ES2932664T3 - Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado - Google Patents

Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado Download PDF

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Abstract

Se proporcionan nuevos medios de cultivo sin suero que comprenden factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta-3 y ácido ascórbico en una concentración de al menos aproximadamente 50 microgramos/ml; ácido ascórbico en un rango de concentración de aproximadamente 400-600 microgramos/ml, bFGF en un rango de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml, reemplazo de suero libre de xeno y una mezcla de lípidos; la quimera IL6RIL6 en un rango de concentración de aproximadamente 50-200 picogramos por mililitro (pg/ml); o factor inhibidor de la leucemia (LIF) a una concentración de al menos 2000 unidades/ml; en el que el medio de cultivo es capaz de mantener las células madre pluripotentes en un estado indiferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras. También se proporcionan cultivos celulares que comprenden células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas (iPS) y los medios de cultivo novedosos, métodos para usarlos para expandir células madre pluripotentes en un estado indiferenciado usando medios bidimensionales o tridimensionales. sistemas de cultivo; y métodos de expansión de células iPS en un cultivo en suspensión desprovisto de adherencia al sustrato y encapsulación celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a medios de cultivo libres de suero que pueden usarse para mantener células madre en un estado pluripotente y no diferenciado, y a medios de cultivo definidos, a cultivos celulares que comprenden los mismos y a métodos que usan los mismos para cultivar células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión.
El excepcional potencial de diferenciación de las células madre embrionarias humanas (hESC) las destaca como uno de los mejores modelos para estudiar el desarrollo humano temprano, el compromiso del linaje, los procesos de diferenciación y para su uso con fines industriales y terapia basada en células.
Las células pluripotentes inducidas (iPS) son células somáticas que se reprograman para obtener células similares a ESC que pueden diferenciarse en tejidos representativos de las tres capas germinales embrionarias, tanto in vitro como in vivo. Se generaron células iPS humanas o de ratón mediante la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción, c-Myc, Oct4, Klf4 y Sox2 en células somáticas. Se demostró que las células iPS forman la misma morfología de colonia que las ESC y expresan algunos marcadores típicos de ESC, tal como Myb, Kit, Gdf3 y Zic3, pero menos prominentemente marcadores tal como Dnmt3a, Dnmt3b, Utf1, Tcl1 y el gen receptor LIF, lo que confirma que las células iPS son similares pero no idénticas a las células ES [Takahashi y Yamanaka, 2006; Takahashi et al, 2007; Meissner et al., 2007; Okita et al., 2007]. Yu Juning et al. (Science 318:1917-1920, 2007) encontraron un patrón de expresión génica común para células iPS derivadas de fibroblastos y hESC.
Otros estudios revelaron que las células iPS podrían obtenerse mediante la transformación de células somáticas con Oct4, Sox2, Nanog y Lin28, omitiendo el uso del oncogén C-Myc [Yu et al, 2007; Nakagawa et al., 2008]. Las mejoras de los métodos de derivación de células iPS incluyen el uso de plásmidos en lugar de vectores virales o la derivación sin ninguna integración en el genoma, lo que podría simplificar el uso futuro de células iPS para aplicaciones clínicas.
[Yu J, et al., Science. 2009, 324: 797-801].
Las células iPS actualmente disponibles son aquellas derivadas de fibroblastos embrionarios [Takahashi y Yamanaka, 2006; Meissner et al, 2007], fibroblastos formados a partir de hESC [Park et al, 2008], fibroblastos fetales [Yu et al, 2007; Park et al, 2008], fibroblastos del prepucio [Yu et al, 2007; Park et al, 2008], tejidos dérmicos y cutáneos adultos [Hanna et al, 2007; Lowry et al, 2008], linfocitos b [Hanna et al 2007] y células adultas de hígado y estómago [Aoi et al, 2008].
De manera similar a las hESC, las células iPS se cultivan tradicionalmente con una capa de soporte en cultivo 2D, lo que permite su crecimiento continuo en el estado no diferenciado. Por ejemplo, las células iPS se cultivaron en capas alimentadoras que consisten en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados o fibroblastos de prepucio [Takahashi y Yamanaka 2006, Meisnner et al. 2007] en presencia de un medio suplementado con suero bovino fetal (FBS). Otras mejoras de los métodos de cultivo incluyen el cultivo de células iPS en capas alimentadoras de MEF en presencia de un medio de cultivo más definido que contiene reemplazo de suero y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (Park et al., 2008). Sin embargo, para aplicaciones clínicas (por ejemplo, terapia basada en células) o fines industriales, las células iPS deben cultivarse en un sistema de cultivo definido, libre de xeno (por ejemplo, sin animales) y un sistema de cultivo escalable con procesos controlados.
La publicación PCT n.° WO2007/026353 divulga un medio de cultivo libre de xeno, bien definido, que comprende una isoforma de TGF-beta o la quimera formada entre IL6 y el receptor soluble de IL6 (IL6RIL6) a una concentración de 100 ng/ml para mantener células madre embrionarias humanas, en un estado no diferenciado en un sistema de cultivo bidimensional.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20050233446 divulga un medio definido que comprende bFGF, insulina y ácido ascórbico para mantener las hESC cuando se cultivan en Matrigel™ en un estado no diferenciado.
Ludwig TE., et al., 2006 (Nature Biotechnology, 24: 185-7) divulga el medio definido TeSR1 para cultivar hESC en una matriz compuesta por colágeno IV, fibronectina, laminina y virtonectina.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20090029462 divulga métodos de expansión de células madre pluripotentes en suspensión utilizando microportadores o encapsulación celular.
La publicación PCT n.° WO/2008/015682 divulga un método de expansión y mantenimiento de células madre embrionarias humanas en un cultivo en suspensión en condiciones de cultivo desprovistas de adherencia al sustrato, en donde el medio de cultivo comprende la quimera IL6RIL6 a una concentración de 100 ng/ml.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20070155013 divulga un método de crecimiento de células madre pluripotentes en suspensión utilizando un vehículo que se adhiere a las células madre pluripotentes.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20080241919 (Parsons et al.) divulga un método de cultivo de células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión en un medio que comprende bFGF, insulina y ácido ascórbico en un recipiente de cultivo celular que incluye una matriz libre de células.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20080159994 (Mantalaris et al.) divulga un método de cultivo de células ES pluripotentes encapsuladas dentro de perlas de alginato en un cultivo tridimensional en un medio que comprende reemplazo de suero y bFGF.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20070264713 divulga un método de cultivo de células madre no diferenciadas en suspensión sobre microportadores en recipientes utilizando un medio acondicionado.
La solicitud de patente de los EE. UU. n.° 2009/191159 A1 divulga el uso de medio ES acondicionado con MEF para cultivar células iPS, en donde el medio incluye factores generados por las células alimentadoras embrionarias de ratón. También se describe el medio MAPC que comprende suero bovino fetal al 2 % y ácido ascórbico pero no bFGF.
Sumario de la invención
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de cultivo que está libre de suero que comprende una quimera IL6RIL6 en un intervalo de concentración de 50-200 picogramos por mililitro (pg/ml) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), en donde el medio de cultivo puede mantener las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula madre pluripotente y el medio de cultivo de la invención.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de derivación de una línea de células madre pluripotentes inducidas, que comprende: (a) inducir una célula somática para obtener una célula madre pluripotente; y (b) cultivar la célula madre pluripotente en el medio de cultivo de la invención; derivando de ese modo la línea de células madre pluripotentes inducidas.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de expansión y mantenimiento de células madre pluripotentes en un estado no diferenciado, comprendiendo el método cultivar las células madre pluripotentes en el medio de cultivo de la invención, expandiendo y manteniendo de ese modo las células madre pluripotentes en el estado no diferenciado.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de generación de células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes, comprendiendo el método: (a) cultivar las células madre pluripotentes según el método de la invención, para obtener de ese modo células madre no diferenciadas, expandidas; (b) someter las células madre no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje; generando de ese modo las células específicas de linaje a partir de las células madre pluripotentes.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de generación de cuerpos embrioides a partir de células madre pluripotentes, comprendiendo el método: (a) cultivar las células madre pluripotentes según el método de la invención, para obtener de ese modo células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas; y (b) someter las células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar las células madre en cuerpos embrioides; generando de ese modo los cuerpos embrioides a partir de las células madre pluripotentes.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de generación de células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes, comprendiendo el método: (a) cultivar las células madre pluripotentes según el método de la invención, para obtener de ese modo células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas; (b) someter las células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar las células madre no diferenciadas, expandidas en cuerpos embrioides; y (c) someter las células de los cuerpos embrioides a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje; generando de ese modo las células específicas de linaje a partir de las células madre pluripotentes.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo celular está libre de células alimentadoras.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo puede expandir las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado cuando se cultivan en un cultivo en suspensión.
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre son células madre embrionarias.
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre son células madre pluripotentes inducidas (iPS).
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes inducidas son células madre pluripotentes inducidas humanas.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo puede expandir las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende además reemplazo de suero.
Según algunas realizaciones de la invención, una concentración de TGFp3 en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 0.5 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, una concentración de TGFp3 en el medio de cultivo es aproximadamente 2 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, una concentración de bFGF en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 5 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bFGF en el medio de cultivo está en el intervalo de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 200 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, una concentración del ácido ascórbico en el medio de cultivo está en el intervalo de aproximadamente 400 microgramos/mililitro (pg/ml) a aproximadamente 600 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, una concentración del ácido ascórbico en el medio de cultivo es aproximadamente 500 pg/ml (microgramos/mililitro).
Según algunas realizaciones de la invención, el bFGF está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, el TGFp3 está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, el ácido ascórbico está en un intervalo de concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 5000 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el bFGF está en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, el TGFp3 está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.5 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, el ácido ascórbico está en un intervalo de concentración de aproximadamente 400 pg/ml a aproximadamente 600 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende además reemplazo de suero.
Según algunas realizaciones de la invención, el reemplazo de suero está libre de xeno.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende además una mezcla de lípidos.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende además bicarbonato de sodio a una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %.
Según algunas realizaciones de la invención, la mezcla de lípidos está a una concentración de aproximadamente el 1 %.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de la quimera IL6RIL6 es 100 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de LIF está en un intervalo de aproximadamente 2000­ 4000 unidades/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo se efectúa en un cultivo en suspensión.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo está desprovisto de TGFp3.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo no comprende más de 0.1 ng/ml de TGFp3.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo está libre de suero y desprovisto de contaminantes animales.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de dicho bFGF es aproximadamente 100 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF) a una concentración de al menos 2000 unidades/ml, en donde el medio de cultivo puede mantener las células iPS en un estado no diferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo está libre de portadores de proteínas.
Según algunas realizaciones de la invención, expandir comprende obtener al menos aproximadamente 8 x 106 células de una sola célula madre pluripotente después de aproximadamente 1 mes.
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes cultivadas en el medio de cultivo exhiben un cariotipo cromosómico normal después de al menos 2 pases.
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes exhiben un tiempo de duplicación de al menos 20 horas.
Según algunas realizaciones de la invención, el mantenimiento es durante al menos 5 pases.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de realizaciones de la invención, a continuación se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitativos.
Breve descripción de los dibujos
Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.
En los dibujos:
Las Figuras 1A-C son fotografías que representan la morfología de la colonia de células iPS cultivadas en un sistema de cultivo bidimensional libre de xeno en presencia de los medios de cultivo novedosos libres de xeno (por ejemplo, libres de animales, sin contaminación animal) y no son según la presente invención. J1.2-3 se cultivaron con capas de soporte de fibroblastos de prepucio humano (HFF) mientras se usaba el siguiente medio de cultivo libre de suero animal: Figura 1A - medio HA70 durante 6 pases; Figura 1B - medio HA40/4 durante 6 pases; y Figura 1C - medio D2 durante 16 pases.
Las Figuras 2A-C son fotografías que representan la tinción inmunofluorescente de células iPS con marcadores de pluripotencia. Se cultivaron células iPS J1.2-3 e iF4 en un sistema de cultivo bidimensional (HFF) libre de xeno en presencia del medio de cultivo libre de suero animal HA77 durante al menos 10 pases y luego se tiñeron con los siguientes marcadores de marcadores no diferenciados: Figura 2A - células iPS J1.2-3 teñidas con Oct4; Figura 2B -células iPS iF4 teñidas con SSEA4; y Figura 2C - células iPS iF4 teñidas con TRA-1-81. Estas fotografías no son según la presente invención.
Las Figuras 3A-C son fotografías que representan la morfología de la línea celular iPS J1.2-3 de HFF cuando se cultiva en suspensión en los siguientes medios de cultivo libres de xeno durante los pases indicados. Figura 3A - células iPS J1.2-3 cultivadas en el medio yFL3 durante 16 pases; Figura 3B - células iPS J1.2-3 cultivadas en el medio CM100F durante 13 pases; Figura 3C - células iPS J1.2-3 cultivadas en el medio yF100 durante 8 pases. Tenga en cuenta que mientras se cultivan en suspensión, las células iPS crean una estructura similar a una esfera que contiene células no diferenciadas. Estas fotografías no son según la presente invención.
La Figura. 4 es una fotografía que representa la morfología de las células iPS J1.2-3 cuando se cultivan en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) después de un período de cultivo prolongado en un cultivo en suspensión. Las células J1.2-3 se cultivaron durante 37 pases en suspensión en el medio CM100F, después de lo cual se volvieron a cultivar con MEF y forman una morfología de colonia iPS típica 24 horas después de su cultivo con MEF. Estas fotografías no son según la presente invención.
Las Figuras 5A-C son fotografías que muestran tinción inmunofluorescente de células iPS con marcadores de pluripotencia. Las células J1.2-3 se cultivaron en suspensión utilizando el medio CM100F durante más de 20 pases y luego se tiñeron con marcadores de células madre no diferenciadas. Figura 5A - TRA-1-81; Figura 5B - TRA-1-60; Figura 5C - SSEA4. Estas fotografías no son según la presente invención.
Las Figuras 6A-D son fotografías que muestran la inmunotinción de células iPS con marcadores de pluripotencia. Las células J1.2-3 se cultivaron en suspensión utilizando el medio CM100F durante al menos 30 pases y luego se transfirieron a matraces giratorios y se cultivaron durante 30 días adicionales, después de lo cual las células se tiñeron con marcadores de células madre no diferenciadas. Figura 6A - Oct4; Figura 6B - TRA-1-81; Figura 6C - TRA-1-60; y Figura 6D - SSEA4. Estas fotografías no son según la presente invención.
Descripción de aspectos específicos de la invención
La presente invención se refiere a medios de cultivo novedosos, a cultivos celulares que comprenden los mismos y a métodos que usa los mismos para derivar una línea de células madre pluripotentes inducidas, para expandir y mantener células madre pluripotentes en un estado no diferenciado y para generar células específicas de linaje o cuerpos embrioides a partir de células madre pluripotentes.
Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención debe entenderse que la aplicación de la invención no está necesariamente limitada a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de varias maneras.
Los presentes inventores han diseñado, después de laboriosas experimentaciones, medios de cultivo definidos, que están libres de suero y libres de xeno (por ejemplo, desprovistos de contaminantes animales) y que pueden mantener células madre pluripotentes tal como iPS y ESC humanas en un estado no diferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras mientras conservan su potencial pluripotente para diferenciarse en las tres capas germinales embrionarias.
Por lo tanto, como se muestra en la sección de Ejemplos que sigue, las células iPS se cultivaron en un estado no diferenciado en sistemas de cultivo bidimensionales que están libres de capas alimentadoras (por ejemplo, en una matriz sintética; Ejemplo 1 no según la invención) o son a base de capas alimentadoras libres de xeno (por ejemplo, fibroblastos de prepucio; Figuras 1A-C y 2A-C, Ejemplo 2 no según la invención) en presencia de medios de cultivo definidos, libres de xeno y libres de suero (por ejemplo, mHA40/4, HA75, HA76, HA77, HA78 o HA74). Mientras están en cultivo, las células madre pluripotentes exhiben una morfología no diferenciada, así como características morfológicas y moleculares típicas de las iPS, tal como cariotipo normal, expresión de marcadores de pluripotencia (por ejemplo, Oct4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60), y la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales embrionarias tanto in vitro (mediante la formación de cuerpos embrioides después de al menos 28 pases) e in vivo (mediante la formación de teratomas después de al menos 31 pases).
Tal como se usa en el presente documento, la frase "células madre pluripotentes" se refiere a células que pueden diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo). La frase "células madre pluripotentes" abarca células madre embrionarias (ESC) y células madre pluripotentes inducidas (células iPS).
La frase "células madre embrionarias" puede comprender células que se obtienen del tejido embrionario formado después de la gestación (por ejemplo, blastocisto) antes de la implantación (es decir, un blastocisto de preimplantación), células de blastocisto extendidas (EBC) que se obtienen de un blastocisto en etapa posterior a la implantación/pre-gastrulación (véase el documento WO2006/040763] y células germinales embrionarias (GE) que se obtienen del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de las 10 semanas de gestación.
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes divulgadas son células madre embrionarias, como las de origen humano o primate (por ejemplo, mono).
Las células madre embrionarias divulgadas pueden obtenerse usando métodos de cultivo celular bien conocidos. Por ejemplo, las células madre embrionarias humanas, que no forman parte de la invención, pueden aislarse de blastocistos humanos. Los blastocistos humanos se obtienen normalmente de embriones de preimplantanción in vivo humanos o de embriones fertilizados in vitro (IVF). Como alternativa, un embrión humano de una sola célula puede expandirse a la etapa de blastocisto. Para el aislamiento de células ES humanas, la zona pelúcida se elimina del blastocisto y la masa celular interna (ICM) se aísla mediante inmunocirugía, en la que las células del trofoectodermo se lisan y se eliminan de la ICM intacta mediante un pipeteo suave. A continuación, la ICM se coloca en placas en un matraz de cultivo de tejidos que contiene el medio apropiado que permite su crecimiento. Después de 9 a 15 días, el crecimiento derivado de la ICM se disocia en grumos ya sea por una disociación mecánica o por una degradación enzimática y luego las células se vuelven a colocar en placa en un medio de cultivo tisular fresco. Las colonias que muestran una morfología no diferenciada se seleccionan individualmente con una micropipeta, se disocian mecánicamente en grumos y se vuelven a colocar en placa. A continuación, las células ES resultantes se dividen de forma rutinaria cada 4-7 días. Para obtener más detalles sobre los métodos de preparación de células ES humanas, véase Thomson et al., [patente de los EE. UU. n.° 5.843.780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; y Gardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998].
Se apreciará que las células madre disponibles en el mercado también pueden usarse con este aspecto de la presente divulgación. Las células ES humanas, que no forman parte de la invención, pueden adquirirse en el registro de células madre embrionarias humanas del NIH (www.escr.nih.gov). Ejemplos no limitativos de líneas de células madre embrionarias de referencia disponibles comercialmente son BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03, TE04 y TE06.
Las células de blastocisto extendidas (EBC), que no forman parte de la invención, pueden obtenerse de un blastocisto de al menos nueve días después de la fertilización en una etapa anterior a la gastrulación. Antes de cultivar el blastocisto, la zona pelúcida se digiere [por ejemplo, mediante solución ácida de Tyrode (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.)] para exponer la masa celular interna. Luego, los blastocistos se cultivan como embriones completos durante al menos nueve y no más de catorce días después de la fertilización. (es decir, antes del acontecimiento de gastrulación) in vitro utilizando métodos estándares de cultivo de células madre embrionarias.
Las células germinales embrionarias (EG) se preparan a partir de las células germinales primordiales obtenidas de fetos de aproximadamente 8-11 semanas de gestación (en el caso de un feto humano) usando técnicas de laboratorio conocidas por cualquier experto en la materia. Las crestas genitales se disocian y se cortan en pequeños trozos que después de esto se disgregan en células por disociación mecánica. A continuación, las células EG se hacen crecer en matraces de cultivo de tejidos con el medio apropiado. Las células se cultivan con sustitución diaria del medio hasta que se observa una morfología celular compatible con las células EG, normalmente después de 7 a 30 días o de 1 a 4 pases. Para obtener detalles adicionales sobre los métodos de preparación de células EG humanas, véase Shamblott et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] y patente de los EE. UU. n.° 6.090.622.
La frase "célula madre pluripotente inducida (iPS)" (o célula madre de tipo embrionario) tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula madre proliferativa y pluripotente que se obtiene mediante la desdiferenciación de una célula somática (por ejemplo, una célula somática adulta).
Según algunas realizaciones de la invención, la célula iPS se caracteriza por una capacidad proliferativa que es similar a la de las ESC y, por lo tanto, puede mantenerse y expandirse en cultivo durante un tiempo casi ilimitado.
Las células IPS pueden dotarse de pluripotencialidad mediante manipulación genética que reprograma la célula para que adquiera características de células madre embrionarias. Por ejemplo, las células iPS divulgadas pueden generarse a partir de células somáticas mediante la inducción de la expresión de Oct-4, Sox2, Kfl4 y c-Myc en una célula somática esencialmente como se describe en Takahashi y Yamanaka, 2006, Takahashi et al, 2007, Meissner et al, 2007 y Okita et al, 2007). Adicionalmente o como alternativa, las células iPS divulgadas pueden generarse a partir de células somáticas mediante la inducción de la expresión de Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 esencialmente como se describe en Yu et al, 2007 y Nakagawa et al, 2008. Cabe señalar que la manipulación genética (reprogramación) de las células somáticas puede realizarse utilizando cualquier método conocido, tal como el uso de plásmidos o vectores virales, o mediante derivación sin ninguna integración al genoma [Yu J, et al., Science. 2009, 324: 797-801].
Las células iPS divulgadas pueden obtenerse mediante inducción de la desdiferenciación de fibroblastos embrionarios [Takahashi and Yamanaka, 2006; Meissner et al, 2007], fibroblastos formados a partir de hESC [Park et al, 2008], fibroblastos fetales [Yu et al, 2007; Park et al, 2008], fibroblastos del prepucio [Yu et al, 2007; Park et al, 2008], tejidos dérmicos y cutáneos adultos [Hanna et al, 2007; Lowry et al, 2008], linfocitos b [Hanna et al 2007] y células adultas de hígado y estómago [Aoi et al, 2008].
Las líneas de células IPS también están disponibles a través de bancos de células tal como el banco WiCell. Los ejemplos no limitativos de líneas celulares iPS disponibles comercialmente incluyen el clon 1 de prepucio iPS [n.° de catálogo de WiCell iPS(prepucio)-1-DL-1], el clon 1 de iPSIMR90 [n.° de catálogo de WiCell iPS(IMR90)-1-DL-1] y clon 4 de iPSIMR90 [n.° de catálogo de WiCell iPS(IMR90)-4-DL-1].
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes inducidas son células madre pluripotentes inducidas humanas.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "medio de cultivo" se refiere a una sustancia líquida usada para apoyar el crecimiento de células madre pluripotentes y mantenerlas en un estado no diferenciado. El medio de cultivo usado mediante la invención según algunas realizaciones puede ser un medio a base de agua que incluye una combinación de sustancias como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas tal como citocinas, factores de crecimiento y hormonas, todos los cuales son necesarios para la proliferación celular y pueden mantener las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado. Por ejemplo, un medio de cultivo puede ser un medio de cultivo de tejido sintético como Ko-DMEM (productos de Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EE. UU.), DMEM/F12 (Biological Industries, Biet HaEmek, Israel), medio Mab ADCB (HyClone, Utah, EE. UU.) complementado con los aditivos necesarios tal como se describe más adelante en el presente documento.
La frase "soporte de células alimentadoras", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una célula alimentadora (por ejemplo, fibroblastos) para mantener las células madre pluripotentes en un estado proliferativo y no diferenciado cuando las células madre pluripotentes se cultivan conjuntamente en las células alimentadoras o cuando las células madre pluripotentes se cultivan en una matriz (por ejemplo, una matriz extracelular, una matriz sintética) en presencia de un medio acondicionado generado por las células alimentadoras. El soporte de las células alimentadoras depende de la estructura de las células alimentadoras mientras están en cultivo (por ejemplo, la matriz tridimensional formada al cultivar las células alimentadoras en una placa de cultivo de tejidos), la función de las células alimentadoras (por ejemplo, la secreción de factores de crecimiento, nutrientes y hormonas por las células alimentadoras, la tasa de crecimiento de las células alimentadoras, la capacidad de expansión de las células alimentadoras antes de la senescencia) y/o la unión de las células madre pluripotentes a la(s) capa(s) de células alimentadoras.
La frase "ausencia de soporte de células alimentadoras", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un medio de cultivo y/o un cultivo celular que está desprovisto de células alimentadoras y/o un medio acondicionado generado de ese modo.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "libre de suero" se refiere a estar desprovisto de un suero humano o un suero animal.
Cabe señalar que la función del suero en los protocolos de cultivo es proporcionar a las células cultivadas un entorno similar al presente in vivo (es decir, dentro del organismo del que se derivan las células, por ejemplo, un blastocisto de un embrión). Sin embargo, el uso de suero, que se deriva de una fuente animal (por ejemplo, suero bovino) o una fuente humana (suero humano), está limitado por las variaciones significativas en los componentes del suero entre los individuos donantes (de los cuales se obtiene el suero) y el riesgo de tener xenocontaminantes (en caso de que se utilice suero animal).
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo libre de suero no comprende suero o partes del mismo.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo libre de suero está desprovisto de albúmina sérica (por ejemplo, albúmina que se purifica a partir de suero humano o suero animal).
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende reemplazo de suero.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "reemplazo de suero" se refiere a una formulación definida, que sustituye la función del suero al proporcionar a las células madre pluripotentes los componentes necesarios para el crecimiento y la viabilidad.
Se conocen en la técnica diversas formulaciones de reemplazo de suero y están disponibles comercialmente.
Por ejemplo, GIBCO™ Knockout™ Serum Replacement (Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EE. UU., n.° de catálogo 10828028) es una formulación libre de suero definida, optimizada para desarrollar y mantener células ES no diferenciadas en cultivo. Cabe señalar que la formulación de GIBCO™ Knockout™ Serum Replacement incluye Albumax (albúmina de suero bovino enriquecida con lípidos) que proviene de una fuente animal (publicación de patente internacional n.° WO 98/30679 concedida a Price, P.J. et al). Sin embargo, una publicación reciente de Crook et al., 2007 (Crook JM., et al., 2007, Cell Stem Cell, 1: 490-494) describe seis líneas de hESC de grado clínico generadas usando fibroblastos de prepucio de grado clínico aprobados por la FDA en Knockout™ Serum Replacement preparado en cGMP (Invitrogen Corporation, EE. UU., n.° de catálogo 04-0095).
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de GIBCO™ Knockout™ Serum Replacement en el medio de cultivo está en el intervalo de aproximadamente el 1 % [volumen/volumen (v/v)] a aproximadamente el 50 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 5 % (v/v) a aproximadamente el 40 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 5 % (v/v) a aproximadamente el 30 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 10 % (v/v) a aproximadamente el 30 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 10 % (v/v) a aproximadamente el 25 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 10 % (v/v) a aproximadamente el 20 % (v/v), por ejemplo, aproximadamente el 10 % (v/v), por ejemplo, aproximadamente el 15 % (v/v), por ejemplo, aproximadamente el 20 % (v/v), por ejemplo, aproximadamente el 30 % (v/v).
Otro reemplazo de suero comercialmente disponible es el suplemento B27 sin vitamina A que está disponible en Gibco-Invitrogen, Corporation, Grand Island, NY, EE. UU., número de catálogo 12587-010. El suplemento B27 es una formulación libre de suero que incluye d-biotina, albúmina de suero bovino (BSA) de la fracción V libre de ácidos grasos, catalasa, L-carnitina HCl, corticosterona, etanolamina HCl, D-galactosa (anhid.), glutatión (reducido), insulina humana recombinante, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina-2-HCl, selenito de sodio, superóxido dismutasa, complejo T-3/albúmina, DL alfa-tocoferol y acetato de DL alfa tocoferol. Sin embargo, el uso del suplemento B27 es limitado ya que incluye albúmina de origen animal.
Según algunas realizaciones de la invención, el reemplazo de suero está libre de xeno.
El término "xeno" es un prefijo basado en la palabra griega "Xenos", es decir, un extraño. Tal como se usa en el presente documento, la frase "libre de xenos" se refiere a estar desprovisto de cualquier componente derivado de una especie xeno (es decir, no el mismo, un foráneo). Dichos componentes pueden ser contaminantes tales como patógenos asociados con (por ejemplo, infectando) la especie xeno, componentes celulares de la especie xeno o componentes acelulares (por ejemplo, fluido) de la especie xeno.
Por ejemplo, un reemplazo de suero libre de xeno puede incluir una combinación de insulina, transferrina y selenio. Adicionalmente o como alternativa, un reemplazo de suero libre de xeno puede incluir albúmina, transferrina e insulina humanas o producidas de forma recombinante.
Los ejemplos no limitativos de composiciones de reemplazo de suero libre de xeno disponibles comercialmente incluyen la premezcla de ITS (insulina, transferrina y selenio) disponible de Invitrogen Corporation (ITS, Invitrogen, número de catálogo 51500-056); Serum Replacement 3 (Sigma, número de catálogo S2640) que incluye albúmina sérica humana, transferrina humana e insulina recombinante humana y no contiene factores de crecimiento, hormonas esteroides, glucocorticoides, factores de adhesión celular, Ig detectables ni mitógenos.
Según algunas realizaciones de la invención, las formulaciones de reemplazo de suero libres de xeno ITS (Invitrogen Corporation) y SR3 (Sigma) se diluyen en una relación de 1 a 100 para alcanzar una concentración de trabajo x1.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo puede mantener la célula madre pluripotente en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos aproximadamente 5 pases, al menos aproximadamente 10 pases, al menos aproximadamente 15 pases, al menos aproximadamente 20 pases, al menos aproximadamente 22 pases, al menos aproximadamente 25 pases, al menos aproximadamente 30 pases, al menos aproximadamente 35 pases, al menos aproximadamente 40 pases, al menos aproximadamente 45 pases, al menos aproximadamente 50 pases y más.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo puede expandir las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado.
Tal como se usa en el presente documento, el término "expansión" se refiere al aumento del número de células madre pluripotentes durante el período de cultivo (en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 50 %, 100 %, 200 %, 500 %, 1000 % y más). Se apreciará que el número de células madre pluripotentes que pueden obtenerse a partir de una sola célula madre pluripotente depende de la capacidad de proliferación de la célula madre pluripotente. La capacidad de proliferación de una célula madre pluripotente puede calcularse por el tiempo de duplicación de la célula (es decir, el tiempo necesario para que una célula experimente una división mitótica en el cultivo) y el período que el cultivo de células madre pluripotentes puede mantenerse en el estado no diferenciado (que es equivalente al número de pases multiplicado por los días entre cada pase).
Por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 (no según la invención) de la sección de Ejemplos que sigue, las células iPS humanas podrían mantenerse en estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado en presencia de los medios de cultivo mHA40/4, HA75, HA76, HA78 y HA74/1 durante al menos 22 pases cuando se cultivan en una matriz libre de alimentador. Dado que cada pase se produce cada 4-7 días, las células iPS humanas se mantuvieron durante 110 días (es decir, 2640 horas). Dado que el tiempo de duplicación de iPS humanas fue de 36 horas, una sola célula iPS humana cultivada en estas condiciones podría expandirse para dar lugar a 273 (es decir, 9.4 x1021) células iPS humanas.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo puede soportar la expansión de una única célula madre pluripotente (por ejemplo, célula iPS humana) o una población de células madre pluripotentes en al menos 223 (es decir, 8 x106) en el plazo de aproximadamente un mes, por ejemplo, al menos 224 (es decir, 16.7 x106) en aproximadamente un mes.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo libre de suero y libre de xeno comprende el factor de crecimiento transformante beta-3 (TGFp3) y ácido ascórbico, en donde la concentración del ácido ascórbico en el medio de cultivo es de al menos 50 pg/ml y en donde el medio de cultivo puede mantener las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras.
El ácido ascórbico (también conocido como vitamina C) es un ácido de azúcar (C6H8Ü6; peso molecular 176.12 gramos/mol) con propiedades antioxidantes. El ácido ascórbico utilizado por el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención puede ser un ácido ascórbico natural, un ácido ascórbico sintético, una sal de ácido ascórbico (por ejemplo, ascorbato de sodio, ascorbato de calcio, ascorbato de potasio), una forma de éster de ácido ascórbico (por ejemplo, palmitato de ascorbilo, estearato de ascorbilo), un derivado funcional del mismo (una molécula derivada del ácido ascórbico que presenta la misma actividad/función cuando se usa en el medio de cultivo de la invención), o un análogo del mismo (por ejemplo, un equivalente funcional del ácido ascórbico ácido que presenta una actividad análoga a la observada para el ácido ascórbico cuando se usa en el medio de cultivo de la invención). Los ejemplos no limitativos de formulaciones de ácido ascórbico que pueden usarse en el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención incluyen ácido L-ascórbico y ácido ascórbico 3-fosfato.
El ácido ascórbico puede obtenerse de diversos fabricantes, tal como Sigma, St Louis, MO, EE. UU. (por ejemplo, números de catálogo: A2218, A5960, A7506, A0278, A4403, A4544, A2174, A2343, 95209, 33034, 05878, 95210, 95212, 47863, 01-6730, 01-6739, 255564, A92902, W210901).
Como se mencionó, la concentración de ácido ascórbico en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 50 pg/ml. Según algunas realizaciones de la invención, el ácido ascórbico puede usarse en un intervalo de concentraciones tales como de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 800 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 200 pg/ml a aproximadamente 800 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 300 pg /ml a aproximadamente 700 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 400 pg/ml a aproximadamente 600 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 450 pg/ml a aproximadamente 550 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de ácido ascórbico en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 75 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 150 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 200 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 250 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 300 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 350 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 400 pg/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 450 pg/ml, por ejemplo, aproximadamente 500 pg/ml.
Como se muestra en el Ejemplo 1 (no según la invención) de la sección de Ejemplos que sigue, los presentes inventores han usado diversos medios de cultivo que incluyen ácido ascórbico en una concentración de al menos 50 pg/ml (por ejemplo, medios de cultivo mHA40/4, HA75, HA76, HA77, HA78 y HA74/1) para cultivar con éxito células iPS y mantenerlas en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 15 pases en ausencia de soporte de células alimentadoras.
El factor de crecimiento de fibroblastos básico (también conocido como bFGF, FGF2 o FGF-p) es un miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos. El bFGF utilizado en el medio de cultivo de la invención puede ser una proteína bFGF purificada, sintética o expresada de manera recombinante [(por ejemplo, polipéptido de bFGF humano, n.° de acceso de GenBank NP_001997.5 (SEQ ID NO:31); polinucleótido de bFGF humano, n.° de acceso de GenBank NM_002006.4 (SEQ ID NO:32). Cabe señalar que para la preparación de un medio de cultivo libre de xeno, el bFGF se purifica preferiblemente a partir de una fuente humana o se expresa de forma recombinante como se describe más adelante en el presente documento. bFGF puede obtenerse de diversas fuentes comerciales como Cell Sciences®, Canton, MA, EE. UU. (por ejemplo, números de catálogo CRF001A y CRF001B), productos de Invitrogen Corporation, Grand Island NY, EE. UU. (por ejemplo, números de catálogo: PHG0261, PHG0263, PHG0266 y PHG0264), ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. Rehovot, Israel (por ejemplo, número de catálogo: CYT-218) y Sigma, St Louis, MO, EE. UU. (por ejemplo, número de catálogo: F0291).
Según algunas realizaciones, la concentración de bFGF en el medio de cultivo está en el intervalo de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 250 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 200 ng /ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 20 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 30 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 40 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 50 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 60 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 70 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 80 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 90 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 110 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 120 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 130 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 140 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 150 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bFGF en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 1 ng/ml, al menos aproximadamente 2 ng/ml, al menos aproximadamente 3 ng, al menos aproximadamente 4 ng/ml, al menos aproximadamente 5 ng/ml, al menos aproximadamente 6 ng/ml, al menos aproximadamente 7 ng, al menos aproximadamente 8 ng/ml, al menos aproximadamente 9 ng/ml, al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 15 ng/ml, al menos aproximadamente 20 ng/ml, al menos aproximadamente 25 ng/ml, al menos aproximadamente 30 ng/ml, al menos aproximadamente 35 ng/ml, al menos aproximadamente 40 ng/ml, al menos aproximadamente 45 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 55 ng/ml, al menos aproximadamente 60 ng/ml, al menos aproximadamente 70 ng/ml, al menos aproximadamente 80 ng/ml, al menos aproximadamente 90 ng/ml, al menos aproximadamente 95 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml.
Como se muestra en el Ejemplo 1 (no según la invención) de la sección de Ejemplos que sigue, los presentes inventores han usado diversos medios de cultivo que incluyen bFGF en el intervalo de 5-200 ng/ml (por ejemplo, los medios de cultivo mHA40/4, HA75 y HA78, que incluyen 10 ng/ml de bFGF; los medios de cultivo HA76 y HA77, que incluyen 100 ng/ml de bFGF; y el medio de cultivo HA74/1, que incluye 50 ng/ml de bFGF) para cultivar con éxito células iPS y mantenerlas en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 15 pases en ausencia de soporte de células alimentadoras.
El factor de crecimiento transformante beta-3 (TGFp3 ) participa en el control de la proliferación, diferenciación y otras funciones en muchos tipos de células, actúa induciendo la transformación y como factor de crecimiento autocrino negativo. TGFp3 puede obtenerse de diversas fuentes comerciales, como R&D Systems Minneapolis MN, EE. UU.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de TGFp3 en el medio de cultivo está en el intervalo de aproximadamente 0.05 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0.5 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de TGFp3 en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 0.5 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.6 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.8 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.9 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 ng /ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 1.2 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 1.4 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 1.6 ng/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 1.8 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 2 ng/ml.
Como se muestra en el Ejemplo 1 (no según la invención) de la sección de Ejemplos que sigue, los presentes inventores han usado diversos medios de cultivo que incluyen TGFp3 a una concentración de aproximadamente 2 ng/ml (por ejemplo, los medios de cultivo mHA40/4, HA75, HA76, HA78 y HA74/1) para cultivar con éxito células iPS y mantenerlas en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 22 pases en ausencia de soporte de células alimentadoras.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende bFGF en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, TGFp3 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, y ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 50 gg/ml a aproximadamente 5000 gg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención comprende bFGF en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, TGFp3 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.5 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, y ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 400 gg/ml a aproximadamente 600 gg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende además una mezcla de lípidos.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "mezcla de lípidos" se refiere a una composición lipídica definida (por ejemplo, definida químicamente) necesaria para cultivar las células madre pluripotentes. Cabe señalar que la mezcla de lípidos se suele añadir a un medio de cultivo que está desprovisto de suero o reemplazo de suero y, por lo tanto, sustituye a los lípidos que normalmente se añaden a las formulaciones de suero o reemplazo de suero.
Un ejemplo no limitativo de una mezcla de lípidos comercialmente disponible, que puede usarse en el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención, incluye el Chemically Define Lipid Concentrate disponible de Invitrogen (n.° de catálogo 11905-031).
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de la mezcla de lípidos en el medio de cultivo es de aproximadamente el 0.5 % [volumen/volumen (v/v)] a aproximadamente el 3 % v/v, por ejemplo, de aproximadamente el 0.5 % v/v a aproximadamente el 2 % v/v, por ejemplo, de aproximadamente el 0.5 % v/v a aproximadamente el 1 % v/v, por ejemplo, aproximadamente el 1 % v/v.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención comprende bFGF en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, TGFp3 en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 50 gg/ml a aproximadamente 5000 gg/ml, reemplazo de suero libre de xeno y una mezcla de lípidos.
Ejemplos no limitativos de medios de cultivo libre de xeno y libre de suero que comprenden TGFp3, bFGF y ácido ascórbico a una concentración de al menos 50 gg/ml y que pueden usarse para mantener células madre pluripotentes en estados proliferativos y no diferenciados incluyen los medios de cultivo HA75 y HA78.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende además bicarbonato de sodio. El bicarbonato de sodio puede obtenerse de Biological Industries, Beit HaEmek, Israel.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bicarbonato de sodio en el medio de cultivo es de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %, por ejemplo, de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 9 %, por ejemplo, de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 8 %, por ejemplo, aproximadamente el 7.5 %.
Los presentes inventores descubrieron que las células madre pluripotentes pueden mantenerse en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 15 pases cuando se cultivan en un medio de cultivo libre de suero y libre de xeno que comprende bFGF y ácido ascórbico pero no comprende una isoforma TGFp.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "isoforma TGFp" se refiere a cualquier isoforma del factor de crecimiento transformante beta (p) que incluye TGFp1 (por ejemplo, TGFp1 de homo sapiens, n.° de acceso de GenBank NP_000651), TGFp2 (por ejemplo, TGFp2 de homo sapiens, n.° de acceso de GenBank NP_003229) y TGFp3 (por ejemplo, TGFp3 de homo sapiens, n.° de acceso de GenBank NP_003230) que funciona a través del mismo sistema de señalización del receptor en el control de la proliferación, diferenciación y otras funciones en muchos tipos de células. TGFp actúa induciendo la transformación y también actúa como un factor de crecimiento autocrino negativo.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende no más de 1 ng/ml de la isoforma TGFp, por ejemplo, no más de 0,5 ng/ml, por ejemplo, no más de 0.1 ng/ml, por ejemplo, no más de 0.05 ng/ml, por ejemplo, no más de 0.01 ng/ml de la isoforma TGFP.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo está completamente desprovisto de una isoforma TGFp (es decir, libre de isoforma TGFp).
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 400-600 gg/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo que comprende ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 400-600 pg/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml puede mantener células madre pluripotentes en un estado no diferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de ácido ascórbico en el medio de cultivo está entre aproximadamente 410 pg/ml y aproximadamente 590 pg/ml, entre aproximadamente 420 pg/ml y aproximadamente 580 pg/ml, entre aproximadamente 450 pg/ml y aproximadamente 550 pg/ml, entre aproximadamente 460 pg/ml y aproximadamente 540 pg/ml, entre aproximadamente 470 pg/ml y aproximadamente 530 pg/ml, entre aproximadamente 490 pg/ml y aproximadamente 520 pg/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 490 pg/ml y aproximadamente 510 pg/ml, por ejemplo, aproximadamente 500 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bFGF en el medio de cultivo está entre aproximadamente 50 ng/ml y aproximadamente 200 ng/ml, entre aproximadamente 60 ng/ml y aproximadamente 190 ng/ml, entre aproximadamente 70 ng/ml y aproximadamente 180 ng/ml, entre aproximadamente 80 ng/ml y aproximadamente 170 ng/ml, entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 160 ng/ml, entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 150 ng/ml, entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 130 ng/ml, entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 120 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bFGF en el medio de cultivo es de aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130, aproximadamente 135, aproximadamente 140, aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 165, aproximadamente 170, aproximadamente 175, aproximadamente 180, aproximadamente 185, aproximadamente 190, aproximadamente 195, aproximadamente 200 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo que comprende ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 400-600 pg/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml, comprende además reemplazo de suero libre de xeno.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo que comprende ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 400-600 pg/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml, comprende además una mezcla de lípidos.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo que comprende bFGF en una concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml y ácido ascórbico en una concentración de aproximadamente 400-600 pg/ml está desprovisto de bicarbonato de sodio.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende bFGF a una concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml y ácido ascórbico a una concentración de aproximadamente 400-600 pg/ml, reemplazo de suero libre de xeno a una concentración de aproximadamente el 1 % y mezcla de lípidos a una concentración de aproximadamente el 1 %.
Un ejemplo no limitativo de un medio de cultivo libre de xeno, libre de suero y libre de isoforma TGFp que comprende ácido ascórbico en un intervalo de concentración de aproximadamente 400-600 pg/ml, bFGF en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng /ml, reemplazo de suero libre de xeno y una mezcla de lípidos y que puede mantener células madre pluripotentes como las células iPS humanas en un estado proliferativo y no diferenciado durante al menos 21 pases en ausencia de soporte de células alimentadoras es el medio de cultivo HA77 (Ejemplo 1 no según la invención de la sección de Ejemplos que sigue) o un medio de cultivo similar al medio HA77 pero que está desprovisto de bicarbonato de sodio tal como un medio de cultivo que consta de DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Israel, Sigma Israel), L-glutamina 2 mM (Invitrogen corporation, Sigma, Israel), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma, Israel), bFGF - 100 ng (Invitrogen corporation), SR3 - 1 % (Sigma, Israel), y mezcla de lípidos definidos 1 % (Invitrogen corporation, Sigma, Israel). Los presentes inventores han descubierto nuevos medios de cultivo libres de suero y altamente definidos, que pueden mantener las células madre pluripotentes en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado en sistemas bidimensionales y tridimensionales (es decir, un cultivo en suspensión) en ausencia de soporte de células alimentadoras.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "cultivo en suspensión" se refiere a un cultivo en el que las células madre pluripotentes se suspenden en un medio en lugar de adherirse a una superficie.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo libre de suero que puede mantener las células madre pluripotentes en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales en ausencia de soporte de células alimentadoras comprende factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende entre aproximadamente 55-190 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 60-190 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 70-180 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 80-160 ng /ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90-150 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90-140 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90-130 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90-120 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90-110 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 95-105 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo que comprende bFGF entre aproximadamente 50­ 200 ng/ml comprende además reemplazo de suero.
Un ejemplo no limitativo de un medio de cultivo que comprende bFGF a una concentración entre aproximadamente 50-200 ng/ml es el medio YF100 que comprende un medio básico (por ejemplo, DMEM/F12, 85 %), reemplazo de suero (15 %), bFGF (100 ng/ml), L-glutamina (2 mM), p-mercaptoetanol (0,1 mM) y reserva de aminoácidos no esenciales (1 %).
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de ácido ascórbico es aproximadamente 50 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de ácido ascórbico es aproximadamente 500 pg/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bFGF es aproximadamente 4 ng/ml.
El medio básico puede ser cualquier medio de cultivo tisular conocido como DMEM/F12 (Biological Industries, Israel o Sigma Israel), Ko-DMEM (Invitrogen). La concentración del medio básico depende de la concentración de los otros ingredientes del medio, como el reemplazo de suero.
El reemplazo de suero puede ser cualquier reemplazo de suero libre de xeno (desprovisto de contaminantes animales) en un intervalo de concentración del 1 al 20 % dependiendo del reemplazo de suero utilizado. Por ejemplo, si se usa el reemplazo de suero SR3, entonces su concentración en el medio es aproximadamente el 1 %.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de L-glutamina es aproximadamente 2 mM.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de la mezcla de lípidos (Sigma, Israel; o Invitrogen, Israel) es aproximadamente el 1 %.
Los ejemplos no limitativos de dicho medio de cultivo incluyen el medio HA13(a) modificado [DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 500 pg/ml, bFGF - 4 ng y SR3 - 1 %]; el medio HA13(b) modificado [DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 500 pg/ml, bFGF - 4 ng, SR3 - 1 % y una mezcla de lípidos (1 %)]; el medio h A13(c) modificado [DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 50 pg/ml, bFGF - 4 ng y SR3 - 1 %]; y el medio HA13(d) modificado [DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 50 pg/ml, bFGF - 4 ng, SR3 - 1 % y una mezcla de lípidos (1 %)]. Estos medios de cultivo pudieron mantener las células madre pluripotentes (por ejemplo, hESC y células de cadera) en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 20 pases cuando se cultivaron en un sistema de cultivo bidimensional (por ejemplo, en un sistema de cultivo libre de capa alimentadora; no se muestran los datos) y durante al menos 20 pases cuando se cultivaron en un sistema de cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión sin adherencia a un sustrato externo, encapsulación celular o a portadora de proteínas; no se muestran los datos).
El medio de cultivo libre de suero de la invención que puede mantener células madre pluripotentes en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales en ausencia de soporte de células alimentadoras comprende una quimera IL6RIL6 en un intervalo de concentración de 50-200 picogramos por mililitro (pg/ml).
Tal como se usa en el presente documento, la frase "quimera IL6RIL6" se refiere a un polipéptido quimérico que comprende la porción soluble del receptor de interleucina-6 [IL-6-R, por ejemplo la IL-6-R humana tal como se establece en GenBank n.° de acceso AAH89410; SEQ ID NO: 33; por ejemplo, una porción de los receptores solubles de IL6 como se establece en los aminoácidos 112-355 (SEQ ID NO: 34) de GenBank n.° de acceso AAH89410] y la interleucina-6 (IL6; por ejemplo, IL-6 humana como se establece en GenBank n.° de acceso CAG29292; SEQ ID NO: 35) o una fracción biológicamente activa del mismo (por ejemplo, un dominio de unión al receptor).
Cabe señalar que al construir la quimera IL6RIL6 las dos porciones funcionales (es decir, la IL6 y su receptor) se pueden fusionar directamente (por ejemplo, unidos o fusionados traduccionalmente, es decir, codificados por un único marco de lectura abierto) entre sí o conjugados (unidos o fusionados traduccionalmente) a través de un conector adecuado (por ejemplo, un conector polipeptídico). Según algunas realizaciones de la invención, el polipéptido quimérico IL6RIL6 presenta una cantidad y un patrón de glicosilación similares a los de IL-6 y receptor de IL6 de origen natural. Por ejemplo, una quimera IL6RIL6 adecuada es la que se establece en SEQ ID NO: 36 y en la Figura 11 del documento WO 99/02552 concedida a Revel M., et al.
Se apreciará que cualquiera de los factores proteináceos usados en el medio de cultivo de la presente invención (por ejemplo, la quimera IL6RIL6, bFGF, TGFp3 ) puede expresarse de forma recombinante o sintetizarse bioquímicamente. Además, los factores proteináceos naturales tales como bFGF y TGFp pueden purificarse a partir de muestras biológicas (por ejemplo, a partir de suero humano, cultivos celulares) utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
La síntesis bioquímica de los factores proteináceos de la presente invención (por ejemplo, la quimera IL6RIL6) se puede realizar utilizando técnicas estándar en fase sólida. Estos métodos incluyen síntesis en fase sólida exclusiva, métodos de síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmentos y síntesis en solución clásica.
La expresión recombinante de los factores proteináceos de la presente invención (por ejemplo, la quimera IL6RIL6) puede generarse usando técnicas recombinantes como las descritas por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol.
153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680, Brogli et al., (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, sección VIII, pág. 421-463. Específicamente, la quimera IL6RIL6 puede generarse tal como se describe en la publicación PCT WO 99/02552 concedida a Revel M., et al. y Chebath J„ et al., 1997.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de la quimera IL6RIL6 en el medio de cultivo está en el intervalo de 55 pg/ml a 195 pg/ml, por ejemplo, de 60 pg/ml a 190 pg/ml, por ejemplo, de 65 pg/ml a 185 pg/ml, por ejemplo, de 70 pg/ml a 180 pg/ml, por ejemplo, de 75 pg/ml a 175 pg/ml, por ejemplo, de 80 pg/ml a 170 pg/ml, por ejemplo, de 85 pg/ml a 165 pg/ml, por ejemplo, de 90 pg/ml a 150 pg/ml, por ejemplo, de 90 pg/ml a 140 pg/ml, por ejemplo, de 90 pg/ml a 130 pg/ml, por ejemplo, de 90 pg/ml a 120 pg/ml, por ejemplo, de 90 pg/ml a 110 pg/ml, por ejemplo, de 95 pg/ml a 105 pg/ml, por ejemplo, de 98 pg/ml a 102 pg/ml, por ejemplo, 100 pg/ml.
El medio de cultivo que contiene la quimera IL6RIL6 de la invención comprende además bFGF.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de bFGF en el medio de cultivo que contiene la quimera IL6RIL6 está en el intervalo de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 80 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, por ejemplo, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 5 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 15 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 20 ng/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo que contiene la quimera IL6RIL6 comprende además reemplazo de suero.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de Knockout™ Serum Replacement en el medio de cultivo que contiene la quimera IL6RIL6 está en el intervalo de aproximadamente el 1 % (v/v) a aproximadamente el 50 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 5 % (v/v) a aproximadamente el 40 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 5 % (v/v) a aproximadamente el 30 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 10 % (v/v) a aproximadamente el 30 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 10 % (v/v) a aproximadamente el 25 % (v/v), por ejemplo, de aproximadamente el 10 % (v/v) a aproximadamente el 20 % (v/v), por ejemplo, aproximadamente el 15 % (v/v).
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende quimera IL6RIL6 en un intervalo de concentración de 50-200 pg/ml, bFGF en un intervalo de concentración de aproximadamente 5-50 ng/ml y reemplazo de suero en una concentración de aproximadamente el 5-40 %.
Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 4 de la sección de Ejemplos que sigue, se demostró que el medio de cultivo CM100Fp puede mantener células madre pluripotentes como las células iPS humanas en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 50 pases en un cultivo en suspensión desprovisto de adherencia al sustrato.
Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo sin suero que puede mantener las células madre pluripotentes en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales en ausencia de soporte de células alimentadoras comprende LIF en una concentración de al menos 2000 unidades/ml.
El factor inhibidor de la leucemia (LIF) es una citocina pleiotrópica que participa en la inducción de la diferenciación hematopoyética, la inducción de la diferenciación de células neuronales, el regulador de la conversión mesenquimal a epitelial durante el desarrollo renal y también puede tener un papel en la tolerancia inmunológica en la interface materno-fetal. El LIF utilizado en el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención puede ser una proteína LIF purificada, sintética o expresada de forma recombinante [por ejemplo, polipéptido LIF humano, n.° de acceso de GenBank NP_002300.1 (SEQ ID NO: 37); polinucleótido LIF humano, n.° de acceso de GenBank n M_002309.3 (SEQ ID NO: 38). Cabe señalar que para la preparación de un medio de cultivo libre de xeno, el LIF se purifica preferentemente a partir de una fuente humana o se expresa de forma recombinante. El LIF humano recombinante puede obtenerse de diversas fuentes, como Chemicon, EE. UU. (n.° de catálogo LIF10100) y AbD Serotec (MorphoSys US Inc, Raleigh, NC 27604, EE. UU.). Murino LIF ESg Ro ® (LIF) puede obtenerse de Millipore, EE. UU. (n.° de catálogo ESG1107).
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de LIF en el medio de cultivo es de aproximadamente 2000 unidades/ml a aproximadamente 10,000 unidades/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2000 unidades/ml a aproximadamente 8,000 unidades/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2000 unidades/ml a aproximadamente 6,000 unidades/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2000 unidades/ml a aproximadamente 5,000 unidades/ml, por ejemplo, de aproximadamente 2000 unidades/ml a aproximadamente 4,000 unidades/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, la concentración de LIF en el medio de cultivo es al menos aproximadamente 2000 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2100 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2200 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2300 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2400 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2500 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2600 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2700 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2800 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2900 unidades/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente 2950 unidades/ml, por ejemplo, aproximadamente 3000 unidades/ml.
Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 4 de la sección de Ejemplos que sigue, se demostró que el medio de cultivo yFL3 puede mantener células madre pluripotentes como las células iPS humanas en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 10 pases cuando se cultivan en un cultivo en suspensión.
Según algunas realizaciones de la invención, los ingredientes incluidos en el medio de cultivo de algunas realizaciones de la invención son sustancialmente puros, con un cultivo tisular y/o un grado clínico.
Según un aspecto de la invención, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula madre pluripotente y el medio de cultivo de la invención.
Según una realización de la invención, el cultivo celular está libre de células alimentadoras (por ejemplo, está desprovisto de células alimentadoras o medio acondicionado con células alimentadoras).
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes que se incluyen en el cultivo celular de algunas realizaciones de la invención exhiben un cariotipo estable (estabilidad cromosómica) durante el período de cultivo, por ejemplo, durante al menos 2 pases, por ejemplo, al menos 4 pases, por ejemplo, al menos 8 pases, por ejemplo, al menos 15 pases, por ejemplo, al menos 20 pases, por ejemplo, al menos 25 pases, por ejemplo, al menos 30 pases, por ejemplo, al menos 35 pases, por ejemplo, al menos 40 pases, por ejemplo, al menos 45 pases, por ejemplo, al menos 50 pases.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo celular de la invención muestra un tiempo de duplicación de al menos 20 horas, por ejemplo, un tiempo de duplicación que está entre 20 y 40 horas (por ejemplo, aproximadamente 36 horas), lo que representa células madre pluripotentes genéticamente estables, no tumorigénicas (por ejemplo, células iPS).
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo celular de la invención se caracteriza por al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 80 %, por ejemplo, al menos el 85 %, por ejemplo, al menos el 90 %, por ejemplo, al menos el 95 % de células madre pluripotentes no diferenciadas.
Según un aspecto de la invención, se proporciona un método de expansión y mantenimiento de células madre pluripotentes en un estado pluripotente y no diferenciado, comprendiendo el método cultivar las células madre pluripotentes en el medio de cultivo de la invención, expandiendo y manteniendo de ese modo las células madre pluripotentes en el estado no diferenciado.
Según algunas realizaciones de la invención, el método de expansión y mantenimiento de las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado se lleva a cabo cultivando las células madre pluripotentes en un medio de cultivo libre de suero, libre de alimentador, libre de matriz y libre de portador de proteínas y que comprende factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml.
Se apreciará que aunque normalmente se siembran suspensiones unicelulares de células madre pluripotentes, también se pueden usar pequeños grupos. Con este fin, la digestión enzimática (tal como con colagenasa tipo IV) utilizada para la disgregación de grupos (véase "Materiales generales y Métodos experimentales" en la sección de Ejemplos que sigue) se termina antes de que las células madre se dispersen por completo y las células se trituran con una pipeta de modo que se forman grupos (es decir, 10-200 células). Sin embargo, se toman medidas para evitar grandes grupos que puedan causar la diferenciación celular.
Tal como se usa en el presente documento, el término "matriz" se refiere a cualquier sustancia a la que se puedan adherir las células madre pluripotentes y que, por lo tanto, pueda sustituir la función de unión celular de las células alimentadoras. Dicha matriz normalmente contiene componentes extracelulares a los que se pueden unir las células madre pluripotentes y, por lo tanto, proporciona un sustrato de cultivo adecuado.
La matriz extracelular puede estar compuesta por componentes derivados de la membrana basal o por componentes de la matriz extracelular que forman parte de acoplamientos ligando-receptor de moléculas de adhesión. MATRIGEL® (Becton Dickinson, EE. UU.) es un ejemplo de una matriz disponible comercialmente que es adecuada. MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales de Engelbreth-Holm-Swarm que gelifica a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida; MATRIGEL® también está disponible como una preparación reducida en factor de crecimiento. Otros componentes de matriz extracelular y mezclas de componentes que son adecuados incluyen matriz de prepucio, matriz de laminina, matriz de fibronectina, matriz de proteoglicano, matriz de entactina, matriz de sulfato de heparán, matriz de colágeno, solos o en diversas combinaciones de los mismos.
La matriz puede estar libre de xeno.
En los casos en los que se deseen condiciones de cultivo completamente libres de animales, la matriz se deriva preferiblemente de una fuente humana o se sintetiza usando técnicas recombinantes como las descritas anteriormente en el presente documento. Dichas matrices incluyen, por ejemplo, fibronectina de origen humano, fibronectina recombinante, laminina de origen humano, matriz de fibroblastos de prepucio o una matriz de fibronectina sintética. La fibronectina de origen humano puede ser de fibronectina plasmática o de fibronectina celular, las cuales pueden obtenerse de Sigma, St. Louis, MO, EE. UU. La matriz de fibroblastos de prepucio y laminina de origen humano se puede obtener de Sigma, St. Louis, MO, EE. UU. Puede obtenerse una matriz de fibronectina sintética de Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo se efectúa en un cultivo en suspensión.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo en suspensión está desprovisto de adherencia a sustrato, por ejemplo, sin adherencia a un sustrato externo tal como componentes de la matriz extracelular, un microportador de vidrio o perlas.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo de las células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión se efectúa en un medio de cultivo libre de portador de proteína.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "portador de proteína" se refiere a una proteína que actúa en la transferencia de proteínas o nutrientes (por ejemplo, minerales como el zinc) a las células en el cultivo. Tales portadores de proteína pueden ser, por ejemplo, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero bovino), Albumax (albúmina enriquecida con lípidos) o plasmanato (proteínas aisladas de plasma humano). Dado que estos portadores se derivan de fuentes humanas o animales, su uso en hESC o cultivos de células iPS humanas está limitado por variaciones específicas de lote y/o exposición a patógenos. Por lo tanto, un medio de cultivo que está desprovisto de un portador de proteína (por ejemplo, albúmina) es muy ventajoso ya que permite un medio verdaderamente definido que puede fabricarse a partir de materiales recombinantes o sintéticos.
Según la invención, el cultivo de las células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión se lleva a cabo en un medio de cultivo libre de suero y libre de células alimentadoras.
Cabe señalar que algunos protocolos de cultivo de células madre pluripotentes, como las hESC y las células iPS, incluyen la microencapsulación de las células dentro de una membrana de hidrogel semipermeable, que permite el intercambio de nutrientes, gases y productos metabólicos con el medio a granel que rodea la cápsula (para detalles véase por ejemplo la solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20090029462 concedida a Beardsley et al.).
Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes cultivadas en el cultivo en suspensión están desprovistas de encapsulación celular.
Según una realización de la invención, se proporciona un método de expansión de células madre pluripotentes inducidas (iPS) y de mantenimiento de las células iPS en un estado no diferenciado. El método se efectúa cultivando las células iPS en un cultivo en suspensión en condiciones de cultivo desprovistas de adherencia al sustrato y desprovistas de encapsulación celular y que permiten la expansión de las células iPS en el estado no diferenciado.
Según la invención, el cultivo de las células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión se efectúa en presencia del medio de cultivo que contiene la quimera IL6RIL6 en el que la concentración de la quimera IL6RIL6 está en el intervalo de 50-200 picogramos por mililitro (pg/ml).
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo de las células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión se efectúa en presencia del medio de cultivo que contiene el factor inhibidor de la leucemia (LIF) en el que la concentración de LIF es al menos aproximadamente 2000 unidades/ml.
Según algunas realizaciones de la invención, el cultivo de las células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión se efectúa en presencia de un medio que comprende factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en un intervalo de concentración de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 200 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 60 ng/ml y aproximadamente 190 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 70 ng/ml y aproximadamente 180 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 80 ng/ml y aproximadamente 170 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90 ng/ml a aproximadamente 160 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 150 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90 ng/ml y aproximadamente 130 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 90 ng/ml a aproximadamente 120 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml.
Por ejemplo, un ejemplo no limitativo de un medio que se encontró adecuado para cultivar hESC y células iPS humanas en un cultivo en suspensión desprovisto de adherencia al sustrato y encapsulación celular es el medio yF100 que comprende reemplazo de suero y 100 ng/ml de bFGF.
Por ejemplo, un ejemplo no limitativo de un medio que se encontró adecuado para cultivar hESC y células iPS humanas en un cultivo en suspensión desprovisto de adherencia al sustrato y encapsulación celular es el medio CM100F que comprende reemplazo de suero, la quimera IL6RIL6 a una concentración de 100 ng/ml y bFGF a una concentración de 10 ng/ml.
Por ejemplo, utilizando los medios de cultivo CM100Fp, CM100F, yF100 o yFL3, los presentes inventores expandieron células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 50 pases (véanse, por ejemplo, las Figuras 3A-C, 4, 5A-C y 6A-D y se describe en los Ejemplos 4 y 5 de la sección de Ejemplos que sigue).
El cultivo en un cultivo en suspensión según el método de algunas realizaciones de la invención se efectúa colocando en placa las células madre pluripotentes en un recipiente de cultivo a una densidad celular que promueve la supervivencia y proliferación celular pero limita la diferenciación. Por lo general, se usa una densidad de colocación en placa de entre aproximadamente 5 x 104 - 2x106 células por ml. Se apreciará que aunque normalmente se siembran suspensiones unicelulares de células madre, también se pueden usar pequeños grupos tales como 10-200 células.
Para proporcionar a las células madre pluripotentes un suministro suficiente y constante de nutrientes y factores de crecimiento mientras se encuentran en el cultivo en suspensión, el medio de cultivo se puede reemplazar diariamente o, en un programa predeterminado, como cada 2-3 días. Por ejemplo, el reemplazo del medio de cultivo se puede realizar sometiendo el cultivo en suspensión de células madre pluripotentes a centrifugación durante aproximadamente 3 minutos a 80 g, y resuspendiendo el sedimento de células madre pluripotentes formado en un medio fresco. Adicionalmente o como alternativa, puede emplearse un sistema de cultivo en el que el medio de cultivo se somete a filtración o diálisis constante para proporcionar un suministro constante de nutrientes o factores de crecimiento a las células madre pluripotentes.
Dado que grandes grupos de células madre pluripotentes pueden provocar la diferenciación celular, se toman medidas para evitar grandes agregados de células madre pluripotentes. Según algunas realizaciones de la invención, los grupos de células madre pluripotentes formados se disocian cada 5-7 días y las células individuales o pequeños grupos de células se dividen en recipientes de cultivo adicionales (es decir, se pasan) o permanecen en el mismo recipiente de cultivo pero con medio de cultivo adicional. Para la disociación de grandes grupos de células madre pluripotentes, un sedimento de células madre pluripotentes (que puede lograrse mediante centrifugación como se describe anteriormente) o un grupo aislado de células madre pluripotentes puede someterse a digestión enzimática y/o disociación mecánica.
La digestión enzimática del (de los) grupo(s) de células madre pluripotentes puede realizarse sometiendo el (los) grupo(s) a una enzima como la colagenasa tipo IV (Worthington biochemical corporation, Lakewood, NJ, EE. UU.) y/o dispasa (productos de Invitrogen Corporation, Grand Island Nueva York, EE. UU.). El tiempo de incubación con la enzima depende del tamaño de los grupos de células presentes en el cultivo en suspensión. Por lo general, cuando los grupos de células de células madre pluripotentes se disocian cada 5-7 días mientras están en el cultivo en suspensión, la incubación de 20-60 minutos con 1.5 mg/ml de colagenasa tipo IV da como resultado grupos de células pequeños que pueden cultivarse más en el estado no diferenciado. Como alternativa, los grupos de células madre pluripotentes pueden someterse a una incubación de aproximadamente 25 minutos con 1.5 mg/ml de colagenasa tipo IV, seguido de una incubación de cinco minutos con 1 mg/ml de dispasa. Cabe señalar que el pase de ESC humanas con tripsina puede dar como resultado la inestabilidad cromosómica y anomalías (véase, por ejemplo, Mitalipova MM., et al., Nature Biotechnology, 23: 19-20, 2005 y Cowan CA et al., N. Engl. J. of Med. 350: 1353-1356, 2004). Según algunas realizaciones de la invención, debe evitarse el pase de células hESC o iPS con tripsina.
La disociación mecánica de grandes grupos de células madre pluripotentes puede realizarse usando un dispositivo diseñado para romper los grupos a un tamaño predeterminado. Tal dispositivo puede obtenerse de CellArtis Goteborg, Suecia. Adicionalmente o como alternativa, la disociación mecánica puede realizarse manualmente usando una aguja como una aguja de 27 g (BD Microlance, Drogheda, Irlanda) mientras se observan los grupos bajo un microscopio invertido.
Según algunas realizaciones de la invención, después de la disociación enzimática o mecánica de los grupos de células grandes, los grupos de células madre pluripotentes disociadas se rompen adicionalmente en pequeños grupos usando puntas de pipeta Gilson de 200 gl (por ejemplo, pipeteando arriba y abajo de las células).
El recipiente de cultivo utilizado para cultivar las células madre pluripotentes en suspensión según el método de algunas realizaciones de la invención puede ser cualquier recipiente de cultivo de tejidos (por ejemplo, con un grado de pureza adecuado para cultivar células madre pluripotentes) que tenga una superficie interna diseñada de tal manera que las células madre pluripotentes cultivadas allí no puedan adherirse o puedan adherirse a dicha superficie (por ejemplo, células no tratadas con cultivo de tejidos, para evitar la unión o la adherencia a la superficie). Preferiblemente, para obtener un cultivo escalable, el cultivo según algunas realizaciones de la invención se realiza utilizando un sistema de cultivo controlado (preferiblemente un sistema de cultivo controlado por computadora) en el que los parámetros de cultivo tales como temperatura, agitación, pH y pO2 se realizan automáticamente utilizando un dispositivo adecuado. Una vez que se registran los parámetros de cultivo, el sistema se configura para el ajuste automático de los parámetros de cultivo según sea necesario para la expansión de células madre pluripotentes.
Como se describe en la sección de Ejemplos que sigue, las células madre pluripotentes se cultivaron en condiciones dinámicas (es decir, en condiciones en las que las células madre pluripotentes están sujetas a un movimiento constante mientras se encuentran en el cultivo en suspensión; véanse, por ejemplo, las Figuras 6A-D; Ejemplo 5) o en condiciones no dinámicas (es decir, un cultivo estático; véanse, por ejemplo, las Figuras 3A-C, 4 y 5A-C; Ejemplo 4) mientras conservan su capacidad pluripotente proliferativa y la estabilidad del cariotipo durante al menos 30 pases.
Para el cultivo no dinámico de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes se pueden cultivar en placas de Petri de 58 mm sin recubrir (Greiner, Frickenhausen, Alemania).
Para el cultivo dinámico de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes pueden cultivarse en matraces giratorios [por ejemplo, de 200 ml a 1000 ml, por ejemplo, 250 ml que pueden obtenerse de CellSpin de Integra Biosciences, Fernwald, Alemania; de 100 ml que puede obtenerse de Bellco, Vineland, NJ; o en Erlenmeyer de 125 ml (Corning Incorporated, Corning NY, EE. UU.)] que pueden conectarse a una unidad de control y así presentar un sistema de cultivo controlado. El recipiente de cultivo (por ejemplo, un matraz giratorio, un Erlenmeyer) se agita continuamente. Según algunas realizaciones de la invención, los recipientes de cultivo se agitan a 90 vueltas por minuto (rpm) utilizando un agitador (S3.02.10L, ELMI ltd, Riga, Latvia). Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo se cambia diariamente.
Según algunas realizaciones de la invención, cuando se cultivan según las enseñanzas de la presente invención, se controla el crecimiento de las células madre pluripotentes para determinar su estado de diferenciación. El estado de diferenciación puede determinarse usando diversos enfoques que incluyen, por ejemplo, evaluación morfológica (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1A-C, 3A-C) y/o detección del patrón de expresión de marcadores típicos del estado no diferenciado usando técnicas inmunológicas tales como citometría de flujo para marcadores ligados a la membrana, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia para marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático para marcadores moleculares secretados. Por ejemplo, la inmunofluorescencia empleada en hESC o células iPS humanas cultivadas según el método de algunas realizaciones de la invención reveló la expresión de Oct4, antígeno embrionario específico de etapa (SSEA) 4, el antígeno de rechazo de tumor (TRA)-1-60 y TRA-1-81 (Figuras 2A-C, 5A-C y 6A-D). Adicionalmente, el nivel de transcritos de marcadores específicos de no diferenciación (por ejemplo, Oct4, Nanog, Sox2, Rex1, Cx43, FGF4) o marcadores de diferenciación (por ejemplo, albúmina, glucagones, a-actina cardíaca, p-globulina, Flk1, AC133 y neurofilamento) puede detectarse mediante técnicas basadas en ARN, como el análisis de RT-PCR y/o el análisis de micromatrices de ADNc.
La determinación de la diferenciación de células ES también puede efectuarse mediante mediciones de actividad de fosfatasa alcalina. Las células ES humanas no diferenciadas tienen actividad de fosfatasa alcalina que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4 % y revelando con el kit de sustrato Vector Red según las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE. UU.).
Los presentes inventores han descubierto que los nuevos medios de cultivo libres de xeno y libres de suero novedosos de la invención pueden usarse para derivar nuevas líneas de células madre pluripotentes.
Por lo tanto, como se muestra más adelante en la sección de Ejemplos que sigue, utilizando el medio de cultivo HA40/4, los presentes inventores fueron capaces de derivar una nueva línea hESC denominada "WC1" a partir de blastocistos completos cultivados en la capa alimentadora de fibroblastos del prepucio humano (Ejemplo de referencia 3 de la sección de Ejemplos que sigue).
El término "derivar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a generar una línea de células madre embrionarias o una línea de células madre pluripotentes inducidas a partir de al menos una célula madre embrionaria o pluripotente inducida.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "línea de células madre embrionarias" se refiere a células madre embrionarias que se derivan de una sola o un grupo de células madre embrionarias de un solo organismo (por ejemplo, un solo blastocisto humano), y que se caracterizan por la capacidad de proliferar en el cultivo mientras se mantiene el estado no diferenciado y la capacidad pluripotente.
La obtención de una célula madre embrionaria a partir de un blastocisto en etapa previa a la implantación, un blastocisto en etapa posterior a la implantación y/o un tejido genital de un feto puede realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica, como se describe anteriormente y en el Ejemplo de referencia 3 de la sección de Ejemplos que sigue. Brevemente, se extrae la zona pelúcida de un blastocisto de 5-7 días de edad utilizando solución ácida de Tyrode (Sigma, St Louis MO, EE. UU.), la capa trofoblástica se retira específicamente mediante inmunocirugía o mecánicamente usando aguas de 27 g y la ICM expuesta se cultiva directamente en un sistema de cultivo adecuado (por ejemplo, capas alimentadoras, matriz libre de alimentador o cultivo en suspensión) en presencia de cualquiera de los medios de cultivo descritos anteriormente en el presente documento durante 4-10 días (en caso de que se utilice un blastocisto de preimplantación) o se somete a implantación in vitro cultivando la ICM durante 6-8 días (para obtener células de un blastocisto de 13 días en caso de que se utilice un blastocisto post-implantación/pre-gastrulación) en capas alimentadoras o un sistema de cultivo libre de alimentador que permita la implantación del blastocisto a la superficie, después de lo cual las células implantadas se aíslan y pueden cultivarse adicionalmente en capas alimentadoras, matriz libre de alimentador o un cultivo en suspensión en presencia de cualquiera de los medios de cultivo descritos anteriormente en el presente documento como se describe a continuación en el presente documento. Cuando se usa el tejido genital de un feto, las crestas genitales se disocian y se cortan en pequeños trozos que luego se disgregan en células por disociación mecánica. A continuación, las células EG de una sola célula se cultivan en cualquiera de los medios de cultivo descritos anteriormente en el presente documento durante 4-10 días.
Según un aspecto de la invención, la línea de células madre pluripotentes es una línea de células madre pluripotentes inducidas (células iPS), y el método de derivación de la línea de células iPS se lleva a cabo mediante: (a) inducción de una célula somática a una célula madre pluripotente; y (b) cultivo de la célula madre pluripotente en el medio de cultivo de la invención, derivando de ese modo la línea de células madre pluripotentes inducidas.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "línea de células madre pluripotentes inducidas" se refiere a células madre pluripotentes derivadas de una única célula madre pluripotente inducida, que se caracterizan por la capacidad de proliferar en cultivo manteniendo el estado no diferenciado y la capacidad pluripotente.
Los métodos de inducción de células madre pluripotentes son bien conocidos en la técnica y se dan ejemplos en Takahashi y Yamanaka, 2006; Takahashi et al, 2007; Meissner et al, 2007; Okita et al, 2007, Yu et al, 2007; Nakagawa et al, 2008, Yu J, et al., Science. 2009, 324: 797-801; Parque et al, 2008; Hanna et al., 2007; Lowry et al., 2008; Aoi et al, 2008.
Una vez obtenidas, las células ESC o iPS se cultivan adicionalmente en cualquiera de los medios de cultivo descritos anteriormente en el presente documento que permiten la expansión de las células madre pluripotentes en el estado no diferenciado, esencialmente como se describe anteriormente en el presente documento.
Se apreciará que una línea de células madre pluripotentes establecida (por ejemplo, línea de células madre embrionarias o línea de células madre pluripotentes inducidas) puede estar sujeta a ciclos de congelación/descongelación sin obstaculizar la capacidad proliferativa de las células en el estado no diferenciado mientras se conserva su capacidad pluripotente. Por ejemplo, como se muestra en la sección de Ejemplos que sigue, utilizando un reemplazo de suero al 15 % y DMSO al 10 %, las células iPS humanas se congelaron y descongelaron con éxito.
Como se describe en los Ejemplos 1, 2, 4 y 5 de la sección de Ejemplos que sigue, las células iPS humanas que se expandieron y mantuvieron en cualquiera de los medios de cultivo descritos anteriormente en el presente documento son pluripotentes. (es decir, pueden diferenciarse en todos los tipos de células de las tres capas germinales embrionarias, el ectodermo, el endodermo y el mesodermo) como se evidencia in vitro (por la formación de EB) e in vivo (por la formación de teratomas) después de un período de cultivo prolongado (por ejemplo, de al menos 20 o 30 pases) en sistemas de cultivo bidimensionales (por ejemplo, matrices libre de alimentador o alimentadores de prepucio) o tridimensionales (por ejemplo, cultivos en suspensión estáticos o dinámicos). Por lo tanto, las células iPS humanas cultivadas según las enseñanzas de la presente invención pueden usarse como una fuente para generar células específicas de linaje diferenciadas. Dichas células pueden obtenerse directamente de las ESC sometiendo las ESC a diversas señales de diferenciación (por ejemplo, citocinas, hormonas, factores de crecimiento) o indirectamente, mediante la formación de cuerpos embrioides y la subsiguiente diferenciación de las células de las EB en células específicas de linaje.
Por tanto, según un aspecto de la invención, se proporciona un método de generación de cuerpos embrioides a partir de células madre pluripotentes. El método se lleva a cabo (a) cultivando las células madre pluripotentes según los métodos de la invención para obtener de ese modo células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas; y (b) sometiendo las células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar las células madre en cuerpos embrioides, generando de ese modo los cuerpos embrioides a partir de las células madre pluripotentes.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "cuerpos embrioides" se refiere a estructuras morfológicas compuestas por una población de ESC, células de blastocisto extendidas (EBC), células germinales embrionarias (EGC) y/o células madre pluripotentes inducidas que han sufrido diferenciación. La formación de EB se inicia después de la eliminación de los factores de bloqueo de la diferenciación de los cultivos de células madre pluripotentes. En el primer paso de la formación de EB, las células madre pluripotentes proliferan en pequeñas masas de células que luego proceden con la diferenciación. En la primera fase de diferenciación, después de 1-4 días de cultivo para ESC humanas o células iPS humanas, se forma una capa de células endodérmicas en la capa externa de la masa pequeña, lo que da como resultado "EB simples". En la segunda fase, después de 3-20 días después de la diferenciación, se forman "EB complejos". Los EB complejos se caracterizan por una amplia diferenciación de células ectodérmicas y mesodérmicas y tejidos derivados.
Por lo tanto, el método según algunas realizaciones de la invención implica el cultivo de células madre pluripotentes en cualquiera de los medios de cultivo descritos anteriormente en el presente documento para obtener células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas y luego someter las células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas (por ejemplo, ESC o células iPS) a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar las células madre pluripotentes en cuerpos embrioides. Tales condiciones de cultivo están sustancialmente desprovistas de factores inhibidores de la diferenciación que se emplean cuando las células madre pluripotentes se van a expandir en un estado no diferenciado, como TGFp3 , ácido ascórbico a una concentración de al menos 50 pg/ml, bFGF y/o la quimera IL6RIL6.
Para la formación de EB, las células madre pluripotentes (ESC o células iPS) se eliminan de sus capas de células alimentadoras, sistemas de cultivo libre de alimentador o cultivos en suspensión y se transfieren a un cultivo en suspensión en presencia de un medio de cultivo que contiene suero o reemplazo de suero y que está desprovisto de factores inhibidores de la diferenciación (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 1,2, 4 y 5 de la sección de Ejemplos que sigue). Por ejemplo, un medio de cultivo adecuado para la formación de EB puede incluir un medio de cultivo básico (por ejemplo, Ko-DMEM o DMEM/F12) complementado con FBSd al 20 % (HyClone, Utah, EE. UU.), L-glutamina 1 mM, p-mercaptoetanol 0.1 mM y el 1 % de reserva de aminoácidos no esenciales.
El control de la formación de EB está dentro de las capacidades de los expertos en la materia y puede efectuarse mediante evaluaciones morfológicas (por ejemplo, tinción histológica) y determinación de la expresión de marcadores específicos de diferenciación [por ejemplo, utilizando técnicas inmunológicas o análisis basados en ARN (por ejemplo, RT-PCR, micromatriz de ADNc)].
Se apreciará que para obtener células específicas de linaje a partir de los EB, las células de los EB pueden someterse además a condiciones de cultivo adecuadas para células específicas de linaje.
El método de este aspecto de la presente invención incluye además el paso (c) de someter las células de los cuerpos embrioides a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje; generando de ese modo las células específicas de linaje a partir de las células madre embrionarias.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje" se refiere a una combinación de sistema de cultivo, por ejemplo, capas de células alimentadoras, matriz libre de alimentador o cultivo en suspensión y un medio de cultivo que son adecuados para la diferenciación y/o expansión de linajes celulares específicos derivados de células de los EB. Los ejemplos no limitativos de tales condiciones de cultivo se describen adicionalmente a continuación en el presente documento.
Según algunas realizaciones de la invención, el método de este aspecto de la invención incluye además el aislamiento de células específicas de linaje después del paso (b).
Tal como se usa en el presente documento, la frase "aislamiento de células específicas de linaje" se refiere al enriquecimiento de una población mixta de células en un cultivo con células que muestran predominantemente al menos una característica asociada con un fenotipo de linaje específico. Se apreciará que todos los linajes celulares se derivan de las tres capas germinales embrionarias. Así, por ejemplo, los hepatocitos y las células pancreáticas se derivan del endodermo embrionario, los tejidos conectivos óseos, cartilaginosos, elásticos y fibrosos, los miocitos, las células miocárdicas, las células de la médula ósea, las células vasculares (es decir, las células endoteliales y del músculo liso), y las células hematopoyéticas se diferencian del mesodermo embrionario y las células neurales, retinales y epidérmicas se derivan del ectodermo embrionario.
Según algunas realizaciones preferidas de la invención, el aislamiento de células específicas de linaje se efectúa clasificando las células de los EB mediante un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
Los métodos de aislamiento de células diferenciadas derivadas de EB mediante análisis FACS son conocidos en la técnica. Según un método, los EB se disgregan utilizando una solución de tripsina y EDTA (0.025 % y 0.01 %, respectivamente), se lavan con suero fetal bovino (FBS) al 5 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incuban durante 30 min en hielo con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra antígenos de superficie celular característicos de un linaje celular específico. Por ejemplo, las células endoteliales se aíslan uniendo un anticuerpo dirigido contra la molécula de adhesión de células endoteliales de plaquetas-1 (PECAM1) como los anticuerpos PECAM1 marcados con fluorescencia (30884X) disponibles de PharMingen (PharMingen, Becton Dickinson Bio Sciences, San Jose, CA, EE. UU.) como se describe en Levenberg, S. et al., (Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99: 4391 -4396). Las células hematopoyéticas se aíslan usando anticuerpos marcados con fluorescencia como CD34-FITC, CD45-PE, CD31-PE, CD38-PE, CD90-FITC, CD117-PE, CD15-FITC, clase I-FITC, todas las IgG1 de los cuales están de PharMingen, CD133/1 -PE (IgG1) (disponible de Miltenyi Biotec, Auburn, CA), y glicoforina A-PE (IgG1), disponible de Immunotech (Miami, FL). Las células vivas (es decir, sin fijación) se analizan en un FACScan (Becton Dickinson Bio Sciences) utilizando yoduro de propidio para excluir las células muertas con el software PC-LYSIS o CELLQUEST. Se apreciará que las células aisladas pueden enriquecerse aún más usando segundos anticuerpos marcados magnéticamente y columnas de separación magnética (MACS, Miltenyi) como se describe por Kaufman, D.S. et al., (Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001,98: 10716-10721).
Según algunas realizaciones de la invención, el aislamiento de células específicas de linaje se efectúa mediante una separación mecánica de células, tejidos y/o estructuras similares a tejidos contenidas dentro de los EB.
Por ejemplo, los cardiomiocitos latiendo pueden aislarse de los EB como se describe en la solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20030022367 concedida Xu et al. Los EB de cuatro días de edad de la presente invención se transfieren a placas recubiertas de gelatina o portaobjetos de cámara y se les permite unirse y diferenciarse. Las células que se contraen espontáneamente, que se observan a partir del día 8 de diferenciación, se separan mecánicamente y se recogen en un tubo de 15 ml que contiene medio de bajo contenido en calcio o PBS. Las células se disocian usando digestión con colagenasa B durante 60-120 minutos a 37 °C, dependiendo de la actividad de colagenasa. Luego, las células disociadas se resuspenden en un medio KB de diferenciación (KCl 85 mM, K2 HPO4 30 mM, MgSÜ4 5 mM, EGTA 1 mM, creatina 5 mM, glucosa 20 mM, Na2ATP 2 mM, piruvato 5 mM y taurina 20 mM, tamponado a pH 7,2, Maltsev et al., Circ. Res. 75:233, 1994) y se incuban a 37 °C durante 15-30 min. Después de la disociación, las células se siembran en portaobjetos de cámara y se cultivan en el medio de diferenciación para generar cardiomiocitos individuales capaces de latir.
Según algunas realizaciones de la invención, el aislamiento de células específicas de linaje se efectúa sometiendo los EB a factores de diferenciación para inducir de ese modo la diferenciación de los EB en células diferenciadas específicas de linaje.
Lo que sigue es una descripción no limitativa de una serie de procedimientos y enfoques para inducir la diferenciación de Eb en células específicas de linaje.
Para diferenciar los EB de algunas realizaciones de la invención en precursores neurales, se cultivan EB de cuatro días durante 5-12 días en placas de cultivo de tejidos que incluyen medio DMEM/F-12 con 5 mg/ml de insulina, 50 mg/ml de transferrina, cloruro de selenio 30 nM y fibronectina 5 mg/ml (medio ITSFn, Okabe, S. et al., 1996, Mech. Dev. 59: 89-102). Los precursores neuronales resultantes pueden trasplantarse para generar células neuronales in vivo (Brüstle, O. et al., 1997. In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 14809-14814). Se apreciará que antes de su trasplante, los precursores neurales se tripsinizan y se trituran para dar suspensiones unicelulares en presencia de ADNasa al 0.1 %.
Los EB de algunas realizaciones de la invención pueden diferenciarse en oligodendrocitos y mielinizar células cultivando las células en medio SATO modificado, es decir, DMEM con albúmina de suero bovino (BSA), piruvato, progesterona, putrescina, tiroxina, triyodotrionina, insulina, transferrina, selenito de sodio, aminoácidos, neurotrofina 3, factor neurotrófico ciliar y Hepes (Bottenstein, J. E. & Sato, G. H., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517; Raff, M. C, Miller, R. H., & Noble, M., 1983, Nature 303: 390-396]. Brevemente, los EB se disocian utilizando tripsina/EDTA al 0.25 % (5 min a 37 °C) y se trituran hasta obtener suspensiones de células individuales. Las células suspendidas se colocan en placa en matraces que contienen medio SATO suplementado con suero equino al 5 % y suero bovino fetal al 5 % (FCS). Después de 4 días de cultivo, los matraces se agitan suavemente para suspender las células adheridas de manera floja (principalmente oligodendrocitos), mientras que los astrocitos permanecen adheridos a los matraces y producen adicionalmente medio acondicionado. Los oligodendrocitos primarios se transfieren a nuevos matraces que contienen medio SATO durante dos días adicionales. Después de un total de 6 días en cultivo, las oligoesferas se disocian parcialmente y se resuspenden en medio SATO para el trasplante de células, o se disocian por completo y se colocan en placa en un medio acondicionado con oligoesferas que se deriva del paso de agitación anterior [Liu, S. et al., (2000). Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6126-6131].
Para la diferenciación de mastocitos, se transfieren EB de dos semanas de algunas realizaciones de la invención a placas de cultivo de tejidos que incluyen medio DMEM suplementado con FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 mg/ml, 20 % (v/v) de medio condicionado con células WEHI-3 y 50 ng/ml de factor recombinante de células madre de rata (rrSCF, Tsai, M. et al., 2000. In vivo immunological function of mast cells derived from embryonic stem cells: An approach for the rapid analysis of even embryonic lethal mutations in adult mice in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 9186-9190). Los cultivos se expanden semanalmente transfiriendo las células a nuevos matraces y reemplazando la mitad del medio de cultivo.
Para generar células hematolinfoides a partir de los EB de algunas realizaciones de la invención, se transfieren EB de 2-3 días a placas de cultivo permeables a gases en presencia del 7.5 % de CO2 y 5 % de O2 utilizando una incubadora con contenido de oxígeno ajustable. Después de 15 días de diferenciación, las células se recogen y se disocian mediante una digestión suave con colagenasa (0.1 unidades/mg) y dispasa (0.8 unidades/mg), ambas disponibles en F.Hoffman-La Roche Ltd, Basel, Suiza. Las células positivas para CD45 se aíslan utilizando el anticuerpo monoclonal (Acm) anti-CD45 M1/9.3.4.HL.2 y microesferas paramagnéticas (Miltenyi) conjugadas con inmunoglobulina anti-rata de cabra como se describe en Potocnik, A. J. et al., (Immunology Hemato-lymphoid in vivo reconstitution potential of subpopulations derived from in vitro differentiated embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 10295­ 10300). Las células positivas para CD45 aisladas pueden enriquecerse aún más usando un solo pase a través de una columna MACS (Miltenyi).
Se apreciará que las condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación y expansión de las células específicas de linaje aisladas incluyen diversos medios de cultivo de tejidos, factores de crecimiento, antibióticos, aminoácidos y está dentro de la capacidad de un experto en la técnica determinar qué condiciones deben aplicarse para expandir y diferenciar tipos de células y/o linajes celulares particulares.
Adicionalmente o como alternativa, las células específicas de linaje pueden obtenerse induciendo directamente las células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas tales como células ESC o células iPS a condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación de linaje celular específico.
Según un aspecto de la invención, se proporciona un método de generación de células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes. El método se lleva a cabo (a) cultivando las células madre pluripotentes según el método de la invención, para obtener de ese modo células madre no diferenciadas, expandidas; y (b) sometiendo las células madre no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje, generando de ese modo células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes.
Los siguientes son ejemplos no limitativos de condiciones de cultivo que son adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes (por ejemplo, ESC y células iPS).
Las células estromales mesenquimatosas que son positivas para CD73 y negativas para SSEA-4 pueden generarse a partir de hESC aumentando mecánicamente la fracción de células diferenciadas similares a fibroblastos formadas en cultivos de hESC, esencialmente como se describe en Trivedi P y Hematti P. Exp Hematol. 2008, 36(3):350-9. Brevemente, para inducir la diferenciación de hESC, los intervalos entre cambios de medio se incrementan a 3-5 días, y las células en la periferia de las colonias de ESC se convierten en células fusiformes que parecen fibroblastos. Después de 9-10 días en estas condiciones, cuando aproximadamente el 40-50 % de las células en el cultivo adquieren la apariencia de fibroblastos, las porciones no diferenciadas de las colonias de ESC se eliminan físicamente y las células diferenciadas restantes se pasan a nuevas placas de cultivo bajo el mismo condiciones.
Para inducir la diferenciación de hESC en neuronas dopaminérgicas (DA), las células se pueden cocultivar con las líneas de células estromales de ratón PA6 o MS5, o pueden cultivarse con una combinación de factor 1 derivado de células estromales (SDF-1/CXCL12), pleiotrofina (PTN), factor de crecimiento similar a insulina 2 (IGF2) y efrina B1 (EFNB1) esencialmente como se describe in Vazin T, et al., PLoS One. 12 de agosto de 2009;4(8):e6606; y en Elkabetz Y., et al., Genes Dev. 15 de enero de 2008; 22: 152-165.
Para generar neuronas de dopamina mesencefálicas (mesDA), las hESC pueden modificarse genéticamente para expresar el factor de transcripción Lmx1a (por ejemplo, usando un vector lentiviral con el promotor PGK y Lmx1a) esencialmente como se describe en Friling S., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 7613-7618.
Para generar epitelio pulmonar (neumocitos tipo II) a partir de hESC, las ESC se pueden cultivar en presencia de un medio de cultivo celular comercialmente disponible (Small Airway Growth Medium; Cambrex, College Park, MD) o, alternativamente, en presencia de un medio acondicionado recogido de una línea celular de neumocitos (por ejemplo, la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano A549) como se describe en Rippon HJ., et al., Proc Am Thorac Soc. 2008; 5: 717-722.
Para inducir la diferenciación de hESC o células iPS humanas en células neurales, las células madre pluripotentes pueden cultivarse durante aproximadamente 5 días en presencia de un medio de reemplazo de suero complementado con inhibidor de TGF-b (SB431542, Tocris; por ejemplo, 10 nM) y Noggin (R&D; por ejemplo, 500 ng/ml), después de lo cual las células se cultivan con cantidades crecientes (por ejemplo, 25 %, 50 %, 75 %, se cambian cada dos días) de medio N2 (Li XJ., et al., Nat Biotechnol. 2005, 23:215-21) en presencia de 500 ng/ml de Noggin, esencialmente como se describe en Chambers SM., et al., Nat Biotechnol. 2009, 27: 275-280.
Además de los cultivos primarios específicos de linaje, los EB pueden usarse para generar líneas celulares específicas de linaje que son capaces de una expansión ilimitada en el cultivo.
Las líneas celulares pueden producirse mediante la inmortalización de las células derivadas de EB mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, la expresión de un gen de telomerasa en las células (Wei, W. et al., 2003. Mol Cell Biol. 23: 2859-2870) o el co-cultivo de las células con células productoras retrovirales NIH 3T3 hph-HOX11 (Hawley, R. G. et al., 1994. Oncogén 9: 1-12).
Se apreciará que, dado que las células específicas de linaje o las líneas celulares obtenidas según las enseñanzas de la invención se desarrollan mediante procesos de diferenciación similares a los que ocurren naturalmente en el embrión humano, pueden usarse adicionalmente para terapia basada en células humanas y regeneración de tejidos.
Por lo tanto, las células o líneas celulares específicas de linaje expandidas y/o diferenciadas obtenidas pueden usarse para tratar un trastorno que requiere terapia de reemplazo celular.
Por ejemplo, los precursores de oligodendrocitos pueden usarse para tratar trastornos de mielina (Repair of myelin disease: Strategies and progress in animal models. Molecular Medicine Today. 1997. pág. 554-561), los condrocitos o las células mesenquimatosas pueden usarse en el tratamiento de defectos óseos y cartilaginosos (patente de los EE. UU. n.° 4.642.120) y las células del linaje epitelial pueden usarse en la regeneración de la piel de una herida o quemadura (patente de los EE. UU. n.° 5.716.411).
Para ciertos trastornos, como los trastornos genéticos en los que falta un producto génico específico [por ejemplo, falta del producto génico CFTR en pacientes con fibrosis quística (Davies JC, 2002. New therapeutic approaches for cystic fibrosis lung disease. J. R. Soc. Med. 95 Supl 41:58-67)], las células derivadas de ESC o las células derivadas de iPS se manipulan preferiblemente para sobreexpresar el gen mutado antes de su administración al individuo. Se apreciará que para otros trastornos, las células derivadas de ESC o las células derivadas de iPS deben manipularse para excluir ciertos genes.
La sobreexpresión o exclusión de genes puede efectuarse utilizando construcciones knock-in y/o knock-out [véase, por ejemplo, Fukushige, S. y Ikeda, J. E.: Trapping of mammalian promoters by Cre-lox site-specific recombination. DNA Res 3 (1996) 73-50; Bedell, M. A., Jerkins, N. A. y Copeland, N. G.: Mouse models of human disease. Part I: Techniques and resources for genetic analysis in mice. Genes and Development 11 (1997) 1-11; Bermingham, J. J., Scherer, S. S., O'Connell, S., Arroyo, E., Kalla, K. A., Powell, F. L. y Rosenfeld, M. G.: Tst-l/Oct-6/SCIP regulates a unique step in peripheral myelination and is required for normal respiration. Genes Dev 10 (1996) 1751-62].
Además de la terapia de reemplazo celular, las células específicas de linaje obtenidas también pueden usarse para preparar una biblioteca de ADNc. El ARNm se prepara mediante técnicas estándares a partir de células específicas del linaje y se transcribe posteriormente de manera inversa para formar ADNc. La preparación de ADNc puede sustraerse con nucleótidos de fibroblastos embrionarios y otras células de especificidad no deseada, para producir una biblioteca de ADNc sustraída mediante técnicas conocidas en la técnica.
Las células específicas de linaje obtenidas pueden usarse para detectar factores (tales como fármacos de molécula pequeña, péptidos, polinucleótidos) o condiciones (tales como condiciones de cultivo o manipulación) que afectan la diferenciación del precursor del linaje en células diferenciadas terminalmente. Por ejemplo, las sustancias que afectan al crecimiento, las toxinas o los posibles factores de diferenciación pueden someterse a ensayo mediante su adición al medio de cultivo.
Tal como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a".
El término "que consiste en" significa "incluido y limitado a".
El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir ingredientes, pasos y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, pasos y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicados.
Tal como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas sus mezclas.
A lo largo de esta solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo como del 1 al 6 tiene subintervalos revelados específicamente como del 1 al 3, del 1 al 4, del 1 al 5, del 2 al 4, del 2 al 6, del 3 al 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las frases "que oscila/oscila entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que oscila/oscila de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se usan indistintamente en el presente documento y pretenden incluir el primer y el segundo número indicado y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea determinada, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarrollados fácilmente a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos por profesionales de la técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.
Tal como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuada en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se delinearon anteriormente en el presente documento y se reivindicaron en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de manera no limitativa.
Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican detalladamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (ed) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); las metodologías se exponen en las patentes de los EE. UU. n.° 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (ed), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (ed), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n.° 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., ed. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos allí descritos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector.
Materiales generales y métodos experimentales
Líneas celulares
Cultivo de células iPS - Las líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPS) J1.2-3 e iF4 [Park et al, 2008] derivadas de fibroblastos de prepucio y fibroblastos adultos respectivamente, se cultivaron con fibroblastos embrionarios de ratón inactivados (MEF) como se describió previamente [Park et al, 2008]. Se sometió a ensayo la capacidad de las siguientes combinaciones de medios de cultivo para determinar su capacidad de apoyar el crecimiento de células iPS en cultivos adjuntos [bidimensionales (2D)]:
Condiciones de cultivo en dos dimensiones: Las líneas celulares iPS humanas se cultivaron con MEF o en matrices sintéticas en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo. Las células se pasaron cada cuatro a seis días usando 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (Gibco Invitrogen Corporation, Grand Island NY, EE. UU.) y se colocaron en placa a una densidad de 1 x 104 - 3 x 105 células por cm2.
Medios usados para cultivos 2D -
(i) medio de cultivo básico yF10 que consiste en el 85 % de DMEM/F12 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), el 15 % de knockout serum replacement (SR; Invitrogen), L-glutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 0.1 mM, 1 % de reserva de aminoácidos no esenciales y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), todos de Invitrogen Corporation products, Grand Island NY, EE. UU., a menos que se indique lo contrario. Este medio de cultivo básico se usó como control y para el crecimiento rutinario de células iPS con MEF inactivado o fibroblastos de prepucio como capas alimentadoras en cultivos 2D.
(ii) mHA40/4 DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Israel), ITS 1 % [Invitrogen corporation; la premezcla ITS es una solución madre X100 que consiste en 1.25 mg de insulina, 1.25 mg de transferrina y 1.25 mg de ácido selenoso], TGFp3 2 ng/ml (de R&D Systems Minneapolis MN, EE. UU.), L-glutamina 2 mM (Invitrogen corporation), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma, Israel), bFGF - 10 ng (Invitrogen corporation), albúmina sérica humana - 0.5 % (Sigma, n.° de catálogo A1653), bicarbonato de Na (7.5 %) (Biological Industries, Israel), mezcla de lípidos definidos al 1 % (Invitrogen corporation).
(iii) HA75 DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Israel), L-glutamina 2 mM (Invitrogen Corporation), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma), bFGF - 10 ng (Invitrogen Corporation), TGFp32 ng/ml (R&D Systems Minneapolis MN, EE. UU.), SR3 (reemplazo de suero) - 1 % (Sigma, Israel), mezcla de lípidos definidos 1 % (Invitrogen corporation).
(iv) HA76 DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Beit HaEmek, Israel), ITS 1 % (Invitrogen Corporation), L-glutamina 2 mM (Invitrogen Corporation), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma, Israel), bFGF - 100 ng (Invitrogen Corporation), TGFp32 ng/ml (R&D Systems Minneapolis MN, EE. UU.), suero de albúmina sérica humana - 1 % (Sigma, número de catálogo A1653), bicarbonato de Na (7.5 %) (Biological Industries, Israel), mezcla de lípidos definidos 1 % (Invitrogen corporation).
(v) HA77 DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Israel, Sigma Israel), L-glutamina 2 mM (Invitrogen corporation, Sigma, Israel), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma, Israel), bFGF - 100 ng (Invitrogen corporation), bicarbonato de Na (7.5 %) (Biological Industries, Israel), SR3 - 1 % (Sigma, Israel), mezcla de lípidos definidos 1 % (Invitrogen corporation, Sigma, Israel). Cabe señalar que HA77 DMEM/F12 (94 %) también puede usarse sin bicarbonato de Na y, sin embargo, apoya el cultivo de células madre pluripotentes (por ejemplo, hESC y iPSC) en un estado proliferativo, pluripotente y no diferenciado durante al menos 10 pases.
(v) HA78 DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Israel), L-glutamina 2 mM (Invitrogen corporation), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma, Israel), bFGF - 10 ng/ml (Invitrogen corporation), TGFp32 ng/ml (R&D Systems Minneapolis MN, EE. UU.), SR3™ - 1 % (Sigma, Israel), bicarbonato de Na (7.5 %) (Biological Industries, Israel), mezcla de lípidos definidos 1 % (Invitrogen corporation).
(v) HA74/1 DMEM/F12 (94 %) (Biological Industries, Israel), ITS 1 % (Invitrogen corporation), L-glutamina 2 mM (Invitrogen corporation), ácido ascórbico 500 pg/ml (Sigma, Israel), bFGF - 50 ng/ml (Invitrogen corporation), TGFp32 ng/ml (R&D Systems Minneapolis MN, EE. UU.), albúmina sérica humana - 0,5 % (Sigma, Israel, n.° de catálogo A1653), bicarbonato de Na (7.5 %) (Biological Industries, Israel), mezcla de lípidos definidos 1 % (Invitrogen Corporación).
Cabe señalar que cuando se usó albúmina humana recombinante (SIGMA, n.° de catálogo A7223) en lugar de albúmina de suero humano (SIGMA, n.° de catálogo A1653) en los medios de cultivo mHA40/4, HA76, HA74/1, se encontró que estos medios de cultivo apoyaban el crecimiento de las células iPS en un estado pluripotente y no diferenciado durante un período prolongado de cultivo. Por lo tanto, estos resultados demuestran que puede usarse albúmina humana recombinante en lugar de albúmina de suero humano en los medios de cultivo de algunas realizaciones de la invención y, por lo tanto, proporcionar condiciones libres de xeno definidas.
Condiciones de cultivo en sistemas de cultivo tridimensionales (cultivo en suspensión):
Medios utilizados para cultivos en suspensión. -
(i) CM100Fp medio que consiste en el medio de cultivo básico (medio de cultivo básico yF10) suplementado con 100 pg/ml de quimera IL6RIL6. La IL6RIL6 de 85 kDa se produjo y purificó como se describe y fue donada por InterPharm, grupo Merck-Serono (Nes-Ziona, Israel y Ginebra, Suiza).
(ii) CM100F medio que consiste en el medio de cultivo básico (medio de cultivo básico yF10) suplementado con 100 ng/ml de quimera IL6RIL6. La IL6RIL6 de 85 kDa se produjo y purificó como se describe y fue donada por InterPharm, grupo Merck-Serono (Nes-Ziona, Israel y Ginebra, Suiza).
(iii) yF100 medio básico (medio de cultivo básico yF10) en el que en lugar de 10 ng/ml de bFGF se utilizaron 100 ng/ml de bFGF. Se encontró que este medio soporta el cultivo en suspensión de hESC con la misma eficiencia que CM100F.
(iv) yFL3 el medio consiste en el medio de cultivo básico yF10 con 4 ng/ml de bFGF en lugar de 10 ng/ml de bFGF y complementado con 3000 unidades/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF). Cabe señalar que las células iPS se cultivaron con el medio yFL3 que comprendía 4 o 10 ng/ml de bFGF con la misma eficacia.
(v) medio HA13(a) modificado consiste en DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 500 pg/ml, bFGF -4 ng y SR3 - 1 %]. Se encontró que las iPSC apoyan en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales.
(vi) medio HA13(b) modificado consiste en DMEM/F 12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 500 pg/ml, bFGF -4 ng, SR3 - 1 % y una mezcla de lípidos (1%)]. Se encontró que las iPSC apoyan en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales.
(vii) medio modificado HA13(c) consiste en DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 50 pg/ml, bFGF -4 ng y SR3 - 1 %. Se encontró que las iPSC apoyan en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales.
(viii) medio modificado HA13(d) consiste en DMEM/F12 (95 %), L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 50 pg/ml, bFGF -4 ng, SR3 - 1 % y una mezcla de lípidos (1 %)]. Se encontró que las iPSC apoyan en sistemas de cultivo bidimensionales y tridimensionales.
Cultivo en cultivos estáticos en suspensión (tridimensionales) - Para iniciar los cultivos en suspensión, las células iPS se extrajeron de su placa de cultivo usando 1.5 mg/ml de colagenasa tipo IV (Worthington biochemical Corporation, Lakewood, NJ, EE. UU.), se rompieron adicionalmente en grupos pequeños usando puntas de pipeta Gilson de 200 pl, y se cultivaron en suspensión en placas Petri de 58 mm (Greiner, Frickenhausen, Alemania) a una densidad celular de 1 x 106 - 5 x 106 células/placa (5-8 ml de medio en placas de 58 mm). Las cajas Petri se mantuvieron estáticas en una incubadora a 37 °C en 5 % de CO2. Cuando fue necesario, los grupos de diferenciación se eliminaron del cultivo durante los primeros tres pases mientras las células se adaptaban a las nuevas condiciones de cultivo. El medio en el cultivo en suspensión se cambió diariamente y las células se pasaron cada 5-7 días cortando manualmente los grupos usando agujas de 27 g (solo en los pases 1-3) o pipeteando suavemente usando puntas de pipeta Gilson de 200 ml. Como alternativa, las células se pasaron usando tripsina EDTA (0.25 %, Biological Industries, Beit Haemek, Israel) combinado con un tratamiento de una hora con inhibidor de ROCK 10 M (EMD Biosciences, Inc. La Jolla, CA, EE. UU.) antes de la incubación con tripsina. Para calcular el tiempo de duplicación de las células, se contaron las células iPS J1.2-3 e iF4 y se cultivaron en suspensión durante 8 días con medios de cultivo CM100F o CM100Fp. Las células se contaron cada dos días. Se calculó el tiempo de duplicación promedio de cuatro repeticiones biológicas.
Cultivo en matraces giratorios (tridimensional) - Los grupos de células iPS se cultivaron en placas de Petri estáticas durante al menos un pase y luego se transfirieron a matraces giratorios de 250 ml (Cell Spin 250 o 100, Integra BioSciences) en los medios de cultivo sometidos a ensayo, se agitaron continuamente a 90 vueltas por minuto (rpm) usando una placa magnética, y se colocaron en placa en una incubadora a 37 °C en 5 % de CO2. El medio se cambió cada dos días. Cada 5-7 días los grupos se dividían en una relación de 1:2.
Inmunofluorescencia de células cultivadas en sistemas de cultivo 2-D o 3-D - Para la inmunotinción fluorescente, las iPS no diferenciadas cultivadas en sistemas de cultivo 2D o 3D en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo o recultivadas en MEF se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se expusieron a los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Se utilizaron anticuerpos conjugados Cys 3 (Chemicon International, Temecula CA, EE. UU.) como anticuerpos secundarios (1:200). Los anticuerpos primarios (1:50) incluyen SSEA 1, 3 y 4 (Hybridoma Bank, Iowa, EE. UU.), TRA1-60 y TRA1-81 (Chemicon International, Temecula CA, EE. UU.) y Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.).
Inmunohistoquímica de células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2-D o 3-D - Después de la desparafinación, las secciones de tejido se tiñeron usando el kit de tinción Dako LSAB+ para detectar la presencia de marcadores de ectodermo (p-3-tubulina 1:500, Chemicon International, Temecula CA EE. UU.), mesodermo (CD31 1:20) y endodermo (a-fetoproteína 1:20) (ambos de DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Como controles, se realizaron tinciones tanto de isotipo IgG como de anticuerpos secundarios. El anticuerpo secundario se conjugó con peroxidasa.
Análisis de cariotipo de células cultivadas en sistemas de cultivo 2-D o 3-D - El análisis de cariotipo (banda G) se realizó en al menos 10 células de cada muestra, dos muestras por ensayo, como se describió anteriormente [Amit et al, 2003]. Los cariotipos se analizaron e informaron según el "Sistema Internacional para la Nomenclatura Citogenética Humana" (ISCN).
Formación de cuerpos embrioides (EB) de células cultivadas en sistemas de cultivo 2-D o 3-D - Para la formación de EB, se pasaron iPS como se describe y se transfirieron a placas Petri de 58 mm (Greiner, Frickenhausen, Alemania). Los EB se cultivaron en un medio que consistía en un 80 % de DMEM/F12 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), complementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) (HyClone, Utah, EE. UU.), un 10 % de knockout serum replacement (SR; Invitrogen), L-glutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 0.1 mM y un 1 % de reserva de aminoácidos no esenciales (Invitrogen Corporation, Grand Island NY, EE. UU.). Se recogieron EB de 10-14 días de edad para aislamiento de ARN y examen histológico. Para el análisis histológico, los EB se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %, se deshidrataron en alcohol graduado (70 % - 100 %) y se incluyeron en parafina. Se desparafinizaron secciones de 1-5 pm y se tiñeron con hematoxilina/eosina (H&E).
RT-PCR de células cultivadas en sistemas de cultivo 2-D o 3-D - Se aisló el ARN total de iPS cultivadas durante 10, 15 y 20 pases en los sistemas de cultivo bidimensionales o tridimensionales libres de xeno en los medios sometidos a ensayo y de EB de 10-14 días (formados a partir de células cultivadas en 2- D, 3-D en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo o células cultivadas en MEF) utilizando Tri-Reagent (Sigma, St. Louis MO, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir de 1 pg de RNA total usando transcriptasa inversa MMLV RNase H minus (Promega, Madison WI, EE. UU.). La reacción de PCR incluyó desnaturalización durante 5 minutos a 94 °C seguida de ciclos repetidos de 94 °C durante 30 segundos, temperatura de hibridación como se indica en la Tabla 1, a continuación en el presente documento, durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 30 segundos. Los cebadores de PCR y las condiciones de reacción se describen en la Tabla 1, a continuación en el presente documento. Los productos de la PCR se fraccionaron por tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2 %. Se usaron marcadores de ADN para confirmar el tamaño de los fragmentos resultantes. Para la PCR cuantitativa (Q-PCR), la densitometría de los genes sometidos a ensayo se normalizó con respecto a GAPDH. Se realizaron tres repeticiones para cada línea sometida a ensayo.
Tabla 1
Cebadores y condiciones de RT-PCR
Tabla 1: Los cebadores de RT-PCR y las condiciones de PCR se proporcionan junto con los números de acceso de GenBank de las transcripciones amplificadas.
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Formación de teratomas a partir de células cultivadas en 2-D - Se recogieron células iPS (iF4 y J1.2-3) de 4-6 pocilios de una placa de 6 pocilios (cada pocilio tiene una superficie total de 10 cm e incluye 1.5-2.5 x 106 células) y se inyectaron en los músculos de las patas traseras de ratones beige con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) macho de cuatro semanas de edad. Diez semanas después de la inyección, se recogieron los teratomas resultantes y se prepararon para el análisis histológico usando el mismo método mencionado para los EB.
Formación de teratomas a partir de células cultivadas en suspensión (sistemas de cultivo 3D) - Se recogieron células iPS (iF4 y J1.2-3) de cuatro a seis placas de 58 mm (de cultivo en suspensión, cada placa incluye 1.5-2.5 x 106 células) y se inyectaron en los músculos de las patas traseras de ratones beige con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) macho de cuatro semanas de edad. Diez semanas después de la inyección, se recogieron los teratomas resultantes y se prepararon para el análisis histológico usando el mismo método mencionado para los EB.
Ejemplo 1 (no según la invención)
Las células madre pluripotentes inducidas pueden mantenerse en un estado no diferenciado y pluripotente cuando se cultivan en sistemas de cultivo 2-D libres de xeno, libres de capa alimentadora
Los experimentos descritos a continuación en el presente documento se realizaron utilizando células iPS que se cultivaron según los métodos, condiciones de cultivo y medios de cultivo descritos en la sección "Materiales generales y métodos experimentales" anterior.
Resultados experimentales
Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2D usando un medio libre de suero, libre de xeno y un sistema libre de capas de soporte exhiben una morfología no diferenciada y características típicas de iPS - Se probaron varias combinaciones de medios posibles (HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) para determinar la capacidad de apoyar cultivos de células iPS libres de capa alimentadora y libres de xeno (desprovistos de cualquier contaminante animal). Todos los medios sometidos a ensayo (es decir, HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) resultaron adecuados para apoyar cultivos iPS durante al menos 15 pases. Usando los medios sometidos a ensayo en condiciones libres de capa alimentadora usando una matriz sintética Matrigel™ se cultivaron células iPS continuamente durante al menos 15 pases manteniendo sus características iPS, incluida la proliferación no diferenciada, la estabilidad del cariotipo y la pluripotencia (datos no mostrados). No se observaron diferencias morfológicas entre las colonias que crecieron en los sistemas de cultivo sometidos a ensayo y las que crecieron en MEF en presencia del medio yF10, en consecuencia, las características morfológicas permanecieron sin cambios a nivel de una sola célula, haciendo que las células fueran pequeñas y redondas, exhibiendo alta relación de núcleo-a-citoplasma, con una presencia notable de uno a tres nucléolos y un espaciado típico entre las células (datos no mostrados). Al igual que las células cultivadas en MEF en presencia de un medio de control (medio de cultivo básico yF10), las células iPS que se cultivaron en una matriz sintética Matrigel™ (BD Bioscience) en presencia de todos los medios sometidos a ensayo (HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) se pasaron de forma rutinaria cada cinco a siete días, en la misma relación de 1 a 2, 2 a 3, o 1 a 3, lo que indica un tiempo de duplicación de la población similar al de las iPS cultivadas en MEF con el medio de control. Las células iPS se pasaron con la misma eficiencia de siembra de aproximadamente 1 millón de células por 10 cm2, con la misma tasa de viabilidad superior al 90 %. Usando reemplazo de suero (SR) al 15 % y DMSO al 10 %, las células iPS se congelaron y descongelaron con éxito.
Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2D en medio libre de animales y sistema libre de capa de soporte expresan marcadores de pluripotencia - Se examinaron varios marcadores de superficie típicos de células ESC e iPS no diferenciadas de primates usando tinción inmunofluorescente [como se describe en Thomson et al, 1995, 1996, 1998]. Se encontró que las células cultivadas con los medios sometidos a ensayo durante al menos 15 pases eran muy positivas para los marcadores de superficie SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 y Oct 4 (datos no mostrados). Como en otras ESC de primates, la tinción con SSEA3 fue débil y la tinción para SSEA1 fue negativa (datos no mostrados).
Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2D en medio libre de animales y sistemas libres de capa de soporte forman EB in vitro y teratomas in vivo - Se examinó in vitro el potencial de desarrollo de las células después de un cultivo prolongado en las condiciones sometidas a ensayo por la formación de cuerpos embrioides (EB). Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo libre de capa alimentadora en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo (HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) formaron EB similares a los creados por ESC cultivadas en MEF (datos no mostrados). Por ejemplo, la capacidad de las células iPS para formar EB se demostró después de 28 pases en el medio HA40/4 y 20 pases en el medio HA77. Dentro de estos EB, las células iPS se diferenciaron en tipos de células representativos de las tres capas germinales embrionarias [Itskovitz-eldor et al, 2000]. Después de su inyección a ratones SCID Beige, las células iPS cultivadas en las condiciones sometidas a ensayo formaron teratomas que contenían tipos de células representativos de las tres capas germinales embrionarias (datos no mostrados), demostrando así su plena pluripotencia. Por ejemplo, la capacidad de las células iPS para formar teratomas se demostró después de 31 pases en el medio mHA40/4; después de 24 pases en el medio HA74/1; y después de 16 pases en el medio HA77.
Ejemplo 2 (no según la invención)
Las células madre pluripotentes inducidas pueden mantenerse en un estado no diferenciado y pluripotente cuando se cultivan en capas alimentadoras libres de xeno en presencia de medio libre de xeno y libre de suero
Los experimentos descritos a continuación en el presente documento se realizaron usando células iPS que se cultivaron según los métodos, condiciones de cultivo y medios de cultivo descritos en la sección "Materiales generales y métodos experimentales" anterior.
Resultados experimentales
Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2D usando medio libre de xeno, libre de suero y capas de células alimentadoras libres de xeno exhiben una morfología no diferenciada y características típicas de iPS - Se sometieron a ensayo varias combinaciones de medios posibles (HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) para determinar la capacidad de apoyar cultivos de iPS libres de xeno (desprovistos de cualquier contaminante animal) usando fibroblastos de prepucio como capas de células alimentadoras. Todos los medios sometidos a ensayo resultaron adecuados para soportar cultivos iPS. Usando los medios sometidos a ensayo en condiciones libres de xeno con fibroblastos de prepucio como capa de soporte, las células iPS se cultivaron continuamente durante al menos 22 pases mientras mantenían sus características iPS, incluida la proliferación no diferenciada (Figuras 1A-C y datos no mostrados), estabilidad del cariotipo y pluripotencia. No pudieron observarse diferencias morfológicas entre las colonias que crecieron en los sistemas de cultivo sometidos a ensayo y las que crecieron en MEF en presencia del medio de control yF10; en consecuencia, las características morfológicas permanecieron sin cambios a nivel de una sola célula, haciendo que las células fueran pequeñas y redondas, exhibiendo alta relación de núcleo-a-citoplasma, con una presencia notable de uno a tres nucléolos y espaciado típico entre las células (datos no mostrados). Al igual que las células cultivadas en MEF, las células iPS cultivadas en células alimentadoras de fibroblastos de prepucio en presencia de todos los medios de cultivo sometidos a ensayo (HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) se sometieron a pases de forma rutinaria cada cinco a siete días, en la misma relación de 1 a 2, 2 a 3 o 1 a 3, lo que indica un tiempo de duplicación de la población similar al de las iPS cultivadas en MEF en presencia de un medio de control yF10. Las células iPS se pasaron con la misma eficiencia de siembra de aproximadamente 1 millón de células por 10 cm2, con la misma tasa de viabilidad superior al 90 %. Usando reemplazo de suero (SR) al 15 % y DMSO al 10 %, las células iPS se congelaron y descongelaron con éxito.
Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2D en medio libre de animales y capa de soporte libre de xeno expresan marcadores de pluripotencia - Se examinaron varios marcadores de superficie típicos de células ESC e iPS no diferenciadas de primates usando tinción inmunofluorescente [como se describe en Thomson et al, 1995, 1996, 1998]. Se encontró que las células cultivadas con los medios sometidos a ensayo durante al menos 15 pases eran muy positivas para los marcadores de superficie SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 y Oct 4 (Figuras 2A-C). Como en otras ESC de primates, la tinción con SSEA3 fue débil y la tinción para SSEA1 fue negativa (datos no mostrados).
Las células iPS cultivadas en sistemas de cultivo 2D en medio libre de animales y capas alimentadoras libres de xeno forman EB in vitro y teratomas in vivo - Se examinó in vitro el potencial de desarrollo de las células después de un cultivo prolongado en las condiciones sometidas a ensayo por la formación de cuerpos embrioides (EB). Las células iPS cultivadas en capas de células alimentadoras libres de xeno (fibroblastos de prepucio) en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo (HA74/1, HA75, HA76, HA77, HA78, HA40\4) formaron e B similares a los creados por ESC cultivados en MEF en presencia del medio de control yF10 (datos no mostrados). Dentro de estos EB, las células iPS se diferenciaron en tipos de células representativos de las tres capas germinales embrionarias [Itskovitz-Eldor et al, 2000]. Después de su inyección a ratones SCID Beige, las células iPS cultivadas en las condiciones sometidas a ensayo forman teratomas que contienen tipos de células representativos de las tres capas germinales embrionarias (datos no mostrados), demostrando así su plena pluripotencia.
Ejemplo de referencia 3
Derivación de una línea de células madre embrionarias en el medio de cultivo libre de xeno de la invención Después de la digestión de la zona pelúcida por la solución ácida de Tyrode (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.), se colocaron blastocistos completos en fibroblastos de prepucio humano (HFF) inactivados mitóticamente en presencia del medio HA40/4, excepto que el medio no contenía bicarbonato de sodio. Inicialmente, las células fueron pasadas mecánicamente usando jeringas de insulina (BD plastipak, n.° de cat. 300013) y después de 4 pases, las células fueron pasadas cada cuatro a seis días usando 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (Gibco Invitrogen corporation products, San Diego, CA, EE. UU.). La línea ESC humana resultante se denominó "WC1".
Ejemplo 4
Las células madre pluripotentes inducidas pueden mantenerse en un estado no diferenciado y pluripotente en cultivos en suspensión estáticos
El cultivo de células iPS en suspensión tiene ventajas significativas sobre los cultivos convencionales, particularmente cuando se pretende obtener grandes cantidades de células para el trasplante de células y tejidos.
Los experimentos descritos a continuación en el presente documento se realizaron utilizando células iPS que se cultivaron según los métodos, condiciones de cultivo y medios de cultivo descritos en la sección "Materiales generales y métodos experimentales" anterior.
Resultados experimentales
Las células iPS pueden mantenerse en un estado no diferenciado en cultivos en suspensión - Las células iPS (las líneas celulares J1.2-3 e iF4) que crecieron con MEF o en condiciones libre de capa alimentadora [Amit et al, 2004], se colocaron en cultivos en suspensión. Después de 24 horas en cultivo en suspensión con el medio de cultivo sometido a ensayo CM100F, CM100Fp, yFL3 (que comprende 4 ng/ml o 10 ng/ml de bFGF y complementado con 3000 unidades/ml de LIF), o yF100, las células iPS crearon grupos esferoides o estructuras a modo de disco que se mantuvieron durante al menos 20 pases (Figuras 3A-C y datos no mostrados). El examen histológico de las iPS que se cultivaron en suspensión durante al menos 10 pases reveló una población homogénea de células pequeñas con núcleos grandes. Los esferoides crecieron y se dividieron mecánicamente cada 5-7 días manteniendo su morfología, lo que permitió la expansión de los cultivos en suspensión. Alternativamente, mediante el uso de tripsina-EDTA y tratamiento con inhibidor ROCK, las células suspendidas pudieron disociarse en células individuales y seguir formando esferoides de la misma morfología y características, lo que permite una expansión celular eficiente. Algunos cultivos se realizaron durante más de 50 pases (un año de cultivo continuo). Las dos líneas celulares iPS diferentes, J1.2-3 e iF4, que se cultivaron en suspensión como se describe en el presente documento con los medios de cultivo sometidos a ensayo, mostraron un comportamiento y una morfología de esferoide e histología similares.
Las células iPS que se cultivaron en suspensión y se volvieron a cultivar en sistemas de cultivo 2-D mantienen la morfología típica de colonias de células iPS - Después de al menos 10 pases en suspensión, cuando se devolvió al cultivo 2D con MEF o superficie de fibronectina, todos los grupos de esferoides se adhirieron a los MEF o a la superficie de fibronectina y después de 24 a 48 horas demostraron una morfología típica de colonia de células iPS, exhibiendo una alta relación núcleo-a-citoplasma con notable presencia de uno a tres nucléolos y con espaciamiento típico entre las células (Figura 4).
Las células iPS mantienen su fenotipo de células madre no diferenciadas mientras se cultivan en cultivos en suspensión (cultivos 3D) - Se examinaron varios marcadores de superficie típicos de células ESC e iPS no diferenciadas de primates usando tinción inmunofluorescente [como se describe en Thomson et al, 1998; Bhattacharya, et al. 2004; Kristensen et al., 2005]. Se encontró que las células iPS humanas que se cultivaron en suspensión con los medios de cultivo sometidos a ensayo durante al menos 30 pases eran fuertemente positivas para SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81 y Oct4 (Figuras 5A-C). Al igual que con otras ESC de primates [Thomson et al., 1995 y 1996] y con ESC cultivadas con MEF, la tinción con SSEA3 fue débil y negativa para SSEA1 (no se muestran los datos). La tinción de marcadores de células madre se mantuvo alta cuando las células cultivadas en suspensión se devolvieron a cultivos 2D con MEF (datos no mostrados). Los análisis de RT-PCR mostraron que, de manera similar a las células cultivadas con MEF, las células iPS cultivadas en suspensión durante al menos 10 pases expresaron marcadores genéticos de pluripotencia [King et al, 2006] que incluyen Oct4, Nanog, Sox2, Rex1, y FGF4 (datos no mostrados). No se detectó diferencia significativa en la expresión génica de Oct4, Nanog, Sox2, Rex1, y FGF4 entre las células iPS cultivadas en suspensión en comparación con las células iPS cultivadas en MEF, ni con las células iPS que se volvieron a cultivar con MEF después de un cultivo continuo en suspensión, similar a las hESC en las mismas condiciones.
Las células iPS que se cultivan en suspensión mantienen un cariotipo normal - El análisis de cariotipo por bandas de Giemsa se llevó a cabo en células después de 30 pases en suspensión, y se encontró que las células exhibían un cariotipo 46,XY normal (datos no mostrados). Así, el cariotipo del cultivo de células en suspensión se mantuvo estable.
Las células iPS que se cultivan en suspensión mantienen su pluripotencialidad in vitro - Después de una expansión prolongada en cultivos en suspensión con los medios de cultivo sometidos a prueba, las células iPS conservaron su capacidad de diferenciación pluripotente, como lo demostró la formación in vitro de EB. Cuando las células iPS que se cultivaron en suspensión durante más de 20 pases se transfirieron a un medio que contenía suero sin la adición de factores de crecimiento, se observó la formación de EB quísticos después de 7 a 10 días, de manera similar a los EB cavitados formados a partir de hESC después de 10 días en cultivo [Itskovitz et al, 2000] y EB quísticos después de 14-20 días. Dentro de los EB formados a partir de las células iPS, había tipos de células representativos de las tres capas germinales embrionarias típicas de la diferenciación de las células iPS (datos no mostrados).
Por ejemplo, la capacidad de las células iPS para formar EB se demostró después de 22 pases en presencia del medio CM100p en un cultivo en suspensión; la capacidad de formar EB se demostró después de 23 pases en presencia del medio yF100 en un cultivo en suspensión; la capacidad de formar EB se mostró después de 8 pases en presencia del medio yFL3 en un cultivo en suspensión.
Las células iPS que se cultivan en suspensión mantienen su pluripotencialidad in vivo - Se demostró además la pluripotencialidad de las células iPS en suspensión in vivo por la formación de teratomas. Se inyectaron células cultivadas en suspensión durante al menos 20 pases en ratones SCID Beige, y 10 semanas más tarde se formaron tumores (datos no mostrados). Dentro de estos teratomas se observaron tejidos representativos de las tres capas germinales.
Por ejemplo, la capacidad de las células iPS para formar teratomas se demostró después de 20 pases en el CM100 en un cultivo en suspensión; y se demostró la capacidad de formar teratomas después de 10 pases en el yFL3 en un cultivo en suspensión.
Ejemplo 5
Las células madre pluripotentes inducidas pueden mantenerse en un estado no diferenciado y pluripotente en cultivos en suspensión dinámicos
Los experimentos que se describen a continuación se realizaron utilizando células iPS que se cultivaron según los métodos, las condiciones de cultivo y los medios de cultivo descritos en la sección de "Materiales Generales y Métodos Experimentales" anterior.
Resultados experimentales
Las células iPS que se cultivan en cultivos en suspensión con agitación mantienen su estado no diferenciado - Las células iPS de la línea J1.2-3 se cultivaron en suspensión en matraces giratorios durante al menos un mes usando los medios de cultivo sometidos a ensayo. Un examen después de un mes mostró que las características morfológicas de los grupos de esferoides formados por las células seguían siendo similares a las observadas cuando las células iPS se cultivan estáticamente en placas Petri (datos no mostrados). Además, las células iPS expresaron fuertemente marcadores de hESC no diferenciadas como Oct-4, TRA-1-81, TRA-1-60 y SSEA4 (Figuras 6A-D). Cuando se volvieron a cultivar en MEF, las células iPS en los grupos se volvieron a unir, formando nuevamente colonias típicas de células iPS (datos no mostrados). Se encontró que el cariotipo de las células cultivadas durante un mes en el matraz giratorio era normal (datos no mostrados).
Las células iPS que se cultivan en cultivos de suspensión dinámicos mantienen el cariotipo normal - Se encontró que las células IPS que se cultivaron durante 30 pases en cultivos de suspensión estáticos (en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo) y luego durante 3 pases en suspensión dinámica (en rotación) (en presencia de los medios de cultivo sometidos a ensayo) exhibieron cariotipo 46,XY normal. Por lo tanto, el cariotipo del cultivo de células iPS en suspensión se mantuvo estable.
Las células iPS que se cultivan en suspensión dinámica mantienen su pluripotencialidad in vitro - Se examinó el potencial de desarrollo de las células iPS que se cultivaron en cultivos de suspensión dinámicos in vitro por la formación de EB. Las iPS se cultivaron en suspensión estática durante más de 20 pases, luego en suspensión dinámica durante al menos 10 pases adicionales, y luego se transfirieron a un medio que contenía suero sin la adición de factores de crecimiento, y se observó la formación de EB quísticos después de 7-10 días, de manera similar a EB cavitados formados a partir de hESC después de 10 días en cultivo [Itskovitz et al, 2000], y EB quísticos después de 14-20 días. Dentro de los EB formados a partir de células iPS había tipos de células representativos de las tres capas germinales embrionarias típicas de la diferenciación de células iPS (datos no mostrados).
Las células iPS que se cultivan en suspensión dinámica mantienen su pluripotencialidad in vivo - La pluripotencialidad de las células iPS cultivadas en suspensión dinámica se demostró in vivo por la formación de teratomas. Las células se cultivaron en suspensión estática durante al menos 20 pases y luego en suspensión dinámica durante 10 pases adicionales y luego se inyectaron en ratones SCID Beige. Después de 10 semanas de inyección en los ratones, se formaron tumores. Dentro de estos teratomas, se observaron tejidos representativos de las tres capas germinales (datos no mostrados).
Este estudio presenta un enfoque novedoso para el cultivo de células iPS no diferenciadas usando un sistema de cultivo 2D definido o cultivos en suspensión. Los presentes inventores demuestran que bajo estas condiciones dos líneas de células iPS, una derivada de fibroblastos adultos y otra derivada de fibroblastos de prepucio, podrían crecer y expandirse a través de muchos pases manteniendo sus características, incluyendo la pluripotencialidad y cariotipos estables. Cuando las células iPS se transfieren a la suspensión en presencia de un medio de diferenciación (por ejemplo, DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, knockout serum replacement al 10 %, Lglutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 0.1 mM y un 1 % de reserva de aminoácidos no esenciales), forman espontáneamente cuerpos embrioides (EB). Por otro lado, usando los sistemas de cultivo sometidos a ensayo (por ejemplo, en presencia de los medios de cultivo CM100F, CM100Fp, yF100 o yFL3), las células iPS forman espontáneamente esferoides que consisten en células no diferenciadas.
Esta es la primera descripción de un método para la expansión continua de iPS no diferenciadas en suspensión 3D y cultivos agitados, que podría aplicarse adecuadamente para la producción de células a gran escala.
Los inventores presentan por primera vez un sistema de cultivo en suspensión para expansión de iPS no diferenciadas, basado en medio libre de suero y factores de crecimiento definidos. Este sistema de cultivo en suspensión utiliza placas Petri, matraces Erlenmeyer agitadores o matraces giratorios. Se cultivaron dos líneas de células iPS de piel de adulto y fibroblastos de prepucio de recién nacido según el método novedoso de la invención como pequeños esferoides que mantienen todas las características típicas de las células ESC/iPS después de un cultivo prolongado de más de 25 pases (86 duplicaciones), incluido un cariotipo estable y pluripotencialidad. Estos resultados demuestran que es posible cultivar células iPS en un medio definido sin capa alimentadora usando cultivo 3D.
Además, cuando se aplicó en un sistema dinámico durante un mes, la cantidad de grupos de células de células iPS humanas aumentó de manera múltiple mientras se mantenían las características únicas de las células. Estos resultados hacen que el sistema de suspensión propuesto sea adecuado tanto para el cultivo rutinario de células iPS o hESC en 3D como para la producción en masa de células iPS y hESC con fines terapéuticos.
Las enseñanzas de la invención presentan sistemas de cultivo escalables, reproducibles y controlados. Estos resultados representan un progreso significativo hacia el objetivo final deseado de obtener un método facilitador para el cultivo a gran escala de células iPS no diferenciadas y hESC necesarias para usos clínicos e industriales.
Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia.
Referencias
(Las referencias adicionales se citan en el texto)
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Amit M, Margulets V, Segev H, Shariki K, Laevsky I, Coleman R, Itskovitz-Eldor J. 2003. Biol Reprod. 68(6): 2150-6. Human feeder layers for human embryonic stem cells.
Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S. Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008.
Bhattacharya, B. et al. (2004). Gene expression in human embryonic stem cell lines: unique molecular signature. Blood 103, 2956-2964.
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Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. (2000). Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Mol. Med. 6, 88-95.
King, T.D., Gandy, J.C. & Bijur, G.N. (2006). The protein phosphatase-l/inhibitor-2 complex differentially regulates GSK3 dephosphorylation and increases sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 levels. Exp. Cell Res.
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Kristensen, D.M., Kalisz, M., & Nielsen, J.H. (2005). Cytokine signaling in embryonic stem cells. APMIS. 113, 756-772. Lowry WE, Richter L, Yachechko R, Pyle AD, Tchieu J, Sridharan R, Clark AT, Plath K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(8):2883-2888.
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Meissner A, Wernig M, Jaenisch R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2007, 25(10): 1177-1181.
Okita K., et al, 2007. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448: 313-318.
Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol. 2008,

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo que está libre de suero que comprende una quimera IL6RIL6 en un intervalo de concentración de 50-200 picogramos por mililitro (pg/ml) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), en donde el medio de cultivo puede mantener células madre pluripotentes en un estado no diferenciado en ausencia de soporte de células alimentadoras.
2. El medio de cultivo de la reivindicación 1, en donde dicho medio de cultivo comprende además reemplazo de suero.
3. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, en donde dicha concentración de dicha quimera IL6RIL6 está entre 90 pg/ml y 120 pg/ml.
4. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha concentración de dicha quimera IL6RIL6 es 100 pg/ml.
5. Un cultivo celular que comprende una célula madre pluripotente y el medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. El cultivo celular de la reivindicación 5, en donde el cultivo celular está libre de células alimentadoras.
7. Un método de derivación de una línea de células madre pluripotentes inducidas, que comprende
(a) inducir una célula somática a una célula madre pluripotente; y
(b) cultivar dicha célula madre pluripotente en el medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, derivando de ese modo la línea de células madre pluripotentes inducidas.
8. Un método de expansión y mantenimiento de células madre pluripotentes en un estado no diferenciado, comprendiendo el método cultivar las células madre pluripotentes en el medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, expandiendo y manteniendo de ese modo las células madre pluripotentes en un estado no diferenciado.
9. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el cultivo celular de la reivindicación 5 o 6, o el método de la reivindicación 7 u 8, en donde dicho medio de cultivo puede expandir dichas células madre pluripotentes en un estado no diferenciado cuando se cultivan en un cultivo en suspensión.
10. Un método de generación de células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes, comprendiendo el método:
(a) cultivar las células madre pluripotentes según el método de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, para obtener de ese modo células madre no diferenciadas, expandidas;
(b) someter dichas células madre no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje;
generando de ese modo las células específicas de linaje a partir de las células madre pluripotentes.
11. Un método de generación de cuerpos embrioides a partir de células madre pluripotentes, comprendiendo el método:
(a) cultivar las células madre pluripotentes según el método de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, para obtener de ese modo células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas; y
(b) someter dichas células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar dichas células madre en cuerpos embrioides;
generando de ese modo los cuerpos embrioides a partir de las células madre pluripotentes.
12. Un método de generación de células específicas de linaje a partir de células madre pluripotentes, comprendiendo el método:
(a) cultivar las células madre pluripotentes según el método de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, para obtener de ese modo células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas;
(b) someter dichas células madre pluripotentes no diferenciadas, expandidas a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar dichas células madre no diferenciadas, expandidas en cuerpos embrioides; y
(c) someter células de dichos cuerpos embrioides a condiciones de cultivo adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje;
generando de ese modo las células específicas de linaje a partir de las células madre pluripotentes.
13. El cultivo celular de la reivindicación 5 o 6, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en donde dichas células madre son células madre embrionarias.
14. El cultivo celular de la reivindicación 5 o 6, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en donde dichas células madre son células madre pluripotentes inducidas (iPS).
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