RU2768963C2 - Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки - Google Patents
Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768963C2 RU2768963C2 RU2018116648A RU2018116648A RU2768963C2 RU 2768963 C2 RU2768963 C2 RU 2768963C2 RU 2018116648 A RU2018116648 A RU 2018116648A RU 2018116648 A RU2018116648 A RU 2018116648A RU 2768963 C2 RU2768963 C2 RU 2768963C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- inhibitor
- stage
- pancreatic
- days
- Prior art date
Links
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title claims abstract description 169
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 44
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 87
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 title description 77
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 884
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 285
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 177
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 150
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 62
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 48
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 claims abstract description 11
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 163
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 claims description 123
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 claims description 123
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 claims description 123
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 97
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 97
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 97
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 83
- FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N (z)-n-(4-benzylpiperazin-1-yl)-1-(3,5-dimethyl-1-phenylpyrazol-4-yl)methanimine Chemical compound CC1=NN(C=2C=CC=CC=2)C(C)=C1\C=N/N(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N 0.000 claims description 82
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 79
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 79
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 79
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 65
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 claims description 65
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 58
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 claims description 50
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 claims description 50
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 47
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 47
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 36
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 33
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 claims description 27
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 claims description 27
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 claims description 25
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 claims description 25
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 claims description 24
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 claims description 24
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 claims description 24
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 22
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 21
- BERLXWPRSBJFHO-UHFFFAOYSA-N 2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-n-pyridin-4-ylpteridin-4-amine Chemical compound FC1=CC=C(Cl)C=C1C1=NC(NC=2C=CN=CC=2)=C(N=CC=N2)C2=N1 BERLXWPRSBJFHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 20
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 20
- 210000003577 pancreatic endocrine progenitor Anatomy 0.000 claims description 20
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 17
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 17
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 claims description 14
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 14
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 claims description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 14
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 claims description 11
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 claims description 10
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 claims description 10
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 10
- -1 PTF1α Proteins 0.000 claims description 9
- ZXSWZQSYZYMZKS-UHFFFAOYSA-N 2-methoxyethyl 4-(3-hydroxyphenyl)-7-(2-methoxyphenyl)-2-methyl-5-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-1h-quinoline-3-carboxylate Chemical compound COCCOC(=O)C1=C(C)NC(CC(CC2=O)C=3C(=CC=CC=3)OC)=C2C1C1=CC=CC(O)=C1 ZXSWZQSYZYMZKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000006533 chordin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008846 chordin Proteins 0.000 claims description 8
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 claims description 6
- ULFUJLFTRWWLPO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2,7,7-trimethyl-5-oxo-4-(4-phenylphenyl)-1,4,6,8-tetrahydroquinoline-3-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=C(C)NC(CC(C)(C)CC2=O)=C2C1C(C=C1)=CC=C1C1=CC=CC=C1 ULFUJLFTRWWLPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 4
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 claims description 4
- 101000923091 Danio rerio Aristaless-related homeobox protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031470 Homeobox protein ARX Human genes 0.000 claims description 3
- 101000923090 Homo sapiens Homeobox protein ARX Proteins 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100021022 Gastrin Human genes 0.000 claims 2
- 102100022123 Hepatocyte nuclear factor 1-beta Human genes 0.000 claims 1
- 101001045758 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-beta Proteins 0.000 claims 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims 1
- 230000008410 smoothened signaling pathway Effects 0.000 claims 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 214
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 204
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 109
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 102
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 102
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 102
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 98
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 77
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 76
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 69
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 68
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 68
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 64
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 64
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 64
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 64
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 59
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 58
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 51
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 51
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 47
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 47
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 38
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 38
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 36
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 35
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 35
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 35
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 35
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 34
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 33
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 33
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 33
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 29
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 29
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 29
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 27
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 26
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 26
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 24
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 24
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 24
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 24
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 23
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 22
- 102100024645 ATP-binding cassette sub-family C member 8 Human genes 0.000 description 21
- 101000760570 Homo sapiens ATP-binding cassette sub-family C member 8 Proteins 0.000 description 21
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 20
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 20
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 19
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 19
- 239000000306 component Substances 0.000 description 18
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 17
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 15
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 14
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 13
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 13
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 13
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 13
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 13
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 13
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 12
- 102100031671 Homeobox protein CDX-2 Human genes 0.000 description 12
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 12
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 12
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 12
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 12
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 12
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 210000001915 nurse cell Anatomy 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 10
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 10
- 101001128694 Homo sapiens Neuroendocrine convertase 1 Proteins 0.000 description 10
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 10
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 10
- 102100032132 Neuroendocrine convertase 1 Human genes 0.000 description 10
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 10
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 10
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 10
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 8
- 101100180045 Gallus gallus ISL1 gene Proteins 0.000 description 8
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 8
- 208000032740 autosomal recessive 10 intellectual disability Diseases 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 8
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 8
- LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 1,5-naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]- Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(C=NN2)C=2N=C3C=CC=NC3=CC=2)=N1 LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 7
- PLOPBXQQPZYQFA-AXPWDRQUSA-N amlintide Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CSSC1)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PLOPBXQQPZYQFA-AXPWDRQUSA-N 0.000 description 7
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 7
- QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N cyclopamine Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C(CC2=C3C)C1C2CCC13OC2CC(C)CNC2C1C QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N (-)-indolactam V Chemical compound C1[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 6
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 6
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N phorbol 12,13-dibutanoate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(=O)CCC)C1(C)C BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N 0.000 description 6
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 6
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 6
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 5
- 102400000442 Ghrelin-28 Human genes 0.000 description 5
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 5
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 102100027647 Activin receptor type-2B Human genes 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101000712602 Danio rerio Thyroid hormone receptor beta Proteins 0.000 description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 4
- 101100437153 Rattus norvegicus Acvr2b gene Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 4
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 4
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 4
- 101150068520 wnt3a gene Proteins 0.000 description 4
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 3
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 3
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 3
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 3
- 101000976653 Homo sapiens Zinc finger protein ZIC 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 3
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 3
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 3
- 102100023497 Zinc finger protein ZIC 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WOLVEMPZUIFSII-IHHOKICGSA-N (2e,4e)-n-[(2s,5s)-5-(hydroxymethyl)-1-methyl-3-oxo-2-propan-2-yl-2,4,5,6-tetrahydro-1,4-benzodiazocin-8-yl]-5-[4-(trifluoromethyl)phenyl]penta-2,4-dienamide Chemical compound CN([C@H](C(N[C@H](CO)CC1=C2)=O)C(C)C)C1=CC=C2NC(=O)\C=C\C=C\C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 WOLVEMPZUIFSII-IHHOKICGSA-N 0.000 description 2
- QSHGISMANBKLQL-OWJWWREXSA-N (2s)-2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]-n-[(7s)-5-methyl-6-oxo-7h-benzo[d][1]benzazepin-7-yl]propanamide Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 QSHGISMANBKLQL-OWJWWREXSA-N 0.000 description 2
- AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N (S)-2-methyl-1-(4-methylisoquinoline-5-sulfonyl)-1,4-diazepane Chemical compound C[C@H]1CNCCCN1S(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC(C)=C12 AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NMEUKWOOQOHUNA-UHFFFAOYSA-N 4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-6-(pyridin-3-ylmethylamino)-1,7-naphthyridine-3-carbonitrile Chemical compound C1=C(Cl)C(F)=CC=C1NC(C1=C2)=C(C#N)C=NC1=CN=C2NCC1=CC=CN=C1 NMEUKWOOQOHUNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027052 Bone morphogenetic protein receptor type-1B Human genes 0.000 description 2
- 102100025422 Bone morphogenetic protein receptor type-2 Human genes 0.000 description 2
- 108050008407 Bone morphogenetic protein receptor type-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100022595 Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Human genes 0.000 description 2
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 2
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 2
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 101000984546 Homo sapiens Bone morphogenetic protein receptor type-1B Proteins 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012825 JNK inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940118135 JNK inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100026299 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710139011 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 108091006556 SLC30A8 Proteins 0.000 description 2
- 108010007945 Smad Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007374 Smad Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000001368 germline stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 1-n-(4-chlorophenyl)-6-methyl-5-n-[3-(7h-purin-6-yl)pyridin-2-yl]isoquinoline-1,5-diamine Chemical compound N=1C=CC2=C(NC=3C(=CC=CN=3)C=3C=4N=CNC=4N=CN=3)C(C)=CC=C2C=1NC1=CC=C(Cl)C=C1 KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000586 2-(4-morpholinyl)ethoxy group Chemical group [H]C([H])(O*)C([H])([H])N1C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WONYMNWUJVKVII-UHFFFAOYSA-N 3,5-diiodothyropropionic acid Chemical compound IC1=CC(CCC(=O)O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C=C1 WONYMNWUJVKVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODYAQBDIXCVKAE-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2-fluorophenyl)phenyl]-N-(4-hydroxyphenyl)butanamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CCCC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)F)C=C1 ODYAQBDIXCVKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVECMUKVOMUNLE-UHFFFAOYSA-N 5-(2-phenyl-3-pyrazolo[1,5-a]pyridinyl)-2H-pyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-amine Chemical compound C1=C2C(N)=NNC2=NN=C1C(=C1C=CC=CN1N=1)C=1C1=CC=CC=C1 XVECMUKVOMUNLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJRJTCMSQLEPFQ-UHFFFAOYSA-N 6-cat Chemical compound ClC1=CC=C2CC(N)CCC2=C1 CJRJTCMSQLEPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004939 6-pyridyl group Chemical group N1=CC=CC=C1* 0.000 description 1
- 108010052946 Activin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018918 Activin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100034111 Activin receptor type-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034134 Activin receptor type-1B Human genes 0.000 description 1
- 102100034135 Activin receptor type-1C Human genes 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 101150013907 BHLH gene Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400001242 Betacellulin Human genes 0.000 description 1
- 101800001382 Betacellulin Proteins 0.000 description 1
- 102100025423 Bone morphogenetic protein receptor type-1A Human genes 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 description 1
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 102000007345 Chromogranins Human genes 0.000 description 1
- 108010007718 Chromogranins Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023266 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710146529 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 229940125373 Gamma-Secretase Inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000058058 Glucose Transporter Type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 108010050777 Growth Differentiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000014015 Growth Differentiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 101150097704 HHEX gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035961 Hematopoietically-expressed homeobox protein HHEX Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108010087745 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000009094 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Human genes 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100031672 Homeobox protein CDX-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 1
- 101000799140 Homo sapiens Activin receptor type-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000799189 Homo sapiens Activin receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 101000799193 Homo sapiens Activin receptor type-1C Proteins 0.000 description 1
- 101000934638 Homo sapiens Bone morphogenetic protein receptor type-1A Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001021503 Homo sapiens Hematopoietically-expressed homeobox protein HHEX Proteins 0.000 description 1
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000777808 Homo sapiens Homeobox protein CDX-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 1
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 1
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000628949 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000950669 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000738523 Homo sapiens Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 1
- LUZOFMGZMUZSSK-UHFFFAOYSA-N Indolactam-V Natural products C1C(CO)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011845 Iodide peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026931 Mitogen-activated protein kinase 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100037809 Mitogen-activated protein kinase 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100490437 Mus musculus Acvrl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100381978 Mus musculus Braf gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011750 Mus musculus Hsp90b1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100191385 Mus musculus Prkdc gene Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XCTXJBRPLSVJIM-UHFFFAOYSA-N N-phenylpyrido[3,2-d]triazin-4-amine Chemical compound N=1N=NC2=CC=CN=C2C=1NC1=CC=CC=C1 XCTXJBRPLSVJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150111723 PDX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037878 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical class CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 108091006299 SLC2A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004783 Serene Substances 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 210000000677 aggregate cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 239000003715 calcium chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- PNZXMIKHJXIPEK-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1CCCCC1 PNZXMIKHJXIPEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- ASIYFCYUCMQNGK-JZGIKJSDSA-L disodium L-tyrosinate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C([O-])C=C1 ASIYFCYUCMQNGK-JZGIKJSDSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008246 gaseous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010842 high-capacity cDNA reverse transcription kit Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N insulin rabbit Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- KVQVEZQDNHMQJV-UHFFFAOYSA-N n-[(3-benzamidophenyl)carbamothioyl]-3,4,5-trimethoxybenzamide Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)NC(=S)NC=2C=C(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)C=CC=2)=C1 KVQVEZQDNHMQJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INVVXEKRUDMEBE-UHFFFAOYSA-N n-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1h-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1C=C(NC(=O)C2OC3=CC=CC=C3OC2)C(OCCN(C)C)=CC=1C=1C=NNC=1 INVVXEKRUDMEBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOVNFNXUCOWYSG-UHFFFAOYSA-N n-[3-[2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethylimidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxyphenyl]-4-(2-morpholin-4-ylethoxy)benzamide Chemical compound C1=C2N(CC)C(C=3C(=NON=3)N)=NC2=CN=C1OC(C=1)=CC=CC=1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1OCCN1CCOCC1 YOVNFNXUCOWYSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNYGWXSATBUBER-UHFFFAOYSA-N n-cyclohexyl-2-(3-fluoro-n-[2-(2-methylimidazol-1-yl)acetyl]anilino)-2-(2-methylphenyl)acetamide Chemical compound CC1=NC=CN1CC(=O)N(C=1C=C(F)C=CC=1)C(C=1C(=CC=CC=1)C)C(=O)NC1CCCCC1 FNYGWXSATBUBER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 210000003458 notochord Anatomy 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002747 omentum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 210000001811 primitive streak Anatomy 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N protopine Chemical compound C1=C2C(=O)CC3=CC=C4OCOC4=C3CN(C)CCC2=CC2=C1OCO2 GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070243 ptf1a gene Proteins 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 102000009929 raf Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010077182 raf Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000035802 rapid maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007261 regionalization Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N selenic acid Chemical compound O[Se](O)(=O)=O QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 101150117196 tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/507—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/395—Thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- User Interface Of Digital Computer (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, и клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников путём дифференцировки. Для осуществления способа клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, обрабатывают ингибитором ALK5, или гормоном щитовидной железы, выбранным из трийодотиронина, тироксина, аналогов трийодотиронина, аналогов тироксина или их смеси, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы. Далее клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал способов для получения функциональных эндокринных клеток и, в частности, функциональных бета-клеток. 22 з.п. ф-лы, 23 ил., 13 табл., 14 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка истребует приоритет, предоставляемый в связи с подачей Предварительной заявки на патент США № 61/747662, поданной 31 декабря 2012 года, которая в полном объеме содержится в настоящем документе в виде ссылки.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области дифференцировки клеток. Более детально, настоящее изобретение представляет способы, клеточные культуры и среду для получения панкреатиатических энтодермальных, панкреатических эндокринных клеток-предшественников и одногормонных панкреатических эндокринных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека путем культивирования клеток в воздушно-жидкой зоне взаимодействия.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса с возможностью трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или бета-клеток, подходящих для приживления трансплантата. Один подход представляет собой получение функциональных бета-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму), в ходе процесса, известного как гаструляция. Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточная стадия данного процесса представляет собой образование дефинитивной энтодермы.
К концу гаструляции энтодерма разделяется на передний и задний отделы, которые могут быть распознаны по экспрессии ряда факторов, однозначно выделяющих переднюю, среднюю и заднюю области энтодермы. Например, HHEX и SOX2 идентифицируют переднюю область, в то время как CDX1, 2 и 4 идентифицируют заднюю половину энтодермы.
Миграция ткани энтодермы приближает энтодерму к различным мезодермальным тканям, которые способствуют регионализации кишечной трубки. Это достигается за счет целого ряда секретируемых факторов, таких как FGFs, Wnts, TGF-Bs, ретиноевой кислоты (RA), лигандов BMP и их антагонистов. Например, FGF4 и BMP способствуют экспрессии CDX2 в предполагаемой энтодерме задней кишки и подавляют экспрессию передних генов Hhex и SOX2 (Development 2000 г., 127:1563–1567). Было продемонстрировано, что сигнализация WNT также действует параллельно с сигнализацией FGF, способствуя развитию задней кишки и препятствуя зачаткам передней кишки (Development 2007 г., 134:2207-2217). Наконец, ретиноевая кислота, секретируемая мезенхимой, регулирует границу между передней и задней кишкой (Curr Biol 2002 г., 12:1215-1220).
Уровень экспрессии специфических факторов транскрипции может использоваться для определения типа ткани. Во время преобразования дефинитивной энтодермы в примитивную кишечную трубку кишечная трубка становится разделенной на широкие домены, которые можно наблюдать на молекулярном уровне с помощью ограниченных паттернов экспрессии генов. Например, регионализованный отдел поджелудочной железы в кишечной трубке демонстрирует очень высокую экспрессию PDX1 и очень низкую экспрессию CDX2 и SOX2. PDX1, NKX6.1, PTF1A и NKX2.2 высоко экспрессируются тканью поджелудочной железы; а экспрессия CDX2 высока в кишечной ткани.
Образование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Дорсальный и вентральный домены поджелудочной железы формируются из эпителия передней кишки. Передняя кишка также дает начало формирования пищевода, трахеи, легких, щитовидной железы, желудка, печени, поджелудочной железы и системы желчных протоков.
Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют панкрео-дуоденальный, содержащий гомеобокс ген PDX1. В отсутствие PDX1 поджелудочная железа не развивается дальше образования вентрального и дорсального зачатков. Следовательно, экспрессия PDX1 является важным этапом органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит как экзокринную, так и эндокринную ткани, которые образуются при дифференцировании панкреатической энтодермы.
D'Amour et al. описывает производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005 г., 23:1534-1541; патент США № 7704738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцированию в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США № 7704738). Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, могут быть далее дифференцированы в PDX1-положительные клетки после добавления FGF10 и ретиноевой кислоты (заявка на патент США № 2005/0266554). Последующая трансплантация таких клеток-предшественников панкреатических клеток в жировое тело иммунодефицитных мышей привела к образованию функциональных панкреатических эндокринных клеток с последующей 3-4-месячной стадией созревания (патент США № 7993920 и патент США № 7534608).
Fisk et al. сообщают о системе получения клеток панкреатических островков из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США № 7033831). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Эмбриональные стволовые клетки человека сначала были дифференцированы в энтодерму при помощи комбинации бутирата натрия и активина A (патент США № 7326572). Затем клетки культивировали с антагонистами BMP, такими как Noggin, в комбинации с EGF или бета-целлюлином для генерирования PDX1-положительных клеток. Конечное дифференцирование индуцировали никотинамидом.
Низкомолекулярные ингибиторы также применяли для индуцирования клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток. Например, низкомолекулярные ингибиторы рецептора TGF-β и рецепторов ВМР (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) применялись для значительного увеличения количества эндокринных клеток поджелудочной железы. Кроме того, низкомолекулярные активаторы также применяли для генерирования клеток дефинитивной энтодермы или клеток-предшественников панкреатических клеток (Curr Opin Cell Biol 2009 г., 21:727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258-265).
НВ9 (также известный как HIXB9 и MNX1) является транскрипционным активаторным белком BHLH, экпрессируемым на ранней стадии развития поджелудочной железы, начинающейся приблизительно на 8 эмбриональный день. НВ9 также экспрессируется в нотохорде и спинном мозге. Экспрессия HB9 неравномерна и достигает пика примерно в день 10,5 в эпителии поджелудочной железы, будучи экспрессированной в клетках, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Примерно в день 12,5 экспрессия HB9 снижается и на поздних стадиях ограничивается только β клетками. В гомозиготах мышей с нулевой мутацией HIXB9, дорсальная доля поджелудочной железы не развивается (Nat Genet 23:67-70, 1999; Nat Genet 23:71-75, 1999). HB9-/- бета-клетки экспрессируют низкие уровни глюкозного транспортера, GLUT2 и NKX6.1. Далее, HB9 -/- поджелудочной железы демонстрирует значительное снижение в количестве инсулин-положительных клеток в то же время, не оказывая значительного влияния на экспрессию прочих гормонов поджелудочной железы. Таким образом, временной контроль HB9 чрезвычайно важен для нормального развития и функционирования бета-клетки. В то время как немного известно о факторах, регулирующих экспрессию HB9 в бета-клетках, недавнее исследование на данио предполагает, что ретиноевая кислота может положительно регулировать экспрессию HB9 (Development, 138, 4597-4608, 2011).
Гормоны щитовидной железы, тироксин («T4») и трииодотиронин («Т3»), являются гормонами, основанными на тирозине, которые производятся щитовидной железой и первоначально отвечают за регулирование метаболизма. Основной формой гормонов щитовидной железы в крови является Т4, обладающий более длительным периодом полужизни, чем Т3. Соотношение Т4 и Т3, выделяемых в кровь, составляет точно 20 к 1. Т4 конвертируется в более активный Т3 (в три-четыре раза более мощный, чем Т4) внутри клеток с помощью деиодиназы.
Т3 прикрепляется к рецепторам гормонов щитовидной железы, TRα1 и TRβ1 (TR). TR является ядерным рецептором гормонов, который гетеродимеризуется с ретиноидным Х рецептором. Димеры связываются с отвечающими элементами щитовидной железы (TREs) в отсутствии лиганда и действуют как транскрипционные репрессоры. Прикрепление Т3 к TR понижает репрессию TRE-зависимых генов и стимулирует экспрессию различных целевых генов. В то время как многочисленные исследования предполагали, что роль Т3 состоит в увеличении пролиферации бета-клеток, снижении апоптоза и улучшении секреции инсулина, его роль в дифференцировке клеток не определена.
Трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) относится к большому семейству плеотропных цитокинов, которые задействованы во многих биологических процессах, включая контроль роста, дифференцировку, миграцию, выживание клеток, фиброз и спецификацию процесса развития. Представители суперсемейства TGF-β передают сигнал посредством рецепторного комплекса, содержащего рецепторы типа I и типа II. Лиганды TGF-B (такие как активины и факторы дифференцировки роста(«GDF»)) связывают вместе рецептор типа II с рецептором типа I. Рецептор типа II фосфорилирует и активирует рецептор типа I в комплексе. Существует пять видов рецепторов типа II у млекопитающих: TβR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II, и AMHR-II и семь рецепторов типа I (ALKs 1–7). Активин и родственные ему лиганды сигнализируют через комбинации ActR-II или ActR-IIB и ALK4 или ALK5, и BMP сигнализируют через комбинации ALK2, ALK3, и ALK6 с ActR-II, ActR-IIB, или BMPR-II. AMH сигнализирует через комплекс AMHR-II с ALK6, и лимфоузел, как выяснилось недавно, сигнализирует через комплекс ActR-IIB и ALK7 (Cell. 2003,113(6):685-700). После закрепления лиганда TGF-B на соответствующем рецепторе испускаемые сигналы передаются в ядро, первоначально через активацию комплексов Smad-белков. При активации рецепторы типа I фосфолирируют представителей рецептор-регулируемого подсемейства Smad-белков. Это активирует их и дает возможность формировать комплексы с обычными медиаторами Smad, Smad4. Smad 1, 5, и 8 являются субстратами для ALK 1, 2, 3, и 6, в то время как Smad 2 и 3 являются субстратами для ALK 4, 5, и 7 (FASEB J 13:2105–2124). Активированные комплексы Smad аккумулируются в ядре, где они напрямую задействованы в транскрипции целевых генов, как правило, в ассоциации с другими специфическими ДНК-связывающими транскрипционными факторами. Составы, которые избирательно ингибируют рецепторы TGF-β, были разработаны для терапевтического применения и для изменения судьбы клетки в контексте репрограммирования и дифференцировки из различных популяций стволовых клеток. В частности, ингибиторы ALK5 ранее применялись для направления дифференцировки эмбриональных стволовых клеток к эндокринной судьбе (Diabetes, 2011, 60(1):239-47).
В целом, процесс дифференцировки прогениторных клеток в функциональные бета-клетки проходит через различные стадии; и протоколы получения панкреатических клеток из прогениторных клеток, таких как плюрипотентные стволовые клетки человека, были в значительной степени улучшены. Несмотря на эти продвижения в расследованиях, каждый шаг в процессе дифференцировки прогениторных клеток является уникальной задачей. Таким образом, сохраняется необходимость в протоколе, который бы привел к получению функциональных эндокринных клеток и, в частности, функциональных бета-клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1А-Н показаны фазовые контрастные образцы клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способа, описанного в Примере 1 на следующих временных точках: День 1 (Фиг. 1A); день 5 (Фиг. 1B); день 6 (Фиг. 1C); день 7(Фиг. 1D); день 9 (Фиг. 1E); день 13 (Фиг. 1F); день 16 (Фиг. 1G); и день 21 (Фиг. 1H).
На Фиг. 2А-К показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении одной недели в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для следующего: DAPI (Фиг. 2A); инсулин (Фиг. 2B); HB9 (Фиг. 2С), DAPI (Фиг. 2D); глюкагон (Фиг. 2E); инсулин (Фиг. 2F); DAPI (Фиг. 2G); инсулин (Фиг. 2H); соматостатин (Фиг. 2I); NKX6.1 (Фиг. 2J); инсулин (Фиг. 2K). Панели A-C, D-F, G-I и J-K были взяты из того же поля.
На Фиг. 3А-Н показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении двух недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для следующего: инсулин (Фиг. 3А); глюкагон (Фиг. 3В); инсулин (Фиг. 3С); соматостатин (Фиг. 3D); инсулин (Фиг. 3Е); NKX6.1 (Фиг. 3F); НВ9 (Фиг. 3G); и NKX6.1 (Фиг. 2Н). Панели А-В, С-D, E-F и G-H были взяты из того же поля.
На Фиг. 4А-D показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении трех недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для инсулина (Фиг. 4А); глюкагона (Фиг. 4В); инсулина (Фиг. 4С) и соматостатина (Фиг. 4D). Панели А-В и С-D были взяты из того же поля.
На Фиг. 5А–R представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 1: PDX1 (Фиг. 5A); NKX6.1 (Фиг. 5B); PAX4 (Фиг. 5C); PAX6 (Фиг. 5D), NGN3 (Фиг. 5E); NKX2.2 (Фиг. 5F); ABCC8 (Фиг. 5G); хромогранин-А (Фиг. 5H); PCSK1 (Фиг. 5I); IAPP (Фиг. 5J); инсулин (Фиг. 5K); глюкагон (Фиг. 5L); соматостатин (Фиг. 5М); грелин (Фиг. 5N); PTFIA (Фиг. 5О); ZIC1 (Фиг. 5Р); CDX2 (Фиг. 5Q) и SOX9 (Фиг. 5R). Клетки культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия после стадии 5.
На Фиг. 6А–L представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 2: PDX1 (Фиг. 6A); NKX6.1 (Фиг. 6B); PAX4 (Фиг. 6C); PAX6 (Фиг. 6D), NGN3 (Фиг. 6E); NKX2.2 (Фиг. 6F); ABCC8 (Фиг. 6G); хромогранин-А (Фиг. 6Н); PCSK1 (Фиг. 6I); IAPP (Фиг. 6J); инсулин (Фиг. 6) и глюкагон (Фиг. 6L).
На Фиг. 7А–L представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 3: PDX1 (Фиг. 7А); NKX6.1 (Фиг. 7В); PAX4 (Фиг. 7C); PAX6 (Фиг. 7D), NGN3 (Фиг. 7E); NKX2.2 (Фиг. 7F); ABCC8 (Фиг. 7G); хромогранин-А (Фиг. 7Н); PCSK1 (Фиг. 7I); IAPP (Фиг. 7J); инсулин (Фиг. 7K) и глюкагон (Фиг. 7L).
На Фиг. 8А–H представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 4: PDX1 (Фиг. 8A); NKX6.1 (Фиг. 8B); NGN3 (Фиг. 8C); ABCC8 (Фиг. 8D); PCSK1 (Фиг. 8E); грелин (Фиг. 8F); глюкагон (Фиг. 8G); и инсулин (Фиг. 8Н).
На Фиг. 9А–F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 4: PDX1 (Фиг. 9А); NKX6.1 (Фиг. 9B); NGN3 (Фиг. 9C); ABCC8 (Фиг. 9D); глюкагон (Фиг. 9E); и инсулин (Фиг. 9F).
На Фиг. 10А-В описаны результаты иммуноокрашивания клеток стадии 6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в соответствии с примером 4 и обработанных либо 1 микромолярным SD208 ингибитором (Фиг. 10А), либо 1 микромолярным ALK5 ингибитором II (Фиг. 10В) и окрашенным для хромогранина-А (пан-эндокринный маркер) и NKX6.1 (панкреатический прекурсорный маркер и специфический маркер бета-клеток).
На Фиг. 11А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, дифференцированных как описано в примере 6: ABCC8 (Фиг. 11A), глюкагон (Фиг. 11B), амилин (Фиг. 11C), инсулин (Фиг. 11D), NGN3 (Фиг. 11Е), NKX2.2 (Фиг. 11F), NKX6.1 (Фиг. 11G) и PDX1 (Фиг. 11H). Данные представлены как кратное возрастание по сравнению с недифференцированной линией Н1.
На Фиг. 12А–Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 7 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 12A), глюкагон (Фиг. 12B), амилин (Фиг. 12C), инсулин (Фиг. 12D), NGN3 (Фиг. 12Е), NKX2.2 (Фиг. 12F), NKX6.1 (Фиг. 12G) и PDX1 (Фиг. 12H).
На Фиг. 13А–Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 8 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 13A), глюкагон (Фиг. 13B), амилин (Фиг. 13C), инсулин (Фиг. 13D), NGN3 (Фиг. 13Е), NKX2.2 (Фиг. 13F), NKX6.1 (Фиг. 13G) и PDX1 (Фиг. 13H).
На Фиг. 14А–Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 9 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 14A), глюкагон (Фиг. 14B), амилин (Фиг. 14C), инсулин (Фиг. 14D), ISL-1 (Фиг. 14Е), MNX1 (Фиг. 14F), NKX6.1 (Фиг. 14G) и SLC30A8 (Фиг. 14H).
На Фиг. 15А-J показаны профили FACS клеток стадии 5 день 3, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для следующего: Изотипический контроль (Фиг. 15А); NKX6.1 (Фиг. 15В); NKX2.2 (Фиг. 15С); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 15D); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 15Е); PAX6 (Фиг. 15F); ISL-1 (Фиг. 15G); FOXA2 (Фиг. 15Н); NeuroD (Фиг. 15I) и глюкагон (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 15J).
На фиг. 16А-I показаны профили FACS клеток стадии 6 день 5, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для: Изотипический контроль (Фиг. 16А); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 16В); NKX2.2 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 16С); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 16D); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 16Е); PAX6 (Фиг. 16F); ISL-1 (Фиг. 16G); FOXA2 (Фиг. 16Н) и NeuroD (Фиг. 16I).
На Фиг. 17А-I показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 6 день 15, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для: Изотипический контроль (Фиг. 17А); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 17В); NKX2.2 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 17С); глюкагон (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 17D); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 17Е); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 17F); ISL-1 (Фиг. 17G); FOXA2 (Фиг. 17Н) и NeuroD (Фиг. 17I).
На Фиг. 18А-С показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 4 день 4, дифференцированных как описано в примере 1 и окрашенных для: NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 18А); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 18В); и NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 18С).
На Фиг. 19А-С показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 6 день 6, дифференцированных как описано в примере 11 и окрашенных для: NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 19А); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 19В); и NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 19С).
Фиг. 20 показывает кинетику производства человеческого С-пептида в условиях in vivo в NOD-SCID мыши, куда трансплантированы различные популяции клеток, как описано в примере 11.
На Фиг. 21А –F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 12: Амилин (Фиг. 21А); инсулин (Фиг. 21В), MAFA (Фиг. 21C), NKX6.1 (Фиг. 21D), PTF1a (Фиг. 21E) и SOX9 (Фиг. 21F).
На Фиг. 22А-D представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, дифференцированных, как описано в примере 13: MAFA (Фиг. 22А); инсулин (Фиг. 22В); Амилин (Фиг. 22С) и NKX6.1 (Фиг. 22D).
На Фиг. 23А–F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 5: PDX1 (Фиг. 23А); NKX6.1 (Фиг. 23B); NGN3 (Фиг. 23C); ABCC8 (Фиг. 23D); глюкагон (Фиг. 23E); и инсулин (Фиг. 23F).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения, будет более понятно при изучении вместе с приложенными рисунками. Рисунки предоставлены с целью иллюстрации определенных вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами. Для четкости описания, а не для ограничения настоящего изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Настоящее изобретение направлено на дифференцировку энтодермальных прогениторных клеток, таких как плюрипотентные стволовые клетки, в клетки, демонстрирующие характеристики панкреатических эндокринных клеток путем культивирования упомянутых прогениторных клеток, по меньшей мере частично, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которая существует в открытом культуральном сосуде или культуральном сосуде, частично заполненном субстратом. Хотя термин «воздух» применяется здесь для удобства, изобретение не ограничено смесью газов и составляющих, находящихся в нормальной окружающей среде. Изобретение детально рассматривает и включает газообразные смеси, обладающие составом, отличным от нормальной окружающей среды, включая, например, смеси, обогащенные определенным компонентом или в которых содержание определенного компонента понижено или исключено.
Дополнительно, настоящее изобретение представляет клеточные культуры для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, демонстрирующие характеристики панкреатических эндокринных клеток, так же, как и дифференцировочную среду, которая инициирует и упрощает подобную дифференцировку. Преимуществом является то, что эти клеточные культуры и дифференцировочная среда могут применяться в сочетании с дифференцировкой в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для обеспечения не полученных ранее урожаев клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
Культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия может производиться на всех стадиях, задействованных в дифференцировке от плюрипотентных стволовых клеток до панкреатических эндокринных клеток, или может включать культивирование планарной культуры, погруженной в субстрат на ранних стадиях дифференцировки, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время поздних стадий дифференцировки. В предпочтительном варианте процесс изобретения включает комбинацию культивирования плюрипотентных стволовых клеток на поддерживающей поверхности, погруженной в среду, на ранних стадиях, и затем культивирование в воздушно-жидкостной среде на поздних стадиях дифференцировки. В таких вариантах осуществления клетки могут быть первоначально посеяны на твердую поверхность для погруженного культивирования, а затем удалены с твердой поверхности и пересеяны на пористую поверхность для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Альтернативно, клетки могут быть изначально посеяны на пористую поддерживающую поверхность, которая затем погружается в субстрат, на ранних стадиях дифференцировки и затем перемещены в воздушно-жидкостную зону взаимодействия на поздних стадиях дифференцировки. Культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на поздних стадиях дифференцировки в значительной степени улучшает экспрессию эндокринных маркеров по сравнению с культивированием клеток в погруженном состоянии на протяжении всего процесса, указывая, что больший процент клеток был дифференцирован в панкреатические эндокринные клетки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на дифференцировку энтодермальных прогениторных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культурального сосуда, частично заполненного субстратом, в панкреатические энтодермальные клетки, положительные для NKX6.1, PDX1, и НВ9. Это изобретение частично основано на открытии того, что культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия значительно улучшает экспрессию эндокринных маркеров. Более того, было открыто, что панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут быть быстро получены в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, что приводит к получению предоминантных одногормонных инсулин-положительных клеток. Было обнаружено, что одноклеточный посев в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия улучшает консистенцию производства инсулина.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые как обладающие способностью на одноклеточном уровне к самообновлению и дифференциации. Стволовые клетки могут производить клетки-потомки, включая самообновляющиеся прогениторные клетки, необновляющиеся прогениторные клетки и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий дифференцирования из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и вносят значительный вклад в образование большинства, если не всех тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируются по потенциалу развития. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток.
Дифференцировка представляет собой процесс, посредством которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной клетки или мышечной клетки. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования относится к клетке, дошедшей в ходе процесса дифференцирования до стадии, с которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до конкретного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированной (или коммитированной) позиции в клеточной линии дифференцировки. Применяемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» означает наследственность клетки, т.е. из каких клеток произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркер, специфичный для линии дифференцирования, относится к характеристике, специфически ассоциированной с фенотипом клеток интересующей линии дифференцирования, и его можно использовать для оценки дифференцирования некоммитированной клетки в клетки интересующей линии дифференцирования.
В настоящем документе термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в исследуемых клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией понимают повышенный уровень положительного маркера и пониженный уровень отрицательного маркера по сравнению с недифференцированной клеткой. Обнаруживаемый уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества способов, известных в данной области.
В настоящем документе клетка «положительна по» заданному маркеру или «положительна», если заданный маркер явно обнаруживается в клетке. Аналогично клетка «отрицательна по» заданному маркеру или «отрицательна», если заданный маркер не обнаруживают в клетке. В частности, положительность по FACS, как правило, выше чем 2%, в то время как отрицательный предел по FACS, как правило, менее 1%. Положительность по ПЦР, как правило, менее 34 циклов (Cts): в то время как отрицательность по ПЦР, как правило, более 34,5 циклов.
В попытках воспроизвести дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в функциональные клетки энтодермы поджелудочной железы в статичных клеточных культурах в условиях in vitro, процесс дифференцировки часто рассматривается как прогрессирование через несколько последовательных стадий. В частности, процесс дифференцировки в целом рассматривается как прогрессирование через шесть стадий. В этой постадийной прогрессии «стадия 1» относится к первому шагу в процессе дифференцировки, дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 1»). «Стадия 2» относится ко второму шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 2»). «Стадия 3» относится к третьему шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 3»). «Стадия 4» относится к четвертому шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток-предшественников панкреатической передней кишки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 4»). «Стадия 5» относится к пятому шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток-предшественников панкреатической передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или панкреатических эндокринных клеток-предшественников (здесь и далее упоминаются как «панкреатические энтодермальные клетки/эндокринные клетки-предшественники» или альтернативно как «клетки стадии 5»). «Стадия 6» относится к дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или эндокринных панкреатических клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 6»).
Однако следует отметить, что не все клетки в отдельно взятой популяции прогрессируют через эти стадии с одинаковой скоростью. Вследствие этого, в клеточных культурах в условиях in vitro нередко обнаруживается присутствие клеток, которые прогрессировали менее или более по пути дифференцировки, чем большинство клеток, присутствующих в популяции, в особенности на поздних стадиях дифференцировки. Например, нередко наблюдается появление маркеров, характерных для панкреатических энтодермальных клеток, во время стадии 5 культивирования клеток. Для иллюстративных нужд настоящего изобретения характеристики различных типов клеток ассоциированы с определенными выше стадиями, как описано в настоящем документе.
«Клетки дефинитивной энтодермы», как используется в настоящем документе, относится к клеткам, которые несут в себе характеристики клеток, появившиеся из эпибласта во время гаструляции, и которые формируют желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: FOXA2 (также известный как гепатоцитный ядерный фактор 3-β (HNF3β)), GATA4, SOX17, CXCR4, брахиурия, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, и MIXL1. Маркерные характеристики клеток дефинитивной энтодермы включают CXCR4, FOXA2 и SOX17. Таким образом, клетки дефинитивной энтодермы могут быть охарактеризованы их экспрессией CXCR4, FOXA2 и SOX17. Дополнительно, в зависимости от длительности времени, на протяжении которого клеткам позволяется оставаться на стадии 1, можно наблюдать рост в HNF4α.
«Клетки кишечной трубки», как используется в данном документе, относится к клеткам, произошедшим от дефинитивной энтодермы, которые могут дать начало всем энтодермальным органам, таким как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник. Клетки кишечной трубки могут быть охарактеризованы их постоянно растущей экспрессией HNF4α, выше, чем экспрессия клеток дефинитивной энтодермы. Например, рост экспрессии HNF4α в мРНК в десять-сорок раз можно наблюдать на стадии 2.
«Энтодерма передней кишки», как используется в данном документе, относится к клеткам энтодермы, которые дают начало пищеводу, легким, желудку, печени, поджелудочной железе, желчному пузырю и части двенадцатиперстной кишки. Клетки энтодермы передней кишки экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4α. Клетки энтодермы передней кишки могут быть охарактеризованы ростом экспресии PDX1 по сравнению с клетками кишечной трубки. Например, более пятидесяти процентов клеток в культурах стадии 3 типично экспрессируют PDX1.
«Клетка-предшественник панкреатической передней кишки», как используется в данном документе, относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, гастрин, FOXA2, PTF1a, PROX1 и HNF4α. Клетки-предшественники панкреатической передней кишки поджелудочной железы можно охарактеризовать как положительные по отношению к экспрессии PDX1, NKX6.1 и SOX9.
Используемый в настоящей заявке термин, «панкреатическая энтодермальная клетка» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 β, PTF1 α, HNF6, HNF4 α, SOX9, NGN3; гастрин; HB9, или PROX1. Панкреатические энтодермальные клетки могут характеризоваться отсутствием у них значительной экспрессии CDX2 или SOX2.
«Панкреатическая эндокринная клетка-предшественник», как используется в настоящем документе, относится к клеткам энтодермы поджелудочной железы, обладающим возможностью стать клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD1, ISL1, PAX4, PAX6 или ARX. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут быть охарактеризованы их экспрессией NKX2.2 и NeuroD1.
Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая эндокринная клетка» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид. В дополнение к этим гормонам, маркерные характеристики панкреатических эндокринных клеток включают один или несколько из NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, и PAX6. Панкреатические эндокринные клетки, экспрессирующие маркеры бета-клеток, могут характеризоваться их экспрессией инсулина и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, MAFA и PAX6.
В настоящем документе используются попеременно «д1», «1д», и «день1», «д2», «2д», и «день 2» и так далее. Эти комбинации цифр и букв относятся к конкретному дню инкубации на различных стадиях в процессе поэтапного протокола дифференцировки настоящей заявки.
В настоящем документе термин «глюкоза» применяют относительно декстрозы, сахару, обычно встречающемуся в природе.
В настоящем документе термин «NeuroD1» применяют для обозначения белка, экспрессируемого в прогениторных клетках панкреатических эндокринных клеток, и гена, кодирующего его.
«LDN-193189» относится к ((6-(4-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенил)-3-(пиридин-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин, гидрохлорид; DM-3189)), ингибитору рецептора BMP, доступному по торговой маркой STEMOLECULETM от Stemgent, Inc., Cambridge, MA, USA.
Характеристики, источник, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
А. Характеристики плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать одно или несколько определенных TRA-1-60 и TRA-1-81 антител (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии TRA-1-60 и TRA-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочнофосфатазную активность, которую можно обнаружить путем обработки клеток 4%-м раствором параформальдегида, а затем выращивая с щелочнофосфатазным набором субстратов, который продается под торговой маркой VECTOR® Red, как описано производителем (Vector Laboratories, штат Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток можно подтвердить, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их последующего гистологического исследования на наличие клеточных типов, происходящих от этих трех зародышевых листков. Плюрипотентность можно альтернативно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа эмбриоидных телец на наличие маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с использованием стандартного способа G-бэндинга и сравнить с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все хромосомы человека присутствуют и не имеют видимых изменений.
В. Источники плюрипотентных стволовых клеток
Примерные типы плюрипотентных стволовых клеток, которые можно применять, включают в себя устойчивые линии плюрипотентных клеток, в том числе преэмбриональной ткани (такой как, например, бластоцист), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно перед сроком приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Не имеющими ограничительного характера примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека, такие как, например, эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 (WiCell Research Institute, Мэдисон, штат Висконсин, США). Клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток, также пригодны для использования. Индуцибельные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, полученные из взрослых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов, относящихся к плюрипотентным транскрипционным факторам, таким как OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011 г., 12:165–185, см. также IPS, Cell, 126(4): 663-676) также могут использоваться. Эмбриональные стволовые клетки человека, применяемые в способах настоящего изобретения, также могут быть подготовлены, как описано Thomson и др. (патент США № 5,843,780; Science, 1998 г.; 282:1145–1147; Curr Top Dev Biol, 1998 г.; 38:133–165; Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:7844-7848). Мутантные линии эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, Athens, Ga.), или клетки, полученные из зрелых соматических клеток человека, такие как клетки, описанные в Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007) также могут применяться. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки, пригодные для применения в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью способов, описанных в: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872 (2007), и в заявке на патент США № 2011/0104805. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные клетки могут иметь не-эмбриональное происхождение. Все эти ссылки, патенты и приложения к патентам включены в настоящий документ способом ссылок во всей их полноте, в частности, поскольку они относятся к выделению, культуре, размножению и дифференцировке плюрипотентных клеток.
С. Размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируются на слое питающих клеток, которые оказывают разностороннюю поддержку плюрипотентным клеткам. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но тем не менее поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцировки часто поддерживают путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. Альтернативно, рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживают путем использования среды с определенным химическим составом.
Плюрипотентные клетки можно легко размножить в культуре путем использования различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых матриксными белками. Альтернативно, химически определенные поверхности в сочетании с определенными средами, такими как среды, которые продаются под торговыми марками mTESR®1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), могут использоваться для обычного размножения клеток. Плюрипотентные клетки можно легко удалить из культуральных планшетов посредством ферментативного расщепления, механического разделения или с применением различных кальцийхелатирующих агентов, таких как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Альтернативно, плюрипотентные клетки можно размножить в суспензии в отсутствие каких-либо матриксных белков или питательного слоя.
Множество различных способов размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток могут применяться в описываемом изобретении. Например, способы изобретения могут использовать способы Reubinoff et al., Thompson et al., Richard et al. и заявки на патент США № 2002/0072117. Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 282: 1145-1147 (1998) описывают культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов. Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценивает панель из одиннадцати слоев различных человеческих взрослых, эмбриональных и неонатальных питающих клеток по их способности поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека, замечая, что линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных на питательных фибробластах взрослой кожи достигают морфологии эмбриональных стволовых клеток человека и остаются плюрипотентными. заявке на патент США № 2002/0072117 описаны линии клеток, продуцирующие среду, которая поддерживает рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток культуре. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимальные и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США № 2002/072117 также описано использование клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
Прочие пригодные способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, к примеру, в Wang et al., Stojkovic et al., Miyamoto et al. и Amit et al. Wang et al. (Stem Cells 23: 1221–1227, 2005 г.), описаны способы длительного выращивания плюрипотентных стволовых клеток человека на слоях питающих клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека. Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306–314, 2005 г.), описана система питающих клеток, полученная в результате спонтанного дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека. Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433–440, 2004 г.), описан источник питающих клеток из плаценты человека. Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150–2156, 2003 г.) описывает слой питающих клеток, полученных из крайней плоти человека.
Другие подходящие способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, к примеру, в Inzunza et al., патенте США No. 6642048, WO 2005/014799, Xu et al. и заявке на патент США № 2007/0010011. Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544–549, 2005 г.), описывает слой питающих клеток, полученных из фибробластов постнатальной крайней плоти человека. В патенте США № 6642048 описана среда, поддерживающая рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток среде, а также клеточные линии, которые можно использовать для производства такой среды. Патент США № 6642048 сообщает о мезенхимальных и фибробластоподобных клеточных линиях, полученных из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток; так же как и способах получения таких клеточных линий, обработки среди и выращивания стволовых клеток с применением подобной среды. В международной заявке WO 2005/014799 описана кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцирования клеток млекопитающих. В заявке на патент WO 2005/014799 сообщает, что культуральная среда, изготовленная в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется при помощи секреторной активности клеток мыши, в частности, активности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов, именуемых MMH (Met Murine Hepatocyte). Xu et al. (Stem Cells 22: 972–980, 2004 г.), описана кондиционированная среда, полученная из производных эмбриональных стволовых клеток человека, генетически модифицированных для сверхэкспрессии обратной транскриптазы теломеразы человека. В заявке на патент США № 2007/0010011 описана культуральная среда с определенным химическим составом для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используют бессывороточную среду, обогащенную факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Примеры подобных культуральных систем включают, без ограничения, Cheon et al., Levenstein et al. и патентом США № 2005/0148070. Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описана не содержащая питающих клеток и сыворотки культуральная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток. Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568–574, 2006 г.), описаны способы длительного культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF). В заявке на патент США № 2005/0148070, описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих клеток-фибробластов, где данный способ включает: культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, культуральную среду, в основном, не включающую эмбриональную сыворотку млекопитающих и содержащую по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, при этом фактор роста фибробластов происходит из источника, иного, чем просто слой питающих клеток-фибробластов, среду, поддерживающую пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без слоя питающих клеток или кондиционированной среды.
Другие пригодные способы культивирования и размножения плюрипотентных стволовых клеток описаны в заявке на патент США № 2005/0233446, патенте США № 6800480, заявке на патент США № 2005/0244962 и WO 2005/065354. В заявке на патент США № 2005/0233446, описана среда с определенным составом, которую можно использовать при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. Среда в растворе по существу является изотонической по сравнению с культивируемыми стволовыми клетками. В данной культуре конкретная среда содержит основную среду и количество каждого из bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, необходимое для поддержки по существу недифференцированного роста зародышевых стволовых клеток. В патенте США № 6800480, отмечено, что культуральная среда для выращивания зародышевых стволовых клеток приматов по существу в недифференцированном состоянии, включающая в себя основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. В описании в патенте 6800480 далее сообщается, что основную среду объединяют с питательной сывороткой, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбранным из группы, состоящей из питающих клеток и компонента внеклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Эта среда дополнительно включает в себя аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов и соли пировиноградной кислоты. В заявке на патент США № 2005/0244962 сообщает, что один из аспектов раскрытия представляет способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов и что стволовые клетки в культивируют в культуре, по существу не содержащей эмбриональную сыворотку млекопитающих (предпочтительно также по существу не содержащей сыворотку любого животного) и при наличии фактора роста фибробластов, полученного из источника, отличного от просто питающего слоя фибробластов.
Международная заявка WO 2005/065354 раскрывает определенную, изотоническую культуральную среду, которая по существу не содержит питающих клеток и сыворотки, и содержит: базальную среду; bFGF; инсулин; и аскорбиновую кислоту в количествах, достаточных для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих. Подробнее, в международной заявке № WO2005/086845, описан способ поддержания недифференцированной стволовой клетки, причем указанный способ включает воздействие на стволовую клетку представителем семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), представителем семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клетки в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения необходимого результата.
Плюрипотентные стволовые клетки можно высевать на соответствующий культуральный субстрат. В одном варианте осуществления соответствующий культуральный субстрат представляет собой компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с адгезивными молекулами. Подходящим культуральным субстратом является восстановленная базальная мембрана, которая продается под торговой маркой MATRIGEL™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). МАТРИГЕЛЬ™ представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы допустимо использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток данные компоненты могут включать в себя по отдельности или в различных комбинациях ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п.
Плюрипотентные стволовые клетки можно высевать на субстрат с соответствующим распределением и при наличии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение желательных характеристик клеток. Все данные характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению при посеве и могут быть без труда определены специалистом в данной области. Подходящая культуральная среда может быть создана из следующих компонентов: модифицированная среда Дюльбекко по способу Игла (DMEM), которая продается под торговой маркой GibcoTM (часть № 11965-092) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; модифицированная среда Дюльбекко по способу Игла нокаут (KO DMEM), которая продается под торговой маркой GibcoTM (часть № 10829-018) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; базальная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глютамин, который продается под торговой маркой GibcoTM (часть № 15039-027) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; непервостепенный раствор аминокислоты, который продается под торговой маркой GibcoTM (часть № 11140-050) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; бета-меркаптоэтанол (часть № М7522), которые продает компания Sigma-Aldrich, Company, LLC, Saint Louis, MO; и фактор роста человеческого рекомбинантного базисного фибробласта (bFGF), которые продается под торговой маркой GibcoTM (часть № 13256- 029) компании Life Technologies Corporation, Grand Island, NY.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток
По мере того как плюрипотентные клетки дифференцируются в бета-клетки, они дифференцируются через различные стадии, каждая из которых может быть охарактеризована присутствием или отсутствием определенных маркеров. Дифференцировка клеток на этих стадиях достигается путем создания специфических условий культивирования, в том числе присутствие или отсутствие определенных факторов, добавленных в культуральную среду. В целом, эта дифференцировка может задействовать дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в дефинитивные клетки энтодермы. Эти дефинитивные клетки энтодермы могут быть затем дифференцированы в клетки кишечной трубки, которые в свою очередь могут затем быть дифференцированы в клетки энтодермы передней кишки. Клетки энтодермы передней кишки могут быть дифференцированы в клетки-предшественники передней кишки поджелудочной железы, которые, в свою очередь, дифференцируются в клетки энтодермы поджелудочной железы, панкреатические эндокринные клетки-предшественники или и те, и другие. Эти клетки могут быть затем дифференцированы в клетки, продуцирующие гормоны поджелудочной железы (такие как бета-клетки). Это изобретение представляет разбитую на стадии дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки путем культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, существующей внутри культуральных сосудов, частично заполненных субстратом, особенно культивирование клеток стадий 4-6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеток поджелудочной железы
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или более из следующих маркеров: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81.
Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают линию эмбриональных стволовых клеток человека H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07), а также эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также подходящими для применения являются клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 иTRA-1-81.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В альтернативном варианте осуществления клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В альтернативном варианте осуществления клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляют собой клетки панкреатической энтодермы, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 значительно превышает экспрессию CDX2 и SOX2. В некоторых вариантах осуществления более тридцати процентов клеток экспрессируют PDX1 и NKX6.1 и менее тридцати процентов клеток экспрессируют CDX2 или SOX2, согласно измерениям FACS. Особенно пригодными являются клетки, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 по меньшей мере в два раза превышает экспрессию CDX2 или SOX2.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической эндокринной железы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин, или панкреатический полипептид. В предпочтительном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка являются бета-клеткой, производящей инсулин.
В определенных вариантах осуществления для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, применяется протокол, согласно которому процесс начинается с плюрипотентных стволовых клеток или индуцибельных плюрипотентных клеток, предпочтительно плюрипотентных стволовых клеток. Данный протокол включает следующие стадии:
Стадия 1: Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, полученные из культуры клеточных линий, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток.
Стадия 2: Клетки, полученные на стадии 1, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки.
Стадия 3: Клетки, полученные на стадии 2, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки.
Стадия 4: Клетки, полученные на стадии 3, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки. Клетки не в обязательном порядке культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в конце стадии 4.
Стадия 5: Клетки, полученные на стадии 4, обрабатываются соответствующими факторами и культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников.
Стадия 6: Клетки, полученные на стадии 5, обрабатываются соответствующими факторами и культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
В то время как настоящее изобретение, в определенных вариантах осуществления, включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток (например, клеток, предшествующих стадии 1) в клетки стадии 6, изобретение также включает дифференцировку клеток, являющуюся результатом других промежуточных стадий, ведущую к стадии 6. В частности, изобретение включает дифференцировку клеток стадии 4-6. Более того, хотя процесс описан в отдельных стадиях, обработка, так же как и прогресс клеток через процесс дифференцировки, может быть как последовательным, так и непрерывным.
Стадия 1: Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы
Плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или любого способа, предложенного в настоящем изобретении. Способы, пригодные для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, обнародованы в: заявке на патент США № 2007/0254359; заявке на патент США № 2009/0170198; заявке на патент США № 2009/0170198; заявке на патент США № 2011/0091971; заявке на патент США № 2010/0015711; заявке на патент США № 2010/0015711; заявке на патент США № 2012/0190111; заявке на патент США № 2012/0190112; заявке на патент США № 2012/0196365; заявке на патент США № 20100015711; заявке на патент США № 2012/0190111; заявке на патент США № 2012/0190112; заявке на патент США № 2012/0196365; заявке на патент США № 20100015711; заявке на патент США № 2012/0190111; заявке на патент США № 2012/0190112; заявке на патент США № 2012/0196365; предварительной заявке на патент США № 61/076900; предварительной заявке на патент США № 61/076908 и предварительной заявке на патент США № 61/076915, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к плюрипотентным стволовым клеткам и дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки обрабатываются средой, обогащенной активином А и WNT3A для получения поколения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Обработка может задействовать контакт плюрипотентных стволовых клеток средой, содержащей от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл, альтернативно от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл, альтернативно около 100 нг/мл активина А. Обработка также может включать контакт клеток с от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл, альтернативно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 30 нг/мл, альтернативно приблизительно 20 нг/мл WNT3A. Плюрипотентные клетки могут культивировать на протяжении приблизительно двух-пяти дней, предпочтительно около трех дней, для обеспечения удобства их дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. В одном из вариантов осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии активина А и WNT3A на протяжении одного дня, после чего культивирование продолжается в присутствии активина А (без присутствия WNT3A).
В другом варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки обрабатывают средой, обогащенной дифференцированным фактором роста 8 («GDF8») и ингибитором гликоген синтазы киназы-3 β («GSK3β») (таким как циклические анилино-пиридинотриазиновые композиции, раскрытые в заявке на патент США № 2010/0015711, полностью включенной в данный документ путем ссылки) для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Предпочтительным ингибитором GSK3β является 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он, далее именуемый «Композиция MCX». Обработка может включать контакт плюрипотентных стволовых клеток со средой, обогащенной от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл, альтернативно от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл, альтернативно приблизительно 100 нг/мл GDF8. Обработка может также включать контакт клеток с от приблизительно 0,1 до 5 мкМ, альтернативно от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5 мкМ, предпочтительно примерно 1 мкМ композиции МСХ. Плюрипотентные клетки могут культивировать на протяжении приблизительно двух-пяти дней, предпочтительно приблизительно два-три дня, для обеспечения удобства их дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии GDF8 и композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и более низкой концентрации композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 на протяжении одного дня в отсутствии композиции МСХ. В частности, клетки могут культивироваться в присутствии GDF8 и приблизительно 1мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и примерно 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 на протяжении одного дня в отсутствии композиции МСХ. В альтернативном варианте осуществления клетки могут культивироваться в присутствии GDF8 и приблизительно 1мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и примерно 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, можно определить путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют данных маркеров. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток может быть обнаружена, когда клетки начинают экспрессировать маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Способы оценки экспрессии белковых маркеров и маркеров нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Эти способы включают в себя количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизацию in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ред. 2001 г., дополнение)), а также иммунологические анализы (такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, — способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998 г.)).
Дополнительно, эффективность дифференцирования можно определить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток веществом (таким как антитело), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный интересующими дифференцированными клетками.
Дифференцированные клетки в дальнейшем также могут быть очищены. Например, после обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов настоящего изобретения дифференцированные клетки можно очистить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток веществом (таким как антитело), специфически распознающим белковый маркер, характерно экспрессируемый очищенными дифференцированными клетками.
Стадия 2: Дифференцирование клеток экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной эндодермы, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки. В одном из вариантов осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы со средой, содержащей фактор роста фибробластов («FGF»)7 или FGF10 для дифференцировки этих клеток. Например, культуральная среда может включать от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 75 нг/мл, альтернативно от приблизительно 30нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, альтернативно приблизительно 50 нг/мл FGF7 или FGF10, предпочтительно FGF7. Клетки можно культивировать при этих условиях на протяжении двух-трех дней, предпочтительно примерно два дня.
В другом варианте осуществления дифференцировка в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, с FGF7 или FGF10 и аскорбиновой кислотой (витамином С). Культуральная среда может содержать от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 0,4 мМ, альтернативно приблизительно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. Культуральная среда также может включать от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 35 нг/мл, альтернативно от приблизительно 15нг/мл до приблизительно 30 нг/мл, альтернативно приблизительно 25 нг/мл FGF7 или FGF10, предпочтительно FGF7. Например, культуральная среда может содержать приблизительно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и приблизительно 25 нг/мл FGF7. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 1 обрабатываются FGF7 и аскорбиновой кислотой на протяжении 2 дней.
Стадия 3: Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки. В одном из вариантов осуществления, клетки стадии 2 далее дифференцируются в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, обогащенной сглаженным ингибитором рецепторов («SMO») (таким «MRT10» (N-[[[3-бензойламино)фенил]амино]тиоксометил]-3,4,5-триметоксибензамид)) или Sonic Hedgehog («SHH») антагонистом, сигнализирующим о траектории (таким как сглаженный антагонист 1 («SANT-1») ((Е)-4-бензил-N-((3,5-диметил-l-фенил-lH-пиразол-4-ил)метилен-пиперазин-l-амин)), Hedgehog ингибитор траектории 1 («HPI-l) (2-метоксиэтил 1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-(3-гидроксифенил)-7-(2-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-3-хинолдинкарбоксилат), ретиноевой кислотой и Noggin. Альтернативно, клетки стадии 2 могут быть дифференцированы в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, дополненной SMO ингибитором рецептора, SHH, сигнализирующим о траектории антагонистом, ретиноевой кислотой и Noggin. Клетки можно культивировать на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно примерно два дня. В одном из вариантов осуществления среда обогащена от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,3 мкМ SANT-1, от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 3 мкМ ретиноевой кислоты и от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл Noggin. В другом варианте осуществления среда обогащена приблизительно 0,25 мкМ SANT-1, приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты и приблизительно 100 нг/мл Noggin.
В альтернативном варианте осуществления, клетки стадии 2 далее дифференцируются в клетки стадии 3 путем обработки клеток стадии 2 средой, обогащенной FGF7 или FGF10, ретиноевой кислотой, ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин), или антагонистом, сигнализирующим о траектории, SHH (таким как SANT-1 или HPI-1), активатором протеинкиназы С («РКС») (таким как ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторометил)фенил)-2,4-пентадиенойламино)бензолактам) («ТРВ»); EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ), форбол-12,13-дибутират («PDBu»), форбол-12-миристат-13-ацетат («PMA») или индолактам V («ILV»), ингибитором морфогенического белка кости («BMP») (таким как LDN-193189, Noggin или Chordin) и аскорбиновой кислотой. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена FGF7 или FGF10, ретиноевой кислотой, ингибитором SMO, SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории (таким как SANT-1), активатором РКС (таким как ТРВ), ингибитором ВМР (таким как LDN-193189), и аскорбиновой кислотой. Клетки могут культивироваться в присутствии этих факторов роста, низкомолекулярных антагонистов и антагонистов на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно около двух-трех дней.
В одном из вариантов осуществления среда обогащена от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 35 нг/мл FGF7, от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты, от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,4 мкМ SANT-1, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 300 нМ ТРВ, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 200 нМ LDN-193189 и от приблизительно 0,15 мкМ до приблизительно 0,35 мкМ аскорбиновой кислоты. В другом варианте осуществления среда обогащена приблизительно 25 нг/мл FGF7, приблизительно 1 мкМ ретиноевой кислоты, приблизительно 0,25 мкМ SANT-1, приблизительно 200 нМ ТРВ, приблизительно 100 нМ LDN-193189 и приблизительно 0,25 мкМ аскорбиновой кислоты.
Получение клеток стадии 4-6 путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Хотя настоящее изобретение рассматривает культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на всех стадиях пути от плюрипотентной клетки до панкреатической эндокринной клетки, изобретение предпочтительно представляет формирование клеток стадии 1-3 в погруженной культуре, и клеток стадии 4-6 путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет пошаговый способ дифференцировки плюрипотентных клеток, включающий культивирование во время стадий 4-6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В определенных вариантах осуществления клетки могут культивироваться в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на всем протяжении стадий 4-6. В других вариантах осуществления, только на поздней стадии 4 по стадию 6, или только стадии 5-6, или только стадии 4-5, или только стадии 4-6 включают культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Когда клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия (воздушно-жидкостной зоне взаимодействия), клетки могут культивироваться на пористом субстрате, так что клетки находятся в контакте с воздухом сверху и с культуральной средой внизу. Например, достаточный объем среды может быть добавлен снизу культурального сосуда, содержащего пористый субстрат (например, вкладыш фильтра), так что среда контактирует с нижней поверхностью клеток, расположенных на субстрате, но не инкапсулирует и не покрывает их. Подходящие пористые субстраты могут быть сформированы из любого материала, который не окажет отрицательного влияния на рост и дифференцировку клеток. Примеры пористых субстратов изготовлены из полимеров, таких как полиэтилен терефталат (РЕТ), полиэфир или поликарбонат. Подходящие пористые субстраты могут обладать или не обладать покрытием. В одном из вариантов осуществления пористый субстрат может быть покрыт MATRIGELтм. В одном из вариантов осуществления изобретения пористым субстратом является пористый вкладыш фильтра, который может быть покрыт MATRIGELтм. Предпочтительно, однако, чтобы пористым субстратом являлся вкладыш фильтра без покрытия. Пористость субстрата должна быть достаточной для поддержания жизнеспособности клетки и стимуляции дифференцировки клеток. Подходящие субстраты включают фильтрующие вкладыши, обладающие размером пор от около 0,3 до около 3,0 мкм, от около 0,3 до около 2,0 мкм, от около 0,3 до около 1,0 мкм, от около 0,3 до около 0,8 мкм, от около 0,3 до около 0,6 мкм, от около 0,3 до около 0,5 мкм, от около 0,5 до около 3,0 мкм, от около 0,6 до около 3,0 мкм, от около 0,8 до около 3,0 мкм, от около 1,0 до около 3,0 мкм, от около 2,0 мкм до 3,0 мкм, предпочтительно около 0,4 мкм, и плотностью пор от около 50 до около 120 миллионов пор/см2, от около 60 до около 110 миллионов пор/см2, от около 70 до около 100 миллионов пор/см2, предпочтительно от 80 до 100 миллионов пор/см2, от около 90 до около 100 миллионов пор/см2, более предпочтительно около 100 миллионов пор/см2
Среду следует заменять или освежать ежедневно или через день. Клетки, выросшие на верхней части пористого субстрата, как правило, не являются одиночными клетками, скорее они формируют лист или существуют в агрегатном кластере клеток. Клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, могут испытывать значительно большее воздействие кислорода по сравнению с клетками, погруженными в среду.
Настоящее изобретение таким образом включает получение клеток стадий 4-6, предпочтительно клеток стадий 5-6, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетки стадии 4 могут быть культивированы полностью в планарных культурах, полностью в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, или клетки могут культивироваться в погруженной планарной культуре во время ранней части стадии 4, а затем культивироваться в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время поздней части стадии 4. Эти клетки могут быть получены путем дифференцировки плюрипотентных столовых клеток или путем дальнейшей дифференцировки клеток стадий 3, 4 или 5, полученный иными путями.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, предпочтительно бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных/бета-клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, предпочтительно бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Способ может включать обработку средой, обогащенной трииодотиронином (Т3), тироксином (Т4), аналогов Т3 или Т4 или их сочетаний (общее название здесь и далее «Т3/Т4», или ингибитором активина рецептороподобной киназы («ALK») 5, или одновременно Т3/Т4 и ингибитором ALK5. Пригодные для применения аналоги гормонов щитовидной железы могут включать: GC-1 (Собертиром), доступный от R & D Systems, Inc. кат. № 4554; DITPA (3,5-дииодотиропропионовоая кислота); КВ-141, обсуждаемый в J. Steroid Biochem. Мол. Biol. 2008, 111; 262-267 и Proc. Natl. Acad. Sci. США 2003, 100: 10067-10072; MB07344, обсужденный в Proc. Natl. Acad. Sci. США 2007, 104: 15490-15495; T0681, обсужденный в PLoS One, 2010, 5e8722 и J. Lipid Res. 2009, 50; 938-944; и GC-24, обсужденный в PLoS One, 2010, e8722 и Endocr. Pract. 2012; 18(6): 954-964, содержание которого полностью включено в настоящий документ. Пригодные ALK5 ингибиторы включают: ALK5 ингибитор II (Enzo, Farmingdale, NY); ALK5i (Axxora, San Diego, CA); SD208 (R & D systems (MN)); TGF-B ингибитор SB431542 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); ITD-1 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2109761 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); A83-01 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2157299 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); TGF-β рецептор ингибитор V (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор I (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор IV (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VIII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор II (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VI (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор III (EMD Chemicals, Gibstown, NJ). Способ может включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, и культивированием в планарной культуре. Способ может также включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или обоими, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В одном из вариантов осуществления способ включает обработку средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления способ включает обработку клеток стадии 3 средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5. Способ также может включать обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5.
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ формирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для бета-клеток, включая дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии β-клеток, экспрессирует инсулин и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, 1SL1, HNF3β, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном из вариантов осуществления способы изобретения приводят к формированию клеток, которые положительны для NKX6.1, PDX1 и НВ9. Соответственно, изобретение представляет способ индуцирования экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в человеческих клетках путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в условиях, достаточных для индуцирования такой экспрессии. Изобретение также представляет способ индуцирования экспрессии PDX1, NKX6.1 и NGN3 в человеческих клетках путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Способ может включать обработку средой, обогащенной Т3, ALK5, или обоими. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, среда может быть обогащена Т3, в то время как в другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена как T3, так и ингибитором ALK5. Клетки стадии 6 могут быть клетками, положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9. В других вариантах осуществления клетки стадии 6 являются положительными для одного гормона. Например, клетки стадии 6 могут быть клетками, которые (а) соэкспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А или (b) соэкспрессируют NKX6.1 и инсулин.
Культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия включает посев клеток на пористый субстрат, такой как пористый вкладыш фильтра. В определенных вариантах осуществления размер пор в субстрате может быть от примерно 0,4 до примерно 3 микрон, или любого другого размера, упомянутого в настоящем документе. Посев может быть выполнен путем выделения отдельных клеток или кластеров клеток из однослойных культур в суспензию и затем аликвотирования клеточной суспензии на пористый субстрат, помещенный в воздушно-жидкостную зону взаимодействия. Клетки могут быть посеяны на пористый субстрат из суспензии, содержащей от около 1000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 90,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 80,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 70,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 60,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 50,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 40,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 30,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 20,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 10,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 5000 клеток/мкл, от около 5000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 10,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 20,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 30,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 40,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 50,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 60,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 20,000 клеток/мкл до около 80,000 клеток/мкл, от около 30,000 клеток/мкл до около 70,000 клеток/мкл, от около 40,000 клеток/мкл до около 60,000 клеток/мкл, предпочтительно около 50,000 клеток/мкл. Клетки могут быть посеяны в виде капель клеточной суспензии, содержащих отдельные клетки или скопления клеток. Полученный клеточный депозит может содержать от около 5×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 6×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 7×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 8×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 9×106 до около 5×107 клеток/см2, от около 1×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 2×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 2×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 3×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 3×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 4×107 до около 5×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 4×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 3×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 2×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 1×107 клеток/см2, от около 5×106 до около 9×106 клеток/см2, от около 5×106 до около 8×106 клеток/см2, от около 5×106 до около 7×106 клеток/см2, от около 5×106 до около 6×106 клеток/см2, от около 7×106 до около 4×107 клеток/см2, от около 8×106 до около 3×107клеток/см2, от около 9×106 до около 2×107 клеток/см2, предпочтительно порядка около 1×107 клеток/см2.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу повышения экспрессии белка НВ9 путем культивирования и дифференцировки популяции панкреатических энтодермальных клеток-предшественников, со-положительных для PDX1 и NKX6.1, в панкреатические эндокринные клетки, со-положительные для PDX1 и NKX6.1 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на пористом субстрате. Альтернативно, экспрессия белка НВ9 может быть понижена путем культивирования и дифференцировки популяции энтодермальных клеток передней кишки, состоящей первоначально из клеток, положительных для PDX1, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток панкреатической энтодермы получают путем поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток, по меньшей мере частично, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления изобретение представляет способ повышения количества клеток, положительных для одного гормона (например, клеток, которые со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин, или клетки, которые производят NKX6.1 и хромогранин-А), путем культивирования и дифференцировки популяции клеток, со-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, затем дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки путем обработки составом, выбранным из следующих: ингибитор ALK5, ингибитором ВМР, ингибитор гамма-секретазы, Эфрин лиганды, ингибитор EphB, ингибитор РКС, ингибитор EGFr, ретиноевая кислота, витамин С Т3/Т4, глюкоза, регуляторы клеточного цикла, регуляторы WNT, ингибитор SHH или сочетание вышеперечисленного.
В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, затем дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки-предшественники и клетки, экспрессирующие гормоны поджелудочной железы. В альтернативном варианте осуществления изобретение включает клетки, подготовленные способами настоящего изобретения, которые экспрессируют инсулин, но не NKX6.1. В некоторых вариантах осуществления популяция панкреатической энтодермальной клеточной линии, полученная в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, трансплантируется в животное, больное диабетом, для дальнейшего созревания in vivo до функциональных панкреатических эндокринных клеток.
Стадия 4: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 3 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка. Например, ростовая среда, такая как MCDB131 или BLAR, может быть обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин), или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (например, SANT-1 или HPI-1), ингибитором ВМР (например, LDN-193189, Noggin или Chordin), аскорбиновой кислотой и активатором РКС (таким как TPB, PDBu, PMA или ILV) для обеспечения полезной среды для дифференцировки. Культивирование клеток стадии 3 в такой среде на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, как правило, достаточно для дифференцировки клеток стадии 3 в клетки стадии 4. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1; примерно 100 нМ ретиноевой кислоты; примерно 2 нг/мл FGF7; примерно 100 нМ LDN-193189; и примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и примерно около 100 нМ ТРВ, на протяжении трех дней. В другом варианте осуществления среда далее обогащена Т3, к примеру, от около 5 нМ до около 25 нМ, альтернативно около 10 нМ Т3.
На стадии 4 клетки могу культивироваться в планарной культуре или в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В частности, настоящее изобретение представляет клеточную культуру в условиях in vitro для дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток. Альтернативно, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки путем обработки средой, обогащенной, как описано выше, в планарной культуре.
В последующем варианте воплощения, клетки в конце стадии 4 могут быть обработано ингибитором Rho-ассоциированной киназы («ROCK»), таким как Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-аминоэтил)-N-(пиридин-4-ил)цикоргексанкарбоксамид), GSK269962 (N-[3-[[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3?-ил)-1-этил-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси]фенил]-4-[2-(4-морфолинил)этокси]бензамид), H1152 ((S)-(+)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил)сульфонил]гомопиперазин, 2HCl,) и, SR3677 (N-[2-[2-(диметиламино)этокси]-4-(1H-пиразол-4-ил)фенил-2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-2-карбоксамид дигидрохлорид). В определенных вариантах осуществления может быть использовано около 10 мкМ ингибитора ROCK.
В определенных вариантах осуществления в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культивируются только клетки поздней стадии 4. В одном из вариантов осуществления в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культивируются только клетки поздней стадии 4, обработанные ингибитором ROCK. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В альтернативном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5, Noggin и РКС активатором (таким как ТРВ). В некоторых вариантах осуществления среда может быть обогащена около 0,1 мкМ ингибитора ALK5, около 100 нг/мл Noggin и около 500 нМ ТРВ. Клеточная культура может быть в однослойном формате. Обработка может длиться около полных трех дней. В определенных вариантах осуществления клетки могут обрабатываться на протяжении двух дней, а затем в последний день клетки могут быть обработаны протеолитическими ферментами, коллагенолитическими ферментами или и теми и другими, такими как диспаза, и разбиты на клеточные кластеры диаметром менее чем 100 микрон, а затем культивированы в присутствии ингибитора ALK5 и LDN-193189. В определенных вариантах осуществления клеточные кластеры с диаметром меньшем, чем около 100 микрон, могут культивироваться в среде, обогащенной около 200 нМ ингибитора ALK5 и около 100 нМ LDN-193189.
Стадия 5: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В другом варианте осуществления ростовая среда обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин) или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (таким как SANT-1 или HPI-1), ретиноевой кислотой, Т3, аскорбиновой кислотой, ингибитором ВМР рецептора (таким как LDN-193189, Noggin или Chordin) и ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором SMO. SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, Т3, аскорбиновой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно на протяжении трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 50нМ LDN-193189, примерно 10 нМ Т3 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5. В некоторых вариантах осуществления ингибитором ALK5 является SD208 (2-(5-хлоро-2-фторофенил)птеридин-4-ил]пиридин-4-ил-амин). В одном из вариантов осуществления среда обогащена около 1000 нМ SD208.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно на протяжении трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, вместе с ретиноевой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5.
Среда может также быть обогащена ZnSO4. Например, может быть добавлено около 10 мкМ ZnSO4. Таким образом, в одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 могут дифференцироваться в клетки стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ZnSO4, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, LDN-193189 и ингибитором ALK5 II. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 50 нМ LDN-193189, примерно 10нМ Т3 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5. Подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, SD208, ингибитор ALK5 II, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания.
В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. В другом варианте осуществления использовано около 1000 нМ ингибитора ALK5. В альтернативно варианте осуществления клетки стадии 4 обрабатываются средой, обогащенной примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 100 нМ LDN-193189 и примерно 10000 нМ ингибитора ALK5 II.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении примерно двух дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 50 нМ LDN-193189 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5 (такого как SD208 или ингибитор ALK5 II). В определенных вариантах осуществления средой может быть MCDB-131 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY).
Количество клеток, посеянных для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, может варьировать. Например, для культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, капли клеточной суспензии, содержащие от около 2×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 3×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 4×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 5×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл, 2×105 клеток/мкл до около 5×105 клеток/мкл, 2×105 клеток/мкл до около 4×105 клеток/мкл, или около 3×105 клеток/мкл, могут быть посеяны на пористый субстрат, такой как фильтр, расположенный в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления капли клеточной суспензии, содержащие от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл, от около 0,6×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл, или от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,6×105 клеток/мкл высеваются на пористый субстрат для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором рецептора ВМР (например, LDN-193189, Noggin или Chordin) и ингибитором ALK5, на протяжении примерно одного дня для дифференцировки клеток стадии 4 в клетки стадии 5. Например, среда может быть обогащена примерно 100 нМ LDN-193189 и примерно 200 нМ ингибитора ALK5. Предпочтительно этот вариант осуществления также включает предварительную обработку клеток диспазой. Клетки могут быть сформированы в кластеры. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4, полученные согласно вариантам осуществления изобретения используются и дифференцируются в клетки стадии 5, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки 4, полученные в соответствии с другими протоколами.
В соответствии с последующим способом, изобретение также представляет клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
В определенных вариантах осуществления культивирование клеток на стадии 5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия может улучшить экспрессию гормонов поджелудочной железы. Соответственно, изобретение также представляет способы повышения экспрессии гормонов поджелудочной железы путем культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления клетки на стадии 5 могут быть обработаны согласно приведенному описанию и в таблицах VIII-XIII ниже. В определенных вариантах осуществления способ также моет понизить экспрессию PTF1a, SOX9, CDX2 (маркер кишечника), ZIC1 (маркер эктодермы) и SOX2 (фронтальный маркер энтодермы).
В одном из вариантов осуществления способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или обоими, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Стадия 6: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 5 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток стадии5 в клетки стадии 6. В одном из вариантов осуществления ростовая среда обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин) или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (таким как SANT-1 или HPI-1), ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, Т3/Т4 и ингибитором ALK5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. Клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 500 мМ ингибитора ALK5 и 0,1 нМ T3, на протяжении трех дней. Альтернативно, клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 500 нМ ингибитора ALK5 и 10 нМ T3, на протяжении трех дней. Клетки могут культивироваться в подобной среде на протяжении дополнительных двух дней, или более, если это желательно.
Альтернативно, клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в стадию 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, SMO ингибитором или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ингибитором ВРМ, Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении шести-четырнадцати дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней, альтернативно около 8 дней, альтернативно около 9 дней, альтернативно около 10 дней, альтернативно около 11 дней, альтернативно около 12 дней, альтернативно около 13 дней и альтернативно около 14 дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. Например, клетки могут культивироваться в среде, обогащенной около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ T3 и от около 500 до около 10,000 нМ, от около 1000 до около 10,000 нМ, от около 5000 до около 10,000 нМ, от около 600 до около 5000 нМ, от около 700 до около 5000 нМ, от около 800 до около 5000 нМ, от около 900 до около 5000 нМ, от около 1000 нМ до около 5000 нМ, от около 600 до около 1000 нМ, от около 700 до около 1000 нМ, от около 800 до около 1000 нМ, от около 600 до около 1200 нМ, от около 700 до около 1200 нМ, от около 800 до около 1200 нМ, от около 900 до около 1200 нМ, альтернативно около 500 нМ, альтернативно около 1000 мМ, и альтернативно около 10,000 нМ ингибитора ALK5.
Подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, SD208, ингибитор ALK5 II, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания.
В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. В другом варианте осуществления использовано около 1000 нМ ингибитора ALK5. Соответственно, в одном из вариантов осуществления клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, ингибитора SMO или SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории, ингибитором ВМР, Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении примерно шести дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, SMO ингибитором или SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории, ингибитором ВМР, T3, и ингибитором ALK5 II, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении от около 5 дней до около 15 дней, от около 6 дней до около 14 дней, от около 7 дней до около 13 дней, от около 8 дней до около 12 дней, от около 9 дней до около 11 дней, от около 5 дней до около 10 дней, от около 10 дней до около 15 дней, альтернативно около 5 дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней, альтернативно около 8 дней, альтернативно около 9 дней, альтернативно около 10 дней, альтернативно около 11 дней, альтернативно около 12 дней, альтернативно около 13 дней, альтернативно около 14 дней, альтернативно около 15 дней. В одном из вариантов осуществления клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении 5 дней или более. 6 дней или более, 7 дней или более, 8 дней или более, 9 дней или более, 10 дней или более, 11 дней или более, 12 дней или более, 13 дней или более, 14 дней или более, 15 дней или более. В одном из вариантов осуществления клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении 15 дней или менее, 14 дней или менее, 13 дней или менее, 12 дней или менее, 11 дней или менее, 10 дней или менее, 9 дней или менее, 8 дней или менее, 7 дней или менее, 6 дней или менее, 5 дней или менее. В одном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 10 дней. В другом варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 11 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 12 дней. В еще одном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 15 дней. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 100 нМ LDN-193189, примерно 1000 нМ T3 и примерно 10000 нМ ингибитора ALK5 II. В некоторых вариантах осуществления среда может быть также обогащена сульфатом цинка (ZnSO4). Например, среда может быть обогащена 10 мкМ ZnSO4. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории.
В соответствии с последующим способом, изобретение также представляет клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
В одном из вариантов осуществления клетки стадии 5, полученные согласно вариантам осуществления изобретения используются и дифференцируются в клетки стадии 6, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки 5, полученные в соответствии с другими протоколами.
В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, который являются положительными для одного гормона. Таким образом, способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
В определенных вариантах осуществления изобретения способ использует среду BLAR (см. таблицу II) на стадиях 4-6. Среда предпочтительно должна заменяться каждый день или альтернативно через день. В некоторых вариантах осуществления способы включают обработку клеток стадий 4-6 указанными компонентами в количествах, указанных в таблицах VIII-XIII настоящего документа.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 6, со-экспрессирующих NKX6.1 и хромогранин-А, включающему культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6, предпочтительно стадиях 5-6. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток, положительных для одного гормона инсулина, экспрессирующих NKX6.1, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6, предпочтительно стадиях 5-6.
Культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время или после стадии 4 может существенно улучшить экспрессию панкреатических энтодермальных маркеров вместе с маркерами, относящимися к эндокринным. Соответственно, изобретение представляет способ увеличения экспрессии панкреатических энтодермальных и относящихся к эндокринным маркеров путем культивирования клеток во время или после стадии 4 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления изобретение также представляет способы увеличения урожая положительных для NKX6.1 клеток, со-экспрессирующих инсулин, хромогранин-А и инсулин, путем культивирования клеток стадии 4 и последующих в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в присутствии ингибитора ALK5. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. Другие подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания. В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к ингибитору ALK5, клетки могут быть обработаны, как описано в таблицах VIII-XIII ниже.
В одном из вариантов осуществления изобретение представляет способы увеличения урожая положительных для NKX6.1 клеток, со-экспрессирующих инсулин, хромогранин-А и инсулин, путем культивирования клеток стадии 5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в присутствии ингибитора ALK5 II. В одном из вариантов осуществления способ также включает культивирование клеток во время стадии 5 в присутствии ингибитора ALK5 II и Т3.
Созревание клеток стадии 6 в условиях in vivo
В некоторых вариантах осуществления клетки стадии 6, подготовленные в соответствии с способами изобретения, могут в дальнейшем созревать в условиях in vivo. В одном из вариантов осуществления эти клетки могут дозревать путем трансплантации in vivo млекопитающему. Например, клетки могут быть трансплантированы под почечную капсулу мыши. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6, которые дозревают в условиях in vivo, являются клетками, со-экспрессирующими NKX6.1 и инсулин. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6, которые дозревают в условиях in vivo, являются клетками, со-экспрессирующими NKX6.1 и хромагранин. В альтернативном варианте осуществления созревание in vivo (а) клеток, со-экспрессирующих NKX6.1 и инсулин, или (b) клеток, со-экспрессирующих NKX6.1 и хромагранин, приводит к раннему получению С-пептида. В определенных вариантах осуществления уровень выработки С-пептида от трансплантации приблизительно 3 миллионов клеток стадии 6 равен количеству С-пептида, полученного от трансплантации приблизительно 3000 человеческих островков.
Культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия согласно способам, описанным в настоящем документе, также хорошо подходит для применения в скрининговых составах из-за их эффекта на секрецию панкреатических гормонов и эндокринных маркеров. В частности, клетки стадий 4-6, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, могут использоваться в различных культурных форматах, включая от 384 до 6- WELL(&) форматы, для оценки эффекта включения различных мелких молекул или биоединиц, в различных дозах и временных интервалах, оказываемого на последующую экспрессию маркеров панкреатических энтодермальных, панкреатических эндокринных и панкреатических бета-клеток. Такая оценка может быть выполнена путем измерения генной экспрессии с помощью ПЦР, белковой экспрессии путем FACS, иммуноокрашивания, или с помощью ELISA секреции факторов клетками, на которые воздействовало добавление низкомолекулярных компонентов или высокомолекулярных биологических препаратов.
Клетки, получаемые с помощью способов изобретения
Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить способами настоящего изобретения. Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, полученную способами настоящего изобретения.
Изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, предпочтительно экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, для которых характерна значительная со-экспрессия NKX6.1 и хромогранин-А. Изобретение также представляет инсулин-положительную клетку или популяцию инсулин-положительных клеток, предпочтительно экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, для которых характерна экспрессия NKX6.1 (не в обязательном порядке >30%). Эти популяции ранее не описаны, как объяснено в Примере 10.
Способы обработки
Изобретение представляет способы обработки. В частности, настоящее изобретение представляет способ лечения пациента, страдающего диабетом или подвергающегося риску развития данного заболевания.
Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить или полученные способом настоящего изобретения для применения в способе лечения. В частности, настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить или полученные способом настоящего изобретения для применения в способе лечения пациента, страдающего диабетом или подвергающегося риску развития данного заболевания.
Диабет может быть диабетом типа I или типа II.
В одном из вариантов осуществления способ лечения включает имплантацию клеток, которые получены или могут быть получены способом настоящего изобретения, пациенту.
В одном из вариантов осуществления способ лечения включает
дифференцировку плюрипотентных клеток in vitro в клетки стадии 1, стадии 2, стадии 3, стадии 4, стадии 5 или стадии 6, например, как описано в настоящем документе,
и имплантации дифференцированных клеток пациенту.
В одном из вариантов осуществления способ также содержит стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток, например как описано в настоящем документе, предшествующую стадии дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
В одном из вариантов осуществления способ также включает стадию дифференцировки клеток in vivo, после стадии имплантации.
В одном из вариантов осуществления пациент является млекопитающим, предпочтительно человеком.
В одном из вариантов осуществления клетки можно имплантировать в форме дисперсных клеток или клеток, образующих кластеры, которые можно вводить в воротную вену печени способом инфузии. Клетки можно альтернативно вводить в биосовместимые разлагающиеся полимерные опорные материалы, пористые неразлагающиеся устройства или в инкапсулированном виде для защиты от иммунного ответа организма-хозяина. Клетки можно имплантировать в подходящее место в организме реципиента. Места имплантации включают в себя, например, печень, естественную поджелудочную железу, пространство под почечной капсулой, сальник, брюшную полость, субсерозное пространство, кишечник, желудок или подкожный карман.
Для стимуляции дальнейшего дифференцирования, выживаемости или активности имплантированных клеток in vivo, до, одновременно с или после введения клеток можно вводить дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты или противовоспалительные вещества. Данные факторы могут секретироваться эндогенными клетками и воздействовать на внедренные клетки in situ. Дифференцирование имплантированных клеток можно индуцировать любой комбинацией эндогенных и введенных экзогенно факторов роста, известных в данной области.
Количество клеток, используемых при имплантации, зависит от ряда различных факторов, включая состояние пациента и его реакцию на лечение, и может быть определено специалистом в данной области.
В одном из вариантов осуществления способ лечения также включает встраивание клеток перед имплантацией в трехмерный опорный материал. Клетки можно поддерживать in vitro на данном опорном материале перед имплантацией пациенту. Опорный материал, содержащий клетки, альтернативно можно имплантировать непосредственно в организм пациента без дополнительного культивирования in vitro. В опорный материал может быть необязательно включено по меньшей мере одно фармацевтическое вещество, обеспечивающее выживаемость и функционирование трансплантированных клеток.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример изучает и демонстрирует, что панкреатические эндокринные клетки-предшественники (клетки стадии 5) могут далее дозревать с помощью культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для культивирования панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы в панкреатические эндокринные клетки-предшественники на основе протокола, описанного ниже.
Эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 рассеивали как одиночные клетки при концентрации 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1:30; BD Biosciences, штат Нью-Джерси), в среде MTESR®1 (StemCell Technologies, г. Ванкувер, Канада) с добавлением 10 мкM Y27632 (Rock inhibitor, Catalog No. Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1: (3 дня): 60-70% конфлюэнтных прикрепленных к субстрату культур недифференцированных клеток Н1, размещенных на поверхностях, покрытых MATRIGEL, разведенным в соотношении 1:30, были помещены в среду GIBCO® RPMI 1640 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY), обогащенную 0,2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Hyclone, Utah), 100 нг/мл активина-A (AA; Pepro-tech; Rocky Hill, NJ), и 20 нг/мл Wnt3A (R&D Systems), только на один день. В течение последующих двух дней клетки культивировались в среде GIBCO® RPMI с 0,5% FBS и 100 нг/мл АА.
b) Стадия 2: (3 дня): Клетки стадии 1 были затем помещены в среду Дюльбекко, модифицированную по способу Игла (DMEM-F12) (Life Technologies Corporation, NY), обогащенную 2% FBS и 50 нг/мл FGF7 (Pepro-tech) на три дня.
с) Стадия 3: (4 дня): Клетки стадии 2 затем культивировались на протяжении четырех дней в среде DMEM-HG (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY), обогащенной 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO), 2 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich), 100 нг/мл Noggin (R&D Systems), и 1% (об/об) добавки, которая продается под торговой маркой B27® (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY (кат. №: 17504044).
d) Стадия 4: (3 дня): Клетки стадии 3 культивировались на протяжении трех дней в среде DMEM-HG, обогащенной 0,1 мкМ ингибитора ALK5 (ALK5i; Axxora, San Diego, CA), 100 нг/мл Noggin, 500 нМ ТРВ ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторометил)фенил)-2,4-пентадиенойламино)бензолактам; EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ) и 1% В27 в однослойном формате. Для последнего дня культивирования клетки были обработаны 5 мг/мл диспазы (Becton Dickinson, Bedford, MA, #354235) на протяжении 5 минут, после чего осторожно пипетированы для смешивания и разбивки на клеточные кластеры (<100 микрон). Клеточные кластеры были перенесены в одноразовые полистироловые центрифужные пробирки емкостью 125 мл (Corning) и вращались со скоростью 80-100 об/мин на протяжении ночи в суспензии со средой DMEM-HG, обогащенной 200 нМ ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 (Stemgent, CA) и 1% В27.
е) Стадия 5: (1 день): Клетки стадии 4 были обработаны 5 мг/мл диспазы на протяжении 5 минут, после чего осторожно пипетированы для смешивания и разбивки на клеточные кластеры (<100 микрон). Клеточные кластеры были перенесены в одноразовые полистироловые центрифужные пробирки емкостью 125 мл (Corning, NY) и вращались со скоростью 80-100 об/мин на протяжении ночи в суспензии со средой DMEM-HG, обогащенной 200 нМ ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 (Stemgent, CA), и 1% В27.
Кластеры стадии 5 день 1 были посеяны в пористые культуральные фильтровые вкладыши с диаметром пор 0,4 микрон (BD Biosciences, PET membranes, #353493) на 6-лунковые пластины (в 10 микролитров аликвот содержится ~1 миллион клеток) и культивировались на протяжении 3 недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия путем добавления 1,5 мл DMEM-HG + 1% B27 на дно вкладыша и без среды над ним. На Фиг. 1А-Н представлены фазовые контрастные образы кластеров на разных временных точках после посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. На Фиг. 2 А-К показаны результаты иммуноокрашивания для следующих белков через 1 неделю после посева клеточных кластеров на фильтры: DAPI (Фиг. 2A); инсулин (Фиг. 2B); HB9 (Фиг. 2С), DAPI (Фиг. 2D); глюкагон (Фиг. 2E); инсулин (Фиг. 2F); DAPI (Фиг. 2G); инсулин (Фиг. 2H); соматостатин (Фиг. 2I); NKX6.1 (Фиг. 2J); и инсулин (Фиг. 2K). В то время как на Фиг. 3А-Н показаны результаты иммуноокрашивания для следующих белков через 2 недели после посева на фильтры: инсулин (Фиг. 3А); глюкагон (Фиг. 3В); инсулин (Фиг. 3С); соматостатин (Фиг. 3D); инсулин (Фиг. 3Е), NKX6.1 (Фиг. 3F); HB9 (Фиг. 3G) и NKX6.1 (Фиг. 3Н). На Фиг. 2 панели A-C, D-F, G-I и J-K были взяты из того же поля. На Фиг. 3 панели А-В, С-D, E-F и G-H, соответственно, были взяты из того же поля. На Фиг. 4А-D показаны результаты иммуноокрашивания следующих протеинов через 3 недели после посева на фильтры: инсулин (Фиг. 4А; глюкагон (Фиг. 4В),; инсулин (Фиг. 4С) и соматостатин (Фиг. 4D). На Фиг. 4 панели А-В и С-D, соответственно, были взяты из того же поля.
На стадии 4 и в последующих культурах мРНК была собрана для ПЦР анализа на релевантные панкреатические энтодермальные/ эндокринные гены. Общая РНК был экстрагирована с помощью RNeasy® Mini Kit (Qiagen; Valencia, CA) и обратнотранскрибирована с помощью High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК была усилена с помощью Taqman Universal Master Mix и Taqman Gene Expression Assays, которые были предварительно загружены в Taqman Arrays (Applied Biosystems). Данные были проанализированы с применением ПО Sequence Detection Software (Applied Biosystems) и нормализованы относительно недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hES) с помощью способа ΔΔCt (т.е. результаты ПЦР были откорректированы относительно внутренних контролей (ΔΔCt=ΔCtобразец-ΔCtсправочное)). Все праймеры приобретали в Applied Biosystems. Цитометрия и иммунофлуоресцентный анализ были осуществлены в соответствии с предшествующим описанием (Diabetes, 61, 20126, 2012).
На Фиг. 5А–R представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 1: PDX1 (Фиг. 5A); NKX6.1 (Фиг. 5B); Pax4 (Фиг. 5C); Pax6 (Фиг. 5D), NGN3 (Фиг. 5E); NKX2.2 (Фиг. 5F); ABCC8 (Фиг. 5G); хромогранин-А (Фиг. 5H); PCSK1 (Фиг. 5I); IAPP (Фиг. 5J); инсулин (Фиг. 5К); глюкагон (Фиг. 5L); соматостатин (Фиг. 5М); грелин (Фиг. 5N); Ptf1a (Фиг. 5О); Zic1 (Фиг. 5Р); CDX2 (Фиг. 5Q) и SOX9 (Фиг. 5R). По истечении 3-недельного культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия было отмечено значительное зависимое от времени увеличение экспрессии маркеров, ассоциированных с созреванием эндокринных клеток, таких как ABCC8, IAPP (амилин) и PCSK1. Наблюдался значительный спад в экспрессии PTF1а и SOX9 и очень низкая экспрессия CDX2 (кишечный маркер), ZIC1 (эктодермический маркер) и SOX2 (фронтальный эндодермический маркер), в то время как экспрессия NKX6.1 и PDX1 поддерживались на очень высоком уровне. Экспрессия все гормонов поджелудочной железы была значительно улучшена на протяжении 3-недельного культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Пример 2. Культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением различных фильтровых вкладышей
Этот пример изучает тип и пористость фильтровых вкладышей в дифференцировке панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для изучения воздействия типа и пористости фильтровых вкладышей эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением описанного ниже протокола.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48) , в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100) (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d. Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е. Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нМ Т3, 50 нМ LDN-193189, 1000 нМ ингибитора ALK5 SD208 в течение трех дней. SD208 (2-(5-хлоро-2-фторофенил)птеридин-4-ил]пиридин-4-ил-амин) является 2,4-двузамещенным птеридином, АТР-конкурентным ингибитором TGF-βR I киназы, раскрытом в Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161, и обладающим структурой, показанной в формуле 1.
Формула 1
f. Стадия 6 (5 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,025 мМ аскорбиновой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5, 0,1 нМ T3 в течение трех дней.
В некоторых культурах клетки на стадиях 3-6, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была посеяна с плотностью около 2-6×106 клеток на фильтровые вкладыши для клеточных культур с диаметром пор 0,4 микрон, обладающие поверхностной областью приблизительно 4,2 см2 на 6-лунковой платформе. Различные фильтровые вкладыши, использованные в этом процессе, идентифицированы в таблице 1. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. В некоторых культурах фильтры покрывались MATRIGEL™ (раствор 1:30) на 1 час при комнатной температуре, и клетки были посеяны на верхнюю часть покрытых вкладышей в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия или же с культуральной средой на верхушке вкладыша. На протяжении исследования среда заменялась через день.
Фиг. 6 демонстрирует данные анализа ПЦР в реальном времени об экспрессии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 2: PDX1 (Фиг. 6A); NKX6.1 (Фиг. 6B); PAX4 (Фиг. 6C); PAX6 (Фиг. 6D), NGN3 (Фиг. 6E); NKX2.2 (Фиг. 6F); ABCC8 (Фиг. 6G); хромогранин-А (Фиг. 6Н); PCSK1 (Фиг. 6I); IAPP (Фиг. 6J); инсулин (Фиг. 6К) и глюкагон (Фиг. 5L). Культивирование клеток стадии 4 на фильтровых вкладышах ((Corning, 3412, BD 353493, и Millipore PIHT 30R 48) существенно увеличивает панкреатические энтодермальные маркеры, так же как и маркеры, относящиеся к эндокринным. Покрытие фильтров MATRIGEL™ существенно снижает преимущества культивирования на фильтре в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Более того, клетки, культивируемые на фильтровых вкладышах с низкой плотностью пор (BD 353090, Corning 3452) продемонстрировали более низкую выживаемость и дифференцировку.
Таблица I
Список фильтровых вкладышей, оцененных в примере 2. |
||||
Фильтровый вкладыш | Полимерная композиция | Размер пор (микрон) | Плотность пор (#/см2) | Покрытие |
BD, #353493 | PET | 0,4 | 100+/- 10×106 | Нет |
BD, #353090 | PET | 0,4 | 2+/- 0,2×106 | Нет |
Corning, #3452 | Полистирол | 0,4 | 4×106 | +/- покрытие MATRIGEL™ (раствор 1:30) |
Corning, #3412 | Поликарбонат | 0,4 | 100×106 | Нет |
Millipore, #PIHT 30R 48 | PET | 0,4 | 100×106 | +/- покрытие MATRIGEL™ (раствор 1:30) |
Пример 3 Панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, показали увеличение экспрессии эндокринных маркеров по сравнению с планарными культурами или культурами, поддержанными на фильтрах в жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример направлен на различия в склонности к дифференцировке панкреатических энтодермальных клеток, культивированных на планарных субстратах по сравнению с культивированными в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В дополнение, эффект воздушно-жидкостной зоны взаимодействия был дополнительно подчеркнут дифференцировкой интересующих клеток на вкладышах, но со средой, добавленной как на верхнюю, так и на нижнюю части вкладышей.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100) (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Для клеток, культивированных на фильтровых вкладышах, в начале стадии 1 в некоторых культурах среда была добавлена только на дно вкладыша, а верхняя часть вкладыша находилась в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, в то время как в других культурах среда также была добавлена как на верхнюю, так и на нижнюю часть фильтрового вкладыша. Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и композиции 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (производится компанией Invitrogen, см. таблицу II с компонентами среды BLAR), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нМ Т3, 50 нМ LDN-193189, 1000 нМ ингибитора ALK5 (SD208) в течение трех дней.
f) Стадия 6 (5 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,025 мМ аскорбиновой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5, 0,1 нМ T3 в течение трех дней.
В некоторых культурах клетки в конце стадии 3, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 2-6×106 клеток (в 50-100 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась через день.
Фиг. 7 демонстрирует данные анализа ПЦР в реальном времени об экспрессии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 3: PDX1 (Фиг. 7A); NKX6.1 (Фиг. 7B); PAX4 (Фиг. 7C); PAX6 (Фиг. 7D), NGN3 (Фиг. 7E); NKX2.2 (Фиг. 7F); ABCC8 (Фиг. 7G); хромогранин-А (Фиг. 7Н); PCSK1 (Фиг. 7I); IAPP (Фиг. 7J); инсулин (Фиг. 7К) и глюкагон (Фиг. 7L).
Культивирование клеток на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6 значительно повысило панкреатические маркеры, относящиеся к эндокринным. Далее, клетки, которые культивировались и дифференцировались на покрытых MATRIGEL™ фильтровых вкладышах с начала стадии 1 со средой на верхней и нижней частях фильтровых вкладышей, продемонстрировали более низкие уровни панкреатической энтодермальной и эндокринной экспрессией по сравнению с клетками, культивированными в планарных культурах и в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Более того, панкреатические энтодермальные клетки, культивированные на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, продемонстрировали самую высокую экспрессию панкреатических эндокринных клетках по сравнению со всеми протестированными конфигурациями.
Таблица II
Список компонентов среды BLAR |
|
Компонент | Концентрация (мМ) |
Аминокислоты | |
Глицин | 3.0E-02 |
Аланин | 3.0E-02 |
Аргинин | 3.0E-01 |
Аспарагин | 1.0E-01 |
Аспарагиновая кислота | 1.0E-01 |
Цистеин | 2.0E-01 |
Глутаминовая кислота | 3.0E-02 |
Гистидин | 1.1E-01 |
Изолейцин | 1.0E-02 |
Лейцин | 9.0E-02 |
Лизина гидрохлорид | 1.5E-01 |
Метиан | 3.0E-02 |
Фенилаланин | 3.0E-02 |
Пролин | 1.0E-01 |
Серин | 1.0E-01 |
Теронин | 3.0E-02 |
Триптофан | 2.0E-03 |
Тирозиндинатрий | 1.0E-02 |
Vвоздушно-жидкостной зоны взаимодействия | 3.0E-02 |
Витамины | |
Биотин | 3.0E-05 |
Холина хлорид | 5.0E-03 |
D-кальций пантотенат | 1.5E-03 |
Соль кальция фолиевой кислоты | 2.3E-03 |
Ниацинамид | 4.9E-03 |
Пиридоксина гидрохлорид | 9.7E-04 |
Рибофлавин | 1.0E-05 |
Тинамина гидрохлорид | 3.0E-03 |
Витамин В12 | 3.7E-06 |
I-инозитол | 2.8E-03 |
Минералы/прочие | |
Кальция хлорид (CaCl2-2H2O) | 3.0E-01 |
Меди сульфат (CuSO4-5H2O) | 4.8E-06 |
Железа сульфат (FeSO4-7H2O) | 1.0E-03 |
Магния сульфат (MgSO4-7H2O) | 4.1E-01 |
Калия хлорид (KCl) | 3.8E+00 |
Селеновая кислота H2SeO3 | |
Натрия бикарбонат (NaHCO3) | 1.4E+01 |
Натрия хлорид (NaCl) | 1.1E+02 |
Натрия фосфат двухосновный (Na2HPO4-7H2O) | 5.0E-01 |
Цинка сульфат (ZnSO4-H2O) | 1.0E-04 |
Aденин | 1.0E-03 |
D-глюкоза (декстроза) | 5.0E+00 |
Липоевая кислота | 1.2E+05 |
Фенол красный | 1.0E-02 |
Натрия пируват | 1.0E+00 |
Тимидин | 9.8E-05 |
Пример 4. Панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и обработанные ингибитором ALK5 II, продемонстрировали существенно большее количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих хромогранин-А и инсулин
Этот пример был осуществлен для демонстрации того, что ингибитор ALK5 II был уникален в получении значительной популяции клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которые экспрессировали NKX6.1 и инсулин или хромогранин-А. Более того, это наблюдение было уникально для культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Погруженные культуры в однослойных планарных культурах не смогли продемонстрировать значительное количество клеток NKX6.1, экспрессирующих инсулин или хромогранин-А.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% не содержащего жирных кислот BSA(Lampire, PA) и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного BSA без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты, 50 нМ LDN; 500-1000 нМ различных ингибиторов ALK5 (см. таблицу III со списком использованных ингибиторов) в течение трех дней.
f) Стадия 6 (7 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты; 500-1000 нМ ингибиторов ALK5 (см. таблицу III со списком протестированных ингибиторов).
В некоторых культурах клетки в конце дня 1 стадии 4, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 2-4×106 клеток (в 25-50 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась через день.
На Фиг. 8 представлены данные ПЦР в реальном времени при анализе экспрессии следующих генов в эмбриональных стволовых клетках человека линии Н1, дифференцированных и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия как описано в примере 4 после дня 1 стадии 4, дня 3 стадии 5 и дня 6 стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: PDX1 (Фиг. 8A); NKX6.1 (Фиг. 8B); NGN3 (Фиг. 8C); ABCC8 (Фиг. 8D); PCSK1 (Фиг. 8E); грелин (Фиг. 8F); глюкагон (Фиг. 8G); и инсулин (Фиг. 8Н).
На Фиг. 9 представлены данные ПЦР анализа в реальном времени об экспресии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 4 и культивированных в планарных однослойных культурах на день 3 стадии 5 и день 4 стадии 6 для PDX1 (Фиг. 9A), NKX6.1 (Фиг. 9B), NGN3 (Фиг. 9C), ABCC8 (Фиг. 9D), PCSK1 (Фиг. 9E), грелин (Фиг. 9F), глюкагон (Фиг. 9G), и инсулин (Фиг. 9H). Сравнение Фиг. 8 и 9 обнаруживает, что обработка планарных культур на стадии 5 и стадии 6 ингибитором ALK5 II привела к падению экспрессии инсулина на стадии 6 по сравнению со стадией 5. Однако обработка культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия ингибитором ALK5 привела к росту экспрессии инсулина на стадии 6 по сравнению со стадией 5. Та же схема применима к экспрессии NGN3 и NKX6.1 в культурах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в сравнении с однослойными культурами.
На Фиг. 10 описаны результаты иммуноокрашивания клеток стадии 6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде, обработанной либо 1 микромолярным SD208 ингибитором (панель 9А), либо 1 микромолярным ALK5 ингибитором II (панель 10В) и окрашенным для хромогранина-А (пан-эндокринный маркер) и NKX6.1 (панкреатический прекурсорный маркер и специфический маркер бета-клеток). Культуры, обработанные ингибитором ALK5 II, привели в результате к со-экспрессии NKX6.1 и хромогранина-А. Однако, культуры, обработанные SD208, продемонстрировали очень низкую со-экспрессию NKX6.1 и хромогранина-А.
Культивирование панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в сочетании с ингибитором ALK5 II существенно повысили количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин и хромогранин-А. Более того, тот же протокол, примененный к клеткам, культивированным в однослойным культурам, не показал значительного количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин или хромогранин-А. Последнее, обработка клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия ингибиторами ALK5, отличных от ингибитора ALK5 II, не показала значительного количества клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин или хромогранин-А. Эти результаты показывают, что уникальная комбинация культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия со средой, обогащенной ингибитором ALK5 II, приводит к со-экспрессии инсулина/хромогранина-А и NKX6.1.
Таблица III
Ингибиторы FLK5, протестированные в примере 4 |
||
Соединение | Производитель | Номер по каталогу |
Ингибитор TGF-B SB431542 | Xcess Biosciences (San Diego, Ca) | M60015-25s |
SD208 | R & D systems (MN) | 3269 |
ITD-1 | Xcess Biosciences (San Diego, Ca) | M600060-2S |
LY2109761 | Xcess Biosciences (San Diego, Ca) | M60035-2S |
A83-01 | Xcess Biosciences (San Diego, Ca) | M60021-2S |
LY2157299 | Xcess Biosciences (San Diego, Ca) | M60064-2S |
ALK5-ингибитор II | Enzo (Farmingdale, NY) | ALX-270-445 |
Пример 5. Сравнение различных ингибиторов ALK5 на стадиях 5 и 6 для клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример демонстрирует, что ингибитор ALK5 II был уникален в получении значительной популяции клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которые экспрессировали NKX6.1 и инсулин или хромогранин-А. Дополнительные ингибиторы TGF-β, протестированные в данном примере, перечислены в таблице IV.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали в течение еще одного дня в среде MSDB-131, обогащенной следующими компонентами: 2% BSA без жирных кислот; 0,0012 г/мл натрия бикарбоната; 1X GlutaMax™; 4,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8; и 0,1 мкМ композиции МСХ. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d. Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 100 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×105 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах или на фильтровые вкладыши размером 10 см (Corning, #3419) в 10-сантиметровые чашки. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша на 6-лунковых пластинах, и 7,5 мл среды было добавлено на дно каждого 10-сантиметрового вкладыша. На верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е. Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 затем культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189; 1000 нМ различных ингибиторов ALK5 (см. таблицу IV со списком использованных ингибиторов) в течение трех дней.
f. Стадия 6 (6 дней): Клетки стадии 5 затем культивировались в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3; 1000 нМ ингибитора ALK5 (см. таблицу IV со списком использованных ингибиторов) в течение шести дней.
На Фиг. 23 представлены данные ПЦР в реальном времени при анализе экспрессии следующих генов в эмбриональных стволовых клетках человека линии Н1, дифференцированных и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия как описано в примере 5 после дня 4 стадии 5 и дня 6 стадии 6: PDX1 (Фиг. 23А); NKX6.1 (Фиг. 23B); NGN3 (Фиг. 23C); ABCC8 (Фиг. 23D); глюкагон (Фиг. 23E); и инсулин (Фиг. 23F). Аналогично результатам примера 4, культивирование панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и обработка ингибитором ALK5 II значительно повысило экспрессию инсулина и глюкагона. Обработка панкреатических клеток-предшественников передней кишки с другими ингибиторами ALK5 не привела к существенной экспрессии инсулина или глюкагона.
Таблица IV Ингибиторы ALK5 (также называемые рецепторами TGF-β), протестированные в примере 5 |
||
Соединение | Производитель | Номер по каталогу |
Ингибитор TGF-β рецептор V | EMD | 616456 |
Ингибитор TGF-β рецептор I | EMD | 616451 |
Ингибитор TGF-β рецептор IV | EMD | 616454 |
Ингибитор TGF-β рецептор VII | EMD | 616458 |
Ингибитор TGF-β рецептор VIII | EMD | 616459 |
Ингибитор TGF-β рецептор II | EMD | 616452 |
Ингибитор TGF-β рецептор VI | EMD | 616464 |
Ингибитор TGF-β рецептор III | EMD | 616453 |
Пример 6 Воздействие плотности клеточного посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на последующую дифференцировку в эндокринные клетки
Этот пример идентифицирует диапазон плотности посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и результирующую экспрессию эндокринных маркеров. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4,5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней. Затем, в конце стадии 3, клетки, культивированные на планарных чашках, были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты PBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), затем последовало удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,1, 0,5, 1 и 5×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение двух дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (14 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 10000 нM ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 и 1000 нМ T3 в течение четырнадцати дней.
Образцы РНК отбирались на стадиях 4, 5 и 6, и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 11 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 6 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 11A), глюкагон (Фиг. 11B), амилин (Фиг. 11C), инсулин (Фиг. 11D), NGN3 (Фиг. 11Е), NKX2.2 (Фиг. 11F), NKX6.1 (Фиг. 11G) и PDX1 (Фиг. 11H). Плотность посева в диапазоне 0,1-1×106 клеток/10 мкл привела к одинаковой экспрессии панкреатических энтодермальных и эндокринных маркеров на стадиях 5 и 6. При самой высокой протестированной плотности посева (5×106 клеток/10 мкл) в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия наблюдался спад экспрессии эндокринных маркеров.
Пример 7. Сравнение фильтровых вкладышей с размером пор 0,4, 1 и 3 микрон
Этот пример сравнивает воздействие размера пор фильтра на последующую дифференцировку в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение трех дней. Затем, в конце стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты PBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), затем последовало удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4, 1 или 3 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (15 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение пятнадцати дней.
Образцы РНК отбирались на стадии 6 и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 12 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в этом примере и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 12A), глюкагон (Фиг. 12B), амилин (Фиг. 12C), инсулин (Фиг. 12D), NGN3 (Фиг. 12Е), NKX2.2 (Фиг. 12F), NKX6.1 (Фиг. 12G) и PDX1 (Фиг. 12H). Фильтровые вкладыши с размером пор от 0,4 до 3 микрон не оказали значительного влияния на экспрессию панкреатических энтодермальных или эндокринных маркеров в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Пример 8. Сравнение дифференцировки панкреатических клеток-предшественников передней кишки в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с жидкостно-жидкостной (L/L) зоной взаимодействия на фильтровых вкладышах
Этот пример сравнивает воздействие культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с культивированием в жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия на дифференцировку панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 100 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. Для условий L/L среда также добавлялась на верхнюю часть фильтровых вкладышей, что приводит к получению жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (10 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение десяти дней.
Образцы РНК отбирались на стадиях 5 и 6, и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 13 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 8 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 13A), глюкагон (Фиг. 13B), амилин (Фиг. 13C), инсулин (Фиг. 13D), NGN3 (Фиг. 13Е), NKX2.2 (Фиг. 13F), NKX6.1 (Фиг. 13G) и PDX1 (Фиг. 13H). Наиболее значительная разница была отмечена в значительном повышении регуляции (7Х) глюкагона в условиях L/L в сравнении с воздушно-жидкостной зоной взаимодействия.
Пример 9. Панкреатические энтодермальные/эндокринные клетки-предшественники, культивированные в воздушно-жидкостной среде, могут применяться для скрининга библиотеки композиций
Этот пример изучает применение культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для скрининга библиотек композиций. Для осуществления этого эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (12 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение двенадцати дней. На этой стадии композиции, перечисленные в таблице V, были скринированы для идентификации потенциальных композиций, которые воздействуют на энтодермальные и эндокринные маркеры.
Таблица V
Список композиций, протестированных на стадии 6 |
|||
Кат. №/ Производитель | Ингибитор | Целевая киназа | Тестовая концентрация |
328007-EMD | ERK-ингибитор II | ERK1, ERK2 | 2 мкM |
420119-EMD | JNK-ингибитор II | JNK | 2 мкM |
420136-EMD | JNK-ингибитор IX | JNK2, JNK3 | 2 мкM |
444939-EMD | Ингибитор MEK1/2 | MEK1/2 | 2 мкM |
454861-EMD | Ингибитор MNK1 | MNK1 | 2 мкM |
475863-EMD | Ингибитор MK2a | MK2a | 2 мкM |
506156-EMD | Ингибитор V MAP-киназы p38 | p38, CK1 | 2 мкM |
513000-EMD | PD 98059 | MEK | 2 мкM |
553014-EMD | Ингибитор IV Raf-киназы | B-Raf | 2 мкM |
559389-EMD | SB 203580 | p38 MAPK | 2 мкM |
616373-EMD | Ингибитор Tpl2-киназы | Tpl2-киназа | 2 мкM |
692000-EMD | ZM 336372 | c-Raf 1 | 2 мкM |
M60043-25/XcessBio | IDH1 | Изоцитрата дегидрогеназа | 2 мкM |
M60668-25/XcessBio | AGI5198 | Изоцитрата дегидрогеназа | 2 мкM |
Образцы РНК отбирались на стадии 6 и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 14 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 9 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 14A), глюкагон (Фиг. 14B), амилин (Фиг. 14C), инсулин (Фиг. 14D), ISL-1 (Фиг. 14Е), MNX1 (Фиг. 14F), NKX6.1 (Фиг. 14G) и SLC30A8 (Фиг. 14H). Этот пример демонстрирует потенциал клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в качестве инструмента скрининга.
Пример 10. FACS-профиль клеток стадии 5-6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример изучает композицию культур стадии 5 и стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы на стадии 5 и стадии 6 с применением протокола, изложенного ниже.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (15 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 5-15 дней.
Урожай клеток был собран на стадии 5 и различных временных точках стадии 6, и проанализирован способом FACS. FACS окрашивание было осуществлено, как ранее описывалось (Diabetes, 61, 2016, 2012), с применением антител, перечисленных в таблице VI. На Фиг. 15 представлены FACS профили клеток, собранных на стадии 5. На Фиг. 16 представлены FACS профили клеток стадии 6 день 5, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. И наконец, на Фиг. 17 представлены профили клеток стадии 6 день 15, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Как показано на Фиг. 15, на стадии 5 было мало клеток, со-экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (~1%) и значительное количество PDX1-положительных клеток находились в активном клеточном цикле, как измерено со-экспрессией PDX1 и KI-67 (~23%; KI-67 является индикатором клеток, находящихся в клеточном цикле.) Однако, на стадии 6 день 5 (Фиг. 16) произошел значительный спад в пролиферации PDX1 + клеток (8%), в то время как наблюдался значительный рост количества NKX6.1 + клеток, со-экспрессирующих хромогранин-А (51%; хромогранин-А является пан эндокринным маркером) или инсулин (14%). Более того, отмечен значительный рост клеток, экспрессирующих эндокринные прекурсорные маркеры ISL-1, NeuroD и NKX2.2. Это означает, что уникальные культуры стадии 6 позволяют быстрое созревание клеток вне судьбы пролиферирующего прогенитора к раннему созреванию эндокринных клеток. Дополнительно, рост процентной доли клеток, со-экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (33%) наблюдался при продлении стадии 6 до 15 дней (Фигура 17), Более того, наблюдался дальнейший спад процентной доли клеток, положительных для PDX1, которые находились в клеточном цикле (1%) и дальнейший рост процентной доли ISL-1 и NeuroD. И наконец, большинство гормон-положительных клеток являлись одногормонными инсулин-положительными клетками (34% одногормонных инсулин-положительных клеток, 7% одногормонных глюкагон-положительных клеток и 8% полигормонных клеток). Значительная со-экспрессия NKX6.1 и хромогранина-А и одногормонный инсулин-положительные клетки, экспрессирующие NKX6.1 (>30%) отличают ранее неописанную популяцию клеток.
Таблица VI
Список антител, использованных в FACS анализах клеток, полученных в примере 10 |
|||
Антиген | Вид | Источник/кат. № | Разведение |
Глюкагон | Мышь | Sigma-Aldrich, G2654 | 1:250 |
Инсулин | Кролик | Cell Signaling, 3014B | 1:10 |
NKX6.1 | Мышь | Developmental Studies Hybridoma Bank; F55A12 | 1:50 |
NKX2.2 | Мышь | Developmental Studies Hybridoma Bank; | 1:100 |
PDX1 | Мышь | BD BioSciences, 562161 | 1:50 |
Ki67 | Мышь | BD Biosciences, 558595 | 1:20 |
Pax6 | Мышь | BD Biosciences, 561552 | 1:20 |
Хромогранин-А | Кролик | Dako, A0430 | 1:40 |
ISL-1 | Мышь | BD Biosciences, 562547 | 1:20 |
NEUROD | Мышь | BD Biosciences, 563001 | 1:40 |
FOXA2 | Мышь | BD Biosciences, 561589 | 1:80 |
Пример 11. Созревание в условиях in vivo NKX6.1+ Хромогранин-А+ инсулин+ клеток NKX6.1 + Хромогранин-А-инсулин- и панкреатических прогениторных клеток, со-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1 в сравнении с человеческими островками в SCID мыши
Этот пример описывает in vitro композицию дифференцированных клеток и влияние на поведение клеток в условиях in vivo. В частности, 5 миллионов панкреатических клеток-предшественников передней кишки (PDX1+ NKX6.1+), взятых на стадии 4 в день 4 и подготовленных в соответствии с примером 1 в планарных культурах, 5 миллионов NKX6.1+ хромогранин-А-отрицательных клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, и 3 миллиона NKX6.1+ хромогранин-А-положительных клеток, подготовленных в соответствии с примером 10 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия были трансплантированы в почечную капсулу не больных диабетом SCID мышей, как описано в (Diabetes 2012, 61(8):2016-29). У мышей отслеживали циркуляцию человеческого С-пептида как способа измерения состояния зрелости клеток во времени. Дополнительно, в отдельную партию мышей был трансплантирован эквивалент1500-4000 трупных человеческих островков (PRODO labs, Irvine, CA) в качестве положительного контроля.
NKX6.1+ хромогранин-А отрицательная популяция была подготовлена следующим образом:
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней. Затем клетки стадии 3 были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью ~2×106 клеток/10 мкл на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
d. Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 затем культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 100 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение двух дней.
e. Стадия 5 (2 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 50 нМ LDN-193189 и 500 нМ ингибитора ALK5 (SD208) в течение двух дней.
f. Стадия 6 (6 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5 в течение шести дней.
Таблица VII ниже описывает уровень экспрессии различных панкреатических энтодермальных и эндокринных маркеров для трех популяций, полученных из человеческих эмбриональный стволовых клеток. Более детально, таблица VII сравнивает следующие результаты: (1) популяция стадии 4 день 4, полученная в соответствии с примером 1 (стадия 4 день 4); (2) популяция панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученная в соответствии с примером 11 (панкреатические энтодермальные/эндокринные); и (3) NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+ популяция, полученная в соответствии с примером 10 (NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+). Информация по каждому FACS профилю представлена на Фиг. 17-19. В частности, Фиг.17 демонстрирует FACS профиль NKX6.1+ хромогранин-А+ популяции; Фиг.18 демонстрирует FACS профиль клеток стадии 4 день 4; и Фиг. 19 демонстрирует FACS профиль панкреатических эндокринных клеток стадии 6 день 6, полученных в соответствии с примером 11.
Таблица VII
Сравнение профиля экспрессии трех трансплантированных популяций, измеренной способом FACS |
|||
Популяция | |||
Маркер | Стадия 4 день 4a | Панкреатическая энтодермальная/ эндокриннаяb | NKX6.1+ хромогранин-A+ инсулин+c |
% PDX1+ Ki-67+ | 25 | 17 | 1 |
% NKX6.1+ хромогранин-A+ | 10 | 10 | 57 |
% NKX6.1-хромогранин-А+ | 19 | 53 | 31 |
% Инсулин+ NKX6.1+ | 1 | 1 | 33 |
a Популяция стадии 4 день 4 была получена в соответствии с примером 1 (см. Фиг. 18) b Панкреатическая энтодермальная/эндокринная популяция была получена в соответствии с примером 11. (см. Фиг. 19) c Популяция NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+ была получена в соответствии с примером 10 (см. Фиг. 17) |
После внедрения мышей периодически тестировали на концентрацию циркулирующего человеческого С-пептида. Циркуляция человеческого С-пептида тестировалась путем взятия крови из подкожной вены ноги. Плазма хранилась при -20°C и позднее анализировалась с применением человеческого С-пептида с помощью набора для анализа ELISA (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Результаты представлены графически на Фиг. 20.
Фигура 20 показывает кинетику производства С-пептида в трех популяциях, полученных из эмбриональных стволовых клеток, в сравнении с различными дозами человеческих островков. Популяция клеток, экспрессирующая значимую со-экспрессию NKX6.1 и хромогранина-А, и NKX6.1 и инсулина привела к существенно раннему производству С-пептида. Уровень производства С-пептида был аналогичен трансплантации приблизительно 4000 человеческих островков на 12 недель. Однако, через 16 недель после трансплантации, уровни человеческого С-пептида почти вдвое превзошла магнитуду С-пептида, которая наблюдалась при трансплантации 4000 человеческих островков.
Однако трансплантация прогениторных клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, или смешанной популяции панкреатических клеток-предшественников и полигормонных клеток (хромогранин-А+ NKX6.1-) потребовала существенно более длительных периодов времени для выделения уровней С-пептида, эквивалентных 4000 человеческих островков.
Пример 12. Добавление ингибитора гамма секретазы ХХ ускоряет созревание маркеров клеток стадии 6, культивируемых в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример демонстрирует, что ингибиторы NOTCH, такие как ингибиторы гамма секретазы, дополнительно увеличивают количество маркеров зрелости бета-клеток, одновременно поддерживая уровень экспрессии NKX6.1. Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 42) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
a) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
e) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (14 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2 % BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 14 дней.
На стадии 6 были протестированы различные дозы (от 100 нМ до 5000 нМ) ингибитора гамма секретазы ХХ (EMD, #565789). мРНК была собрана на стадии 6 день 4 и стадии 6 день 8. Фиг. 21 описывает данные анализа ПЦР для ключевых маркеров зрелости бета-клеток и панкреатических прогениторных маркеров. Как показано на Фиг. 21, маркеры зрелости, такие как амилин (панель 21А), инсулин (панель 21В) и MAFA (панель 21С) были значительно повышены, в то время как экспрессия NKX6.1 (панель 21D) не испытала значительного влияния. Однако панкреатические прекурсорные маркеры, такие как PTFF1 (панель 21Е) и SOX9 (панель 21F), были значительно понижены.
Пример 13. Присутствие ингибитора ALK5 важно для повышения MAFA и добавление Т3 также повышает экспрессию MAFA
Этот пример описывает способность добавки ингибитора ALK5 II к повышению экспрессии MAFA и что добавка Т3 с ингибитором ALK5 и LDN-193189 еще больше увеличивает экспрессию MAFA.
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 42) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×105 клеток/см2 на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
a) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-ного БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
e) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (8 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 8 дней.
На стадии 6 ингибитор ALK5, T3 или LDN были удалены в различных сочетаниях для проверки влияния каждого фактора на экспрессию NKX6.1, инсулина и MAFA. РНК была собрана на стадии 6 день 5 и стадии 6 день 8. Фиг. 22 описывает данные анализа ПЦР для ключевых маркеров зрелости бета-клеток и панкреатических прогениторных маркеров. Как показано на Фиг. 22, удаление ингибитора ALK5 на стадии 6 привело к резкому спаду экспрессии MAFA. В то же время сочетание ингибитора ALK5, LDN-183189 (ингибитор рецептора ВМР) и Т3 существенно улучшило экспрессию MAFA (Фиг. 22А), инсулина (Фиг. 22В), амилина (Фиг. 22С) и умеренно улучшило экспрессию NKX6.1 (Фиг. 22D).
Пример 14. Дополнительный протокол культивирования клеток стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример раскрывает дополнительные материалы и способы культивирования клеток стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Применялись следующие материалы: 10-сантиметровые фильтры от компании Corning (кат. № 3419, 0,4 микрон поликарбонатная мембрана), среда MCDB-131 (Invitrogen, кат. №10372-019) или среда BLAR (производства компании Invitrogen); ITS-X (Invitrogen, Ca); гормон щитовидной железы (Т3); Sigma ингибитор ALK5 II- ENZO (кат. № ALX-27-445); LDN-193189- StemGent (#04-0074); гепарин (Sigma, H3149); и BSA без жирных кислот (Proliant/Lampire, 7500804).
Подготовка базальной среды стадии 6: Добавить 1,5 г/л натрия бикарбоната в среду MCDB 131, плюс 2% BSA, плюс 1:200 ITS-X, плюс дополнительные 15 мМ глюкозы.
Подготовка дифференцировочной среды стадии 6: К базальной среде стадии 6 добавить 10 мМ ингибитора ALK5 II, 100 нМ LDN-193189 и 1 мМ Т3.
Способы
Добавить 7,5 мл дифференцировочной среды стадии 6 на дно фильтрового вкладыша размером 10 см. Добавить кластеры клеток в небольших объемах (20-30 мкл) на верхнюю часть фильтровых вкладышей. Как правило, примерно 50 клеточных кластеров размещаются на 10 см вкладыша. При посеве каждый клеточный кластер содержит приблизительно 0,5 М клеток.
Предпочтительно заменять среду ежедневно. Клетки могут быть удалены с фильтрового вкладыша путем удаления клеточных агрегаций индивидуально, например, при помощи пипетки с широким просветом, или же все агрегации могут быть удалены одновременно путем промывания верхних частей фильтра базальной средой. Клеточные агрегации слабо закреплены на вкладышах.
В дополнение к специфическим условиям культивирования, описанным в вышеизложенных примерах, другие подходящие условия для дифференцировки плюрипотентных клеток или их прогениторов в панкреатические эндокринные клетки перечислены далее в таблицах VIII-XIII. В этих таблицах «инг. ALK5» значит «ингибитор ALK5», «RA» - ретиноевая кислота, «Вит. С» - аскорбиновая кислота, «инг.» - ингибитор, «акт.» - активатор, ZnSO4 - цинка сульфат, «МСХ» - композиция МСХ, и «АА» - активин А. В определенных вариантах осуществления любая из обработок на одной стадии (например, стадии 4) может быть скомбинирована с любой обработкой на другой стадии (например, стадии 5).
Таблица VIII
Протокол дифференцировки клеток, включающий культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия |
||||||
Стадия 1 | Стадия 2 | Стадия 3 | Стадия 4 | Фильтр стадии 5 | Фильтр стадии 6 | |
Базовая среда | MCDB131 Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) | MCDB131 Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) | BLAR Высокий Бикарбонат (Общее количество: 2,93 г/л) | BLAR Высокий Бикарбонат (Общее количество: 2,93 г/л) | BLAR Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) | BLAR Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л) |
Обогащение | 0,5% FAF-BSA, 10 мМ глюкозы | 0,5% FAF-BSA, 10 мМ глюкозы | 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 10 мМ глюкозы |
2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 10 мМ глюкозы | 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 20 мМ глюкозы | 2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 20 мМ глюкозы |
Факторы роста | 100 нг/мл GDF8 | 25 нг/мл FGF7 | 25 нг/мл FGF7 | 2 нг/мл FGF7 | 10 мкг/мл гепарина | 10 мкг/мл гепарина |
Низко-молекулярный антагонист/ антагонист | 1.0 мкM MCX День 1 100 нM MCX на День 2 |
0,25 мM Вит. C | 1 мкM ретиноевой кислоты 0,25 мкM SANT 200 нM TPB 100 нM LDN-193189 0,25 мM Вит. C |
100 нM LDN 0,25 мкM SANT 100 нM TPB 100 нM ретиноевой кислоты 0,25 мM Вит. C |
0,25 мкM SANT 50 нM ретиноевой кислоты 10000 нM инг. ALK5 100 нM LDN-193189 10 мM ZnSO4 |
10000 нM инг. ALK5 1 мкМ T3 100 нM LDN-193189 10 мM ZnSO4 |
Продолжительность (дней) | Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 3-15 дней |
Тип культуры | Планарная | Планарная | Планарная | Планарная | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия |
Таблица IX
Реагенты, использованные в протоколе дифференцирования, описанном в таблице VII |
|||
Реактив | Концентрация | Производитель | № по каталогу |
MCDB131 BLAR (изготовленная на заказ среда) |
(Добавить 1:100 X Glutamax) Промежуточный бикарбонат: Добавить 1,5 г натрия бикарбоната/1000 мл среды. Высокий бикарбонат: Добавить 2,5 г бикарбоната/1000 мл среды |
Invitrogen | 10372019 |
FAF-BSA | 0,5% на стадиях 1-2 2% на стадиях 3-6 |
Proliant | 68700 |
ITS-X | раствор 1:200 | Invitrogen | 51500056 |
Глюкоза | 10 мM на стадиях 1-4 20 мM на стадиях 5-6 |
Sigma | G8769 |
GDF8 | 100 нг/мл | Peprotech | 120-00 |
MCX | 1,0 мкМ в день 1 и 100 нМ на день 2 | ||
FGF7 | 25 нг/мл на стадии 2, 25 нг/мл на стадии 3, 2 нг/мл на стадии 4 | R & D Systems | 251-KG |
RA | 1 мкМ на стадии 3 100 нM на стадии 4 50 нM на стадии 5 |
Sigma | R2625 |
SANT-1 (SHH ингибитор) | 0,25 мкM | Sigma | S4572 |
LDN-193189 (антагонист ВМР r) |
100 нM на стадиях 3-6 | Stemgent | 04-0019 |
ТРВ (активатор РКС) | 200 нМ на стадии 3, 100 нМ на стадии 4 | ChemPartner | Дополнительно |
Аскорбиновая кислота (Вит. С) | 0,25 мM на стадиях 2-4 | Sigma | A4544 |
Ингибитор ALK5 II | 10000 нM на стадиях 5-6 | ENZO | ALX-270-445 |
T3 | 1 мкМ на стадии 6 | Sigma | T6397 |
Гепарин | 10 мкг/мл на стадиях 5-6 | Sigma | H3149 |
Цинка сульфат | 10 мкМ на стадиях 5-6 | Sigma | Z0251 |
Фильтровые вкладыши на 6-лунковых пластинах | 0,4 микрон фильтры от BD или Millipore | BD Millipore |
353493 PIHT15R48 |
Таблица X
Примеры культуральных условий, пригодных для применения в способах Изобретения |
|||
Стадия 4 | Стадия 5 | Стадия 6 | |
Обработка | клетки стадии 3 | клетки стадии 4 | Стадия 5 |
с по меньшей мере | Инг. ALK5; Noggin | ||
RA; FGF7; Вит. С. | |||
T3 | |||
Инг. ALK5 | |||
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II) | |||
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II); RA; LDN-193189 | |||
инг ALK5 (например, инг. ALK5 II); RA; LDN-193189 | |||
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II) | |||
Т3; инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II) & LDN-193189 | |||
Т3; инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II); LDN-193189 и гепарин | |||
Другие необязательные компонентыа (по меньшей мере один из перечисленных) |
PKC aкт. (например, TPB); SANT-1; ROCK инг. (например, Y27632) | RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN-193189); гепарин | RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN-193189); гепарин |
Культивирование: | Планарное (воздушно-жидкостная зона взаимодействия не в обязательном порядке в конце стадии 4) | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия |
Продолжительность обработки | Приблизительно 2-4 дня; предпочтительно 2-3 дня | Приблизительно 2-4 дня; предпочтительно 2-3 дня | Приблизительно 3-15 дней |
а исключены из списка, если упомянуты в категории «с по меньшей мере» |
Примерные диапазоны компонентов, упомянутых в таблице Х, примененные в способах настоящего изобретения, показаны ниже:
Таблица XI
Примеры объемов культуральных компонентов, пригодных для применения в способах настоящего изобретения |
||
Компонент | Примерный пригодный объем | Альтернативно |
T3 | около 0-1500 нМ | около 10 нМ около 1000 нМ |
Ингибитор ALK5 | от около 75 нМ до около 15000 нМ | около 100 нМ около 200 нМ около 1000 нМ около 2000 нМ около 10000 нМ |
SANT-1 | приблизительно от 0,1 мкМ до 0,3 мкМ | около 0,25 мкМ |
Ретиноевая кислота | приблизительно от 25 нМ до 150 нМ | около 50 нМ около 100 нМ |
Аскорбиновая кислота | от около 0,1 до около 0,4 мМ | около 0,25 мМ |
FGF7 | от около 2 до около 35 нг/мл | около 2 нг/мл около 25 нг/мл |
ингибитор рецептора ВМР (например, LDN-193189) | от около 50 до около 150 мМ | около 100 мМ |
PKC активатор (например, TPB) | от около 50 до около 150 мМ | около 200 мМ |
Noggin | от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл | около 100 нг/мл |
Гепарин | от около 5 мкг/мл до около 15 мкг/мл | около 10 мкг/мл |
ROCK ингибитор (например, Y27632) | приблизительно от 5 мкМ до 15 мкМ | около 10 мкМ |
Цинка сульфат | приблизительно от 5 мкМ до 15 мкМ | около 10 мкМ |
Таблица XI ниже иллюстрирует альтернативные примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Таблица XII
Примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения |
||||||
Стадия 1 | Стадия 2 | Стадия 3 | Стадия 4 | Стадия 5 | Стадия 6 | |
Обработка | Плюри-потентные стволовые клетки | клетки стадии 1 | клетки стадии 2 | клетки стадии 3 | клетки стадии 4 | Стадия 5 |
С по меньшей мере | GDF8 и MCX | |||||
AA и Wnt3A | ||||||
FGF7 и Вит. С | ||||||
FGF7; RA; SANT; TPB; LDN и Вит. C | ||||||
Инг. ALK5, Noggin | ||||||
RA; FGF7; Вит. С. | ||||||
T3 | ||||||
FGF7; LDN-193189; SANT; TPB; RA и Вит. C | ||||||
Инг. ALK5 | ||||||
Т3 и инг. ALK5 | ||||||
Т3 и инг. ALK5, RA | ||||||
Инг. ALK5, RA, LDN | ||||||
гепарин; SANT; RA; инг. ALK5; LDN; ZnSO4 | ||||||
Т3 и инг. ALK5 | ||||||
Т3; инг. ALK5 и LDN | ||||||
T3, инг. ALK5, LDN и гепарин | ||||||
гепарин; инг. ALK5; T3; LDN; ZnSO4 | ||||||
Прочие необязательные компоненты а (по меньшей мере один из перечисленных) | PKC aкт. (например, TPB); SANT-1; ROCK инг. (например Y27632) |
RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN); гепарин | RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO4; BMP инг. (например, LDN); гепарин | |||
Продолжительность (дней) | Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 3-15 дней; предпочтительно около 7-15 дней |
Тип культуры | Планарная | Планарная | Планарная | Планарная (воздушно-жидкостная зона взаимодействия не в обязательном порядке в конце стадии 4) | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр) | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр) |
а исключены из списка, если упомянуты в категории «с по меньшей мере». |
Таблица XII ниже иллюстрирует альтернативные примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Таблица XШ
Примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения. |
||||||
Стадия 1 | Стадия 2 | Стадия 3 | Стадия 4 | Стадия 5 | Стадия 6 | |
Обработка | Плюри-потентные стволовые клетки | клетки стадии 1 | клетки стадии 2 | клетки стадии 3 | клетки стадии 4 | Стадия 5 |
С по меньшей мере | GDF8 и MCX |
FGF7 и Вит. С |
FGF7; RA; SANT; TPB; LDN и Вит. C | FGF7; LDN; SANT; TPB; RA и Вит. C | гепарин; SANT; RA; инг. ALK5; LDN; ZnSO4 | гепарин; инг. ALK5; T3; LDN; ZnSO4 |
Примерные объемы | ~100 нг/мл GDF8 и ~1.0 мкM MCX день 1 ~100 нM MCX на день 2 |
~25 нг/мл FGF7; ~0,25 мМ Вит. C | ~25 нг/мл FGF7; ~1 мкM RA ~0,25 мкM SANT ~200 нM TPB ~100 нM LDN ~0,25 мM Вит. C |
~2 нг/мл FGF7; ~100 нM LDN ~0,25 мкM SANT ~100 нM TPB ~100 нM RA ~0,25 мM Вит. C |
~0,25 мкM SANT ~50 нM RA ~10000 нM инг. ALK5 ~100 нM LDN ~10 мM ZnSO4 |
~10 мкг/мл гепарина; ~10000 нM инг. ALK5 ~1 мкM T3 ~100 нM LDN ~10 мM ZnSO4 |
Продолжительность (дней) | Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней | Приблизительно 3-15 дней; предпочтительно около 7-15 дней |
Тип культуры | Планарная | Планарная | Планарная | Планарная | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр) | Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр) |
Как детально описано выше, настоящее изобретение представляет, inter alia, способ формирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для бета-клеток, включая дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем обработки средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или и Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В одном из вариантов осуществления только клетки стадии 4-6 путем культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетки стадии 6 могут быть положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9. Соответственно, изобретение также представляет способ включения экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, включающий: (а) культивирование плюрипотентных стволовых клеток; (b) дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки; и (с) дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1 и НВ9, путем обработки средой, обогащенной Т3/Т4, ингибитором ALK5 или и Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Далее, полученные клетки стадии 6 могут быть клетками, положительными для одного гормона. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6 со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А. В другом варианте осуществления клетки стадии 6 со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
В определенных вариантах осуществления способ включает обработку клеток стадии 5 средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5, например ингибитором ALK5 II. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевая кислота, аскорбиновая кислота, SANT-1 или LDN-139189.
Хотя изобретение было описано и проиллюстрировано ссылками на различные конкретные материалы, процедуры и примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными комбинациями материалов и процедур, выбранными для этой цели. Многочисленные изменения, касающиеся таких деталей изобретения, будут очевидными для специалистов в данной области техники. Подразумевается, что все описания и примеры представлены только в качестве иллюстрации и находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, что отражено в нижеприведенной формуле изобретения. Все ссылки, патенты и заявки на патенты, приведенные в этой заявке, полностью включены в этот документ путем отсылки.
Claims (23)
1. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, и клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников, включающий обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, ингибитором ALK5, или гормоном щитовидной железы, выбранным из трийодотиронина, тироксина, аналогов трийодотиронина, аналогов тироксина или их смеси, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, где указанные клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, не выделяют из эмбрионов человека.
2. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1β, PTF1α, HNF6, HNF4α, SOX9, NGN3, гастрин, HB9 и PROX1.
3. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, представляют собой панкреатические энтодермальные клетки.
4. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеток-предшественников поджелудочной железы, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD1, ISL1, PAX4, PAX6 и ARX.
5. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, представляют собой панкреатические эндокринные клетки-предшественники.
6. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, гастрин, FOXA2, PTF1a, PROX1 и HNF4α.
7. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, представляют собой панкреатические клетки-предшественники передней кишки.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором клетки представляют собой клетки человека.
9. Способ по п. 1, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток передней кишки, ингибитором ALK5 и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
10. Способ по п. 1, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, гормоном щитовидной железы, выбранным из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, аналогов тироксина и их смесей, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
11. Способ по п. 1, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы, выбранным из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, аналогов тироксина и их смесей, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
12. Способ по пп. 1, 9 или 11, в котором ингибитор ALK5 выбирают из группы, включающей ингибитор ALK5 II, ALK5i, SD208, ингибитор TGF-B SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III.
13. Способ по п. 12, в котором ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
14. Способ по любому из пп. 1, 10 или 11, в котором гормон щитовидной железы представляет собой трийодтиронин.
15. Способ по любому из пп. 1 или 11, в котором гормон щитовидной железы представляет собой трийодтиронин, и ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
16. Способ по п. 1, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, аналогов тироксина и их смесей, или обработку одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы и одним или несколькими веществами из числа ретиноевой кислоты, аскорбиновой кислоты, сульфата цинка, гепарина, SANT-1 и LDN-193189 и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
17. Способ по п. 16, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, сульфатом цинка, гепарином, SANT-1, LDN-193189, ингибитором ALK5 или тиреоидным гормоном, выбранным из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, аналогов тироксина и их смесей, или обработку одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
18. Способ по п. 1, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, с антагонистом пути передачи сигналов SHH, выбранным из SANT-1 или HPI-1, ингибитором рецептора BMP, выбранного из LDN-193189, Noggin или Chordin, ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранного из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, аналогов тироксина и их смесей, или обработку одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
19. Способ по любому из пп. 16-18, в котором ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
20. Способ по любому из пп. 16-18, в котором гормон щитовидной железы представляет собой трийодтиронин.
21. Способ по любому из пп. 16-18, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки ингибитором ALK5.
22. Способ по любому из пп. 16-18, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, гормоном щитовидной железы, выбранным из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, аналогов тироксина и их смесей.
23. Способ по любому из пп. 16-18, в котором способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы, выбранным из группы, состоящей из трийодтиронина, тироксина, аналогов трийодтиронина, тироксиновых аналогов и их смесей.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261747662P | 2012-12-31 | 2012-12-31 | |
US61/747,662 | 2012-12-31 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015131835A Division RU2658488C2 (ru) | 2012-12-31 | 2013-12-18 | Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018116648A RU2018116648A (ru) | 2018-10-24 |
RU2018116648A3 RU2018116648A3 (ru) | 2021-08-26 |
RU2768963C2 true RU2768963C2 (ru) | 2022-03-25 |
Family
ID=51017432
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018116647A RU2018116647A (ru) | 2012-12-31 | 2013-12-18 | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
RU2018116648A RU2768963C2 (ru) | 2012-12-31 | 2013-12-18 | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
RU2015131835A RU2658488C2 (ru) | 2012-12-31 | 2013-12-18 | Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018116647A RU2018116647A (ru) | 2012-12-31 | 2013-12-18 | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015131835A RU2658488C2 (ru) | 2012-12-31 | 2013-12-18 | Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10344264B2 (ru) |
EP (1) | EP2938724B1 (ru) |
JP (1) | JP6557146B2 (ru) |
KR (1) | KR102084561B1 (ru) |
CN (1) | CN105008518B (ru) |
AR (1) | AR094347A1 (ru) |
AU (4) | AU2013368221B2 (ru) |
BR (1) | BR112015015770A2 (ru) |
CA (1) | CA2896655C (ru) |
DK (1) | DK2938724T3 (ru) |
ES (1) | ES2837763T3 (ru) |
HK (1) | HK1217110A1 (ru) |
MX (1) | MX2015008577A (ru) |
PH (1) | PH12015501465A1 (ru) |
RU (3) | RU2018116647A (ru) |
SG (2) | SG11201505128SA (ru) |
WO (1) | WO2014105543A1 (ru) |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101952415B (zh) | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CA2706560C (en) | 2007-11-27 | 2017-02-28 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
WO2011011300A2 (en) | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
BR112014015417A8 (pt) | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
GB2531952C (en) * | 2013-06-11 | 2019-10-09 | Harvard College | Differentiated pancreatic ß cells and methods of differentiating progenitor cells to such cells |
CA2949056A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
US10443042B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US10190096B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-01-29 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived β cells and uses thereof |
WO2016100921A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF |
US10253298B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-04-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof |
MA45329A (fr) | 2016-04-08 | 2019-02-13 | Univ California | Production de cellules bêta matures pleinement fonctionnelles à partir de progénitrices pancréatiques humaines |
KR101870240B1 (ko) * | 2016-04-12 | 2018-06-22 | 서울대학교산학협력단 | 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법 |
MA45502A (fr) | 2016-06-21 | 2019-04-24 | Janssen Biotech Inc | Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases |
CA3032972A1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-02-22 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Methods of differentiating stem cells into endoderm |
JP6869554B2 (ja) * | 2016-08-24 | 2021-05-12 | 学校法人慶應義塾 | ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用2dオルガノイド及びその使用 |
FR3061206B1 (fr) * | 2016-12-23 | 2020-06-26 | Laboratoires Clarins | Modele de peau incluant epiderme, derme et hypoderme, son procede de preparation et son utilisation |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
BR112020009275A2 (pt) | 2017-11-15 | 2020-10-27 | Semma Therapeutics, Inc. | composições de fabricação de célula de ilhota e métodos de uso |
EP3833365A4 (en) | 2018-08-10 | 2022-05-11 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | ISLE DIFFERENTIATION DERIVED FROM STEM CELLS |
US10724052B2 (en) | 2018-09-07 | 2020-07-28 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
US20210340499A1 (en) * | 2018-09-25 | 2021-11-04 | The Regents Of The University Of California | Production and Enrichment of Pancreatic Endocrine Progenitor Cells |
EP3972614A4 (en) * | 2019-05-21 | 2023-08-23 | President and Fellows of Harvard College | ENDOCRINE DIFFERENTIATION INDUCTION MOLECULE |
CA3139292A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | Timothy M. BRUHN | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
JP2022535239A (ja) | 2019-05-31 | 2022-08-05 | ダブリュ.エル.ゴア アンド アソシエイツ,インコーポレイティド | 生体適合性メンブレン複合体 |
US20220370184A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-11-24 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
CA3139591C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-16 | Timothy M. BRUHN | A biocompatible membrane composite |
EP4025224A1 (en) | 2019-09-05 | 2022-07-13 | CRISPR Therapeutics AG | Universal donor cells |
US11118195B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-09-14 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
AU2021414405A1 (en) | 2020-12-31 | 2023-08-10 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CN112980774B (zh) * | 2021-03-19 | 2022-04-01 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养方法 |
CN112961823B (zh) * | 2021-03-19 | 2024-01-23 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液 |
CN113046299B (zh) * | 2021-03-19 | 2024-06-28 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的添加剂 |
AU2022366819A1 (en) * | 2021-10-15 | 2024-05-02 | Thymmune Therapeutics, Inc. | Thymic cells and methods of making |
WO2023201361A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Aspen Neuroscience, Inc. | Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells |
CN115011544B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-11-17 | 广州国家实验室 | 体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006088867A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Medistem Laboratories, Incorporated | Method for expansion of stem cells |
US20110281355A1 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of Human Embryonic Stem Cells |
US20120052576A1 (en) * | 2010-08-31 | 2012-03-01 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of Pluripotent Stem Cells |
Family Cites Families (267)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
US5804178A (en) | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
DK0628639T3 (da) | 1991-04-25 | 2000-01-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Rekonstitueret humant antistof mod human interleukin-6-receptor |
US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
WO1994023572A1 (en) | 1993-04-08 | 1994-10-27 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
JP4079461B2 (ja) | 1994-12-29 | 2008-04-23 | 中外製薬株式会社 | Il−6アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤 |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
US5681561A (en) | 1995-06-07 | 1997-10-28 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for improving autologous fat grafting |
PL191111B1 (pl) | 1997-04-24 | 2006-03-31 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Podstawione imidazole, sposób ich wytwarzania, kompozycje zawierające podstawione imidazole oraz ich zastosowanie |
ATE358493T1 (de) | 1997-07-03 | 2007-04-15 | Osiris Therapeutics Inc | Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
US6521427B1 (en) | 1997-09-16 | 2003-02-18 | Egea Biosciences, Inc. | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
AU1197699A (en) | 1997-10-23 | 1999-05-10 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
US6372779B1 (en) | 1997-12-29 | 2002-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Anti-inflammatory compounds |
AU755888B2 (en) | 1998-03-18 | 2003-01-02 | Mesoblast International Sarl | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
US6458593B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-10-01 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
DE60037107T2 (de) | 1999-02-11 | 2008-09-25 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Pluripotente embryonale keimzellinie aus vögeln |
US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
WO2001023528A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | University Of Florida Research Foundation | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
AU778155B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-11-18 | Scripps Research Institute, The | Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
EP2295539A1 (en) | 2000-06-26 | 2011-03-16 | Nc Medical Research Inc. | Cell fractions containing cells capable of differentiating into neural cells |
CN100525768C (zh) | 2000-10-23 | 2009-08-12 | 史密丝克莱恩比彻姆公司 | 新化合物 |
MXPA03005139A (es) | 2000-12-08 | 2004-01-29 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos macroheterociclicos utiles como inhibidores de cinasa. |
RU2003117078A (ru) | 2000-12-08 | 2004-12-10 | Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. (Us) | Индазолил-замещенные соединения пирролина в качестве ингибиторов киназы |
US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
CA2435826A1 (en) | 2001-01-24 | 2002-08-01 | The Government Of The United States Of America | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
PT3078667T (pt) | 2001-01-25 | 2018-12-28 | The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services | Formulação de compostos de ácido borónico |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
WO2002086107A2 (en) | 2001-04-19 | 2002-10-31 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
JP4296781B2 (ja) | 2001-04-24 | 2009-07-15 | 味の素株式会社 | 幹細胞及びその分離方法 |
EP1393066A4 (en) | 2001-05-15 | 2006-01-25 | Rappaport Family Inst For Res | INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS |
US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
CA2456981C (en) | 2001-08-06 | 2012-02-28 | Bresagen, Inc. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
US20030138951A1 (en) | 2001-10-18 | 2003-07-24 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
AU2002363659B2 (en) | 2001-11-15 | 2008-09-25 | Children's Medical Center Corporation | Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof |
US7033831B2 (en) | 2001-12-07 | 2006-04-25 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
EP2305276A3 (en) | 2001-12-07 | 2011-09-21 | Cytori Therapeutics, Inc. | Processed lipoaspirate cells for use in therapy |
AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
JP2005512593A (ja) | 2001-12-28 | 2005-05-12 | セルアーティス アーベー | 多能性のヒト胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法 |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
WO2003087349A1 (fr) | 2002-04-17 | 2003-10-23 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Methode de formation de cellules pancreatiques $g(b) a partir de cellules mesenchymales |
US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
DE60319364T2 (de) | 2002-05-08 | 2009-02-19 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) * | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
JP2006512046A (ja) | 2002-05-28 | 2006-04-13 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | invitroにおけるヒト膵臓腺房細胞の増殖およびインスリン産生細胞への分化転換のための方法 |
EP1513830A1 (en) | 2002-06-05 | 2005-03-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
JP2005534345A (ja) | 2002-07-29 | 2005-11-17 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | インスリン陽性、グルコース応答性細胞の分化のための多段階方法 |
WO2004016747A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
AU2003268534A1 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-29 | Amcyte Inc. | Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
AU2003302702B2 (en) | 2002-12-05 | 2008-08-07 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
KR101156745B1 (ko) | 2002-12-16 | 2012-06-15 | 테크니온 리서치 앤드 디벨롭먼트 파운데이션 리미티드 | 지지세포 비함유, 이종 비함유의 인간 배아줄기세포의 조제방법 및 이들을 사용하여 조제되는 줄기세포 배양물 |
US20050118148A1 (en) | 2002-12-20 | 2005-06-02 | Roland Stein | Compositions and methods related to mammalian Maf-A |
RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
US7976853B2 (en) | 2003-01-29 | 2011-07-12 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Process for producing coated preparation |
WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
US20060194315A1 (en) | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
CA2530421C (en) | 2003-06-27 | 2015-04-21 | Ethicon, Incorporated | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US20050042595A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Banking of multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
US20060205072A1 (en) | 2003-08-27 | 2006-09-14 | Nobuko Uchida | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
US6939633B2 (en) | 2003-09-17 | 2005-09-06 | General Motors Corporation | Fuel cell shutdown and startup using a cathode recycle loop |
WO2005058301A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
GB0329498D0 (en) | 2003-12-19 | 2004-01-28 | Novartis Ag | Organic compounds |
US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
US7541185B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-06-02 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
CN103898045B (zh) | 2003-12-23 | 2019-02-01 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
CN1946838A (zh) | 2003-12-23 | 2007-04-11 | 赛瑟拉公司 | 定形内胚层 |
US20050233446A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
US20080241107A1 (en) | 2004-01-23 | 2008-10-02 | Copland Iii John A | Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells |
US20070298453A1 (en) | 2004-02-12 | 2007-12-27 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem Cells |
JP4901471B2 (ja) | 2004-02-19 | 2012-03-21 | 国立大学法人京都大学 | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
AU2005221095A1 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | John J. O'neil | Methods for generating insulin-producing cells |
CA2558486A1 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Alberto Hayek | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
US7892835B2 (en) | 2004-03-23 | 2011-02-22 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Pluripotent stem cell growing method |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
WO2005097977A2 (en) | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
KR101278421B1 (ko) | 2004-04-27 | 2013-07-15 | 비아싸이트, 인크. | Pdx1 발현 내배엽 |
WO2005121011A1 (en) | 2004-06-08 | 2005-12-22 | Il Shik Yoon | Prefabricated light reflecting system mounted to ceiling of elevator cage |
CA2573283C (en) | 2004-07-09 | 2023-03-14 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
JP5102030B2 (ja) | 2004-08-13 | 2012-12-19 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法 |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
JP2006075022A (ja) * | 2004-09-07 | 2006-03-23 | Foundation For Biomedical Research & Innovation | 膵臓ホルモン産生細胞取得方法 |
US7442548B2 (en) | 2004-09-08 | 2008-10-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells in medium containing pipecholic acid and gamma amino butyric acid |
KR101264940B1 (ko) | 2004-09-08 | 2013-05-15 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 |
CA2596231A1 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Novathera Ltd | Methods for embryonic stem cell culture |
CA2613812A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
WO2006094286A2 (en) | 2005-03-04 | 2006-09-08 | John O'neil | Adult pancreatic derived stromal cells |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
EP1876893B1 (en) | 2005-04-15 | 2012-04-11 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
WO2006114097A2 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
JP4557797B2 (ja) | 2005-05-20 | 2010-10-06 | 株式会社日立製作所 | 光ディスク装置 |
WO2006126574A1 (ja) | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Kumamoto University | Es細胞の分化誘導方法 |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
BRPI0611733A2 (pt) | 2005-06-10 | 2010-09-28 | Irm Llc | compostos que mantêm pluripotência de células-tronco embriÈnicas |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
US20080199959A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-08-21 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method For Cell Culture |
CN107189980B (zh) | 2005-06-22 | 2021-07-09 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 人胚胎干细胞的悬浮培养物 |
CA2611438C (en) | 2005-06-30 | 2014-01-07 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Cyclic anilino-pyridinotriazines |
US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
US20090087907A1 (en) | 2005-07-29 | 2009-04-02 | Alice Pebay | Compositions and Methods for Growth of Pluripotent Cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
EP1962719A4 (en) | 2005-08-29 | 2011-05-04 | Technion Res And Dev Of Foundation Ltd | MEDIA FOR BREEDING STEM CELLS |
CN101341245A (zh) | 2005-09-02 | 2009-01-07 | 新加坡科技研究局 | 获取祖细胞系的方法 |
WO2007030870A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Es Cell International Pte Ltd | Cardiomyocyte production |
US20100322906A1 (en) | 2005-10-05 | 2010-12-23 | Osaka University | Method for Obtaining Pancreatic Endocrine Cells From Adipose Tissue-Origin Cells |
AU2006304318B2 (en) | 2005-10-14 | 2012-12-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
US7732202B2 (en) | 2005-10-21 | 2010-06-08 | International Stem Cell Corporation | Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells |
DK1957636T3 (en) | 2005-10-27 | 2018-10-01 | Viacyte Inc | PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FORTARM ENDODERM |
PT1970446E (pt) | 2005-12-13 | 2011-09-01 | Univ Kyoto | Factor de reprogramação nuclear |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
DK2420565T3 (en) | 2006-02-23 | 2017-12-04 | Viacyte Inc | APPLICABLE COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTIVATING DIFFERENTIBLE CELLS |
US7695965B2 (en) * | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
DK2650360T3 (da) * | 2006-03-02 | 2019-10-07 | Viacyte Inc | Endokrine prekursorceller, pancreatiske hormon udtrykkende celler og fremgangsmåder til fremstilling |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
EP3527658B1 (en) | 2006-04-28 | 2024-07-24 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
GB2452186B (en) | 2006-05-02 | 2011-01-26 | Wisconsin Alumni Res Found | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
WO2007139929A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
AU2007254766A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems |
WO2007149182A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
CA2656175C (en) | 2006-06-26 | 2018-08-28 | Lifescan, Inc. | Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
WO2008004990A2 (en) | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Es Cell International Pte Ltd | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
DK3441459T3 (da) | 2006-08-02 | 2021-06-07 | Technion Res & Dev Foundation | Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
WO2008039521A2 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Nmt Medical, Inc. | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
WO2008049027A1 (en) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Stiefel Laboratories, Inc. | Talarazole metabolites |
US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
US8835163B2 (en) | 2006-10-18 | 2014-09-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
WO2008056779A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan | Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire |
US8217027B2 (en) | 2006-12-21 | 2012-07-10 | Abbott Laboratories | Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
CA2676044C (en) | 2007-01-30 | 2019-10-22 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc) |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
WO2008148105A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
KR20160005142A (ko) | 2007-06-29 | 2016-01-13 | 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 | 배아줄기세포 배양을 위한 자동화 방법 및 장치 |
CN101978044B (zh) | 2007-07-01 | 2017-10-24 | 生命扫描有限公司 | 单个多能干细胞培养 |
MX2010000746A (es) * | 2007-07-18 | 2010-07-05 | Lifescan Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
WO2009048675A1 (en) | 2007-07-31 | 2009-04-16 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells |
CN101952415B (zh) | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CA2696622C (en) | 2007-08-24 | 2016-07-19 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Compositions for the treatment of neoplastic diseases |
US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
CA2706560C (en) | 2007-11-27 | 2017-02-28 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
CN102046779A (zh) | 2008-02-21 | 2011-05-04 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
JPWO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2011-07-14 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
JP2011514169A (ja) | 2008-03-17 | 2011-05-06 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア |
RU2359030C1 (ru) | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
EP2727998B1 (en) | 2008-04-21 | 2019-06-12 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
WO2009154606A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
MX2011000125A (es) | 2008-06-30 | 2011-02-25 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre pluripotentes. |
CA2729734A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
WO2010022395A2 (en) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of reprogramming cells |
MX349178B (es) | 2008-10-31 | 2017-07-17 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciación de células madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreático. |
PL2346988T3 (pl) | 2008-10-31 | 2017-10-31 | Janssen Biotech Inc | Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych do linii endokrynnej trzustki |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
EP2356213B1 (en) | 2008-11-04 | 2019-05-29 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
JP2012508584A (ja) | 2008-11-14 | 2012-04-12 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化 |
MX2011005288A (es) | 2008-11-20 | 2011-06-01 | Centocor Ortho Biotech Inc | Celulas madre pluripotentes en microportadores. |
DK2356218T3 (en) | 2008-12-05 | 2017-08-21 | Inserm (Institut Nat De La Santé Et De La Rech Médicale) | METHOD AND MEDIUM FOR NEURAL DIFFERENTIZATION OF PLURIPOTENT CELLS |
RU2540021C2 (ru) | 2009-07-20 | 2015-01-27 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека |
MX2012000898A (es) | 2009-07-20 | 2012-06-01 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
WO2011011300A2 (en) | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
AU2010283229B2 (en) | 2009-08-12 | 2015-04-02 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells |
KR101861584B1 (ko) | 2009-10-29 | 2018-05-28 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 만능 줄기 세포 |
ES2932664T3 (es) | 2009-11-12 | 2023-01-23 | Technion Res & Dev Foundation | Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
JP5882226B2 (ja) | 2009-12-23 | 2016-03-09 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | ヒト胚性幹細胞の分化 |
US9150833B2 (en) * | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
JP5762979B2 (ja) | 2009-12-29 | 2015-08-12 | 武田薬品工業株式会社 | 膵ホルモン産生細胞の製造法 |
CA2794473A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-11 | National Cancer Center | Induced hepatic stem cell and process for production thereof, and applications of the cell |
WO2011108993A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | National University Of Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
CN102959076B (zh) | 2010-03-31 | 2015-09-16 | 斯克里普斯研究所 | 重编程细胞 |
WO2011139628A1 (en) | 2010-04-25 | 2011-11-10 | Mount Sinai School Of Medicine | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
EP2582795B1 (en) | 2010-06-15 | 2017-04-12 | Kyoto University | Method for selecting human induced pluripotent stem cells |
US9085757B2 (en) | 2010-06-17 | 2015-07-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of insulin producing cells |
CN103180434A (zh) | 2010-08-05 | 2013-06-26 | 威斯康星校友研究基金会 | 用于人多能细胞培养的简化基础培养基 |
WO2012117333A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
US20130274184A1 (en) | 2011-10-11 | 2013-10-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Er stress relievers in beta cell protection |
WO2013056072A1 (en) | 2011-10-13 | 2013-04-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells |
EP2766474B1 (en) | 2011-10-14 | 2020-10-07 | Children's Medical Center Corporation | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes |
BR112014015417A8 (pt) | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
DK3450542T3 (da) | 2012-06-08 | 2021-11-01 | Janssen Biotech Inc | Differentiering af humane embryonale stamceller til endokrine pancreatiske celler |
JP6470687B2 (ja) | 2012-09-03 | 2019-02-13 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 |
MX2015008578A (es) | 2012-12-31 | 2015-09-07 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9. |
US8987471B2 (en) | 2013-02-14 | 2015-03-24 | Allergan, Inc. | Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
SG10201708332WA (en) | 2013-03-15 | 2017-11-29 | Jackson Lab | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
-
2013
- 2013-12-18 SG SG11201505128SA patent/SG11201505128SA/en unknown
- 2013-12-18 US US13/998,884 patent/US10344264B2/en active Active
- 2013-12-18 RU RU2018116647A patent/RU2018116647A/ru unknown
- 2013-12-18 BR BR112015015770A patent/BR112015015770A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-12-18 WO PCT/US2013/075939 patent/WO2014105543A1/en active Application Filing
- 2013-12-18 JP JP2015550478A patent/JP6557146B2/ja active Active
- 2013-12-18 CN CN201380074040.4A patent/CN105008518B/zh active Active
- 2013-12-18 ES ES13869259T patent/ES2837763T3/es active Active
- 2013-12-18 KR KR1020157020562A patent/KR102084561B1/ko active IP Right Grant
- 2013-12-18 CA CA2896655A patent/CA2896655C/en active Active
- 2013-12-18 RU RU2018116648A patent/RU2768963C2/ru active
- 2013-12-18 MX MX2015008577A patent/MX2015008577A/es unknown
- 2013-12-18 EP EP13869259.5A patent/EP2938724B1/en active Active
- 2013-12-18 RU RU2015131835A patent/RU2658488C2/ru active
- 2013-12-18 DK DK13869259.5T patent/DK2938724T3/da active
- 2013-12-18 SG SG10201709338RA patent/SG10201709338RA/en unknown
- 2013-12-18 AU AU2013368221A patent/AU2013368221B2/en active Active
-
2014
- 2014-01-03 AR ARP140100011A patent/AR094347A1/es unknown
-
2015
- 2015-06-25 PH PH12015501465A patent/PH12015501465A1/en unknown
-
2016
- 2016-05-04 HK HK16105105.3A patent/HK1217110A1/zh unknown
-
2018
- 2018-12-14 AU AU2018279009A patent/AU2018279009B2/en active Active
-
2021
- 2021-10-09 AU AU2021245259A patent/AU2021245259B2/en active Active
-
2023
- 2023-12-19 AU AU2023285724A patent/AU2023285724A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006088867A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Medistem Laboratories, Incorporated | Method for expansion of stem cells |
US20110281355A1 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of Human Embryonic Stem Cells |
US20120052576A1 (en) * | 2010-08-31 | 2012-03-01 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of Pluripotent Stem Cells |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
OBREGON MJ, Thyroid hormone and adipocyte differentiation, Thyroid, 2008, 18(2), 185-195, doi:10.1089/thy.2007.0254. * |
ВЕЧКАНОВ Е.М. и др., Основы клеточной инженерии, учебное пособие, Ростов-на-Дону, 2012, 136 с. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2768963C2 (ru) | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки | |
JP7278990B2 (ja) | Hb9調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化 | |
KR102376911B1 (ko) | 글루코스-의존성 미토콘드리아 호흡 및 2-상 인슐린 분비 반응을 나타내는 인간 만능 줄기 세포 유래 기능성 베타 세포의 생성 | |
JP6588969B2 (ja) | 膵内分泌細胞内のmafa発現を強化するための小分子の使用 |