JP4079461B2 - Ｉｌ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍の治療において抗腫瘍剤の作用を補助、増強するインターロイキン６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト腫瘍の化学療法には、これまでアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、白金化合物等が用いられてきた。これらの抗腫瘍剤を単独で用いても顕著な治療効果が認められない場合、複数の抗腫瘍剤を併用する治療法が考えられてきた（Frei, E. III, Cancer Res., 32, 2593-2607, 1992）。腫瘍細胞は、抗腫瘍剤に様々な感受性を有し、あるものは抗腫瘍剤に対して治療抵抗性を示すことが知られている（Magrath, I., New Directions in Cancer Treatment, 1989, Springer-Verlag）。腫瘍細胞の治療抵抗性獲得には、マルチドラッグレジスタンス（multi-drug resistance ；ＭＤＲ）の発現（Tsuruo, T.ら、Cancer Res., 42, 4730-4733, 1982) 、抗腫瘍剤の細胞内取込みの減少 (Sherman, S. E.ら、Science, 230, 412, 1985)、ＤＮＡ修復活性の増加 (Borch, R. F., Metabolism and Action of Anticancer Drugs. Powis, G. & Prough, R. 編、Taylor & Francis, London, 1987, 163-193)または細胞内での抗腫瘍剤の不活化の促進 (Teicher, B. A.ら、Cancer Res., 46, 4379, 1986)等がその原因であるといわれている。このような場合、抗腫瘍剤を投与するだけでは予期した治療効果が認められない場合が多い。
【０００３】
腎細胞癌（renal cell carcinoma）は、シスプラチン、アドリアマイシンおよびビンブラスチンなどの抗腫瘍剤に治療抵抗性を示す腫瘍である（Kakehi, Y.ら、J.Urol., 139, 862-864, 1988 ；Kanamaru, H.ら、J.Natl.Cancer Inst., 81, 844-847, 1989；Teicher, B.A. ら、Cancer Res., 47, 388-393, 1987）。シスプラチンなどの抗腫瘍作用を有する白金化合物は、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡの合成および細胞の分裂を阻害する (Pinto, A. L.ら、Biochica et Biophysica Acta, 780, 167-180, 1985)。
【０００４】
腎細胞癌のシスプラチンに対する治療抵抗性には、グルタチオン−Ｓ トランスフェレース−π（ＧＳＴ−π）の発現、スルフィドリル基を含有する物質の細胞質内レベル上昇によるシスプラチンの作用抑制、ＤＮＡ修復能上昇あるいはｃ−ｍｙｃなどの発ガン遺伝子の活性化等が複雑に関与していると考えられている（Sklar, M.D. ら、Cancer Res., 51, 2118-2123, 1991；Mizutani, Y.ら、Cancer in press, 1994 ；Nakagawa, K.ら、Japan.J.Cancer Res., 79, 301-305, 1988）。
【０００５】
また、腫瘍細胞での膜透過輸送能の変化は、細胞内のシスプラチンの取込み減少をもたらし、シスプラチンに対する治療抵抗性を増すといわれている（Richon, V.ら、Cancer Res., 47, 2056-2061, 1987；Waud, W.R.ら、Cancer Res., 47, 6549-6555, 1987）。スルフィドリル基を含む物質として、哺乳類動物細胞内に最も豊富に存在するグルタチオンは、細胞内でシスプラチンを不活化することが報告されており、ある種の腫瘍において細胞内のグルタチオンおよびメタロチオネインレベルが高くなっていることが示された（Hromas, R.A.ら、Cancer LETT., 34, 9-13, 1987；Taylor, D.M.ら、Eur.J.Cancer, 12, 249-254, 1976 ）。
【０００６】
グルタチオンはトリペプチドチオールであり、アルキル化剤やシスプラチンのようなＤＮＡ結合物質の不活化およびこれらによる細胞障害の修復に重要な役割を担っている。ＧＳＴ−πの有する一つの作用は、上記のような抗腫瘍剤をグルタチオンに結合させることにより抗腫瘍剤の不活化を促進することである。
腎細胞癌は、インターロイキン６（ＩＬ−６）を産生し、ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）を発現していることから、腎細胞癌の増殖活性化にＩＬ−６が何らかの役割を担っていることが示唆されている（Miki, S.ら、FEBS Lett., 250, 607-610, 1989；Takenawa, J., ら、J.Natl.Cancer Inst., 83, 1668-1672, 1991）。さらに、腎細胞癌患者の治療予後が悪い場合、血清中のＩＬ−６レベルが上昇していることが報告されている（Blay, J., ら、Cancer Res., 52, 3317-3322, 1992；Tsukamoto, T.,ら、J.Urol., 148, 1778-1782, 1992 ）。しかしながら、ＩＬ−６と腎細胞癌の抗腫瘍剤に対する治療抵抗性とはこれまでに明確な関連づけがなされておらず不明であった。
【０００７】
ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２あるいはインターフェロンβ２と呼称された、多機能サイトカインである。ＩＬ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Hirano, T.ら、Nature 324, 73-76, 1986 ）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかとなった（Akira, S. ら、Adv.in Immunology 54, 1-78, 1993）。ＩＬ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物学的活性を伝達する。
【０００８】
一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０KDのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ−６Ｒである。ＩＬ−６Ｒは、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）としても存在する。もう一つは非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０KDのｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６ＲはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を形成し、次いでもう一つの膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Tagaら、J.Exp.Med., 196, 967, 1987）。
【０００９】
シスプラチンのような白金化合物や、マイトマイシンＣといった抗腫瘍剤は、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するが、ＩＬ−６は抗腫瘍剤により誘導されたアポトーシスを抑制することが報告されている（Kerr, J.ら、Cancer 73, 2013-2026, 1994；Sachs, L. ら、Blood 82, 15-21, 1993 ）。また、シスプラチンやマイトマイシンＣのような抗腫瘍剤は、フリーラジカルを産生することにより、腫瘍細胞に細胞毒性を及ぼす（Oyanagi, Y. ら、Biochem.Pharmacol., 26, 473-476, 1997 ；Nakano, H.ら、Biochem.Biophys.Acta., 796, 285-293, 1984 ）が、ＩＬ−６がフリーラジカル分解作用を有するマンガネーススーパーオキサイドジスムテース（Manganese superoxide dismutase；ＭｎＳＯＤ）の発現を促進し、ＩＬ−６抗体が促進されたＭｎＳＯＤ発現を抑制することが知られている（Ono, M.,ら、Biochem.Biophys.Res.Commun., 182, 1100-1107, 1992 ；Dougall, W.C. ら、Endocrinology, 129, 2376-2384, 1991 ）。
【００１０】
しかしながら、これらの報告は、ＩＬ−６の生物学的活性を遮断することにより抗腫瘍剤の作用を増強させることについて述べたものはなく、また、実際に抗腫瘍剤の作用増強剤としてＩＬ−６アンタゴニストの使用を試みたものはなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
これまで腫瘍の治療には、抗腫瘍剤が使用されていたが、これらを多量に使用すると吐き気・嘔吐、腎、肝機能障害や骨髄機能抑制といった好ましくない副作用が生ずることから、腫瘍細胞に対し、抗腫瘍作用を十分に発揮するような必要量を投与することが危険な場合もあった。また、通常の抗腫瘍剤を用いる化学療法では効果がみられない治療抵抗性の腫瘍があり、このような腫瘍の抗腫瘍剤に対する感受性を上昇させる作用増強剤の登場が待たれていた。
【００１２】
本発明の目的は、抗腫瘍剤の作用を補助、増強し、抗腫瘍剤に治療抵抗性の腫瘍細胞の感受性を上昇させるような新しい抗腫瘍剤の作用増強剤を提供することである。より詳しくは、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍剤の作用増強剤を提供する。より詳しくは、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍作用を有する化学療法剤の作用増強剤を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、腫瘍細胞の抗腫瘍剤に対する感受性の変化にＩＬ−６アンタゴニストが及ぼす影響について鋭意検討を重ねた結果、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体などのＩＬ−６アンタゴニストが腫瘍細胞の抗腫瘍剤に対する感受性を上昇させ、より低用量の抗腫瘍剤で治療効果が認められること、さらには、通常の抗腫瘍剤には治療抵抗性を示す腫瘍に対しＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる作用増強剤を併用することにより治療効果が現れることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍剤の作用増強剤に関する。より詳しくは、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍作用を有する化学療法剤の作用増強剤に関する。
ＩＬ−６アンタゴニストとしては、ＩＬ−６に対する抗体、ＩＬ−６Ｒに対する抗体等が好ましく、例えばこれらのモノクローナル抗体が好ましい。具体的なモノクローナル抗体としてはＰＭ−１抗体、又はヒト型化ＰＭ−１抗体が挙げられる。また、ＩＬ−６アンタゴニストと組合わせて使用される抗腫瘍剤としては、化学療法剤、例えば抗腫瘍活性を有する白金化合物、マイトマイシンＣ等が挙げられる。白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、２５４−Ｓ、ＤＷＡ−２１１４Ｒ、ＮＫ−１２１等が挙げられる。
【００１５】
【具体的な説明】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤とは、腫瘍を治療するに際し、抗腫瘍剤と併用されることで、抗腫瘍作用を増強する。また、抗腫瘍剤の必要用量を低減させ、さらには通常の化学療法では治療効果が認められない治療抵抗性の腫瘍に対しても、抗腫瘍剤の感受性を上昇させる効果を有する。
【００１６】
本発明の作用増強剤により抗腫瘍作用が増強される抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に作用して腫瘍細胞の発育と増殖を抑制し、腫瘍の治療効果を有する化学療法剤である。化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、植物由来アルカロイド、ホルモン療法剤、白金化合物などがある。このような抗腫瘍剤の中でも、抗腫瘍抗生剤であるマイトマイシンＣや抗腫瘍作用を有する白金化合物が特に好ましい。白金化合物は白金原子を有し、他の原子と錯体を形成している。このものは、ＤＮＡと結合することにより、腫瘍細胞のＤＮＡ合成を阻害し、腫瘍細胞の分裂を阻害して抗腫瘍作用を示す。これまでに抗腫瘍作用を有する白金化合物として、シスプラチン（cis-diammine dichloroplatinum(II) 、下記の構造式を有する）、
【００１７】
【化１】
【００１８】
カルボプラチン（cis-diammine (1,1-cyclobutanedicarboxylato)-platinum(II)、下記の構造式を有する）、
【００１９】
【化２】
【００２０】
２５４−Ｓ（(Glycolato-0,0')diammineplatinum(II)、下記の構造式を有する）、
【００２１】
【化３】
【００２２】
ＤＷＡ−２１１４Ｒ（(-)-(R)-2-aminomethylpyrrolidine(1,1-cyclobutanedicarboxylatoplatinum(II) 、下記の構造式を有する）、
【００２３】
【化４】
【００２４】
ＮＫ−１２１（(R)-cis-2-methyl-1,4-butanediamine(1,1-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II)、下記の構造式を有する）、
【００２５】
【化５】
【００２６】
オキサリプラチン（oxaliplatin ；USAN, Oxalato(trans-1,2-cyclohexanediamine)platinum(II) 、下記の構造式を有する）、
【００２７】
【化６】
【００２８】
ＴＲＫ−７１０（(alpha-acetyl-gamma-methyltetronate)2-(I-1,2-diaminocyclohexane)platinum(II)、下記の構造式を有する）
【００２９】
【化７】
【００３０】
等が知られている。これらの白金化合物のうちで特に、上記シスプラチン、カルボプラチン、ＤＷＡ−２１１４Ｒが好ましく例示される。
これらの抗腫瘍剤は、常法により製剤化される。例えば、白金化合物の場合、必要ならば補助剤とともに医薬として用いる単体と混合して、経口的にまた、非経口的に、好ましくは注射剤として用いられる。注射剤とする場合には、蒸留水あるいは塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩溶液または、ブドウ糖溶液、生理食塩水に混和するのがよい。これらの製剤中の抗腫瘍剤の量は、患者の年齢、症状等により、使用に便利な単位量が望まれ、例えば、成人の腫瘍治療に用いられる場合、一日一回１０−２０００mg／ｍ2 （体表面積）を投与し、投与量により５日間の連投あるいは投与間に１−４週の休薬期間を設けてもよい。
【００３１】
本発明の作用増強剤により抗腫瘍作用が認められる腫瘍細胞は、ＩＬ−６Ｒを有し、ＩＬ−６を一つの生理活性物質として増殖および／または治療抵抗性を示す腫瘍である。このような腫瘍としては、腎細胞癌 (Miki, S.ら、FEBS Letter, 250, 607-610, 1989)、骨髄腫 (Kawano, M.ら、Nature, 332, 83-85, 1988) 、卵巣ガン (Kobayashi, H. ら、第53回日本がん学会総会講演要旨集271 頁、874, 1994)、ＥＢウイルス感染Ｂリンパ腫 (Tosata, G.ら、J. Virol., 64, 3033-3041, 1990) 、成人Ｔ細胞白血病 (Sawada, T. & Takatsuki, K. Br. J. Cancer, 62, 923-924, 1990)、前立腺がん (Siegall, C. B.ら、Cancer Res., 50, 7786-7788, 1990) 、Ｋａｐｏｓｉ肉腫 (Miles, S. A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 4068-4072, 1990) 等が知られている。
【００３２】
本発明で使用されるＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来を問わない。ＩＬ−６アンタゴニストとしては、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−６改変体、ＩＬ−６ＲのアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒの部分ペプチド等が挙げられる。
【００３３】
本発明でＩＬ−６アンタゴニストとして使用される抗体、たとえば、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、あるいはｇｐ１３０抗体はその由来および種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。これら抗体はＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６とＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６Ｒとｇｐ１３０の結合を阻害してＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。
【００３４】
モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
【００３５】
このような抗体は、ＩＬ−６抗体としては、ＭＨ１６６抗体（Matsuda ら、Eur.J.Immunol. 18 ：951-956, 1988 ）やＳＫ２抗体（Satoら、第２１回 日本免疫学会総会、学術記録、２１：１１６，１９９１）等が挙げられる。ＩＬ−６Ｒ抗体としては、ＰＭ−１抗体（Hirataら、J.Immunol. 143：2900-2906, 1989 ）、ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）などが挙げられる。
【００３６】
このような抗体のうち、特にＩＬ−６Ｒ抗体が好ましく、その具体例としては上記ＰＭ−１抗体が挙げられる。
モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、ＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
【００３７】
より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としてはヒト由来のものが好ましく、ヒトＩＬ−６の場合、Hiranoら、Nature, 324 ：73, 1986に開示されたヒトＩＬ−６の遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒトＩＬ−６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６タンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６タンパク質を感作抗原として用いればよい。
【００３８】
ヒトＩＬ−６Ｒの場合、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を用いて上記ヒトＩＬ−６と同様の方法に従えばＩＬ−６Ｒタンパク質を得ることができる。ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱している可溶性のもの（ｓＩＬ−６Ｒ）（Yasukawaら、J.Biochem., 108, 673-676, 1990）との二種類がある。ｓＩＬ−６Ｒは細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒと異なっている。
【００３９】
ヒトｇｐ１３０の場合、欧州特許出願公開番号ＥＰ４１１９４６に開示されている遺伝子配列を用いて上記ＩＬ−６と同様の方法に従えば、ｇｐ１３０タンパク質を得ることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。
【００４０】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００４１】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8. 653)(J.Immunol. 123 ：1548, 1978），ｐ３−Ｕ１（Current Topics in Micro-biology and Immunology 81 ：1-7, 1978 ），ＮＳ−１（Eur.J.Immunol. 6：511-519, 1976 ），ＭＰＣ−１１（Cell, 8 ：405-415, 1976 ），ＳＰ２／０（Nature, 276 ：269-270, 1978 ），ＦＯ（J.Immunol.Meth. 35：1-21, 1980），Ｓ１９４（J.Exp.Med. 148：313-323, 1978 ），Ｒ２１０（Nature, 277 ：131-133, 1979 ）等が好適に使用される。
【００４２】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Milsteinら、Methods Enzymol. 73 ：3-46, 1981）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００４３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ １６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００４４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００４５】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。
【００４６】
このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００４７】
また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られる抗体産生細胞を細胞融合させて生ずるハイブリドーマから得られるものだけでなく、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを公知の細胞株、例えば、ＣＯＳ，ＣＨＯ等に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させたモノクローナル抗体を用いることができる（例えば、Vandamme, A-M.ら、Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990参照）。
【００４８】
さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。
このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（Immunofluorescence Analysis ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。
【００４９】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものがより好ましい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。
【００５０】
さらに、再構成（reshaped）したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができ、その好ましい具体例として再構成されたＰＭ−１抗体が挙げられる（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
【００５１】
なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Satoら、Cancer Res. 53：1-6, 1993 ）。さらには抗原に結合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり、抗体の断片、たとえば、Ｆ（ａｂ′）2 ，ＦａｂあるいはＦｖ、Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、Birdら、TIBTECH, 9：132-137, 1991 を参照）。
【００５２】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結してなる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結されている（Huston, J.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 85, 5879-5883, 1988 ）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。これらのＶ領域は、好ましくは、ペプチドリンカーによって連結されている。ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００５３】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００５４】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作成されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。ｓｃＦｖは、抗体分子に比べ、組織への移行性が優れており、再構成ヒト抗体と同様の機能を有するものとしての利用が期待される。
【００５５】
本発明で使用されるＩＬ−６改変体としてはBrakenhoffら、J.Biol.Chem. 269：86-93, 1994 あるいはSavinoら、EMBO J. 13：1357-1367, 1994 に開示されたものが挙げられる。
ＩＬ−６改変体としては、ＩＬ−６のアミノ酸配列中に置換、欠失、挿入といった変異を導入することにより、ＩＬ−６Ｒとの結合活性を維持したまま、ＩＬ−６のシグナル伝達作用がないものが使用される。さらにその由来となるＩＬ−６は上記の性質を有する限り、その動物種を問わないが、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好ましい。具体的には、ＩＬ−６のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩＦ（Vriendら、J.Mol.Graphics, 8 ：52-56, 1990 ）を用いてその二次構造を予測し、さらに変異アミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。
【００５６】
適当な変異アミノ酸残基を決定した後、ヒトＩＬ−６遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ（ポリメレースチェインリアクション）法により変異を導入することにより、ＩＬ−６改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌細胞や哺乳類細胞で発現させ、培養上清中に含まれたまま、あるいは通常の手法により、これを単離精製し、ＩＬ−６Ｒに対する結合活性およびＩＬ−６のシグナル伝達の中和活性を評価することができる。
【００５７】
本発明で使用されるＩＬ−６部分ペプチドあるいはＩＬ−６Ｒ部分ペプチドは、各々ＩＬ−６ＲあるいはＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の活性伝達作用がないものであれば、その断片の配列を問わない。ＩＬ−６部分ペプチドおよびＩＬ−６Ｒ部分ペプチドについては、米国特許公報ＵＳ５２１００７５および欧州特許公開公報ＥＰ６１７１２６を参照のこと。ＩＬ−６Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、特願平５−３００３３８を参照のこと。
【００５８】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤は、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、抗腫瘍剤の作用を補助、増強する限り、ＩＬ−６Ｒを有し、ＩＬ−６を一つの生理活性物質として増殖および／または治療抵抗性を示すいかなる腫瘍の治療に有効に用いることができる。
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。
【００５９】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、ＩＬ−６Ｒ抗体の場合、およそ１−１０００mg／患者の範囲で４回以下の分割用量を選択することができる。また、１−１０mg／kg／週の用量で投与することができる。しかしながら、本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００６０】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤は常法にしたがって製剤化することができる (Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国) 。たとえば、注射用製剤は、精製されたＩＬ−６アンタゴニストを溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例、参考例および実験例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の感受性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
種々の抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の感受性について、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響を調べた。
（１）ヒト腎細胞癌の調製
ヒト腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−１のサブラインであるシスプラチン耐性株Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ、ヒト腎細胞癌ＡＣＨＮ、ヒト腎細胞癌Ａ７０４（Giard, D.J. ら，J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417-1423, 1973)を２５mM ＨＥＰＥＳ、２mM Ｌ−グルタミン、１％ non-essentialアミノ酸、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシンおよび１０％加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培養液（以上、Ｇｉｂｃｏ製）（以下、完全培養液という）中で、プラスチックディッシュ上で単層になるように培養した。
【００６２】
一方、Mizutani, Y.ら（Cancer 69, 537-545, 1992）の方法にしたがい、腎細胞癌患者から新鮮腫瘍細胞を得た。三人の腎細胞癌患者の外科的処置の際に、腎細胞癌腫瘍組織を得た。組織学的分類により、腎細胞癌であることを確認した後、３mg／mlのコラーゲネース（Sigma Chemical Co.製）により、腫瘍組織を細かく分解し、腫瘍細胞懸濁液を調製した。ＲＰＭＩ １６４０培養液で三回洗浄した後、細胞懸濁液を、１５ml容量のプラスチックチューブ中の各々２mlの１００％、８０％および５０％のFicol-Hypaque からなる非連続的な勾配上に重層し、４００xgにて３０分間遠心した。上記１００％の層中のリンパ球に富む単球層を取り除き、８０％の層から腫瘍細胞と中皮細胞を得た。
【００６３】
他細胞の混入を防ぐため、１５mlのプラスチックチューブにいれた完全培養液中で腫瘍細胞に富む細胞懸濁液を、各々３mlの２５％、１５％、１０％のＰｅｒｃｏｌｌからなる非連続的な勾配上に重層して、室温にて２５xgで７分間遠心した。リンパ球と分離された腫瘍細胞をチューブ底面より得た。得られた腫瘍細胞を洗浄し、完全培養液で懸濁した後、トリパンブルー染色法により腫瘍細胞の生存を確認した。このように調製したこれらの腫瘍細胞を以下の実験に用いた。
（２）ＥＬＩＳＡ法による腎細胞癌のＩＬ−６産生確認
腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ，ＡＣＨＮ，Ａ７０４および腎細胞癌患者（No. １−３）由来新鮮腫瘍細胞の培養上清中にＩＬ−６が存在するか否かを、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay ）法で調べた。
【００６４】
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに１００μｌのＩＬ−６抗体を添加し、少なくとも一晩おいてＥＬＩＳＡプレートをＩＬ−６抗体でコートした。これらのプレートは使用するまで４℃にて最大４週保存した。ＩＬ−６抗体でコートしたプレートを三回洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＥＬＩＳＡ ＰＢＳで１時間ブロックした。二回の洗浄の後、１００μｌの腫瘍細胞培養上清またはコントロールとして大腸菌由来組換えＩＬ−６（Yasukawaら，Biotechnol. Lett., 12, 419, 1990）を各ウェルに加えた。
【００６５】
プレートを１時間インキュベートし、三回洗浄して１００μｌの抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（Matsuda, T. ら、Eur.J.Immunol., 18, 951-956, 1988 ）を各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートし、アルカリフォスフェイト結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、アルカリフォスフェイト基質（Sigma 104, Sigma Chemical Co. 製）とともにインキュベートした。２時間後にＥＬＩＳＡ ＲＥＡＤＥＲ（Immunoreader, Japan Intermed Co.ltd.製）により、４０５nmの吸光度を測定した。その結果より、これらの腎細胞癌はＩＬ−６を産生することが明らかとなった（表１参照）。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（３）抗腫瘍剤の細胞毒性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
各種濃度の抗腫瘍剤、すなわち、シスプラチン（cis-diamminedichloroplatinum(II)) 、マイトマイシンＣ（mitomycin C ；ＭＭＣ）、アドリアマイシン（adriamycin；ＡＤＲ）、ビンブラスチン（vinblastine ；ＶＢＬ）および５−フルオロウラシル（5-fluorouracil；５−ＦＵ）に対する各腎細胞Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ，ＡＣＨＮ，Ａ７０４および患者（No. １−３）由来新鮮腫瘍細胞の感受性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響を調べるために、ＭＴＴ法（Mizutani, Y.ら、Cancer 73, 730-737, 1994）を実施した。
【００６８】
１００μｌの上記の腎細胞癌腫瘍細胞懸濁液（２×１０4 細胞）を９６ウェル底面マイクロタイタープレート（Corning Glass Works, Corning製）に分注した。プレートを３７℃にて、５％ＣＯ2 存在加湿下におき、腫瘍細胞を２４時間培養した。細胞培養上清を吸引除去し、腫瘍細胞をＲＰＭＩ １６４０培養液で三回洗浄した。ＩＬ−６抗体（Matsuda, T. ら、Eur.J.Immunol., 18, 951-956, 1988 ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（Hirata, Y.ら、J.Immunol., 143, 2900-2906, 1989）との共存下において２００μｌの各抗腫瘍剤を含む溶液またはコントロールとして完全培養液を各ウェルに添加し、３７℃にて２４時間培養した。２０μｌのＭＴＴ溶液（５mg／ml、Sigma Chemical Co.製）を各ウェルに加え、引続き３７℃で、５％ＣＯ2 存在加湿下にて４時間培養した。培養液を各ウェルから取り除き、０．０５Ｎ ＨＣｌを含むイソプロパノール（Sigma Chemical Co.製）と置換した。
【００６９】
各ウェルの溶液の５４０nmにおける吸光度をマイクロカルチュアプレートリーダー（Immunoreader, Japan Intermed Co.ltd.製）で測定した。細胞毒性の割合を次の式にて計算した。細胞毒性（％）＝〔１−（実験群の吸光度／コントロール群の吸光度）〕×１００。
その結果、Ｃａｋｉ−１細胞では、抗体との共存下で、シスプラチン（図１Ａ，Ｂ参照）またはＭＭＣ（図２Ａ，Ｂ参照）による細胞毒性が明らかに上昇した。コントロール抗体ＭＯＰＣ３／Ｃ（J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 41, 1083, 1968）を加えた実験群では、シスプラチンまたはＭＭＣに対する感受性に影響はみられなかった。抗腫瘍剤単独を添加した場合と比べ、抗腫瘍剤とＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下では同程度の細胞毒性の効果を見出すための抗腫瘍剤の必要量は１／１０−１／１００であった。一方、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とＡＤＲ，ＶＢＬまたは５−ＦＵの共存下では、腫瘍細胞の抗腫瘍剤に対する感受性は変化しなかった。
【００７０】
Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ細胞のシスプラチンに対する耐性は、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とシスプラチンが共存することで克服された（図３Ａ，Ｂ参照）。このようなＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とシスプラチンとの共同作用は、他の腎細癌胞株ＡＣＨＮ（図４Ａ，Ｂ参照）、Ａ７０４（図５Ａ，Ｂ参照）および三人の患者から得られた新鮮腫瘍細胞（図６，７，８の各Ａ，Ｂ参照）においても同様に認められた。
【００７１】
実施例２ カルボプラチンに対する腎細胞癌の感受性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１を用い、各種の濃度に調製したカルボプラチン（carboplatin)とＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体が共存したときの細胞毒性について上記実施例１と同様に検討した。その結果、Ｃａｋｉ−１細胞のカルボプラチンに対する感受性が増強された（図９Ａ，Ｂ参照）。
【００７２】
実施例３ 抗腫瘍剤の細胞内蓄積に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
１０μｇ／mlのシスプラチンまたは１００μｇ／mlの５−ＦＵとコントロールとしての培養液、１０μｇ／mlのコントロール抗体ＭＯＰＣ３／Ｃ、１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の組合せの存在下で、Ｃａｋｉ−１細胞を２４時間培養した。
【００７３】
次いで、培養液を取り除き、細胞をＲＰＭＩ １６４０培養液で三回洗浄した。シスプラチンの細胞内蓄積を、フレームレス原子吸光スペクトロメトリー法（Daley-Tates, P. T.ら、Biochem. Pharmacol., 34, 2263-2369 ; Riley, C. M. ら、Analytical Biochem., 124, 167-179, 1982)にしたがい測定した。測定機器は、ジーマンＺ−８０００（Zeeman z-8000 Spectrophotometer, Hitachi Co.ltd.製）を用いた。また、５−ＦＵの細胞内蓄積を、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（Marunaka, T., ら、J. Pharm. Sci., 69, 1296-1300, 1980)で測定した。測定機器は、ＪＧＣ−２０ＫＰガスクロマトグラフを備えたＪＭＳ−Ｄ ３００マススペクトロメーター（ＪＯＥＬ製）を用いた。その結果を表２に示す。ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体はシスプラチン、５−ＦＵの腫瘍細胞内蓄積に何ら影響を与えないことが明らかになった。
【００７４】
【表２】
【００７５】
実施例４ Glutathione S-transferase- π（ＧＳＴ−π）発現に関するシスプラチン、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
Ｃａｋｉ−１細胞を、コントロールとしての培養液、１０μｇ／mlのシスプラチン、１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とともに４時間培養した。ついで、細胞の全ＲＮＡをMizutani, Y.ら（Cancer 73, 730-737, 1994）の方法により調製し、１０μｇ ＲＮＡ／レーンとなるよう２００mMモップス（ＭＯＰＳ；３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸）、５０mM酢酸ナトリウムおよび１０mM ＥＤＴＡナトリウムを含む１×ＭＯＰＳ緩衝液中で、１．２％アガロース−２．２Ｍ ＨＣＨＯゲルで電気泳動した。次いで、ＲＮＡを、３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム（pH７．０）を含む２０×ＳＳＣ溶液中でＢｉｏｄｙｎｅ Ａメンブレン（Ｐｏｌｌ製）に転写した。５０−１００ngのＧＳＴ−π ｃＤＮＡプローブ（Nakagawa, K.ら，J. Biol. Chem. 265, 4296-4301, 1990)を、α32Ｐ−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ製）によりランダムオリゴプライマー伸長法で標識した。ＲＮＡを転写した上記ナイロン膜を紫外線でクロスリンクし、上記プローブとハイブリダイズさせた。結果を図１０に示す。
【００７６】
シスプラチンによりＣａｋｉ−１細胞のＧＳＴ−π ｍＲＮＡの発現は何ら影響を受けなかった。しかしながら、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体を添加するとＧＳＴ−π ｍＲＮＡの発現が低下した。これらのことから、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体による腎細胞癌のシスプラチンに対する感受性上昇に関し、ＧＳＴ−π ｍＲＮＡの発現レベルの低下が関与していることが示唆された。
【００７７】
【発明の効果】
ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体といったＩＬ−６アンタゴニストを抗腫瘍剤と共存させることで、より低用量で抗腫瘍剤に対す腫瘍細胞の感受性が認められ、ＩＬ−６アンタゴニストと抗腫瘍剤により、併用効果が発揮されることが確認される。さらに、抗腫瘍剤に治療抵抗性を示す腫瘍細胞は、ＩＬ−６アンタゴニストにより抗腫瘍剤感受性を増強される結果、治療が可能となることが証明される。
【００７８】
また、本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる抗腫瘍剤の作用増強剤は、抗腫瘍剤の投与必要量を低下させることにより、抗腫瘍剤の組織へ及ぼす毒性を低減することができ、したがって、抗腫瘍剤の作用増強剤として期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図１Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図１Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図２】図２は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のマイトマイシンＣとＩＬ−６抗体（図２Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図２Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１に対する細胞傷害活性を示す。◆は、マイトマイシンＣのみ、■は、マイトマイシンＣと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、マイトマイシンＣと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、マイトマイシンＣと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図３】図３は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図３Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図３Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰに対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図４】図４は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図４Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図４Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株ＡＣＨＮに対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図５】図５は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図５Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図５Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ａ７０４に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図６】図６は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図６Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図６Ｂ）が共存したときの患者１から得られた新鮮腎細胞癌に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図７】図７は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図７Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図７Ｂ）が共存したときの患者２から得られた新鮮腎細胞癌に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図８】図８は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図８Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図８Ｂ）が共存したときの患者３から得られた新鮮腎細胞癌に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図９】図９は、０，１，１０または１００μｇ／mlの濃度のカルボプラチンとＩＬ−６抗体（図９Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図９Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１に対する細胞傷害活性を示す。◆は、カルボプラチンのみ、■は、カルボプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、カルボプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、カルボプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図１０】図１０Ａは、培養液（コントロール）、１０μｇ／mlのシスプラチン、１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体で処理した腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１においてＧＳＴ−π ｍＲＮＡ発現を調べるためのＧＳＴ−π ｃＤＮＡプローブを用いたＣａｋｉ−１の全ＲＮＡのノザンブロットの結果を示す図である。レーン１は、培養液のみ、レーン２はシスプラチン、レーン３はＩＬ−６抗体、レーン４はＩＬ−６Ｒ抗体で処理している。図１０Ｂは、エチジウムブロマイド染色を施した、ノザンブロットに用いたゲルの図である。各レーンにはＲＮＡが存在することを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍の治療において抗腫瘍剤の作用を補助、増強するインターロイキン６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト腫瘍の化学療法には、これまでアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、白金化合物等が用いられてきた。これらの抗腫瘍剤を単独で用いても顕著な治療効果が認められない場合、複数の抗腫瘍剤を併用する治療法が考えられてきた（Frei, E. III, Cancer Res., 32, 2593-2607, 1992）。腫瘍細胞は、抗腫瘍剤に様々な感受性を有し、あるものは抗腫瘍剤に対して治療抵抗性を示すことが知られている（Magrath, I., New Directions in Cancer Treatment, 1989, Springer-Verlag）。腫瘍細胞の治療抵抗性獲得には、マルチドラッグレジスタンス（multi-drug resistance ；ＭＤＲ）の発現（Tsuruo, T.ら、Cancer Res., 42, 4730-4733, 1982) 、抗腫瘍剤の細胞内取込みの減少 (Sherman, S. E.ら、Science, 230, 412, 1985)、ＤＮＡ修復活性の増加 (Borch, R. F., Metabolism and Action of Anticancer Drugs. Powis, G. & Prough, R. 編、Taylor & Francis, London, 1987, 163-193)または細胞内での抗腫瘍剤の不活化の促進 (Teicher, B. A.ら、Cancer Res., 46, 4379, 1986)等がその原因であるといわれている。このような場合、抗腫瘍剤を投与するだけでは予期した治療効果が認められない場合が多い。
【０００３】
腎細胞癌（renal cell carcinoma）は、シスプラチン、アドリアマイシンおよびビンブラスチンなどの抗腫瘍剤に治療抵抗性を示す腫瘍である（Kakehi, Y.ら、J.Urol., 139, 862-864, 1988 ；Kanamaru, H.ら、J.Natl.Cancer Inst., 81, 844-847, 1989；Teicher, B.A. ら、Cancer Res., 47, 388-393, 1987）。シスプラチンなどの抗腫瘍作用を有する白金化合物は、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡの合成および細胞の分裂を阻害する (Pinto, A. L.ら、Biochica et Biophysica Acta, 780, 167-180, 1985)。
【０００４】
腎細胞癌のシスプラチンに対する治療抵抗性には、グルタチオン−Ｓ トランスフェレース−π（ＧＳＴ−π）の発現、スルフィドリル基を含有する物質の細胞質内レベル上昇によるシスプラチンの作用抑制、ＤＮＡ修復能上昇あるいはｃ−ｍｙｃなどの発ガン遺伝子の活性化等が複雑に関与していると考えられている（Sklar, M.D. ら、Cancer Res., 51, 2118-2123, 1991；Mizutani, Y.ら、Cancer in press, 1994 ；Nakagawa, K.ら、Japan.J.Cancer Res., 79, 301-305, 1988）。
【０００５】
また、腫瘍細胞での膜透過輸送能の変化は、細胞内のシスプラチンの取込み減少をもたらし、シスプラチンに対する治療抵抗性を増すといわれている（Richon, V.ら、Cancer Res., 47, 2056-2061, 1987；Waud, W.R.ら、Cancer Res., 47, 6549-6555, 1987）。スルフィドリル基を含む物質として、哺乳類動物細胞内に最も豊富に存在するグルタチオンは、細胞内でシスプラチンを不活化することが報告されており、ある種の腫瘍において細胞内のグルタチオンおよびメタロチオネインレベルが高くなっていることが示された（Hromas, R.A.ら、Cancer LETT., 34, 9-13, 1987；Taylor, D.M.ら、Eur.J.Cancer, 12, 249-254, 1976 ）。
【０００６】
グルタチオンはトリペプチドチオールであり、アルキル化剤やシスプラチンのようなＤＮＡ結合物質の不活化およびこれらによる細胞障害の修復に重要な役割を担っている。ＧＳＴ−πの有する一つの作用は、上記のような抗腫瘍剤をグルタチオンに結合させることにより抗腫瘍剤の不活化を促進することである。
腎細胞癌は、インターロイキン６（ＩＬ−６）を産生し、ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）を発現していることから、腎細胞癌の増殖活性化にＩＬ−６が何らかの役割を担っていることが示唆されている（Miki, S.ら、FEBS Lett., 250, 607-610, 1989；Takenawa, J., ら、J.Natl.Cancer Inst., 83, 1668-1672, 1991）。さらに、腎細胞癌患者の治療予後が悪い場合、血清中のＩＬ−６レベルが上昇していることが報告されている（Blay, J., ら、Cancer Res., 52, 3317-3322, 1992；Tsukamoto, T.,ら、J.Urol., 148, 1778-1782, 1992 ）。しかしながら、ＩＬ−６と腎細胞癌の抗腫瘍剤に対する治療抵抗性とはこれまでに明確な関連づけがなされておらず不明であった。
【０００７】
ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２あるいはインターフェロンβ２と呼称された、多機能サイトカインである。ＩＬ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Hirano, T.ら、Nature 324, 73-76, 1986 ）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかとなった（Akira, S. ら、Adv.in Immunology 54, 1-78, 1993）。ＩＬ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物学的活性を伝達する。
【０００８】
一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０KDのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ−６Ｒである。ＩＬ−６Ｒは、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）としても存在する。もう一つは非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０KDのｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６ＲはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を形成し、次いでもう一つの膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Tagaら、J.Exp.Med., 196, 967, 1987）。
【０００９】
シスプラチンのような白金化合物や、マイトマイシンＣといった抗腫瘍剤は、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するが、ＩＬ−６は抗腫瘍剤により誘導されたアポトーシスを抑制することが報告されている（Kerr, J.ら、Cancer 73, 2013-2026, 1994；Sachs, L. ら、Blood 82, 15-21, 1993 ）。また、シスプラチンやマイトマイシンＣのような抗腫瘍剤は、フリーラジカルを産生することにより、腫瘍細胞に細胞毒性を及ぼす（Oyanagi, Y. ら、Biochem.Pharmacol., 26, 473-476, 1997 ；Nakano, H.ら、Biochem.Biophys.Acta., 796, 285-293, 1984 ）が、ＩＬ−６がフリーラジカル分解作用を有するマンガネーススーパーオキサイドジスムテース（Manganese superoxide dismutase；ＭｎＳＯＤ）の発現を促進し、ＩＬ−６抗体が促進されたＭｎＳＯＤ発現を抑制することが知られている（Ono, M.,ら、Biochem.Biophys.Res.Commun., 182, 1100-1107, 1992 ；Dougall, W.C. ら、Endocrinology, 129, 2376-2384, 1991 ）。
【００１０】
しかしながら、これらの報告は、ＩＬ−６の生物学的活性を遮断することにより抗腫瘍剤の作用を増強させることについて述べたものはなく、また、実際に抗腫瘍剤の作用増強剤としてＩＬ−６アンタゴニストの使用を試みたものはなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
これまで腫瘍の治療には、抗腫瘍剤が使用されていたが、これらを多量に使用すると吐き気・嘔吐、腎、肝機能障害や骨髄機能抑制といった好ましくない副作用が生ずることから、腫瘍細胞に対し、抗腫瘍作用を十分に発揮するような必要量を投与することが危険な場合もあった。また、通常の抗腫瘍剤を用いる化学療法では効果がみられない治療抵抗性の腫瘍があり、このような腫瘍の抗腫瘍剤に対する感受性を上昇させる作用増強剤の登場が待たれていた。
【００１２】
本発明の目的は、抗腫瘍剤の作用を補助、増強し、抗腫瘍剤に治療抵抗性の腫瘍細胞の感受性を上昇させるような新しい抗腫瘍剤の作用増強剤を提供することである。より詳しくは、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍剤の作用増強剤を提供する。より詳しくは、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍作用を有する化学療法剤の作用増強剤を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、腫瘍細胞の抗腫瘍剤に対する感受性の変化にＩＬ−６アンタゴニストが及ぼす影響について鋭意検討を重ねた結果、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体などのＩＬ−６アンタゴニストが腫瘍細胞の抗腫瘍剤に対する感受性を上昇させ、より低用量の抗腫瘍剤で治療効果が認められること、さらには、通常の抗腫瘍剤には治療抵抗性を示す腫瘍に対しＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる作用増強剤を併用することにより治療効果が現れることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍剤の作用増強剤に関する。より詳しくは、本発明はＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる、抗腫瘍作用を有する化学療法剤の作用増強剤に関する。
ＩＬ−６アンタゴニストとしては、ＩＬ−６に対する抗体、ＩＬ−６Ｒに対する抗体等が好ましく、例えばこれらのモノクローナル抗体が好ましい。具体的なモノクローナル抗体としてはＰＭ−１抗体、又はヒト型化ＰＭ−１抗体が挙げられる。また、ＩＬ−６アンタゴニストと組合わせて使用される抗腫瘍剤としては、化学療法剤、例えば抗腫瘍活性を有する白金化合物、マイトマイシンＣ等が挙げられる。白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、２５４−Ｓ、ＤＷＡ−２１１４Ｒ、ＮＫ−１２１等が挙げられる。
【００１５】
【具体的な説明】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤とは、腫瘍を治療するに際し、抗腫瘍剤と併用されることで、抗腫瘍作用を増強する。また、抗腫瘍剤の必要用量を低減させ、さらには通常の化学療法では治療効果が認められない治療抵抗性の腫瘍に対しても、抗腫瘍剤の感受性を上昇させる効果を有する。
【００１６】
本発明の作用増強剤により抗腫瘍作用が増強される抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に作用して腫瘍細胞の発育と増殖を抑制し、腫瘍の治療効果を有する化学療法剤である。化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、植物由来アルカロイド、ホルモン療法剤、白金化合物などがある。このような抗腫瘍剤の中でも、抗腫瘍抗生剤であるマイトマイシンＣや抗腫瘍作用を有する白金化合物が特に好ましい。白金化合物は白金原子を有し、他の原子と錯体を形成している。このものは、ＤＮＡと結合することにより、腫瘍細胞のＤＮＡ合成を阻害し、腫瘍細胞の分裂を阻害して抗腫瘍作用を示す。これまでに抗腫瘍作用を有する白金化合物として、シスプラチン（cis-diammine dichloroplatinum(II) 、下記の構造式を有する）、
【００１７】
【化１】
カルボプラチン（cis-diammine (1,1-cyclobutanedicarboxylato)-platinum(II)、下記の構造式を有する）、
【００１９】
【化２】
２５４−Ｓ（(Glycolato-0,0')diammineplatinum(II)、下記の構造式を有する）、
【００２１】
【化３】
ＤＷＡ−２１１４Ｒ（(-)-(R)-2-aminomethylpyrrolidine(1,1-cyclobutanedicarboxylatoplatinum(II) 、下記の構造式を有する）、
【００２３】
【化４】
ＮＫ−１２１（(R)-cis-2-methyl-1,4-butanediamine(1,1-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II)、下記の構造式を有する）、
【００２５】
【化５】
オキサリプラチン（oxaliplatin ；USAN, Oxalato(trans-1,2-cyclohexanediamine)platinum(II) 、下記の構造式を有する）、
【００２７】
【化６】
ＴＲＫ−７１０（(alpha-acetyl-gamma-methyltetronate)2-(I-1,2-diaminocyclohexane)platinum(II)、下記の構造式を有する）
【００２９】
【化７】
等が知られている。これらの白金化合物のうちで特に、上記シスプラチン、カルボプラチン、ＤＷＡ−２１１４Ｒが好ましく例示される。
これらの抗腫瘍剤は、常法により製剤化される。例えば、白金化合物の場合、必要ならば補助剤とともに医薬として用いる単体と混合して、経口的にまた、非経口的に、好ましくは注射剤として用いられる。注射剤とする場合には、蒸留水あるいは塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩溶液または、ブドウ糖溶液、生理食塩水に混和するのがよい。これらの製剤中の抗腫瘍剤の量は、患者の年齢、症状等により、使用に便利な単位量が望まれ、例えば、成人の腫瘍治療に用いられる場合、一日一回１０−２０００mg／ｍ2 （体表面積）を投与し、投与量により５日間の連投あるいは投与間に１−４週の休薬期間を設けてもよい。
【００３１】
本発明の作用増強剤により抗腫瘍作用が認められる腫瘍細胞は、ＩＬ−６Ｒを有し、ＩＬ−６を一つの生理活性物質として増殖および／または治療抵抗性を示す腫瘍である。このような腫瘍としては、腎細胞癌 (Miki, S.ら、FEBS Letter, 250, 607-610, 1989)、骨髄腫 (Kawano, M.ら、Nature, 332, 83-85, 1988) 、卵巣ガン (Kobayashi, H. ら、第53回日本がん学会総会講演要旨集271 頁、874, 1994)、ＥＢウイルス感染Ｂリンパ腫 (Tosata, G.ら、J. Virol., 64, 3033-3041, 1990) 、成人Ｔ細胞白血病 (Sawada, T. & Takatsuki, K. Br. J. Cancer, 62, 923-924, 1990)、前立腺がん (Siegall, C. B.ら、Cancer Res., 50, 7786-7788, 1990) 、Ｋａｐｏｓｉ肉腫 (Miles, S. A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 4068-4072, 1990) 等が知られている。
【００３２】
本発明で使用されるＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来を問わない。ＩＬ−６アンタゴニストとしては、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−６改変体、ＩＬ−６ＲのアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒの部分ペプチド等が挙げられる。
【００３３】
本発明でＩＬ−６アンタゴニストとして使用される抗体、たとえば、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、あるいはｇｐ１３０抗体はその由来および種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。これら抗体はＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６とＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６Ｒとｇｐ１３０の結合を阻害してＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。
【００３４】
モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
【００３５】
このような抗体は、ＩＬ−６抗体としては、ＭＨ１６６抗体（Matsuda ら、Eur.J.Immunol. 18 ：951-956, 1988 ）やＳＫ２抗体（Satoら、第２１回 日本免疫学会総会、学術記録、２１：１１６，１９９１）等が挙げられる。ＩＬ−６Ｒ抗体としては、ＰＭ−１抗体（Hirataら、J.Immunol. 143：2900-2906, 1989 ）、ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）などが挙げられる。
【００３６】
このような抗体のうち、特にＩＬ−６Ｒ抗体が好ましく、その具体例としては上記ＰＭ−１抗体が挙げられる。
モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、ＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒあるいはｇｐ１３０を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
【００３７】
より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としてはヒト由来のものが好ましく、ヒトＩＬ−６の場合、Hiranoら、Nature, 324 ：73, 1986に開示されたヒトＩＬ−６の遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒトＩＬ−６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６タンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６タンパク質を感作抗原として用いればよい。
【００３８】
ヒトＩＬ−６Ｒの場合、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を用いて上記ヒトＩＬ−６と同様の方法に従えばＩＬ−６Ｒタンパク質を得ることができる。ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱している可溶性のもの（ｓＩＬ−６Ｒ）（Yasukawaら、J.Biochem., 108, 673-676, 1990）との二種類がある。ｓＩＬ−６Ｒは細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒと異なっている。
【００３９】
ヒトｇｐ１３０の場合、欧州特許出願公開番号ＥＰ４１１９４６に開示されている遺伝子配列を用いて上記ＩＬ−６と同様の方法に従えば、ｇｐ１３０タンパク質を得ることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。
【００４０】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００４１】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8. 653)(J.Immunol. 123 ：1548, 1978），ｐ３−Ｕ１（Current Topics in Micro-biology and Immunology 81 ：1-7, 1978 ），ＮＳ−１（Eur.J.Immunol. 6：511-519, 1976 ），ＭＰＣ−１１（Cell, 8 ：405-415, 1976 ），ＳＰ２／０（Nature, 276 ：269-270, 1978 ），ＦＯ（J.Immunol.Meth. 35：1-21, 1980），Ｓ１９４（J.Exp.Med. 148：313-323, 1978 ），Ｒ２１０（Nature, 277 ：131-133, 1979 ）等が好適に使用される。
【００４２】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Milsteinら、Methods Enzymol. 73 ：3-46, 1981）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００４３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ １６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００４４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００４５】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。
【００４６】
このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００４７】
また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られる抗体産生細胞を細胞融合させて生ずるハイブリドーマから得られるものだけでなく、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを公知の細胞株、例えば、ＣＯＳ，ＣＨＯ等に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させたモノクローナル抗体を用いることができる（例えば、Vandamme, A-M.ら、Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990参照）。
【００４８】
さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。
このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（Immunofluorescence Analysis ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。
【００４９】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものがより好ましい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。
【００５０】
さらに、再構成（reshaped）したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができ、その好ましい具体例として再構成されたＰＭ−１抗体が挙げられる（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
【００５１】
なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Satoら、Cancer Res. 53：1-6, 1993 ）。さらには抗原に結合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり、抗体の断片、たとえば、Ｆ（ａｂ′）2 ，ＦａｂあるいはＦｖ、Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、Birdら、TIBTECH, 9：132-137, 1991 を参照）。
【００５２】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結してなる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結されている（Huston, J.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 85, 5879-5883, 1988 ）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。これらのＶ領域は、好ましくは、ペプチドリンカーによって連結されている。ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００５３】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００５４】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作成されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。ｓｃＦｖは、抗体分子に比べ、組織への移行性が優れており、再構成ヒト抗体と同様の機能を有するものとしての利用が期待される。
【００５５】
本発明で使用されるＩＬ−６改変体としてはBrakenhoffら、J.Biol.Chem. 269：86-93, 1994 あるいはSavinoら、EMBO J. 13：1357-1367, 1994 に開示されたものが挙げられる。
ＩＬ−６改変体としては、ＩＬ−６のアミノ酸配列中に置換、欠失、挿入といった変異を導入することにより、ＩＬ−６Ｒとの結合活性を維持したまま、ＩＬ−６のシグナル伝達作用がないものが使用される。さらにその由来となるＩＬ−６は上記の性質を有する限り、その動物種を問わないが、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好ましい。具体的には、ＩＬ−６のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩＦ（Vriendら、J.Mol.Graphics, 8 ：52-56, 1990 ）を用いてその二次構造を予測し、さらに変異アミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。
【００５６】
適当な変異アミノ酸残基を決定した後、ヒトＩＬ−６遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ（ポリメレースチェインリアクション）法により変異を導入することにより、ＩＬ−６改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌細胞や哺乳類細胞で発現させ、培養上清中に含まれたまま、あるいは通常の手法により、これを単離精製し、ＩＬ−６Ｒに対する結合活性およびＩＬ−６のシグナル伝達の中和活性を評価することができる。
【００５７】
本発明で使用されるＩＬ−６部分ペプチドあるいはＩＬ−６Ｒ部分ペプチドは、各々ＩＬ−６ＲあるいはＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の活性伝達作用がないものであれば、その断片の配列を問わない。ＩＬ−６部分ペプチドおよびＩＬ−６Ｒ部分ペプチドについては、米国特許公報ＵＳ５２１００７５および欧州特許公開公報ＥＰ６１７１２６を参照のこと。ＩＬ−６Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、特願平５−３００３３８を参照のこと。
【００５８】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤は、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、抗腫瘍剤の作用を補助、増強する限り、ＩＬ−６Ｒを有し、ＩＬ−６を一つの生理活性物質として増殖および／または治療抵抗性を示すいかなる腫瘍の治療に有効に用いることができる。
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。
【００５９】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、ＩＬ−６Ｒ抗体の場合、およそ１−１０００mg／患者の範囲で４回以下の分割用量を選択することができる。また、１−１０mg／kg／週の用量で投与することができる。しかしながら、本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００６０】
本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる、抗腫瘍剤の作用増強剤は常法にしたがって製剤化することができる (Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国) 。たとえば、注射用製剤は、精製されたＩＬ−６アンタゴニストを溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例、参考例および実験例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の感受性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
種々の抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の感受性について、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響を調べた。
（１）ヒト腎細胞癌の調製
ヒト腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−１のサブラインであるシスプラチン耐性株Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ、ヒト腎細胞癌ＡＣＨＮ、ヒト腎細胞癌Ａ７０４（Giard, D.J. ら，J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417-1423, 1973)を２５mM ＨＥＰＥＳ、２mM Ｌ−グルタミン、１％ non-essentialアミノ酸、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシンおよび１０％加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培養液（以上、Ｇｉｂｃｏ製）（以下、完全培養液という）中で、プラスチックディッシュ上で単層になるように培養した。
【００６２】
一方、Mizutani, Y.ら（Cancer 69, 537-545, 1992）の方法にしたがい、腎細胞癌患者から新鮮腫瘍細胞を得た。三人の腎細胞癌患者の外科的処置の際に、腎細胞癌腫瘍組織を得た。組織学的分類により、腎細胞癌であることを確認した後、３mg／mlのコラーゲネース（Sigma Chemical Co.製）により、腫瘍組織を細かく分解し、腫瘍細胞懸濁液を調製した。ＲＰＭＩ １６４０培養液で三回洗浄した後、細胞懸濁液を、１５ml容量のプラスチックチューブ中の各々２mlの１００％、８０％および５０％のFicol-Hypaque からなる非連続的な勾配上に重層し、４００xgにて３０分間遠心した。上記１００％の層中のリンパ球に富む単球層を取り除き、８０％の層から腫瘍細胞と中皮細胞を得た。
【００６３】
他細胞の混入を防ぐため、１５mlのプラスチックチューブにいれた完全培養液中で腫瘍細胞に富む細胞懸濁液を、各々３mlの２５％、１５％、１０％のＰｅｒｃｏｌｌからなる非連続的な勾配上に重層して、室温にて２５xgで７分間遠心した。リンパ球と分離された腫瘍細胞をチューブ底面より得た。得られた腫瘍細胞を洗浄し、完全培養液で懸濁した後、トリパンブルー染色法により腫瘍細胞の生存を確認した。このように調製したこれらの腫瘍細胞を以下の実験に用いた。
（２）ＥＬＩＳＡ法による腎細胞癌のＩＬ−６産生確認
腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ，ＡＣＨＮ，Ａ７０４および腎細胞癌患者（No. １−３）由来新鮮腫瘍細胞の培養上清中にＩＬ−６が存在するか否かを、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay ）法で調べた。
【００６４】
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに１００μｌのＩＬ−６抗体を添加し、少なくとも一晩おいてＥＬＩＳＡプレートをＩＬ−６抗体でコートした。これらのプレートは使用するまで４℃にて最大４週保存した。ＩＬ−６抗体でコートしたプレートを三回洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＥＬＩＳＡ ＰＢＳで１時間ブロックした。二回の洗浄の後、１００μｌの腫瘍細胞培養上清またはコントロールとして大腸菌由来組換えＩＬ−６（Yasukawaら，Biotechnol. Lett., 12, 419, 1990）を各ウェルに加えた。
【００６５】
プレートを１時間インキュベートし、三回洗浄して１００μｌの抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（Matsuda, T. ら、Eur.J.Immunol., 18, 951-956, 1988 ）を各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートし、アルカリフォスフェイト結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、アルカリフォスフェイト基質（Sigma 104, Sigma Chemical Co. 製）とともにインキュベートした。２時間後にＥＬＩＳＡ ＲＥＡＤＥＲ（Immunoreader, Japan Intermed Co.ltd.製）により、４０５nmの吸光度を測定した。その結果より、これらの腎細胞癌はＩＬ−６を産生することが明らかとなった（表１参照）。
【００６６】
【表１】
（３）抗腫瘍剤の細胞毒性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
各種濃度の抗腫瘍剤、すなわち、シスプラチン（cis-diamminedichloroplatinum(II)) 、マイトマイシンＣ（mitomycin C ；ＭＭＣ）、アドリアマイシン（adriamycin；ＡＤＲ）、ビンブラスチン（vinblastine ；ＶＢＬ）および５−フルオロウラシル（5-fluorouracil；５−ＦＵ）に対する各腎細胞Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ，ＡＣＨＮ，Ａ７０４および患者（No. １−３）由来新鮮腫瘍細胞の感受性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響を調べるために、ＭＴＴ法（Mizutani, Y.ら、Cancer 73, 730-737, 1994）を実施した。
【００６８】
１００μｌの上記の腎細胞癌腫瘍細胞懸濁液（２×１０4 細胞）を９６ウェル底面マイクロタイタープレート（Corning Glass Works, Corning製）に分注した。プレートを３７℃にて、５％ＣＯ2 存在加湿下におき、腫瘍細胞を２４時間培養した。細胞培養上清を吸引除去し、腫瘍細胞をＲＰＭＩ １６４０培養液で三回洗浄した。ＩＬ−６抗体（Matsuda, T. ら、Eur.J.Immunol., 18, 951-956, 1988 ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（Hirata, Y.ら、J.Immunol., 143, 2900-2906, 1989）との共存下において２００μｌの各抗腫瘍剤を含む溶液またはコントロールとして完全培養液を各ウェルに添加し、３７℃にて２４時間培養した。２０μｌのＭＴＴ溶液（５mg／ml、Sigma Chemical Co.製）を各ウェルに加え、引続き３７℃で、５％ＣＯ2 存在加湿下にて４時間培養した。培養液を各ウェルから取り除き、０．０５Ｎ ＨＣｌを含むイソプロパノール（Sigma Chemical Co.製）と置換した。
【００６９】
各ウェルの溶液の５４０nmにおける吸光度をマイクロカルチュアプレートリーダー（Immunoreader, Japan Intermed Co.ltd.製）で測定した。細胞毒性の割合を次の式にて計算した。細胞毒性（％）＝〔１−（実験群の吸光度／コントロール群の吸光度）〕×１００。
その結果、Ｃａｋｉ−１細胞では、抗体との共存下で、シスプラチン（図１Ａ，Ｂ参照）またはＭＭＣ（図２Ａ，Ｂ参照）による細胞毒性が明らかに上昇した。コントロール抗体ＭＯＰＣ３／Ｃ（J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 41, 1083, 1968）を加えた実験群では、シスプラチンまたはＭＭＣに対する感受性に影響はみられなかった。抗腫瘍剤単独を添加した場合と比べ、抗腫瘍剤とＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下では同程度の細胞毒性の効果を見出すための抗腫瘍剤の必要量は１／１０−１／１００であった。一方、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とＡＤＲ，ＶＢＬまたは５−ＦＵの共存下では、腫瘍細胞の抗腫瘍剤に対する感受性は変化しなかった。
【００７０】
Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰ細胞のシスプラチンに対する耐性は、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とシスプラチンが共存することで克服された（図３Ａ，Ｂ参照）。このようなＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とシスプラチンとの共同作用は、他の腎細癌胞株ＡＣＨＮ（図４Ａ，Ｂ参照）、Ａ７０４（図５Ａ，Ｂ参照）および三人の患者から得られた新鮮腫瘍細胞（図６，７，８の各Ａ，Ｂ参照）においても同様に認められた。
【００７１】
実施例２ カルボプラチンに対する腎細胞癌の感受性に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１を用い、各種の濃度に調製したカルボプラチン（carboplatin)とＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体が共存したときの細胞毒性について上記実施例１と同様に検討した。その結果、Ｃａｋｉ−１細胞のカルボプラチンに対する感受性が増強された（図９Ａ，Ｂ参照）。
【００７２】
実施例３ 抗腫瘍剤の細胞内蓄積に関するＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
１０μｇ／mlのシスプラチンまたは１００μｇ／mlの５−ＦＵとコントロールとしての培養液、１０μｇ／mlのコントロール抗体ＭＯＰＣ３／Ｃ、１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の組合せの存在下で、Ｃａｋｉ−１細胞を２４時間培養した。
【００７３】
次いで、培養液を取り除き、細胞をＲＰＭＩ １６４０培養液で三回洗浄した。シスプラチンの細胞内蓄積を、フレームレス原子吸光スペクトロメトリー法（Daley-Tates, P. T.ら、Biochem. Pharmacol., 34, 2263-2369 ; Riley, C. M. ら、Analytical Biochem., 124, 167-179, 1982)にしたがい測定した。測定機器は、ジーマンＺ−８０００（Zeeman z-8000 Spectrophotometer, Hitachi Co.ltd.製）を用いた。また、５−ＦＵの細胞内蓄積を、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（Marunaka, T., ら、J. Pharm. Sci., 69, 1296-1300, 1980)で測定した。測定機器は、ＪＧＣ−２０ＫＰガスクロマトグラフを備えたＪＭＳ−Ｄ ３００マススペクトロメーター（ＪＯＥＬ製）を用いた。その結果を表２に示す。ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体はシスプラチン、５−ＦＵの腫瘍細胞内蓄積に何ら影響を与えないことが明らかになった。
【００７４】
【表２】
実施例４ Glutathione S-transferase- π（ＧＳＴ−π）発現に関するシスプラチン、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の影響
Ｃａｋｉ−１細胞を、コントロールとしての培養液、１０μｇ／mlのシスプラチン、１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体とともに４時間培養した。ついで、細胞の全ＲＮＡをMizutani, Y.ら（Cancer 73, 730-737, 1994）の方法により調製し、１０μｇ ＲＮＡ／レーンとなるよう２００mMモップス（ＭＯＰＳ；３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸）、５０mM酢酸ナトリウムおよび１０mM ＥＤＴＡナトリウムを含む１×ＭＯＰＳ緩衝液中で、１．２％アガロース−２．２Ｍ ＨＣＨＯゲルで電気泳動した。次いで、ＲＮＡを、３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム（pH７．０）を含む２０×ＳＳＣ溶液中でＢｉｏｄｙｎｅ Ａメンブレン（Ｐｏｌｌ製）に転写した。５０−１００ngのＧＳＴ−π ｃＤＮＡプローブ（Nakagawa, K.ら，J. Biol. Chem. 265, 4296-4301, 1990)を、α32Ｐ−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ製）によりランダムオリゴプライマー伸長法で標識した。ＲＮＡを転写した上記ナイロン膜を紫外線でクロスリンクし、上記プローブとハイブリダイズさせた。結果を図１０に示す。
【００７６】
シスプラチンによりＣａｋｉ−１細胞のＧＳＴ−π ｍＲＮＡの発現は何ら影響を受けなかった。しかしながら、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体を添加するとＧＳＴ−π ｍＲＮＡの発現が低下した。これらのことから、ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体による腎細胞癌のシスプラチンに対する感受性上昇に関し、ＧＳＴ−π ｍＲＮＡの発現レベルの低下が関与していることが示唆された。
【００７７】
【発明の効果】
ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体といったＩＬ−６アンタゴニストを抗腫瘍剤と共存させることで、より低用量で抗腫瘍剤に対す腫瘍細胞の感受性が認められ、ＩＬ−６アンタゴニストと抗腫瘍剤により、併用効果が発揮されることが確認される。さらに、抗腫瘍剤に治療抵抗性を示す腫瘍細胞は、ＩＬ−６アンタゴニストにより抗腫瘍剤感受性を増強される結果、治療が可能となることが証明される。
【００７８】
また、本発明のＩＬ−６アンタゴニストからなる抗腫瘍剤の作用増強剤は、抗腫瘍剤の投与必要量を低下させることにより、抗腫瘍剤の組織へ及ぼす毒性を低減することができ、したがって、抗腫瘍剤の作用増強剤として期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図１Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図１Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図２】図２は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のマイトマイシンＣとＩＬ−６抗体（図２Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図２Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１に対する細胞傷害活性を示す。◆は、マイトマイシンＣのみ、■は、マイトマイシンＣと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、マイトマイシンＣと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、マイトマイシンＣと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図３】図３は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図３Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図３Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１／ＤＤＰに対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図４】図４は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図４Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図４Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株ＡＣＨＮに対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図５】図５は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図５Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図５Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ａ７０４に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図６】図６は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図６Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図６Ｂ）が共存したときの患者１から得られた新鮮腎細胞癌に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図７】図７は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図７Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図７Ｂ）が共存したときの患者２から得られた新鮮腎細胞癌に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図８】図８は、０，０．１，１または１０μｇ／mlの濃度のシスプラチンとＩＬ−６抗体（図８Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図８Ｂ）が共存したときの患者３から得られた新鮮腎細胞癌に対する細胞傷害活性を示す。◆は、シスプラチンのみ、■は、シスプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、シスプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、シスプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図９】図９は、０，１，１０または１００μｇ／mlの濃度のカルボプラチンとＩＬ−６抗体（図９Ａ）またはＩＬ−６Ｒ抗体（図９Ｂ）が共存したときの腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１に対する細胞傷害活性を示す。◆は、カルボプラチンのみ、■は、カルボプラチンと０．１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、▲は、カルボプラチンと１μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下、●は、カルボプラチンと１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体の共存下における細胞傷害活性（％）を示す。
【図１０】図１０Ａは、培養液（コントロール）、１０μｇ／mlのシスプラチン、１０μｇ／mlのＩＬ−６抗体またはＩＬ−６Ｒ抗体で処理した腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１においてＧＳＴ−π ｍＲＮＡ発現を調べるためのＧＳＴ−π ｃＤＮＡプローブを用いたＣａｋｉ−１の全ＲＮＡのノザンブロットの結果を示す図である。レーン１は、培養液のみ、レーン２はシスプラチン、レーン３はＩＬ−６抗体、レーン４はＩＬ−６Ｒ抗体で処理している。図１０Ｂは、エチジウムブロマイド染色を施した、ノザンブロットに用いたゲルの図である。各レーンにはＲＮＡが存在することを示す。
Claims (5)
- インターロイキン６（IL-6）に結合し、IL-6のシグナル伝達を阻害し得る抗体と、抗腫瘍作用を有する白金化合物又はマイトマイシンＣから選択される抗腫瘍剤とを有効成分とする抗腫瘍剤。
- インターロイキン６（IL-6）に結合し、IL-6のシグナル伝達を阻害し得る抗体と、抗腫瘍作用を有する白金化合物又はマイトマイシンＣから選択される抗腫瘍剤とを組み合わせてなる抗腫瘍剤。
- 前記抗体が、ヒトインターロイキン６（IL-6）に結合し、ヒトIL-6のシグナル伝達を阻害し得る抗体である、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
- 前記抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、254−S、DWA−2114R又はNK−121である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
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