CN111886334A - 三维培养多能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种三维培养多能干细胞的方法，其中，即使减少培养基更换的频度，多能干细胞也能够维持良好的增殖性。根据本发明，提供一种三维培养多能干细胞的方法，其中，在通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，将多能干细胞培养至细胞浓度成为1.4×106cells/mL以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种三维培养多能干细胞的方法。
背景技术
作为多能干细胞，已知有人工多能干细胞(induced pluripotent stem cell；还称为iPS细胞)及胚胎干细胞(embryonic stem cell：还称为ES细胞)等。在再生医学领域中，正在进行尤其针对iPS细胞的实际应用的研究。
对于多能干细胞的实际应用，重要的是建立多能干细胞的三维大规模培养系统。在非专利文献1中，记载有通过使用特定的三维悬浮搅拌培养装置(生物反应器)，并设定适当的搅拌叶片的转速、pH及溶解氧浓度，不管逆转录病毒载体或附加型载体(episomalvector)等建立方法的种类，均能够使用mTeSR1(注册商标)、Essential8(产品名)、StemFit(注册商标)AK03来将维持在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或SNL饲养细胞上及基质胶、玻连蛋白、层粘蛋白E8片段上的人类iPS细胞从单细胞悬浮状态进行培养，从而经由形成细胞凝聚体，未分化细胞在4天内在每100mL的培养槽内扩增至1×108个约5倍。
并且，在专利文献1中，记载有如下培养基，即，包含抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、无异种成分的血清替代物及脂质混合物且无血清及异种成分，并且具有在无饲养细胞支撑的情况下将多能干细胞维持在未分化状态的能力。在专利文献2中，记载有包括在上述培养基中培养多能干细胞的步骤且将多能干细胞增殖/维持在未分化状态的方法。而且，在专利文献2中，记载有如下培养基，即，包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β-3(TGFβ3)及抗坏血酸且无血清及异种成分，并且培养基中的上述抗坏血酸的浓度至少约为50μg/ml，其中，培养基用于在无饲养细胞支撑的情况下将多能干细胞维持在未分化状态。在专利文献2中，记载有包括在上述培养基中培养多能干细胞的步骤且将多能干细胞增殖/维持在未分化状态的方法。在专利文献3中，记载有包含用于大规模生产人类多能干细胞的功能聚合物的三维球形培养系统。并且，在专利文献4中，报告有成纤维细胞生长因子的热稳定性突变体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2013-510567号公报
专利文献2：日本特开2017-225456号公报
专利文献3：日本特表2015-530104号公报
专利文献4：日本特开2014-507951号公报
非专利文献
非专利文献1：生物工程、2014年、第92卷、第9号、483-486页
发明内容
发明要解决的技术课题
在三维下大规模培养多能干细胞时，通常采用随着细胞数的增加而逐渐更换或添加成完全培养基的方法。完全培养基是指能够单独增殖/维持多能干细胞的培养基。但是，由于用于培养多能干细胞的培养基昂贵，因此上述方法成本高。作为其解决方案，正在通过仅添加细胞所消耗的成分来降低成本。即，在该培养方法中，组合使用细胞接种时的种子(Seed)培养基与第二天之后补充的饲料(Feed)培养基。但是，作为用于在三维下将多能干细胞培养为高细胞浓度的方法，有时不够充分。
本发明要解决的课题在于提供一种三维培养多能干细胞的方法，其中，即使减少培养基更换或培养基添加的频度，多能干细胞也能够维持良好的增殖性。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究的结果，发现了在三维培养多能干细胞时，通过在通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中，将多能干细胞培养至细胞浓度成为1.4×106cells/mL以上，能够维持多能干细胞的良好的增殖性的同时三维培养多能干细胞。本发明是根据上述见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下发明。
(1)一种三维培养多能干细胞的方法，其中，在通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，将多能干细胞培养至细胞浓度成为1.4×106cells/mL以上。
(2)根据(1)所述的方法，其中，上述碱性成纤维细胞生长因子包含温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，培养中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度维持在开始培养时的碱性成纤维细胞生长因子的浓度的40％以上。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的方法，其以2天以上的间隔进行培养基或特定的培养基成分的更换或添加。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中，三维培养中开始培养时的细胞浓度为1×104cells/mL以上且1×106cells/mL以下。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中，相对于开始培养时的细胞数，开始培养4天后的细胞数为5倍以上。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的方法，其中，多能干细胞在维持多能性的状态下增殖。
发明效果
根据基于本发明的三维培养多能干细胞的方法，即使减少培养基更换的频度，也能够维持多能干细胞的良好的增殖性。
附图说明
图1表示培养天数与细胞增殖率的关系。
图2表示培养天数与培养基中的bFGF浓度的关系。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。
基于本发明的三维培养多能干细胞的方法为如下方法，即，在通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，将多能干细胞培养至细胞浓度成为1.4×106cells/mL以上。
＜多能干细胞＞
多能干细胞表示具有分化为3个胚层即内胚层、外胚层及中胚层全部的能力的细胞。
作为多能干细胞，可以举出胚胎干细胞(ESC)及人工多能干细胞(iPS细胞)。作为多能干细胞，优选人工多能干细胞(iPS细胞)。
并且，作为多能干细胞，优选来源于人类或灵长类动物(例如，猴子)的胚胎干细胞，更优选人类多能干细胞。
作为胚胎干细胞(ESC)及人工多能干细胞(iPS细胞)，优选使用人类胚胎干细胞及人类人工多能干细胞。
作为胚胎干细胞，可以举出从怀孕后所形成的胚胎组织获得的细胞(例如，着床前胚泡)、从着床后期/原肠形成前期的胚泡获得的扩增胚泡细胞(EBC)及在怀孕期间的任意时期(优选怀孕的10周以前)从胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。
关于胚胎干细胞，能够通过众所周知的方法来获得。例如，关于人类胚胎干细胞，能够从人类胚泡分离出。关于人类胚泡，从人类体内着床前胚胎或体外受精(IVF)胚胎获得。或者，关于单细胞人类胚胎，能够使其增殖至胚泡阶段。关于扩增胚泡细胞(EBC)，能够从至少受精9天后的原肠形成前期的胚泡获得。并且，关于胚胎生殖(EG)细胞，在为人类胎儿的情况下，能够由从怀孕约8～11周的胎儿获得的原始生殖细胞进行制备。
并且，还能够使用市售的胚胎干细胞。关于人类胚胎干细胞，例如能够从NIH(National Institutes of Health：国立卫生研究院)人类胚胎干细胞注册处(NIH humanembryonic stem cells registry)(www.escr.nih.gov)购买。
人工多能干(iPS)细胞为通过将重编程因子导入到体细胞中而获得的多能干细胞。
作为体细胞，并无特别限定，能够利用任意体细胞。例如，除了胎儿期的体细胞以外，也可以使用成熟的体细胞。作为体细胞，例如可以举出(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(成体干细胞)、(2)组织前体细胞、(3)成纤维细胞(皮肤细胞等)、上皮细胞、肝细胞、淋巴细胞(T细胞、B细胞)、内皮细胞、肌肉细胞、毛细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞、皮肤细胞等分化的细胞。
作为成为体细胞的来源的活体，并无特别限定，但是例如可以举出人类及非人类动物(例如，猴子、绵羊、牛、马、狗、猫、兔子、大鼠及小鼠)。优选为人类。
作为导入到体细胞中的重编程因子，并无特别限定，但是例如可以举出Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Klf2、L-Myc、N-Myc、Klf5、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2、E-cadherin。其中，能够从这些基因组中选择2以上的基因并以任意地组合导入。其中，优选至少具有Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的组合、至少具有Oct3/4、Sox2、Klf4及L-Myc的组合或至少具有Oct3/4、Sox2、Nanog及Lin28的组合。
并且，待导入的基因的种类优选与导入对象的细胞的种类相同。例如，导入到来源于人类的细胞中的基因优选为人类基因。例如，作为导入到来源于人类的体细胞中的基因，优选至少具有人类Oct3/4、人类Sox2、人类Klf4及人类c-Myc的组合、至少具有人类Oct3/4、人类Sox2、人类Klf4及人类L-Myc的组合或至少具有人类Oct3/4、人类Sox2、人类Nanog及人类Lin28的组合。
重编程因子的基因能够使用基因表达载体来导入到体细胞中。作为基因表达载体，并无特别限定，但是例如可以举出病毒载体、质粒载体、人工染色体载体及转座子载体。作为病毒载体，可以举出逆转录病毒载体、腺病毒载体、仙台病毒载体、慢病毒载体及腺相关病毒载体。
关于将重编程因子导入到体细胞中而获得的未分化细胞即分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞，可以通过将重编程因子导入到体细胞中来自行制作，但是也可以获得从研究机构或企业提供或正在出售的细胞。即，本发明中的第一工序可以为从人工多能干细胞库获得人工多能干细胞的工序。
例如，能够获得并使用从Cellular Dynamics International提供的iPS细胞。
并且，能够获得并使用从京都大学iPS细胞研究所提供的201B7、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2、1231A3、1383D2、1383D6、iPS-TIG120-3f7、iPS-TIG120-4f1、iPS-TIG114-4f1、CiRA086Ai-m1、CiRA188Ai-M1或iRA188Ai-W1。
而且，还能够从NIH(National Institutes of Health)或California Instituteof Regenerative Medicine(加州再生医学研究所)、New York Stem Cell Foundation(纽约干细胞基金会)、European Bank for induced Pluripotent Stem Cells(欧洲诱导多功能干细胞银行)等所构建的iPS细胞库获得。
＜三维培养＞
三维培养为接种后立体培养细胞的方法，并且与使细胞粘附在培养皿等容器平面上来进行培养的二维培养不同。三维培养中，细胞能够自发形成立体的细胞团或者球体，但是还能够使用经由细胞外基质或微载体等外部基质的方法。三维培养中，细胞团悬浮在液体培养基中。悬浮培养是指多能干细胞悬浮在培养基中的状态下的培养，而不是附着在基质的表面上。即，在悬浮培养中，为了获得悬浮力而搅拌培养基，或者还能够在培养基中添加用于获得悬浮力的聚合物。例如，在专利文献3中，公开有在包含细胞源纳米纤维的培养基中，在无搅拌状态下三维培养多能干细胞的方法。
＜碱性成纤维细胞生长因子＞
在本发明中，在通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子的培养基中进行多能干细胞的培养。
碱性成纤维细胞生长因子(有时还标记为bFGF、FGF2或FGF-β)为成纤维细胞生长因子家族的成员。
碱性成纤维细胞生长因子(已知还作为bFGF、FGF2或FGF-β)为属于成纤维细胞生长因子家族的一种的细胞因子，并具有受伤时的成纤维细胞的增殖或血管生成等功能。在本发明中，具有有助于维持细胞未分化的作用。作为在本发明中所使用的bFGF，可以为天然来源的bFGF、化学合成的bFGF或基因重组bFGF中的任一个。例如，人类bFGF的氨基酸序列及碱基序列被注册为GenBank注册号码NP_001997.5及GenBank注册号码NM_002006.4。关于bFGF，还能够使用各种市售品。
另外，对在本发明中所使用的培养基将在后面进行叙述，但是在市售的培养基中已包含bFGF的情况下，直接使用这种市售的培养基即可。
在本发明中，作为碱性成纤维细胞生长因子，优选包含温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子。温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子为具有温度稳定性即耐热性的碱性成纤维细胞生长因子。已知天然bFGF在37℃的培养环境下快速分解，但是能够通过对氨基酸序列的一部分导入突变而制作赋予了温度稳定性的碱性成纤维细胞生长因子。例如，在专利文献4中，公开有通过制成取代了bFGF的特定的氨基酸(Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S及C96T)的突变体，能够赋予温度稳定性。
“通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子”是指，在培养期间，碱性成纤维细胞生长因子的浓度通常保持在35ng/mL以上，并且是指不存在由于碱性成纤维细胞生长因子消耗或分解而变得小于35ng/mL的状态。在本发明中，通过培养基中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度通常为35ng/mL以上即通过不产生培养基中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度变得小于35ng/mL的状态，多能干细胞能够显示出良好的增殖性。
在通常优选包含40ng/mL以上、更优选包含50ng/mL以上、进一步优选包含60ng/mL以上、尤其优选包含70ng/mL以上、最优选包含80ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子的培养基中进行多能干细胞的培养。另外，培养基中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度的上限并无特别限定，但是通常为300ng/mL以下，优选为200ng/mL以下。更优选为150ng/mL以下。
关于培养基中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度，对多能干细胞的培养液的一部分进行采样，并能够使用Human bFGF ELISA Kit(SIGMA Corporation)等来进行定量。
在本发明中，优选培养中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度维持在开始培养时的碱性成纤维细胞生长因子的浓度的40％以上，更优选维持在50％以上，进一步优选维持在60％以上，尤其优选维持在70％以上，最优选维持在80％以上。
＜培养基或特定的培养基成分的更换或添加＞
在本发明中，优选不实施2天以上的培养基或特定的培养基成分的更换或添加，可以不实施3天以上，也可以不实施4天以上。在本发明中，能够优选以2天以上(更优选3天以上，进一步优选4天以上)的间隔进行培养基或特定的培养基成分的更换或添加。作为特定的培养基成分，并无特别限定，但是例如能够举出碱性成纤维细胞生长因子。
＜细胞浓度及细胞数＞
在本发明中，将多能干细胞培养至细胞浓度成为1.4×106cells/mL以上。多能干细胞优选能够培养至细胞浓度成为1.5×106cells/mL以上、更优选能够培养至成为1.6×106cells/mL以上、进一步优选能够培养至成为1.8×106cells/mL以上、进一步优选能够培养至成为2.0×106cells/mL以上、进一步优选能够培养至成为2.3×106cells/mL以上、进一步优选能够培养至成为2.6×106cells/mL以上、进一步优选能够培养至成为3.0×106cells/mL以上、进一步优选能够培养至成为3.6×106cells/mL以上。
多能干细胞的细胞浓度的上限并无特别限定，但是通常为1.0×107cells/mL以下，优选为5.0×106cells/mL以下。
在本发明中，按照所需多能干细胞的细胞数，能够适当选择培养量。
三维培养中开始培养时的细胞浓度优选为1×104cells/mL以上且1×106cells/mL以下，更优选为5×104cells/mL以上且2×105cells/mL以下。
关于细胞浓度及细胞数，能够通过以下方法进行测定。收集一部分培养容器内的细胞团，使用D-PBS(达尔伯克(Dulbecco)PBS；PBS表示磷酸缓冲生理盐水)进行清洗之后，添加TrypLE Select(产品名)并在37℃下进行5分钟的处理来将细胞分离成单个细胞，并且通过常规方法测量细胞浓度。能够根据培养量求出烧瓶内的细胞数。
＜增殖率＞
在本发明中，相对于开始培养时(第0天)的细胞数，开始培养4天后(第4天)的细胞数优选为5倍以上，优选为10倍以上，更优选为13倍以上，进一步优选为14倍以上，进一步优选为20倍以上，进一步优选为23倍以上。
在本发明中，相对于开始培养时(第0天)的细胞数，开始培养8天后(第8天)的细胞数优选为5倍以上，优选为100倍以上，更优选为200倍以上，进一步优选为300倍以上，进一步优选为400倍以上，进一步优选为500倍以上。
＜培养基＞
作为本发明中所使用的培养基，能够使用mTeSR1(注册商标)(StemcellTechnologies)或StemFlex(注册商标)等市售的培养基。但是，从包含温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子等观点考虑，优选使用StemFlex(注册商标)。
或者，例如，作为基础培养基，可以使用DMEM(Dulbecco Modified Eagle medium：达尔伯克改良伊格尔培养基)、DMEM与F12的混合培养基(DMEM/F12＝1:1)、Knockout(产品名)D-MEM(Invitrogen公司)等。在使用上述基础培养基的情况下，能够使用任意地组合替代血清(KSR；Knockout(产品名)Serum Replacement(Invitrogen公司))、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、抗生素(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素、丝裂霉素)等添加成分而添加到上述基础培养基中，并进一步添加了碱性成纤维细胞生长因子(优选温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子)的培养基。关于温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子，例如能够使用FGF-Basic-TS(Thermostable；HumanZyme)，但是并不限定于此。
作为本发明中所使用的培养基的条件，优选为无血清培养基且无饲养细胞培养基。
＜培养条件＞
作为本发明中的多能干细胞的培养条件，优选在37℃且5％CO2条件下等，但是并无特别限定。并且，培养优选为搅拌培养，转速并无特别限定，但是优选为10rpm～100rpm，更优选为20rpm～60rpm，进一步优选为30rpm～50rpm。
用于三维培养多能干细胞的培养容器并无特别限定，能够使用任意组织培养容器，但是也可以使用具有如下内部表面的容器，即，设计成在培养容器中进行培养的多能干细胞无法粘附或附着于内部表面上。
关于多能干细胞的三维培养，能够在温度、搅拌速度、pH及CO2浓度等培养参数得到控制的培养系统中进行。优选地，上述培养参数的控制能够使用适当的器件来自动执行。作为培养容器，并无特别限定，但是能够使用30mL的一次性生物反应器或100mL的一次性生物反应器(ABLE INC.)等。
＜本发明的具体例＞
在37℃且5％CO2浓度的孵化器内，在作为增殖用培养基的mTeSR1(注册商标)(STEMCELL Technologies Inc.)及覆盖了Matrigel(注册商标)的板上培养多能干细胞(优选iPS细胞，更优选人类iPS细胞)。培养基除了接种第二天以外，每天更换成新的培养基。另外，也可以使用覆盖了饲养细胞的板来代替覆盖了Matrigel(注册商标)的板。作为饲养细胞，并无特别限定，但是可以举出小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)及小鼠胎儿成纤维细胞(STO细胞)。
使用蛋白酶(例如，TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific Inc.)等)处理通过上述方法培养的多能干细胞，从而将细胞分离为单个细胞。测定细胞数之后，在包含bFGF(优选温度稳定性bFGF)的培养基(尤其优选StemFlex(注册商标)培养基(Thermo FisherScientific Inc.))中，将细胞的浓度调节为0.2×105cells/mL～5×105cells/mL，优选为0.5×105cells/mL～2×105cells/mL、例如为1×105cells/mL。将所获得的细胞悬浮液添加到培养容器中并进行搅拌培养。将转速设定成10～100rpm，并在37℃且5％CO2浓度的孵化器内进行培养。
以上述方式开始搅拌培养之后，培养基的更换能够按适当的时间表进行。但是，如上述，在本发明中，优选不实施2天以上的培养基或特定的培养基成分的更换或添加，可以不实施3天以上，也可以不实施4天以上。
在进行培养基更换的情况下，收集预定的细胞数(作为一例，1.5×106cells分)的细胞团，并通过离心分离去除培养基。添加用于酶消化多能干细胞团的酶(例如，GentleCell Dissosiation Reagent：温和细胞解离试剂(STEMCELL Technologies Inc.))并进行处理之后，以预定的速度将处理液放入过滤器(例如，37μm Reversible Strainer：可逆过滤器(STEMCELL Technologies Inc.))中，从而能够在物理上细分细胞团。通过离心分离对上清液进行分离之后，添加新的培养基并重新悬浮，从而将细胞调节为适当的细胞浓度(0.2×105cells/mL～5×105cells/mL、优选为0.5×105cells/mL～2×105cells/mL、例如1×105cells/mL)。能够将通过上述而获得的培养液再次添加到培养容器内来进行培养。
＜多能性的维持＞
根据本发明，能够在维持多能性的状态下(即，在未分化状态下)增殖多能干细胞。
在本发明中，可以监测多能干细胞来评价多能性。
关于多能性(或分化状态)的评价，例如能够通过形态学评价和/或多能性(未分化)标记的表达分析(RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)、cDNA微阵列分析、流式细胞仪、免疫组织化学等)等方法来进行。
例如，能够从通过对一部分的培养中的细胞进行采样而获得的细胞收集RNA，使用通过将所收集的RNA逆转录为cDNA而获得的cDNA，并通过实时定量PCR来评价基因表达量。
作为多能性(未分化)标记(多能性相关基因)的具体例，能够举出NANOG、SOX2、POU5F1、DNMT3B及LIN28等，但是并无特别限定。
标记名称如下所示。
Sox：SRY-boxes
POU5F1：POU domain，class 5，transcription factor 1
DNMT3B：DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3beta
在后述实施例中确认到通过本发明的方法培养的多能干细胞中的上述多能性(未分化)标记的表达量与未分化对照仅有数倍左右的变动，表达水平几乎没有变动。
＜多能干细胞的分化＞
通过本发明的方法培养的多能干细胞在其培养后，能够置于适合分化为多能干细胞的胚状体(embryoid body：EB)的培养条件下。
从其培养物取出通过本发明的方法培养的多能干细胞，并在含有血清或血清替代物且不含有分化抑制因子的培养基的存在下进行悬浮培养，从而能够形成EB。
关于EB的形成的监测，能够通过常规方法进行形态学评价(例如组织学染色)及分化特异性的标记的表达的判定来实施。关于分化特异性的标记的表达的判定，能够通过免疫学的测定或RNA表达分析(例如，RT-PCR、cDNA微阵列)来进行。
EB的细胞通过进一步置于适合系统特异性的细胞的分化和/或增殖的培养条件下，能够获得系统特异性的细胞。“适合系统特异性的细胞的分化和/或增殖的培养条件”能够通过培养系统(例如，饲养细胞层、无饲养层基质或悬浮培养中的任一个)与适合系统特异性的细胞的分化和/或增殖的培养基的组合来进行构建。另外，系统特异性的细胞为外胚层、内胚层或中胚层中的任一个细胞种类。
通过以下实施例对本发明更具体地进行说明，但是本发明并不受实施例限定。
实施例
＜实施例1＞
(1)iPS细胞的培养1
在37℃且5％CO2浓度的孵化器内，在作为增殖用培养基的mTeSR1(注册商标)(STEMCELL Technologies Inc.)及覆盖了Matrigel(注册商标)的板上培养了人类iPS细胞(从Cellular Dynamics International出售)。培养基除了接种第二天以外，每天更换成新的培养基。培养4天后进行了传代。如下实施传代操作，即，使用0.5mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行7～8分钟左右的处理来剥离细胞，并通过移液操作(Pipetting operation)将细胞分离成适当的尺寸。传代操作后，进一步进行了4天培养。
(2)iPS细胞的培养2
对通过上述方法培养的iPS细胞添加TrypLE Select(产品名)(Thermo FisherScientific Inc.)并在37℃下进行5分钟的处理，从而将细胞分离为单个细胞。通过常规方法测定细胞数之后，在包含终浓度1mmol/L的Y-27632(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)的mTeSR1(注册商标)培养基或者StemFlex(注册商标)培养基(ThermoFisher Scientific Inc.)中，将细胞的浓度调节为1×105cells/mL。另外，在mTeSR1(注册商标)培养基中所包含的bFGF为模仿了天然型bFGF的序列的重组蛋白质，在StemFlex(注册商标)中所包含的bFGF为添加了赋予温度稳定性的修饰的重组蛋白质。向30mL的一次性生物反应器(ABLE INC.)内添加15mL的这些细胞悬浮液，并使用专用的6通道磁力搅拌器进行了搅拌培养。将转速设定成40rpm，并在37℃且5％CO2浓度的孵化器内进行了培养。
(3)iPS细胞的培养3
搅拌培养开始之后，按照表1中所记载的时间表将培养基全部进行了更换。开始培养4天后，收集一部分烧瓶内的细胞团，并通过以下所示的方法测量了细胞数。首先，使用D-PBS(达尔伯克PBS；PBS表示磷酸缓冲生理盐水)(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行清洗之后，添加TrypLE Select(产品名)并在37℃下进行5分钟的处理来将细胞分离成单个细胞。通过常规方法测量细胞浓度之后，根据培养量计算出烧瓶内的细胞数。从所获得的细胞浓度的信息收集1.5×106cells分的细胞团，并通过离心分离去除了培养基。添加GentleCell Dissosiation Reagent(STEMCELL Technologies Inc.)并在室温下处理7分钟之后，以1mL/分钟的速度将处理液放入37μm Reversible Strainer(STEMCELL TechnologiesInc.)中，从而在物理上细分了细胞团。通过离心分离对上清液进行分离之后，添加15mL的包含终浓度1mmol/L的Y-27632的mTeSR1培养基或者StemFlex(注册商标)培养基并重新悬浮，从而将细胞的细胞浓度调节为1×105cells/mL。再次向30ml的一次性生物反应器内添加30mL的相同培养液，并以与上述“(2)iPS细胞的培养2”相同的方式进行了培养。
[表1]
培养8天后，通过与上述“(3)iPS细胞的培养3”相同的方法测量细胞浓度及细胞数，并结合培养5天后(第4天)的细胞数的结果制成了增殖曲线。将在开始培养时点的细胞数设为1时的相对细胞数作为增殖率计算出的结果示于图1中，将培养过程中的细胞浓度和细胞数的变化的结果示于表2中。并且，相对于对一部分进行采样的细胞，使用RNeasyMicro Kit(Qiagen公司)来收集RNA，并使用High Capacity RNA-to-cDNA Kit(ThermoFisher Scientific Inc.)来将其逆转录为cDNA。使用Taqman(注册商标)Gene ExpressionMaster Mix(Thermo Fisher Scientific Inc.)及表3中所记载的Taqman(注册商标)GeneExpression Assay(Thermo Fisher Scientific Inc.)，并通过qPCR评价了所获得的cDNA的基因表达量。表3的Assay ID所示的是Thermo Fisher Scientific Inc.的Taqman(注册商标)Gene Expression Assay中用于进行某一基因的PCR的Probe primer set的代码名称。比较通过△△CT法(Comparative CT法：比较CT法)来进行，并以搅拌培养开始前的iPS细胞为参考试料来进行定量(未分化对照)。并且，作为偏离了未分化状态的对照组，将iPS细胞在Essential6(产品名)培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)中培养2周，并使用了促进自发分化的细胞(分化对照)。将结果示于表4中。表4中的数值表示在将未分化对照中的基因表达量设为1.000的情况下的相对表达量。
[表2]
[表3]
| Gene Symbol | Assay ID |
| NANOG | Hs02387400_g1 |
| SOX2 | Hs00415716_m1 |
| POU5F1 | Hs04260367_gH |
| DNMT3B | Hs00171876_m1 |
| LIN28 | Hs00702808_s1 |
[表4]
| NANOG | SOX2 | POU5F1 | DNMT3B | LIN28 | |
| 实施例1 | 1.308 | 0.341 | 1.255 | 1.191 | 1.264 |
| 实施例2 | 2.616 | 0.444 | 1.723 | 1.375 | 1.619 |
| 实施例3 | 2.404 | 0.206 | 1.313 | 1.453 | 1.456 |
| 比较例1 | 1.055 | 0.479 | 1.155 | 1.253 | 1.151 |
| 比较例2 | 1.376 | 0.573 | 1.363 | 1.717 | 1.344 |
| 比较例3 | 1.515 | 0.376 | 1.251 | 1.704 | 1.324 |
| 未分化对照 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 分化对照 | 0.003 | 17.916 | 0.002 | 0.143 | 0.869 |
根据图1及表2的结果，明确了在mTeSR1(注册商标)培养基中进行了培养的iPS细胞存在通过减少培养基更换的频度来逐渐降低增殖性的倾向，相对于此，在StemFlex(注册商标)培养基中进行了培养的iPS细胞均显示出良好的增殖性，未实施培养基更换的实施例3相较于每天在mTeSR1(注册商标)中进行了培养基更换的比较例1，增殖性更高。并且，可知在StemFlex(注册商标)中所培养的细胞团最终获得最大3.6×106cells/mL等细胞浓度非常高的细胞培养液。
并且，根据表4的结果，确认到在这些条件下进行了培养的iPS细胞的细胞团的多能性相关基因(NANOG、SOX2、POU5F1、DNMT3B、LIN28)的表达量与未分化对照仅有数倍左右的变动，表达水平几乎没有变动。
根据以上，可知通过在包含赋予了温度稳定性的bFGF的StemFlex(注册商标)培养基中悬浮培养iPS细胞，即使减少培养基更换的频度也可以显示出良好的增殖性，并且在维持作为iPS细胞的性质的状态下获得高细胞浓度的细胞培养液。
＜实施例2＞培养基中的bFGF的定量
对一部分的通过上述“(2)iPS细胞的培养2”及“(3)iPS细胞的培养3”的方法培养的iPS细胞的培养液进行采样，并使用Human bFGF ELISA Kit(SIGMA Corporation)来定量了培养基中的bFGF量。将结果示于图2中。
根据图2的结果，可知在培养1天时，在mTeSR1(注册商标)中的bFGF降低至20ng/mL以下。其原因在于天然型bFGF在培养基中的稳定性低，因此认为烧瓶内的iPS细胞通常不会受到基于bFGF的增殖刺激。另一方面，StemFlex(注册商标)中的bFGF在任何条件下均维持通常35ng/mL以上的浓度，因此认为烧瓶内的iPS细胞持续受到基于bFGF的增殖刺激。根据以上，可知在培养中将bFGF维持在通常35ng/mL以上的浓度，其对iPS细胞的增殖改善较为有效。
Claims (7)
1.一种三维培养多能干细胞的方法，其中，
在通常包含35ng/mL以上的碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，将多能干细胞培养至细胞浓度成为1.4×106cells/mL以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述碱性成纤维细胞生长因子包含温度稳定性碱性成纤维细胞生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
培养中的碱性成纤维细胞生长因子的浓度维持在开始培养时的碱性成纤维细胞生长因子的浓度的40％以上。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其以2天以上的间隔进行培养基或特定的培养基成分的更换或添加。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
三维培养中开始培养时的细胞浓度为1×104cells/mL以上且1×106cells/mL以下。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
相对于开始培养时的细胞数，开始培养4天后的细胞数为5倍以上。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
多能干细胞在维持多能性的状态下增殖。
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