰＳ細胞からアクチビンＡ（３日間添加）とＣＨＩＲ９９０２１（最初の１日間のみアクチビンＡと同時に添加）を用いて３日間分化誘導した細胞に対し、さらに３日目から９日目の間に種々の分化誘導因子を添加して培養し、９日目の時点における膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）と膵ホルモン産生前駆細胞マーカー（ＮＧＮ３）の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した結果を示す。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値で示す。分化誘導因子としては、レチノイン酸（ＲＡ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）、ドーソモルフィン（ＤＭ）をそれぞれ単独あるいは図中に示す組み合わせで使用し（実施例２〜８）、また、一部の細胞はコントロール（Ｃｔｒｌ）として分化誘導因子を添加せずに培養した。ＰＤＸ１はレチノイン酸とドーソモルフィンを組み合わせて添加した場合（実施例２、実施例７）に顕著に高い値を示し、ＮＧＮ３はレチノイン酸、ＳＢ４３１５４２、ドーソモルフィンの３種類を組み合わせた場合（実施例２）に最も高い値を示した。 図３の場合と同様に、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２、ドーソモルフィンの３種類を組み合わせた条件で培養した分化誘導９日後の細胞（実施例２）に対し、抗ヒトＰＤＸ１抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。ＰＤＸ１陽性細胞の核はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、陰性の細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。大部分の細胞がＰＤＸ１陽性を呈しており、本発明の方法によって非常に高効率に膵前駆細胞への分化が誘導されている。 ヒトｉＰＳ細胞からアクチビンＡ（３日間添加）とＣＨＩＲ９９０２１（最初の１日間のみアクチビンＡと同時に添加）を用いて３日間分化誘導した細胞に対し、図３の方法と同様にして分化誘導因子単独あるいはその組み合わせで３日目〜９日目の６日間分化誘導し、さらに分化誘導因子を添加していない培地で９日目〜１５日目の６日間培養した細胞（実施例９〜１５）におけるＰＤＸ１とインスリンの発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した結果を示す。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値として表示する。ＰＤＸ１とインスリンのいずれも、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２、ドーソモルフィンの３種類を組み合わせた場合（実施例９）に最も高い値を示した。 分化誘導１５日後の実施例９の細胞に対して、抗インスリン抗体と抗ヒトＣペプチド抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。インスリン産生細胞（インスリン陽性細胞）はＡｌｅｘａ５６８により赤色を、Ｃペプチド陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。それぞれの染色像を重ね合わせると、インスリン産生細胞とＣペプチド陽性の細胞が一致するため黄色を呈した。 膵臓細胞への分化誘導法の概略を示す。本分化誘導法は４つの段階からなり、未分化なヒトｉＰＳ細胞に対して図に示した順番で基礎培地と増殖分化因子を組み合わせて加えることで、膵臓系譜の細胞への分化を誘導できる。 図７で示した手法に従って分化を誘導した際の、各種分化マーカーの発現の様子を示す。分化誘導３日後、９日後、１１日後、１５日後において、各種遺伝子の発現量を測定し、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値として表示する。内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７は分化誘導の初期に高値を示し、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２、ドーソモルフィンの３種類を組み合わせた分化誘導処理によって膵前駆細胞マーカーであるＰＤＸ１の持続的な発現が見られた。また、ＰＤＸ１が発現する時期の初期には膵ホルモン産生前駆細胞マーカーであるＮＧＮ３が一過性に高値を示した後、分化誘導処理の後期に膵β細胞マーカーであるインスリンの発現が検出された。 本分化誘導法の工程（４）において、フォルスコリンとニコチンアミドを同時に添加、もしくはＤＭＳＯのみを添加して分化を誘導した際のインスリンの発現の様子を示す。分化誘導１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目におけるインスリンの発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるβ−ａｃｔｉｎの発現量に対する相対値として表示する。フォルスコリンとニコチンアミドを同時に添加することでインスリンの発現亢進が誘導１４日目より認められ、２０日目まで維持された。 本分化誘導法の工程（４）（分化誘導１０日目から２２日目まで）においてフォルスコリン及びニコチンアミドを同時に添加、もしくはＤＭＳＯのみを添加して分化を誘導した細胞に対して、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。インスリン産生細胞（インスリン陽性細胞）はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。フォルスコリン及びニコチンアミドを同時に添加することで、高効率にインスリン産生細胞への分化が誘導されている。 本分化誘導法の工程（４）においてフォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩをそれぞれ単独で、あるいはその組み合わせで添加して分化を誘導した際のインスリンの発現の様子を示す。図中のＮはニコチンアミドを、Ｆはフォルスコリンを、Ｄはデキサメタゾンを、ＡはＡＬＫ５阻害剤ＩＩを示す。図中に示す組み合わせで各因子を添加して培養した後、誘導１２日目、１６日目、２０日目におけるインスリンの発現量を測定した。工程（４）においてフォルスコリン、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩをそれぞれ単独で、あるいはフォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを組み合わせて添加した場合に、インスリンの発現は高値を示した。 本分化誘導法の工程（４）（分化誘導１０日目から２０日目まで）において、フォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを図中に示す組み合わせで添加、あるいはコントロールとして誘導因子を添加せずに分化させた細胞に対して、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。図中のＮはニコチンアミドを、Ｆはフォルスコリンを、Ｄはデキサメタゾンを、ＡはＡＬＫ５阻害剤ＩＩを示す。インスリン産生細胞（インスリン陽性細胞）はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。フォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを組み合わせて添加することで、高効率にインスリン産生細胞への分化が誘導されている。 本分化誘導法の工程（１）（分化誘導０日目から１日目まで）において各種ＧＳＫ３阻害剤をアクチビンＡと同時に添加して１日間培養した後に、さらに工程（２）に従い２日間培養した細胞に対して、抗ヒトＳＯＸ１７抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。ＳＯＸ１７陽性細胞の核はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、陰性の細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。ＣＨＩＲ９９０２１（実施例３２）、ＳＢ４１５２８６（実施例３３）、ＳＢ２１６７６３（実施例３４）をアクチビンＡと組み合わせて添加することで、アクチビンＡを単独（コントロール）で添加した場合よりもＳＯＸ１７陽性細胞の割合が増加している。 本分化誘導法の工程（３）（分化誘導３日目から１０日目まで）において、各種レチノイン酸受容体アゴニストをドーソモルフィンとＳＢ４３１５４２と同時に添加、あるいはコントロールとしてドーソモルフィンとＳＢ４３１５４２のみを添加して分化させた細胞に対して、抗ＰＤＸ１抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。図中のＤＭはドーソモルフィンを、ＳＢはＳＢ４３１５４２を示す。ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。各種レチノイン酸受容体アゴニストをドーソモルフィンとＳＢ４３１５４２と同時に添加することで大部分の細胞がＰＤＸ１陽性細胞へと誘導されている。 本分化誘導法の工程（３）（分化誘導３日目から１０日目まで）において、Ｎｏｇｇｉｎ、レチノイン酸、ドーソモルフィンを単独で、あるいはＮｏｇｇｉｎとレチノイン酸またはドーソモルフィンとレチノイン酸の組み合わせで添加して分化を誘導した。また、一部の細胞では、コントロールとして誘導因子を添加せずに培養した。培養後の細胞に対して、抗ＰＤＸ１抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。図中のＣｔｒｌは誘導因子を添加していないコントロールを、ＮｏｇはＮｏｇｇｉｎを、ＲＡはレチノイン酸を、ＤＭはドーソモルフィンを示す。ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。Ｎｏｇｇｉｎとレチノイン酸またはドーソモルフィンとレチノイン酸の組み合わせで添加した場合に、多くの細胞がＰＤＸ１陽性細胞へと誘導されている。 本分化誘導法の工程（３）（分化誘導３日目から１０日目まで）において、各種アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤をドーソモルフィンとレチノイン酸と同時に添加、あるいはコントロールとしてドーソモルフィンとレチノイン酸のみを添加して培養した細胞におけるＮＧＮ３の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した結果を示す。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値として表示する。いずれのアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤においても、ドーソモルフィンとレチノイン酸と同時に添加することでＮＧＮ３の発現が上昇した。 本分化誘導法の工程（４）（分化誘導１０日目から２１日目まで）においてフォルスコリン（Ｆｓｋ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ＩＢＭＸ、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、Ａ−８３−０１、ＳＢ４３１５４２、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩをそれぞれ添加して培養した細胞、もしくはコントロール（Ｃｔｒｌ）として誘導因子を添加せずに培養した細胞に対して、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を行った結果を示す。インスリン陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。これらの化合物を添加して培養することで、高効率にインスリン陽性細胞への分化が誘導されている。 本分化誘導法の工程（４）（分化誘導１０日目から２１日目まで）においてデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾンをそれぞれ添加して培養した細胞、もしくはコントロール（Ｃｔｒｌ）として誘導因子を添加せずに培養した細胞に対して、抗インスリン抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。インスリン陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。これらの化合物を添加して培養することで、高効率にインスリン陽性細胞への分化が誘導されている。 本分化誘導法に従って分化を誘導した細胞に対して、各種のインスリン分泌を促進する因子を１時間添加した場合の上清中に分泌されるＣペプチドの量を測定した。図中の値は２．５ｍＭグルコースを添加した時のＣペプチドの分泌量を基準とした相対値を示している。２．５ｍＭグルコースを含む緩衝液中に各種化合物を添加することで、細胞外へのＣペプチドの分泌量が上昇している。 本分化誘導法に従って分化を誘導した培養２１日目の細胞に対して、抗グルカゴン抗体、抗グレリン抗体、抗ソマトスタチン抗体、抗Ｃペプチド抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。グルカゴン陽性細胞、グレリン陽性細胞、ソマトスタチン陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、Ｃペプチド陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。本分化誘導法を用いることで、Ｃペプチド陽性細胞だけでなく、グルカゴン陽性細胞、グレリン陽性細胞、ソマトスタチン陽性細胞も同時に誘導されている。 本分化誘導法に従って、異なるヒトｉＰＳ細胞株から内胚葉を誘導した。培養３日目の細胞に対して、抗ＳＯＸ１７抗体、抗ＦＯＸＡ２抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。ＳＯＸ１７陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、ＦＯＸＡ２陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。本分化誘導法を用いることで、全てのヒトｉＰＳ細胞株から効率的にＳＯＸ１７陽性ＦＯＸＡ２陽性の内胚葉が誘導されている。 本分化誘導法に従って、異なるヒトｉＰＳ細胞株から膵前駆細胞を誘導した。分化誘導後の培養１０日目の細胞に対して、抗ＰＤＸ１抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。ＰＤＸ１陽性細胞はＡｌｅｘａ４８８により緑色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。本分化誘導法を用いることで、全てのヒトｉＰＳ細胞株から効率的にＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞が誘導されている。 本分化誘導法に従って、異なるヒトｉＰＳ細胞株からインスリン産生細胞を誘導した。分化誘導後の培養２１日目の細胞に対して、抗インスリン抗体を用いて免疫蛍光染色を行った結果を示す。インスリン陽性細胞はＡｌｅｘａ５６８により赤色を呈し、細胞の核はヘキスト３３３４２によって青色を呈する。本分化誘導法を用いることで、全てのヒトｉＰＳ細胞株から効率的にインスリン産生細胞への分化が誘導されている。

以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
本明細書において、「膵ホルモン」としては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、グレリンが挙げられる。
本明細書において、「膵ホルモン産生細胞」とは膵ホルモンを産生する能力を有する細胞を意味する。該膵ホルモン産生細胞は常に膵ホルモンを産生している必要はなく、膵ホルモンの産生能力を有していればよい。また、産生される膵ホルモン量は特に限定されない。
「膵ホルモン産生細胞」における、「膵ホルモン」としては、上記、本明細書における「膵ホルモン」として例示されたものが挙げられる。「膵ホルモン産生細胞」の具体例としては、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞（本明細書中、膵α細胞と称することがある）、ソマトスタチン産生細胞（本明細書中、膵δ細胞と称することがある）、ＰＰ産生細胞、グレリン産生細胞が挙げられる。

本明細書において「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化しうる細胞をいう。具体的にはＥＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９８，９５：１３７２６−３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４−９）、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）が挙げられ、好ましくは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞またはヒトの体性幹細胞、さらに好ましくはｉＰＳ細胞である。

ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するＥＳ細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ＥＳ細胞の好ましい例としては、ヒトに由来するＥＳ細胞が挙げられる。
ＥＳ細胞の具体例として、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。
各ＥＳ細胞は当該分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７８：７６３４−８）によって樹立されており、例えば大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）などから購入可能である。
ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５−７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）などから購入可能である。

ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するｉＰＳ細胞を使用できる。該哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ｉＰＳ細胞の好ましい例としては、ヒトに由来するｉＰＳ細胞が挙げられる。
ｉＰＳ細胞の具体例として、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８；２６：１０１−１０６）が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊａｎ ９；４（１）：１６−９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｎｏｖ ６；５（５）：４９１−５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１−４）などが挙げられる。
作成されたｉＰＳ細胞は、その作出方法によらずいずれも本発明に用いられうる。
ヒトｉＰＳ細胞株としては、具体的には、２５３Ｇ１株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、２０１Ｂ７株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）（７３歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）（５６歳男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）（新生児男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）等が挙げられる。

体性幹細胞としては、ヒトに由来するものが使用できる。ここで体性幹細胞とは、膵ホルモン産生細胞へと分化し得る細胞であり、例えば骨髄や脂肪由来の間葉系幹細胞や膵臓内に存在する幹細胞が挙げられる。

１．細胞の製造方法
本発明の製造方法は、幹細胞や内胚葉細胞あるいは膵ホルモン産生前駆細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法、幹細胞から内胚葉細胞を製造する方法、内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞を製造する方法であるが、より未分化な状態にある細胞をより分化した状態へと分化誘導する方法でもある。

本発明は、幹細胞を、以下の工程（１）〜（４）に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造方法：
（１）幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程
（４）前記工程（３）で得られた細胞を培養する工程、
を提供する。

本発明の製造方法（分化誘導方法）において幹細胞は、通常培養器上で培養される。ここで用いられる培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。好ましくは、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート等である。培養器は、幹細胞を維持・培養するのに適するようなコーティングが施されていることが好ましい。具体的にはフィーダー細胞や、細胞外基質成分でコーティングされた培養器を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ）等）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。細胞外基質成分としては、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質、あるいはマトリゲル等の基底膜成分等が挙げられる。

工程（１）：幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
本工程は、単独、好ましくは後述する工程（２）とともに幹細胞から内胚葉細胞への分化を誘導する工程に相当する。従って、本発明では、本工程（１）によって、幹細胞を出発材料とした内胚葉細胞の製造方法も提供することができる。

本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−４，７の活性化剤は、ＡＬＫ−４及び／又はＡＬＫ−７に対し活性化作用を有する物質から選択される。
本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の例としては、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎが挙げられる。なかでも、本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としてはアクチビンが好ましい。
上記アクチビンはＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）ファミリーに属する大きさ２４ｋＤのペプチド性細胞増殖、分化因子であり、２個のβサブユニットがＳＳ結合を介して２量体を構成している（Ｌｉｎｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，７７９−７８２；Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，７７６−７７９）。アクチビンには、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＡＢが知られているが、本工程においてはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンも使用することができる。本工程に用いるアクチビンとしては特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、該アクチビンとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本工程に使用するアクチビンとしては、分化に用いる幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
本工程における培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の濃度は、用いるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の種類によって適宜設定されるが、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としてヒトアクチビンＡを使用する場合の濃度は、通常０．１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌである。
また、本工程においては、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤（好ましくはアクチビンＡ）とともにＧＳＫ３阻害剤を含む培地を用いることを特徴とする。アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤及びＧＳＫ３阻害剤との存在下に幹細胞を培養すれば、より好適に内胚葉細胞へと分化させることができる。
なお、本明細書中、物質には、低分子化合物、ペプチド、タンパク質等が含まれる。

本工程で用いるＧＳＫ３阻害剤は、ＧＳＫ３α阻害活性を有する物質、ＧＳＫ３β阻害活性を有する物質、及びＧＳＫ３α阻害活性とＧＳＫ３β阻害活性とを併せ持つ物質からなる群より選択される。本工程で用いるＧＳＫ３阻害剤としては、ＧＳＫ３β阻害活性を有する物質またはＧＳＫ３α阻害活性とＧＳＫ３β阻害活性とを併せ持つ物質が好ましい。
上記ＧＳＫ３阻害剤として、具体的にはＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３、ＢＩＯ、ＴＷＳ−１１９及びＳＢ４１５２８６等が例示される。これらはＡｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ ＢＶ社、和光純薬工業社、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｓｉｇｍａ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
また、ＧＳＫ３のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＧＳＫ３阻害剤として使用することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか既報に従って合成することができる。
上記ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，３−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）である。
本工程では、好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）が用いられる。
ＧＳＫ３阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＧＳＫ３阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。ＧＳＫ３阻害剤としてＳＢ４１５２８６を使用する場合の濃度は、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは１〜１０μＭである。ＧＳＫ３阻害剤としてＳＢ２１６７６３を使用する場合の濃度は、通常０．１〜３０μＭ、好ましくは０．５〜２０μＭである。

本工程において、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とＧＳＫ３阻害剤とは、培地中に同時に添加されてもよく、また、幹細胞の内胚葉細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とＧＳＫ３阻害剤とは、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。

本工程で用いる培地は、上記のようにアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とＧＳＫ３阻害剤を含有している限り特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下では、基礎培地と称することもある）にアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤とＧＳＫ３阻害剤を添加してなるものである。
上記基礎培地は、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの基礎培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の培地であれば培地の組成は製造元によらず同等である。本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地である。
本工程で用いられる培地は、血清含有培地であっても無血清培地であってもよい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない基礎培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。本工程で用いられる培地が血清含有培地である場合、該血清としてはウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）などの哺乳動物の血清が使用できる。該血清の培地中の濃度は通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。

本工程で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、又はこれらの均等物が挙げられる。これらの培地中の濃度は、前記した血清の培地中の濃度と同様である。
ノックアウトシーラムリプレースメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入可能である。その他の血清代替物については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の試薬あるいは添加物であれば組成は製造元によらず同等である。

本工程で用いられる培地はまた、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）又は抗菌剤（例えばアンホテリシンＢ）等を含有してもよい。これらの培地中の濃度は、前記した血清の培地中の濃度と同様である。
本工程は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度（通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度）で、６〜６０時間（好ましくは１２〜３６時間）、１〜１０％（好ましくは５％）の二酸化炭素を通気したＣＯ_２インキュベーター内にて培養することによって実施される。

工程（２）：前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
本工程は、上記工程（１）に続いて実施する工程であり、幹細胞からの内胚葉細胞への分化誘導を完了させる工程に相当する。

即ち、前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程である。
具体的には、幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した（工程（１））後、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含有する培地に培地交換することによって実施される。

本工程で用いる培地は、前記工程（１）で例示した基礎培地（所望により前記工程（１）で例示した各種添加物、血清又は血清代替物を含有していてもよい）にアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を添加することにより作製される。また、所望により培地中に前記工程（１）で例示したＧＳＫ３阻害剤が含有されていてもよい。
本工程で用いられる培地は、前記工程（１）で用いた基礎培地と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、同種の基礎培地を用いて作製されたものであることが好ましい。
本工程で用いられるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の例としては、前記工程（１）で例示したアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤が挙げられる。
本工程においてアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としてアクチビンを用いる場合には、該アクチビンはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれでもよく、なかでもアクチビンＡが好適である。また該アクチビンはヒト、マウス等いずれの動物種由来のアクチビンでもよい。本工程に使用するアクチビンとしては、出発原料とする幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いるのが好ましく、例えばヒト由来の幹細胞を出発原料とする場合、ヒトアクチビンを用いるのが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
本工程における培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の濃度は、用いるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤の種類によって適宜設定されるが、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としてヒトアクチビンＡを使用する場合の濃度は、通常０．１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌである。

本工程は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度（通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度）で、６〜１４４時間（好ましくは１２〜７２時間）、１〜１０％（好ましくは５％）の二酸化炭素を通気したＣＯ_２インキュベーター内にて培養することによって実施される。
本工程において、幹細胞が内胚葉細胞に分化したことの確認は、内胚葉細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子を内胚葉マーカーと称することがある）の発現変動を評価することによって行うことができる。上記内胚葉マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法等によって行なうことができる。上記内胚葉マーカーの例としては、ＳＯＸ１７（性決定領域Ｙ、Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、ＣＸＣＲ４（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）、ＦＯＸＡ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２）が挙げられる。

工程（３）：前記工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程
本工程は、上記工程（１）及び（２）を経て得られた内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導する工程に相当する。

本工程で用いるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストは、天然に存在するレチノイドであっても、化学的に合成されたレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物やレチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物であってもよい。ＲＡＲアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例としては、レチノイン酸（立体異性体の全トランス−レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９−シス−レチノイン酸（９−シスＲＡ）が知られている）が挙げられる。化学的に合成されたレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第５，２３４，９２６号、米国特許第４，３２６，０５５号等）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物の例としては、Ａｍ８０、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＡＣ５５６４９が挙げられる。レチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールが挙げられる（生物機能開発研究所紀要 ９：５５−６１、２００９年）。本工程で用いるＲＡＲアゴニストは、好ましくはレチノイン酸、ＡＭ５８０（４−［［５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル］カルボキシアミド］ベンゾイック アシッド）、ＴＴＮＰＢ（４−［［Ｅ］−２−［５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル］−１−プロペニル］ベンゾイックアシッド）、ＡＣ５５６４９（４’−オクチル−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキシリックアシッド）であり、さらに好ましくはレチノイン酸である。ＲＡＲアゴニストの培地中の濃度は、用いるＲＡＲアゴニストの種類によって適宜設定されるが、ＲＡＲアゴニストとしてレチノイン酸を用いる場合の濃度は、通常０．１〜１００μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭである。ＲＡＲアゴニストとしてＴＴＮＰＢを用いる場合の濃度は、通常０．０２〜２０μＭ、好ましくは０．０５〜１０μＭである。ＲＡＲアゴニストとしてＡＭ５８０を用いる場合の濃度は、通常０．０２〜２０μＭ、好ましくは０．０５〜１０μＭである。ＲＡＲアゴニストとしてＡＣ５５６４９を用いる場合の濃度は、通常０．０２〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭである。

本工程で用いるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害活性を有する物質（例えば、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害活性を有する化合物、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６に対するｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ）であれば特に限定されない。合成可能な（低分子）化合物に加え、サイトカイン等の各種生理活性物質も当該作用を有する限り好適に用いることができる。ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害活性を有する物質の好ましい例としてはＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害活性を有する化合物が挙げられる。該化合物は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）阻害活性を有する化合物、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−２，３，６阻害活性を有する化合物、及びＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害活性とアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６阻害活性とを併せ持つ化合物からなる群より選択される。
ここで、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−２，３，６の阻害剤あるいはＡＬＫ−２，３，６の阻害活性を有する物質とは、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３、及びＡＬＫ−６からなる群より選択される少なくとも一種のＡＬＫに対して阻害活性を有する化合物あるいは物質を意味する。

ＡＭＰＫ阻害活性を有する化合物としては、ドーソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ａｒａＡ（アデニン−９−β−ｄ−アラビノフラノシド）、Ｃ７５等が挙げられる。アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）としては、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の１型受容体であるＡＬＫ−２，３，６や、後述するＴＧＦ−β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌの１型受容体であるＡＬＫ−４，５，７などが知られている。ＡＬＫ−２，３，６阻害活性を有する化合物としては、ドーソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９等が挙げられる。ドーソモルフィンは、ＡＭＰＫ阻害活性及びＡＬＫ−２，３，６阻害活性の両方の活性を有する。本工程で用いるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤としては、ドーソモルフィンが好ましい。

本工程で用いるＢＭＰのアンタゴニストは、ＢＭＰが有する機能（すなわちアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６を介したシグナルの活性化）を阻害する物質（例えば、ＢＭＰと結合してＢＭＰが有する機能を阻害するタンパク質（Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０（２００１）２４４−２５６）や、該タンパク質に対するｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ）であれば特に限定されない。本工程で用いるＢＭＰのアンタゴニストの例としては、Ｎｏｇｇｉｎが挙げられる。

これらの化合物はＳＩＧＭＡ社、Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名であれば同一の化合物を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合には、既知文献に従って調製することもできる。

また、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ、ＡＬＫ−２，３，６のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はＡＬＫ−２，３，６の阻害剤として使用することができる。また、本工程中において培養中の細胞から培地中にＢＭＰファミリーに属する分化因子の増加、あるいは当該分化因子の分泌が確認された場合には、当該分化因子の活性を中和する抗体、あるいはＢＭＰに結合してその作用を阻害することが知られているＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ等もＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はＡＬＫ−２，３，６の阻害剤として使用することができる。

また、本工程中において培養中の細胞から培地中に上記工程（１）で例示したアクチビンのファミリーに属する分化因子の増加、あるいは当該分化因子の分泌が確認された場合には、当該分化因子の活性を中和する抗体、あるいはアクチビンに結合してその作用を阻害することが知られているホリスタチンもＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はＡＬＫ−２，３，６の阻害剤として使用することができる。

本工程においてＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤を用いる場合の、培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ドーソモルフィンの場合、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは０．２〜５μＭである。
本工程においてＢＭＰのアンタゴニストを用いる場合の、培地中の濃度は、用いるＢＭＰのアンタゴニストの種類によって適宜設定されるが、Ｎｏｇｇｉｎの場合、通常１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌである。

アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−４，５，７の阻害剤は、ＡＬＫ−４、ＡＬＫ−５およびＡＬＫ−７からなる群より選択される少なくとも一種のＡＬＫに対し阻害活性を有する化合物から選択される。
本工程で用いるＡＬＫ−４，５，７の阻害剤としては、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、Ａ−８３−０１、ＧＷ６６０４、ＬＹ５８０２７６、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ及びＳＤ−２０８等が挙げられる。

これらはＳＩＧＭＡ社、Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、和光純薬工業社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名であれば同一の化合物を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合には、既知文献に従って調製することもできる。

また、ＡＬＫ−４，５，７のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＡＬＫ−４，５，７の阻害剤として使用することができる。

本工程で用いるＡＬＫ−４，５，７の阻害剤としては、ＳＢ−４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物）、Ａ−８３−０１（３−［６−メチル−２−ピリジニル］−Ｎ−フェニル−４−［４−キノリニル］−１Ｈ−ピラゾル−１−カルボチオアミド）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２−［３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］−１，５−ナフチリジン）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［６−メチル−ピリジン−２−イル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］−キノキサリン）が好ましく、さらにＳＢ−４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物）が好ましい。アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤としてＳＢ−４３１５４２を用いる場合の濃度は、通常、０．１〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭである。アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤としてＡＬＫ５阻害剤ＩＩを用いる場合の濃度は、通常０．０５〜５０μＭ、好ましくは０．２〜１０μＭである。アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤としてＡ−８３−０１を用いる場合の濃度は、通常０．０５〜５０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭである。アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤としてＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩを用いる場合の濃度は、通常０．０５〜５０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭである。

工程（３）は、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤の３種類全ての成分を含む培地中で実施することが好ましく、レチノイン酸受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、及びアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤の３種類全ての成分を含む培地中で実施することが好ましく、レチノイン酸、ドーソモルフィン、及び４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物を含む培地中で実施することがさらに好ましく、レチノイン酸、ドーソモルフィン、及び４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物を含む培地中で実施することが特に好ましい。

本工程において、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤のうち２種以上を組み合わせて用いる場合、それらは培地中に同時に添加されてもよく、また、膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。用いる各因子の種類によっても適宜設定され得るが、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤は、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。

本工程で用いる培地は、前記工程（１）で例示した基礎培地（所望により前記工程（１）で例示した各種添加物、血清又は血清代替物を含有していてもよい）に、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択されるいずれか１種以上を添加することにより作製される。本工程で用いる培地は、上記工程（１）や工程（２）と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよい。膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が本工程での基礎培地として好適に用いられるが、当該培地は公知文献（Ｒｉｃｈｔｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ（１９７２）４９，１７０５）に従って調製することもできる。さらに、血清代替物としてのＢ−２７サプリメント（Ｂｒｅｗｅｒ Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９３）３５，５６７）もまた好適に培地中に添加され得る。
培地中、Ｂ−２７サプリメントの濃度は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。

本工程は、使用する幹細胞又は内胚葉細胞の培養に適した培養温度（通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度）で、７２〜２８８時間（好ましくは１２０〜２１６時間）、１〜１０％（好ましくは５％）の二酸化炭素を通気したＣＯ_２インキュベーター内にて培養することによって実施される。

本工程において、内胚葉細胞が膵ホルモン産生前駆細胞に分化誘導されたことの確認は、膵ホルモン産生前駆細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子を膵ホルモン産生前駆細胞マーカーと称することがある）の発現変動を評価することによって行うことができる。上記膵ホルモン産生前駆細胞マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法等によって評価することができる。上記膵ホルモン産生前駆細胞マーカーとしては、ＮＧＮ３、ＨＮＦ６（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ６、別名：Ｏｎｅ ｃｕｔ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、ＰＤＸ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）等が挙げられる。
本工程（３）を用いれば、上記工程（１）及び（２）を経て得られた内胚葉細胞以外の内胚葉細胞または幹細胞を出発材料として膵ホルモン産生前駆細胞を効率良く製造することもできる。従って、本発明では、本工程（３）によって、内胚葉細胞または幹細胞を出発材料とした膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法、すなわち、内胚葉細胞または幹細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地、より好ましくは以下の（ａ）〜（ｃ）を全て含む培地で培養することを特徴とする、膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法も提供する：
（ａ）上記したレチノイン酸受容体アゴニスト
（ｂ）上記したＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１種
（ｃ）上記したアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤。
なお、上記工程（１）及び（２）を経て得られた内胚葉細胞以外の内胚葉細胞または幹細胞を出発材料とした膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法においても、上記（ａ）〜（ｃ）それぞれについての培地中の濃度、培養に用いる基礎培地、および細胞の培養条件（温度、時間など）は、上記工程（１）及び（２）を経て得られた内胚葉細胞または幹細胞を出発材料とした膵ホルモン産生前駆細胞を製造する方法における工程（３）と同様に行うことができる。

工程（４）：前記工程（３）で得られた細胞を培養する工程
本工程は、膵ホルモン産生前駆細胞から膵ホルモン産生細胞への分化を誘導する工程に相当する。

本工程で用いる基礎培地としては、前記工程（１）で例示した基礎培地が挙げられる。本工程で用いる培地は、上記工程（１）〜（３）と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよい。膵ホルモン産生細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が本工程での基礎培地として好適に用いられ、該培地は公知文献（Ｒｉｃｈｔｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ（１９７２）４９，１７０５）に従って調製することも可能である。特に、Ｂ−２７サプリメントが添加されたＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が好適に用いられる。培地中、Ｂ−２７サプリメントの濃度は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。また、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地へは、細胞の生存率を向上させる添加剤を添加してもよい。そのような添加物として、例えば、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）や、ノックアウトシーラムリプレースメント、Ｎ２サプリメント等の血清代替物等が挙げられる。培地中の前記添加剤の濃度は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。

本工程の、より好ましい別の実施態様においては、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７（ＡＬＫ−４，５，７）の阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種が添加された培地を用いる。所望によりさらにニコチンアミドが添加された培地を用いることもできる。
本工程で用いる（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰ類縁体の例としては、アデニル酸シクラーゼ活性を有する化合物、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性を有する化合物、及びアデニル酸シクラーゼ活性とｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性とを併せ持つ化合物等が挙げられる。より具体的には、フォルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ、ＰＡＣＡＰ２７（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ２７）、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）等が挙げられる。なかでもフォルスコリンが好適に用いられる。本工程で用いる（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも１種の培地中の濃度は、用いるアデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰ類縁体の種類によって適宜設定されるが、フォルスコリンを使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭであり、ＩＢＭＸを使用する場合の濃度は、通常５〜１０００μＭ、好ましくは５０〜５００μＭであり、ジブチルｃＡＭＰを使用する場合の濃度は、通常１０〜４０００μＭ、好ましくは１００〜１０００μＭである。
本工程で用いる（ｉｉ）ステロイドとしては、細胞の分化誘導に寄与し得るものであれば特に限定されない。本工程で用いる（ｉｉ）ステロイドの例としては、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾンが挙げられる。なかでもデキサメタゾンが好適に用いられる。当該ステロイドの培地中の濃度は、用いるステロイドの種類によって適宜設定されるが、ステロイドとしてデキサメタゾンを使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭである。ステロイドとしてヒドロコルチゾンを使用する場合の濃度は、通常０．１〜１００μＭ、好ましくは１〜５０μＭである。ステロイドとしてベタメタゾンを使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは０．５〜２０μＭである。ステロイドとしてベクロメタゾンを使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは０．２〜２０μＭである。
本工程で用いる（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−４，５，７の阻害剤は、ＡＬＫ−４、ＡＬＫ−５およびＡＬＫ−７からなる群より選択される少なくとも一種のＡＬＫに対し阻害活性を有する化合物から選択される。本工程で用いる（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−４，５，７の阻害剤の例としては、ＡＬＫ−４，５，７の活性を阻害する化合物が挙げられ、具体的には、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ）、ＡＬＫ５阻害剤Ｉ、ＡＬＫ５阻害剤ＶＩＩ、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、Ａ−８３−０１、ＧＷ６６０４、ＬＹ５８０２７６、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ及びＳＤ−２０８等が挙げられる。なかでもＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＳＢ−４３１５４２、Ａ−８３−０１、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［６−メチル−ピリジン−２−イル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］−キノキサリン）が好ましく、とりわけＡＬＫ５阻害剤ＩＩが好適に用いられる。ＡＬＫ−４，５，７阻害剤の培地中の濃度は、用いるＡＬＫ−４，５，７阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＡＬＫ−４，５，７阻害剤としてＡＬＫ５阻害剤ＩＩを使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭである。ＡＬＫ−４，５，７阻害剤としてＡ−８３−０１を使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭである。ＡＬＫ−４，５，７阻害剤としてＳＢ−４３１５４２を使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭである。ＡＬＫ−４，５，７阻害剤としてＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩを使用する場合の濃度は、通常０．１〜５０μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭである。
本工程では、所望によりニコチンアミド（ナイアシンまたはニコチン酸アミドとも呼ばれる）をその培地中に添加することができる。ニコチンアミドは、そのポリＡＤＰリボース合成阻害剤としての機能により、膵β細胞の細胞死を抑制することが報告されている。当該ニコチンアミドの培地中の濃度は、通常０．１〜２０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭである。
前述した（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７（ＡＬＫ−４，５，７）の阻害剤は、ＳＩＧＭＡ社、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名であれば同一の化合物を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合には、既知文献に従って調製することもできる。

本工程で用いる培地は、基礎培地に、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）ＡＬＫ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上の成分を添加することにより作製される。培地には、上記した１種以上の成分に加え、所望によりニコチンアミドが添加されていてもよい。上記した１種以上の成分とニコチンアミドを組み合わせて用いる場合、それらは培地中に同時に添加されてもよく、また、膵ホルモン産生細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。上記した１種以上の成分及び／又はニコチンアミドの培地への添加は、同時に行なわれることが簡便であり、また好ましい。

本工程は、使用する膵ホルモン産生前駆細胞の培養に適した培養温度（通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度）で、２４〜２４０時間（好ましくは７２〜１９２時間）、１〜１０％（好ましくは５％）の二酸化炭素を通気したＣＯ_２インキュベーター内にて培養することによって実施される。
本工程において膵ホルモン産生前駆細胞が膵ホルモン産生細胞に分化誘導されたことの確認は、膵ホルモン産生細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子を膵ホルモン産生細胞マーカーと称することがある）の発現変動の評価、あるいは培地中に分泌される膵ホルモンの量を測定することによって行うことができる。上記膵ホルモン産生細胞マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法等によって評価することができる。上記培地中に分泌される膵ホルモンの量の測定は、ウエスタンブロッティング解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法又はそれに準じる方法等により行なうことができる。上記膵ホルモン産生細胞マーカーの例としては、インスリン、グルカゴン、パンクレアティックポリペプチド、ソマトスタチン、ＰＣＳＫ１（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ １）、ＳＵＲ１（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、別名：ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ Ｃ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ），ｍｅｍｂｅｒ ８）、ＮＫＸ６．１（ＮＫ６ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、ＰＡＸ６（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６）、ＮＥＵＲＯＤ（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）、ＡＲＸ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）等が挙げられる。

上記した通り、本発明は、幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法を提供するが、同様の方法、すなわち、より未分化な状態にある細胞をより分化した状態へと分化誘導する方法によって、幹細胞から、多様な分化状態にある細胞（内胚葉細胞、膵管細胞、膵内分泌細胞、膵外分泌細胞やそれらに共通する前駆細胞等）へと分化誘導することができる。誘導された分化の程度は各細胞に特異的に発現しているタンパク質や遺伝子の発現の有無を確認することによって知ることができる。

本発明の製造方法では、幹細胞を膵ホルモン産生細胞へ効率的に分化誘導することにより、高い膵ホルモン分泌能を有する膵ホルモン産生細胞を大量に供給できる。この膵ホルモン産生細胞は、医薬（特に細胞医療の為の医薬）や、糖尿病治療薬を開発するためのツールとして利用することができる。

２．細胞を含む医薬
本発明は、上記した本発明の製造方法により製造された膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある）を提供する。
ここで膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞は、上記した本発明の膵ホルモン産生細胞の製造方法又は膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法により得られた細胞であれば特に限定されない。
該医薬において、膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞はそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、膵ホルモン産生細胞としての機能又は膵ホルモン産生前駆細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。また、膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞が必要量以上に増殖することを防止するために、上記処理と組み合わせて、マイトマイシンＣ前処理等による増殖の抑制や、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を当該細胞に導入して、その後、必要に応じて未活性型の薬を投与し、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を導入した細胞の中だけでその薬を毒物に変化させて細胞を死滅させる方法（自殺遺伝子療法）等の処理に付してもよい。

本発明の医薬は、安全で低毒性であり、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル）に投与することができる。
本発明の医薬のヒトへの投与形態（移植方法）としては、例えば、ヒト患者の右下腹部に小切開を置き、腸間膜の細い血管を露出して直視下にカテーテルを挿入して細胞を移植する方法；エコーにて肝臓の門脈を同定して、カテーテルを穿刺して細胞を移植する方法；又は腹部エコーガイド下に脾臓を直接穿刺することにより脾臓に移植する方法（Ｎａｇａｔａ Ｈ，Ｉｔｏ Ｍ，Ｓｈｉｒｏｔａ Ｃ，Ｅｄｇｅ Ａ，ＭｃＣｏｗａｎ ＴＣ，Ｆｏｘ ＩＪ：Ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７６（４）：７３２−４，２００３．参照）が挙げられる。なかでも、エコーを用いて細胞移植を行う方法の方が、侵襲が少ないため好ましく、このような方法の具体例として、腹部エコーガイド下に直接穿刺することにより脾臓や肝臓に移植する方法が挙げられる。本発明の医薬の投与量（移植量）は、例えば、１×１０^８〜１×１０^１０細胞／個体、好ましくは、５×１０^８〜１×１０^１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０^９〜１×１０^１０細胞／個体である。本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作成された膵ホルモン産生細胞を用いることが好ましいが、年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。そのような場合には、腹腔内や皮下への移植も可能である。また、本発明の医薬の投与量（移植量）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。

本発明の医薬のうち、膵ホルモン産生細胞を含む医薬は、それ自体の投与（移植）により、患者の体内で膵ホルモンの産生（分泌）が可能となり、膵ホルモンの産生（分泌）の低下に起因する疾患の治療に有用である。例えばインスリン産生細胞を含む医薬は、糖尿病の治療に有用である。一方、本発明の医薬のうち、膵ホルモン産生前駆細胞を含む医薬は、患者に投与（移植）された後、適当な条件下で膵ホルモン産生細胞に分化誘導されることによって、膵ホルモンが産生（分泌）される。ここで適当な条件としては、例えば、ヒト患者の右下腹部に小切開を置き、腸間膜の細い血管を露出して直視下にカテーテルを挿入して細胞を移植する方法、エコーにて肝臓の門脈を同定して、カテーテルを穿刺して細胞を移植する方法、又は腹部エコーガイド下に脾臓を直接穿刺することにより脾臓に移植する方法（Ｎａｇａｔａ Ｈ，Ｉｔｏ Ｍ，Ｓｈｉｒｏｔａ Ｃ，Ｅｄｇｅ Ａ，ＭｃＣｏｗａｎ ＴＣ，Ｆｏｘ ＩＪ：Ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７６（４）：７３２−４，２００３．参照）が挙げられる。なかでも、エコーを用いて細胞を移植する方法は侵襲が少ないため好ましく、このような方法の具体例として、腹部エコーガイド下に直接穿刺することにより脾臓や肝臓に移植する方法が挙げられる。本発明の医薬の投与量（移植量）は、例えば、１×１０^８〜１×１０^１０細胞／個体、好ましくは、５×１０^８〜１×１０^１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０^９〜１×１０^１０細胞／個体である。膵ホルモン産生前駆細胞から膵ホルモン産生細胞への分化は患者自身の体内環境を利用することもできるが、分化の効率と特異性を高めるために、本発明に使用した分化誘導因子等を体外から投与することも可能である。本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作成された膵ホルモン産生細胞を用いることが好ましいが、年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。そのような場合には、腹腔内や皮下への移植も可能である。また、本発明の医薬の投与量（移植量）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。

３．スクリーニング方法
本発明は、以下の工程（１）〜（４）からなる群より選択される何れか１種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、医薬（好ましくは糖尿病治療薬）のスクリーニング方法（本明細書中、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある）を提供する：
（１）幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
（２）前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種，及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地で培養する工程
（４）前記工程（３）で得られた細胞を培養する工程。

本発明の別の実施態様においては、工程（４）は、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）ＡＬＫ−４，５，７阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む（所望によりさらにニコチンアミドを含む）培地中で実施される。
各種因子の種類、および培地中の濃度等については、前述した細胞の製造方法（１．）と同じである。

上記工程（１）〜（４）は、上記した本発明の膵ホルモン産生細胞の製造方法における工程（１）〜（４）と同様にして実施され得る。
本スクリーニングに用いられる細胞としては、上記工程（１）〜（４）を経て得られる膵ホルモン産生細胞、上記工程（１）〜（３）を経て得られる膵ホルモン産生前駆細胞、上記工程（１）〜（２）を経て得られる内胚葉細胞、上記工程（１）を経て得られる細胞が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法は具体的には以下のようにして実施される（態様１）。
（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞内の膵ホルモン発現量又は該細胞外への膵ホルモン分泌量をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
膵ホルモンの発現量としては、膵ホルモンタンパク質の発現量、膵ホルモンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ｍＲＮＡなど）の発現量などが挙げられる。膵ホルモンタンパク質の発現量及び分泌量は、公知の方法、例えば、膵ホルモンタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中や培地中などに存在する前記膵ホルモンタンパク質を、ウエスタンブロッティング解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法又はそれに準じる方法等により測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、Ｓ１マッピング法、ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップあるいはアレイ法又はそれに準じる方法に従って行われる。
細胞の培養は、膵ホルモンが発現および／または分泌される条件下であれば特に限定されず公知の方法に従って行えばよい。培地としては、例えば、約１〜２０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）等〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕が用いられる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５時間〜５日間、必要に応じて通気や撹拌を行なって実施される。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿が挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩）などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、又は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられる。
例えば、上記（ａ）の場合における膵ホルモンの発現量又は分泌量を、上記（ｂ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上抑制（阻害）する試験化合物を、膵ホルモン産生細胞における膵ホルモン発現を抑制（阻害）する化合物として選択することができる。
上記（ａ）の場合における膵ホルモンの発現量又は分泌量を、上記（ｂ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、膵ホルモン産生細胞におけるに膵ホルモン発現を促進する化合物として選択することができる。
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、インスリン発現を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生細胞がグルカゴン産生細胞である場合、グルカゴン発現を抑制（阻害）する化合物は糖尿病治療薬として有用である。

本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞の増殖能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる（態様２）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。細胞の増殖能を測定する方法としては、通常、当分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や^３Ｈ、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）等の取り込み、ＡＴＰ量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法等が挙げられる。
例えば、膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、有意にインスリン産生細胞の増殖を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生細胞がグルカゴン産生細胞である場合、有意にグルカゴン産生細胞の増殖を抑制（阻害）する化合物は糖尿病治療薬として有用である。

本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生前駆細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生前駆細胞を培養した場合における、該細胞の分化の程度をそれぞれ調べ、比較する方法が挙げられる（態様３）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。膵ホルモン産生前駆細胞の分化の程度は、例えば膵ホルモン産生前駆細胞及び／又は膵ホルモン産生細胞の特異マーカーの発現の有無によって調べられる。膵ホルモン産生前駆細胞の特異マーカーとしては、ＮＧＮ３（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ３）、ＰＡＸ４（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ４）が、膵ホルモン産生細胞の特異マーカーとしてはインスリン、グルカゴン、パンクレアティックポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、ＰＣＳＫ１（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ １）、ＳＵＲ１（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、別名 ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ Ｃ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ），ｍｅｍｂｅｒ ８）、グルコキナーゼ、ＭＡＦＡ（ｖ−ｍａｆ ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ Ａ）、ＩＡＰＰ（ｉｓｌｅｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）等がそれぞれ例示される。また、膵ホルモン産生前駆細胞の分化の程度は、ホルモン分泌を促進する物質を添加したときのホルモン分泌量によっても調べることが可能である。例えば、膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、高濃度のグルコースを添加したときのインスリン分泌量を、ウェスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法により調べることでインスリン産生細胞の分化の程度を評価することができる。
例えば、膵ホルモン産生前駆細胞がインスリン産生前駆細胞である場合、有意にインスリン産生前駆細胞の分化を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生前駆細胞がグルカゴン産生前駆細胞である場合、有意にグルカゴン産生前駆細胞の分化を抑制（阻害）する化合物は糖尿病治療薬として有用である。

本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で内胚葉細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で内胚葉細胞を培養した場合における、該細胞の増殖あるいは分化能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる（態様４）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。内胚葉細胞の増殖能を測定する方法としては、通常、当分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や^３Ｈ、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）等の取り込み、ＡＴＰ量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。内胚葉細胞の分化能は、例えば内胚葉系細胞の特異マーカーの発現の有無によって調べられる。内胚葉系細胞の特異マーカーとしては、アルファフェトプロテイン、アルブミン、ペプシン、肺サーファクタントプロテインなどが挙げられる。一般に内胚葉系細胞の分化誘導や培養は中胚葉あるいは外胚葉系細胞に比べて技術的に困難であり、当該スクリーニング系によって得られた化合物を利用して作製した細胞自体及び／又は内胚葉の分化誘導系は、新たな医薬のスクリーニング系に利用し得る。
例えば、内胚葉系細胞が肺胞細胞である場合、肺胞細胞の分化や増殖を促進する化合物は肺気腫などの治療薬として有用である。

膵ホルモン産生細胞の機能を保護する（維持する）医薬等も本発明のスクリーニング方法に準じた方法で得ることができる。本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、（ａ）試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、（ｂ）試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞の生存数あるいは機能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる（態様５）。使用する試験化合物としては、上記態様１で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様１と同様にして行うことができる。細胞の生存数を測定する方法としては、通常、当分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や^３Ｈ、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）等の取り込み、ＡＴＰ量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法等が挙げられる。また、アポトーシスが誘発された細胞の数は、形態的な特徴（クロマチンの凝縮、核の断片化、細胞の収縮など）を呈する細胞の計数の他に、ＴＵＮＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）法による断片化ＤＮＡの検出や活性カスパーゼの有無の検出、７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）など生細胞不透過性色素による核染色、ホスファチジルセリンの細胞表面への露出やミトコンドリアメンブレンの脱分極化、特定の細胞内タンパク質の切断や分解などの測定によって定量化し得る。また、細胞の機能を測定する方法としては、グルコース濃度に応じたインスリンあるいはＣペプチドの分泌量や細胞膜電位の変動を測定する方法などが挙げられる。本態様では、膵ホルモン産生細胞に対して障害を与えることが知られている因子、例えば炎症性サイトカインや活性酸素およびその産生誘導物質、高濃度の脂肪酸やグルコースなどを細胞の培養時に添加し、該細胞の生存数あるいは機能を測定し、比較する。
膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、膵ホルモン産生細胞に対して障害を与えることが知られている因子に対して有意にインスリン産生細胞の生存あるいは機能維持を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。

また、本発明のスクリーニング方法の原理を用いて、分化誘導過程における未分化な状態の細胞あるいは前駆細胞を得ることができる。
分化誘導過程における未分化な状態あるいは前駆細胞等において、癌胎児抗原のようないわゆる「分化関連抗原」と呼ばれる腫瘍抗原に類する抗原が発現することが知られている。新規な抗原の発現をプロテオームやグライコームなどの手法とバイオインフォーマティックスの手法を組み合わせて検索し、その発現自体の抑制や抗原を発現するがん細胞の増殖抑制、細胞死等を指標にした抗がん剤のスクリーニングも実施できる。あるいは、これらの細胞を免疫原としてそのままあるいはホルマリン等による変性処理、あるいは細胞膜成分を分画、精製してマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ニワトリ等の動物に投与し、腫瘍細胞と交差反応する抗体を取得し、その抗体との反応性（抗原量の増減）を指標にした抗がん剤のスクリーニングも実施できる。また、得られた抗体自体を医薬あるいは診断薬として使用することもできるし、精製した抗原あるいはその一部を抗腫瘍ワクチンとして使用することもできる。
従って、本発明は、新規な「分化関連抗原」の検出や該抗原に対する抗体、該抗体を含む医薬、あるいは診断薬等のスクリーニングの実施を可能とするツールを提供することができる。

さらに、本発明のスクリーニング方法の原理を用いて、ある特定のホルモン産生細胞から別のホルモン産生細胞への分化転換を促す化合物のスクリーニングを実施することができる。例えば、グルカゴン産生細胞への分化を誘導した後、グルカゴン産生細胞からインスリン産生細胞に分化転換を促す化合物のスクリーニングを実施することができる。
特定の膵ホルモン産生細胞への分化転換の程度は、膵ホルモン産生細胞の特異マーカーの発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲ法等により測定することにより、あるいは膵ホルモン産生細胞から分泌される膵ホルモン量をウェスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法等により測定することにより調べることができる。

上記スクリーニング方法を用いて得られる医薬は、生理学的に許容し得る添加剤（例、担体、香味剤、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤）を用いて、公知の方法に従って製剤化することができる。
このようにして得られる製剤の剤形としては、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などの経口剤；注射剤などの非経口剤が挙げられる。これら製剤における有効成分（本発明のスクリーニング方法により選択された化合物）の含量は例えば、０．１〜９０重量％である。
前記添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムなどの結合剤；結晶性セルロースなどの賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの膨化剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、アカモノ油、チェリーなどの香味剤；油脂、注射用水、植物油（例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）などの液状担体；溶解補助剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）；非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）；溶解補助剤（例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）；無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）；安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）；保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール）；酸化防止剤が挙げられる。
前記注射用水としては、例えば、生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどを含む等張液があげられる。
本発明のスクリーニング方法によって得られる医薬（好ましくは糖尿病治療薬）は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
該医薬の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより適宜設定される。

以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。

実施例１：アクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を用いたヒトｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導〔工程（１）〜工程（２）〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞：Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８；２６：１０１−１０６参照）を膵臓細胞（特に膵ホルモン産生細胞）に分化誘導させるための最初の段階として、９６穴プレートを用いてヒトｉＰＳ細胞を内胚葉細胞へと分化誘導させた。
ヒトｉＰＳ細胞は２５３Ｇ１株（レトロウィルスによりＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作成されたｉＰＳ細胞株；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６，１０１−１０６）を使用した。未分化状態のｉＰＳ細胞の維持培養は、マイトマイシン処理をしたマウス線維芽細胞（ＭＥＦｓ）をゼラチンコートしたプレート上に播種したものをフィーダー細胞として使用し、培地として４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ）と０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２下で行った。培地交換は毎日行い、４〜５日ごとに霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液（リプロセル）を用いて細胞塊の状態で剥離させ、新しいフィーダー細胞上に播種して継代を行った。
内胚葉細胞への分化誘導の前培養として、未分化なｉＰＳ細胞を９６穴プレートに播種した。まず、細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ）で処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を９６穴プレートに１穴あたり２×１０^４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で１日間培養した。９６穴プレートは、ゼラチンコート後に５×１０^３個のＭＥＦｓを播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で５時間培養したものを用いた。また、播種時の培養液としては、１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地を使用した。播種１日後にＹ−２７６３２を添加していない霊長類ＥＳ細胞用培地に交換してさらに２日間培養し、コンフルエントな状態になるまで培養した。
ｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導は、次の方法で行った。まず、コンフルエントとなった細胞をＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）で洗浄した後、各種分化誘導因子と２％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地を添加して１日間培養した。分化誘導因子としては、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）の組み合わせを使用した。１日間培養した後にＲＰＭＩ培地で洗浄し、２％のＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地を用いてさらに２日間培養した。コントロールとしては、一部の細胞を３日間とも２％ＦＢＳのみを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。
比較例として、分化誘導因子として、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）のみ（比較例１）、又はアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ（比較例２）を用いた以外は、実施例１と同様にしてｉＰＳ細胞を処理した。

それぞれの条件下で培養した時の内胚葉分化マーカーの発現変動を調べるため、分化誘導した細胞を経時的に回収し、ＲＮｅａｓｙ９６（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡ画分を精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した後、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して、原始線条マーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７の遺伝子発現量を測定した。発現解析の結果を図１に示す。アクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を１日間添加することで（実施例１）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹの発現量が分化誘導１日後に一過的に上昇した。さらにその後、この細胞をアクチビンＡのみを含む培地で２日間培養することで、ＳＯＸ１７の発現量が顕著に増加した。一方で、内胚葉誘導の際に一般的によく用いられるＷｎｔ３ａをアクチビンＡとともに１日間処理した場合（比較例２）では、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹの発現量はＣＨＩＲ９９０２１で処理した場合と比較して低いレベルであった。また、その２日後のＳＯＸ１７の発現量も、ＣＨＩＲ９９０２１で処理した場合と比較すると低いものであった。
次に、培養３日後のＳＯＸ１７タンパク質の発現を調べるため、抗ＳＯＸ１７抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。図１と同様の手法で３日目まで培養した後、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。１次抗体として抗ヒトＳＯＸ１７抗体（ＡＦ１９２４、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。分化誘導因子としてアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合（実施例１）に、大部分の細胞がＳＯＸ１７タンパクを発現している様子が観察された。アクチビンＡ（比較例１）のみを添加した場合やアクチビンＡとＷｎｔ３ａを添加した場合（比較例２）においても一部の細胞はＳＯＸ１７タンパクを発現していたが、その割合はアクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合と比較すると低いものであった。
以上の検討により、アクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を添加した培地で１日間、さらにアクチビンＡのみを添加した培地で２日間培養することによって効率的に内胚葉細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例２〜８）レチノイン酸、ドーソモルフィン及びＳＢ４３１５４２を用いた内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導〔工程（３）〕
内胚葉細胞へ分化させた細胞から、さらに膵ホルモン産生前駆細胞へと分化誘導させた。
実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞へと分化誘導した細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）及びＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の組合せ（実施例２）で加えた培地に交換した。ドーソモルフィンはＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の阻害剤でありかつ、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）のうちＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６の阻害剤である。また、ＳＢ４３１５４２はＡＬＫのうちＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７の阻害剤である。培地を交換した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で６日間培養し、膵前駆細胞マーカーであるＰＤＸ１と膵ホルモン産生前駆細胞マーカーであるＮＧＮ３の発現量を実施例１と同様の手法を用いて測定した。
レチノイン酸単独（実施例３）、ＳＢ４３１５４２単独（実施例４）、レチノイン酸とＳＢ４３１５４２との組み合わせ（実施例５）、ドーソモルフィン単独（実施例６）、ドーソモルフィンとレチノイン酸との組合せ（実施例７）、ドーソモルフィンとＳＢ４３１５４２との組み合わせ（実施例８）を用いた以外は、実施例２と同様にして内胚葉細胞を処理した。
発現解析の結果を図３に示す。ドーソモルフィンとレチノイン酸とＳＢ４３１５４２を同時に添加して（実施例２）６日間培養することで、ＰＤＸ１とＮＧＮ３の発現量が顕著に増加していた。ドーソモルフィンとレチノイン酸との組合せ（実施例７）を添加した場合は、ＰＤＸ１の発現は大きく増加するもののＮＧＮ３の発現は顕著には増加しなかった。その他の条件についてはＰＤＸ１もＮＧＮ３の発現も顕著には変動しなかった。これらの結果より、ドーソモルフィンとレチノイン酸を添加することでＰＤＸ１を発現する膵前駆細胞への分化が誘導され、さらにドーソモルフィンとレチノイン酸にＳＢ４３１５４２を追加することで膵前駆細胞への分化に加え、ＮＧＮ３を発現する膵ホルモン産生前駆細胞への分化も誘導されることが明らかとなった。
次に、培養９日後のＰＤＸ１タンパク発現を調べるため、抗ＰＤＸ１抗体を用いた免疫染色を実施した。内胚葉細胞へと分化させた細胞に対してドーソモルフィンとレチノイン酸とＳＢ４３１５４２を添加して（実施例２）６日間培養した後、４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間の固定を行った。さらに、１次抗体として抗ヒトＰＤＸ１抗体（ＡＦ２４１９、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡下にて細胞を観察した。その結果を図４に示す。大部分の細胞がＰＤＸ１タンパクを発現している様子が観察された。この結果より、大部分の細胞において膵臓方向への分化が誘導されていることが確認された。

（実施例９〜１５）膵前駆細胞から膵ホルモン産生細胞への分化誘導〔工程（４）〕
膵ホルモン産生前駆細胞へと分化を誘導させた細胞に対して、さらに後期過程の分化を誘導する方法について検討した。
実施例１で示す方法に従って内胚葉に分化させた細胞に対して、実施例２〜８と同様に分化誘導因子（ドーソモルフィン、レチノイン酸、ＳＢ４３１５４２それぞれ単独あるいはそれらの組み合わせ）を添加し、培養３日目から培養９日目まで培養した後、細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄し、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を加えた培地に交換して、さらに６日間（分化誘導開始から１５日目まで）培養した。ドーソモルフィン、レチノイン酸及びＳＢ４３１５４２の組合せを添加した場合を実施例９、レチノイン酸のみを添加した場合を実施例１０、ＳＢ４３１５４２のみを添加した場合を実施例１１、レチノイン酸及びＳＢ４３１５４２の組合せを添加した場合を実施例１２、ドーソモルフィンのみを添加した場合を実施例１３、ドーソモルフィン及びレチノイン酸の組合せを添加した場合を実施例１４、ドーソモルフィン及びＳＢ４３１５４２の組合せを添加した場合を実施例１５とした。膵前駆細胞マーカーであるＰＤＸ１と膵β細胞（インスリン産生細胞）マーカーであるインスリンの発現量は実施例１に示す方法と同様にして測定した。発現解析の結果を図５に示す。培養９日目までドーソモルフィンとレチノイン酸とＳＢ４３１５４２を同時に添加してＮＧＮ３を高発現させた細胞（実施例９）でのみ、培養１５日目においてインスリンの発現が顕著に誘導された。また、この時、ＰＤＸ１の発現量についても他の条件と比較すると高いレベルであった。
次に、インスリンとＣペプチドのタンパク質の発現について調べるため、抗インスリン抗体と抗Ｃペプチド抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。内胚葉へと分化させた細胞に対してドーソモルフィンとレチノイン酸とＳＢ４３１５４２を添加して６日間培養した後、さらに１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に交換して６日間培養した（実施例９）。培養後、２％ＰＦＡを用いて４℃で１晩固定を行った。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）又は抗ヒトＣペプチド抗体（Ｃ−ＰＥＰ−０１、ＭＯＮＯＳＡＮ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）又はＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。免疫蛍光染色の結果を図６に示す。インスリンとＣペプチドを発現している細胞が数多く認められた。また、蛍光像を重ね合わせたところ、染色された細胞の殆どが黄色を呈し、同一の細胞が抗インスリン抗体と抗Ｃペプチド抗体で染色されることを確認した。インスリンは培地中にも大量に含まれているため、細胞が培地中のインスリンを取り込んで疑陽性となる可能性が考えられるが、培地中には添加されていないＣペプチドの抗体でも染色されることから、インスリンタンパクが細胞内において発現していることが確認された。

（試験例１）分化誘導過程における各分化マーカーの発現変動
実施例１〜１５の結果をもとにして、図７に示した４つの段階からなる膵臓分化誘導系を設定し、未分化ｉＰＳ細胞から膵臓方向への分化誘導過程における各種分化マーカーの発現変動を調べた。
段階１では、２％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）を添加して１日間培養した。段階２では、２％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地にアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加して２日間培養した。段階３では、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（２μＭ）の３種類を同時に添加して６日間培養した。段階４では、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてさらに６日間培養した。培養後、各種分化マーカーの経時的な発現変動を、実施例１と同様の方法を用いて測定した。発現解析の結果を図８に示す。
内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７発現は培養３日目で顕著に誘導され、その後は徐々に低下した。ＰＤＸ１発現は培養９日目に発現が上昇し、培養１５日目までその発現量が維持されていた。ＮＧＮ３発現は培養９日目に一過性に上昇した後、培養１１日目以降の発現量は急激に低下した。インスリン発現は培養１５日目から急激に増加した。これらの結果は発生過程で膵臓が形成されるまでの遺伝子発現パターンとよく合致しており、本分化誘導系を用いることで膵発生を模倣した形で膵細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例１６）膵ホルモン産生前駆細胞から膵臓細胞への分化誘導〔工程（４）；フォルスコリン及びニコチンアミドでの処理〕
工程（４）において、インスリン発現細胞への分化効率を上昇させる因子を探索した。その結果、工程（４）においてフォルスコリン及びニコチンアミドを同時に添加した場合にインスリン発現細胞への分化効率が上昇することが見出された。
実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）及びニコチンアミド（１０ｍＭ）を加えた培地、またはコントロールとして０．１％ＤＭＳＯを加えた培地に交換して、さらに１０日間もしくは１２日間培養した（実施例１６）。培地交換は３日〜４日ごとに行った。培養後、インスリンの発現量を、試験例１に示す方法と同様にして測定した。発現解析の結果を図９に示す。フォルスコリン及びニコチンアミドを添加した培地を用いて培養した細胞では、ＤＭＳＯを添加した細胞と比較し、誘導１４日目よりインスリンの発現が高値を示しており、その発現は培養２０日目まで維持されていた。
次に、インスリンタンパク質の発現について調べるため、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。上記と同様の方法で分化を誘導した誘導２２日目の細胞に対して、２％ＰＦＡを用いて４℃で１晩固定を行った。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）と、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。免疫染色の結果を図１０に示す。フォルスコリン及びニコチンアミドを添加して培養した場合（実施例１６）において、ＤＭＳＯを添加した場合と比較して、全体の細胞数に対するインスリン産生細胞の割合が高くなっている様子が観察された。
これらの結果より、フォルスコリン及びニコチンアミドを同時に添加することによって、高効率にインスリン産生細胞への分化を誘導できることが示された。

（実施例１７〜３１）膵ホルモン産生前駆細胞から膵臓細胞への分化誘導〔工程（４）；フォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩでの処理〕
フォルスコリン及びニコチンアミド以外で、工程（４）において、インスリン発現細胞への分化効率を上昇させる因子を探索した。その結果、デキサメタゾンまたはＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）を工程（４）において添加した場合にインスリン発現細胞への分化効率が上昇することが見出された。
実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）のうちの一種類以上の誘導因子を添加した培地、もしくはコントロールとして前記誘導因子を添加していない培地に交換して、さらに１０日間培養した。培地交換は５日ごとに行った。
ニコチンアミドのみを添加した場合を実施例１７、フォルスコリンのみを添加した場合を実施例１８、デキサメタゾンのみを添加した場合を実施例１９、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩのみを添加した場合を実施例２０、ニコチンアミド及びフォルスコリンを添加した場合を実施例２１、ニコチンアミド及びデキサメタゾンを添加した場合を実施例２２、ニコチンアミド及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例２３、フォルスコリン及びデキサメタゾンを添加した場合を実施例２４、フォルスコリン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例２５、デキサメタゾン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例２６、ニコチンアミド、フォルスコリン及びデキサメタゾンを添加した場合を実施例２７、ニコチンアミド、フォルスコリン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例２８、ニコチンアミド、デキサメタゾン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例２９、フォルスコリン、デキサメタゾン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例３０、ニコチンアミド、フォルスコリン、デキサメタゾン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合を実施例３１とした。各条件で培養後、分化誘導１２日目、分化誘導１６日目、分化誘導２０日目の細胞におけるインスリンの発現量を、実施例１に示す方法と同様にして測定した。発現解析の結果を図１１に示す。フォルスコリン（実施例１８）、デキサメタゾン（実施例１９）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（実施例２０）をそれぞれ単独で添加することで、インスリンの発現が顕著に増加した。さらに、フォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの中から２種類以上を組み合わせて添加した場合（実施例２１〜３１）にもインスリンの発現量は顕著に増加していた。
次に、フォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを組み合わせて添加した場合のインスリンのタンパク質レベルでの発現について調べるため、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。実施例１で示した方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、上記の実験においてインスリン発現を特に高値に誘導した培地として、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した培地（実施例３１）、フォルスコリン、ニコチンアミド及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（実施例２８）を添加した培地、ニコチンアミド、デキサメタゾン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した培地（実施例２９）、フォルスコリン及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した培地（実施例２５）、またはコントロールとして誘導因子を添加していない培地に交換して、さらに１０日間培養した。培地交換は５日ごとに行った。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。免疫蛍光染色の結果を図１２に示す。フォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを組み合わせて添加することで、インスリン産生細胞の割合が顕著に増加している様子が観察された。これらの結果は、各培養条件下においてｍＲＮＡレベルでのインスリン発現が顕著に増加するという前述の結果とよく合致するものであった。以上の結果より、膵前駆細胞に対してフォルスコリン、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを単独で、またはフォルスコリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを２種類以上組み合わせて添加することで、インスリン産生細胞への分化をさらに効率よく誘導できることが明らかとなった。

（実施例３２〜３４）ＧＳＫ３阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１以外の化合物を用いたヒトｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導〔工程（１）〕
工程（１）において、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＧＳＫ３阻害剤を用いた場合でも内胚葉細胞への分化誘導が可能であるか検討した。ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化誘導は、次の方法で行った。まず、実施例１と同様にしてコンフルエントな状態のヒトｉＰＳ細胞を調製した。その後、ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）で洗浄した後、各種ＧＳＫ３阻害剤、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、２％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地を用いて１日間培養した。ＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン，３μＭ）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，３−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン，２０μＭ）を用いた。また、コントロールとしてＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンＡのみを添加した培地で処理した。１日間の培養後、ＲＰＭＩ培地で洗浄した後、２％のＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地を用いてさらに２日間培養した。
ＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合を実施例３２、ＳＢ４１５２８６を用いた場合を実施例３３、ＳＢ２１６７６３を用いた場合を実施例３４とした。分化誘導３日目のＳＯＸ１７タンパク質の発現を調べるため、抗ＳＯＸ１７抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。各条件で培養後３日目の細胞に、４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間インキュベートし、細胞の固定を行った。１次抗体として抗ヒトＳＯＸ１７抗体（ＡＦ１９２４、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１３に示す。実施例１で示したとおり、アクチビンＡとＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合（実施例３２）では大部分の細胞がＳＯＸ１７タンパクを発現している様子が観察された。さらに、アクチビンＡとＳＢ４１５２８６（実施例３３）またはアクチビンＡとＳＢ２１６７６３（実施例３４）を添加した場合でも、ＳＯＸ１７タンパクを発現する細胞の割合が、アクチビンＡのみを添加した場合（比較例）と比較して増加している様子が観察された。以上の検討により、工程（１）において、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＧＳＫ３阻害剤をアクチビンＡと同時に添加した場合でも内胚葉への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例３５〜３８）レチノイン酸以外のレチノイン酸受容体アゴニストを用いた内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導〔工程（３）〕
工程（３）において、レチノイン酸以外のレチノイン酸受容体アゴニストを用いた場合でも膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導できるか検討した。実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞へと分化誘導した細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄後、ドーソモルフィン（１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）及び１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に各種レチノイン酸受容体アゴニストを加えた培地に交換した。レチノイン酸受容体アゴニストとして、レチノイン酸（２μＭ、実施例３５）、ＴＴＮＰＢ（０．２μＭ、実施例３６）、ＡＭ５８０（０．２μＭ、実施例３７）及びＡＣ５５６４９（０．５μＭ、実施例３８）を用いた。また、コントロールの細胞ではレチノイン酸受容体アゴニストを添加していない培地に交換した（コントロール）。培地を交換した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７日間培養した。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗ヒトＰＤＸ１抗体（ＡＦ２４１９、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡下にて細胞を観察した。免疫蛍光染色の結果を図１４に示す。いずれのレチノイン酸受容体アゴニストを添加した場合でもドーソモルフィンとＳＢ４３１５４２を同時に添加することで、大部分の細胞がＰＤＸ１陽性細胞へと分化した。これらの結果より、工程（３）においてレチノイン酸以外のレチノイン酸受容体アゴニストを用いた場合でも膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例３９〜４３）ドーソモルフィンの代わりにＮｏｇｇｉｎを用いた内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導〔工程（３）〕
ドーソモルフィンの活性の一つとしてＡＬＫ−２，３，６を阻害することでＢＭＰシグナルを遮断することが知られている。工程（３）において、同じくＢＭＰシグナルを遮断することが知られているＮｏｇｇｉｎをドーソモルフィンの代わりを用いた場合でも膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導できるか検討した。実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞へと分化誘導した細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にレチノイン酸（２μＭ）を加えた培地（実施例３９）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地（実施例４０）、ドーソモルフィン（１μＭ）を加えた培地（実施例４１）、Ｎｏｇｇｉｎとレチノイン酸を加えた培地（実施例４２）、ドーソモルフィンとレチノイン酸を加えた培地（実施例４３）に交換した。また、コントロールの細胞では前記誘導因子を添加していない培地に交換した（Ｃｔｒｌ）。培地を交換した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７日間培養した。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗ヒトＰＤＸ１抗体（ＡＦ２４１９、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡下にて細胞を観察した。免疫蛍光染色の結果を図１５に示す。Ｎｏｇｇｉｎとレチノイン酸を同時に添加した場合に、ドーソモルフィンとレチノイン酸を同時に添加した場合と同様、ＰＤＸ１陽性細胞への分化が顕著に誘導された。膵前駆細胞への分化誘導にはレチノイン酸を添加すると同時にＢＭＰシグナルを遮断することが重要であることが明らかとなった。

（実施例４４〜４７）ＳＢ４３１５４２以外のアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を用いた内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導〔工程（３）〕
工程３において、ＳＢ４３１５４２以外のアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を用いた場合でも膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導できるか検討した。実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞へと分化誘導した細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄後、ドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）及び１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に各種アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を加えた培地に交換した。アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤として、ＳＢ４３１５４２（５μＭ、実施例４４）の他にＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２μＭ、実施例４５）、Ａ−８３−０１（０．２μＭ、実施例４６）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（０．２μＭ、実施例４７）を用いた。また、コントロールとして、ドーソモルフィンとレチノイン酸のみを添加した培地に交換した（Ｃｔｒｌ）。培地を交換した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７日間培養した。培養後、膵ホルモン産生前駆細胞マーカーであるＮＧＮ３の発現量を実施例１と同様の手法で測定した。実験の結果を図１６に示す。いずれのアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を用いた場合でも、ドーソモルフィンとレチノイン酸を同時に添加することで顕著にＮＧＮ３の発現が増加した。これらの結果より、工程（３）においてＳＢ４３１５４２以外のアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を用いた場合でも膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例４８〜５４）膵ホルモン産生前駆細胞から膵臓細胞への分化誘導〔工程（４）；ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、ｃＡＭＰ類縁体、アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤での処理〕
インスリン産生細胞への分化を誘導したフォルスコリンは細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用が知られている。同じく細胞内ｃＡＭＰを増加させることが知られているｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤であるＩＢＭＸまたはｃＡＭＰ類縁体であるジブチルｃＡＭＰを添加した場合でもインスリン産生細胞への分化が誘導されるか検討した。また、インスリン産生細胞への分化を誘導したＡＬＫ５阻害剤ＩＩはアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤であることが知られている。他のアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を添加した場合でもインスリン産生細胞への分化が誘導されるかについても同様に検討した。
実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）を添加した培地（実施例４８）、ジブチルｃＡＭＰ（５００μＭ）を添加した培地（実施例４９）、ＩＢＭＸ（２００μＭ）を添加した培地（実施例５０）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）を添加した培地（実施例５１）、Ａ−８３−０１（０．５μＭ）を添加した培地（実施例５２）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を添加した培地（実施例５３）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（２μＭ）を添加した培地（実施例５４）、もしくはコントロールとして前記誘導因子を添加していない培地（Ｃｔｒｌ）に交換して、さらに１１日間培養した。培地交換は３〜４日ごとに行った。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。実験の結果を図１７に示す。ジブチルｃＡＭＰ、ＩＢＭＸ、Ａ−８３−０１、ＳＢ４３１５４２、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩを添加した場合に、フォルスコリンあるいはＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加した場合と同様にインスリン発現細胞の陽性率が顕著に増加する様子が観察された。これらの結果より、細胞内ｃＡＭＰシグナルを増強させること、またはアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７を阻害することで膵ホルモン産生前駆細胞からインスリン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例５５〜５８）膵ホルモン産生前駆細胞から膵臓細胞への分化誘導〔工程（４）；ステロイドでの処理〕
インスリン産生細胞への分化を誘導したデキサメタゾンはステロイドの１種であることが知られている。他のステロイドを添加した場合でもインスリン産生細胞への分化が誘導されるか検討した。
実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にデキサメタゾン（１０μＭ）を添加した培地（実施例５５）、ヒドロコルチゾン（５μＭ）を添加した培地（実施例５６）、ベタメタゾン（２μＭ）を添加した培地（実施例５７）、ベクロメタゾン（１μＭ）を添加した培地（実施例５８）、もしくはコントロールとして前記誘導因子を添加していない培地（Ｃｔｒｌ）に交換して、さらに１１日間培養した。培地交換は３〜４日ごとに行った。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。実験の結果を図１８に示す。ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾンを添加した場合に、デキサメタゾンを添加した場合と同様にインスリン発現細胞の陽性率が顕著に増加する様子が観察された。これらの結果より、ステロイドを添加することで膵ホルモン産生前駆細胞からインスリン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例５９）分化させたインスリン産生細胞における各種刺激に応答したインスリン分泌
生体内の膵β細胞は、各種刺激に応答してインスリンを細胞外に分泌することが知られている。本分化誘導法を用いて分化させたインスリン産生細胞が、生体内の膵β細胞と同様に各種刺激に応答してインスリンを分泌するかどうか検討した。
実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）を添加した培地に交換してさらに１１日間培養した。培地交換は３〜４日ごとに行った。培養後、２．５ｍＭグルコースを含む緩衝液（ＮａＣｌ（１１６ｍＭ）、ＫＣｌ（４．７ｍＭ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（１．１８ｍＭ）、ＭｇＳＯ_４（１．１８ｍＭ）、ＮａＨＣＯ_３（２５ｍＭ）、ＣａＣｌ_２（２．５２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２４ｍＭ）、０．１％ＢＳＡ）で洗浄し、さらに２．５ｍＭグルコースを含む緩衝液を添加して３７℃で２時間培養した。上清を完全に除去した後、２．５ｍＭグルコースを含む緩衝液、２２．５ｍＭグルコースを含む緩衝液、２．５ｍＭグルコースと２μＭ（−）−Ｂａｙ Ｋ８６４４を含む緩衝液、２．５ｍＭグルコースと１００μＭ ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅを含む緩衝液、２．５ｍＭグルコースと２５０μＭ ｃａｒｂａｃｈｏｌを含む緩衝液、２．５ｍＭグルコースと０．５ｍＭ ＩＢＭＸを含む緩衝液、２．５ｍＭグルコースと３０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液をそれぞれ添加した。３７℃で１時間培養した後、培養上清を回収し、培養上清中に含まれるＣペプチド量をＨｕｍａｎ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ）を用いて測定した。その結果を図１９に示す。（−）−Ｂａｙ Ｋ８６４４、ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ、ｃａｒｂａｃｈｏｌ、ＩＢＭＸ、ＫＣｌを添加した場合にＣペプチド分泌量が上昇していた。これらの結果より、本発明の手法を用いて分化させたインスリン産生細胞は各種刺激に応答してインスリンを細胞外に分泌することが明らかとなった。

（実施例６０）インスリン産生細胞以外の膵ホルモン産生細胞への分化
本分化誘導法を用いることでインスリン産生細胞以外の膵ホルモン産生細胞も同時に誘導されるか検討した。実施例１で示す方法に従って内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）を添加した培地に交換してさらに１１日間培養した。培地交換は３〜４日ごとに行った。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗ヒトＣペプチド抗体（Ｃ−ＰＥＰ−０１、ＭＯＮＯＳＡＮ社）、抗グルカゴン抗体（ＳＣ−７７８０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）、抗グレリン抗体（ＳＣ−１０３６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）又は抗ソマトスタチン抗体（Ａ０５６６、ＤＡＫＯ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）又はＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。免疫蛍光染色の結果を図２０に示す。Ｃペプチド陽性細胞に加え、グルカゴン陽性細胞、グレリン陽性細胞、ソマトスタチン陽性細胞がそれぞれ観察された。本分化誘導法を用いることでインスリン産生細胞以外の膵ホルモン産生細胞も同時に誘導されることが確認された。

（実施例６１）複数のヒトｉＰＳ細胞株からのインスリン産生細胞への分化誘導
上述の実施例ではヒトｉＰＳ細胞株として２５３Ｇ１株を利用していた。２５３Ｇ１株以外のヒトｉＰＳ細胞株からも膵臓細胞への分化が誘導されるか検討した。ヒトｉＰＳ細胞株として、２５３Ｇ１株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）以外に、２０１Ｂ７株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）（７３歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）（５６歳男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）（新生児男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）を用いて分化を誘導した（Ｃｅｌｌ ２００７；１３１（５），ｐ８６１−７２，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２００９；４（１２），ｐ．ｅ８０６７参照）。
実施例１で示す手法に従って内胚葉への分化を誘導した。培養３日後、ＳＯＸ１７とＦＯＸＡ２タンパク質の発現を調べるため、抗ＳＯＸ１７抗体と抗ＦＯＸＡ２抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。実施例１と同様の手法で３日目まで培養した後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。１次抗体として抗ヒトＳＯＸ１７抗体（ＡＦ１９２４、Ｒ＆Ｄ社）、抗ＦＯＸＡ２抗体（０７−６３３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）又はＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２１に示す。２０１Ｂ７株、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）株、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）株、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）株を用いて分化させた場合でも、大部分の細胞がＳＯＸ１７陽性ＦＯＸＡ２陽性の内胚葉細胞に分化している様子が観察された。
内胚葉細胞を誘導した後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗ヒトＰＤＸ１抗体（ＡＦ２４１９、Ｒ＆Ｄ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡下にて細胞を観察した。免疫蛍光染色の結果を図２２に示す。２０１Ｂ７株、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）株、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）株、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）株を用いて分化させた場合でも、大部分の細胞がＰＤＸ１陽性の膵ホルモン産生前駆細胞に分化している様子が観察された。
さらに、誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）を添加した培地に交換して、さらに１１日間培養した。培地交換は３〜４日ごとに行った。培養後、２％ＰＦＡを用いて１０分間、さらに４％ＰＦＡを用いて２０分間、室温において細胞の固定を行った。その後、１次抗体として抗インスリン抗体（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ社）と反応させ、さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。免疫蛍光染色の結果を図２３に示す。２５３Ｇ１株と同様に、２０１Ｂ７株、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）株、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）株、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）株より分化させた場合でも効率よくインスリン産生細胞への分化が誘導されている様子が観察された。以上の結果より、本分化誘導法を用いることでヒトｉＰＳ細胞株の種類によらずにインスリン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。

（実施例６２〜６４）フィーダー細胞をフィブロネクチンやマトリゲルマトリゲルで代用し、ヒトｉＰＳ細胞から膵ホルモン産生細胞を誘導する方法
本分化誘導系においてフィーダー細胞の代用としてフィブロネクチンまたはマトリゲルを用いた場合でも、膵ホルモン産生細胞への分化が誘導されるか検討した。フィブロネクチンでの代用の場合は、９６穴プレートにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で４０倍希釈したｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａフィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０μｌ添加し、室温で３時間以上静置させたのちに除去したものを利用した。一方、マトリゲルでの代用の場合は、９６穴プレートにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で６０倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ−ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｏｕｓｅ（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＩＮＣ．）を５０μｌ添加し、室温で３時間以上静置させたのちに除去したものを利用した。細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ）で処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞をフィブロネクチンあるいはマトリゲルでコートした９６穴プレートに１穴あたり４×１０^４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で１日間培養した。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地を使用した。播種１日後にＹ−２７６３２を添加していない霊長類ＥＳ細胞用培地に交換してさらに２日間培養し、コンフルエントな状態になるまで培養した。培養後、ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）で洗浄した後、ＣＨＩＲ９９０２１、２％ＦＢＳおよびアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ培地を用いて１日間培養した。１日間培養した後にＲＰＭＩ培地で洗浄し、２％のＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地を用いてさらに２日間培養した。その後、１％のＢ−２７を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にドーソモルフィン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の３種類を同時に添加して７日間培養した。培地交換は誘導７日目に一度行った。誘導１０日目の細胞をＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地で洗浄した後、１％のＢ−２７（ＧＩＢＣＯ）を含むＩｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地にフォルスコリン（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（５μＭ）を添加した培地に交換してさらに１１日間培養した。培地交換は３〜４日ごとに行って膵ホルモン産生細胞を誘導した。
フィーダー細胞上で膵ホルモン産生細胞を誘導した場合を実施例６２、フィブロネクチン上で膵ホルモン産生細胞を誘導した場合を実施例６３、マトリゲル上で膵ホルモン産生細胞を誘導した場合を実施例６４とした。誘導０日目及び２１日目の細胞からＲＮＡを回収し、インスリンｍＲＮＡの発現量を実施例１に示す方法と同様にして測定した。結果を表１に示す。いずれの条件においても、培養日数に伴ってインスリンｍＲＮＡ発現が上昇した。これらの結果より、本分化誘導法を用いることで、フィーダー細胞の代用としてフィブロネクチンやマトリゲルをコーティング剤として用いた培養系においても、膵ホルモン産生細胞への誘導が可能であることが明らかとなった。

本出願は、日本で出願された特願２００９−２９９２７６、及び特願２０１０−１４４２８３を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

本発明の製造方法によれば、より効率的に幹細胞から膵臓細胞、特に膵ホルモン産生細胞を製造することができる。該製造方法により得られた膵ホルモン産生細胞は、膵ホルモン産生及び／又は分泌異常に起因する疾患（例、糖尿病）の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニングに用いることができる。さらに本発明の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞を含む医薬は、そのような疾患を治療するために用いることができる。

Claims (14)

1. 幹細胞を、以下の工程（１）〜（４）に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造方法：
   （１）幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤、及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する工程
   （２）前記工程（１）で得られた細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地で培養する工程
   （３）前記工程（２）で得られた細胞を、（ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト、（ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び（ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を含む培地で培養する工程
   （４）前記工程（３）で得られた細胞を培養する工程。
2. 工程（１）および（２）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンであり、工程（３）が、工程（２）で得られた細胞を、(ａ)レチノイン酸受容体アゴニスト、(ｂ’)ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、及び(ｃ)アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤を含む培地で培養する工程である、請求項１記載の製造方法。
3. 工程（４）が、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｉｉ）ステロイド、及び（ｉｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤からなる群より選択される何れか１種以上を含む培地中で実施される、請求項１記載の製造方法。
4. 内胚葉細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む培地で培養することを特徴とする、膵ホルモン産生前駆細胞の製造方法：
   （ａ）レチノイン酸受容体アゴニスト
   （ｂ）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種、及び
   （ｃ）アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤。
5. 工程（１）におけるＧＳＫ３阻害剤が、
   ６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルである請求項１記載の製造方法。
6. 工程（３）におけるアクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が、
   ４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物である請求項１記載の製造方法。
7. 工程（３）におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−２，３，６の阻害剤、又はＢＭＰのアンタゴニストからなる群より選択される少なくとも一種が、ドーソモルフィン、またはＮｏｇｇｉｎである請求項１記載の製造方法。
8. 工程（３）における培地が、
   レチノイン酸、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物、及びドーソモルフィンを含む請求項１記載の製造方法。
9. アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種が、フォルスコリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンまたはジブチルｃＡＭＰである、請求項３記載の製造方法。
10. ステロイドが、デキサメタゾンである、請求項３記載の製造方法。
11. アクチビン受容体様キナーゼ−４，５，７の阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、または４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物である、請求項３記載の製造方法。
12. 培地がニコチンアミドを含む、請求項３記載の製造方法。
13. 幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒトの体性幹細胞である請求項１記載の製造方法。
14. 膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞、及びグレリン産生細胞からなる群より選択されるいずれかである請求項１記載の製造方法。